Автореферат и диссертация по медицине (14.01.04) на тему:Ремоделирование сердца при различных вариантах вегетативного сопровождения стресса у больных артериальной гипертензией и в эксперименте у животных

На правах рукописи

БОНДАРЕНКО Виталий Сергеевич

РЕМОДЕЛИРОВАНИЕ СЕРДЦА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТАХ ВЕГЕТАТИВНОГО СОПРОВОЖДЕНИЯ СТРЕССА У БОЛЬНЫХ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ И В ЭКСПЕРИМЕНТЕ У ЖИВОТНЫХ (клинико-экспериментальное исследование)

14.01.04 - внутренние болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

1 7 ОКТ 2013

Санкт-Петербург - 2013

005535019

Работа выполнена в Институте медицинского образования Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Новгородский государственный университет имени Ярослава Мудрого».

Научный руководитель:

Член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук профессор Вебер Виктор Робертович

Официальные оппоненты:

Мазуров Вадим Иванович - академик РАМН, доктор медицинских наук профессор, ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И. И. Мечникова», проректор по клинической работе

Лапотников Виктор Александрович - доктор медицинских наук профессор, ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова», кафедра терапии факультетской с курсом эндокринологии, кардиологии и функциональной диагностики имени Г. Ф. Ланга, профессор кафедры

Ведущая организация - ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «» октября 2013 г. в-^^ксов на заседании диссертационного совета по защите диссертации на соискание учёной степени кандидата наук Д 215.002.06 ФГКВОУ «Военно-медицинская академии им. С. М. Кирова» МО РФ (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академии им. С. М. Кирова» МО РФ

Автореферат разослан «

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Черкашин Дмитрий Викторович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

На сегодняшний день общепринятым является факт о стресс-обусловленности артериальной гипертензии (АГ) (Савицкая Е. Ю. и др., 2010; Каде А.Х. и др., 2011). При этом одно из центральных значений при АГ имеют процессы ремоделирования сердца и сосудов. Известно, что диастолическая дисфункция левого желудочка (ДДЛЖ) относится к наиболее ранним проявлениям поражения сердца при АГ и обусловлена, прежде всего, фибропластическими процессами в миокарде, что повышает ригидность сердечной мышцы (Рубанова М. П. и др., 2007; Капелько В. И., 2011).

До настоящего времени не разработаны четкие алгоритмы лечения больных АГ с диастолической дисфункцией. Одной из главных причин является неполное понимание патогенетических механизмов развития данного состояния. Нет четких представлений об активации фибропластических процессов в миокарде и причинах их развитии. В связи с этим возникает множество вопросов. Чем можно объяснить отсутствие гипертрофии левого желудочка (ГЛЖ) и наличие значительных нарушений диастолических свойств миокарда у части больных при достаточно длительно протекающей АГ? Какой морфологический процесс является основой при регистрации избыточных значений трансмитрального потока у больных АГ?

Очевидно, что изучение многих вопросов фиброгенеза в миокарде при АГ у больных значительно затруднено вследствие отсутствия оптимальных методологических подходов. Поэтому перспективным представляется дополнение клинического исследования экспериментальным блоком с проведением иммуногистохимического исследования и изучением экспрессии факторов роста фибробластов, а также коллагена I типа.

Степень разработанности темы исследования. Общепринятым является положение о гиперактивации симпатоадреналовой системы (САС) при АГ. Однако всегда ли только активация САС имеет место при АГ? Каков вклад парасимпатической нервной системы (ПНС) в процессы сердечно-сосудистого ремоделирования? Недостаточно изучены механизмы развития фиброза миокарда у больных АГ, особенно в зависимости от преобладания активности симпатического или парасимпатического отделов вегетативной нервной системы (ВНС), слабо изучена роль факторов роста фибробластов -трансформирующего (TGF-ft - transforming growth factor-^) и основного (FGF-2 - fibroblast growth factor-2) при стрессе. Эти вопросы остаются малоизученными и, безусловно, являются одними из приоритетных в практической кардиологии. Поиску ответов на данные актуальные вопросы и посвящено данное диссертационное исследование.

Цель исследования

Изучить структурно-функциональные изменения левого желудочка (ЛЖ) у больных АГ в зависимости от типа вегетативной реакции на стресс, а также особенности фиброгенеза сердца в эксперименте при холинергических и адренергических влияниях. Задачи исследования

1. Исследовать варианты структурно-функциональных изменений миокарда у больных АГ при холодовой пробе (ХП) и в различное время суток.

2. Оценить диастолическую дисфункцию левого желудочка у больных АГ (функциональную и органическую) в покое и в зависимости от типа вегетативного сопровождения стресса.

3. Изучить особенности фиброгенеза и содержание коллагена в миокарде экспериментальных животных при адренергических и холинергических влияниях.

4. Исследовать содержание факторов роста фибробластов (ТОР-/?! и РОР-2) и участие эндотелиоцитов в продукции факторов роста и коллагена I типа при адренергических и холинергических влияниях в эксперименте.

Научная новизна исследования

1. Впервые показана возможность использования холодовой пробы как индикатора органического и функционального типов диастолической дисфункции левого желудочка.

2. Установлено, что сравнительная оценка состояния диастолической функции левого желудочка у больных артериальной гипертензией и здоровых лиц в разное время дня позволяет выявить ранние функциональные её нарушения.

3. Впервые в эксперименте продемонстрировано, что не только избыточные адренергические влияния приводят к интенсивному накоплению коллагена в миокарде, но и холинергические.

4. Впервые исследована экспрессия факторов роста фибробластов (ТОР-/?! и РСР-2) в миокарде при различных моделях острого стресса в эксперименте.

5. Впервые исследована роль эндотелиоцитов в продукции факторов роста (ТОР-/?! и РОР-2) и коллагена I типа при различных вариантах острого стресса в эксперименте.

Теоретическая и практическая значимость работы Использование диагностики состояния диастолической функции левого желудочка (ДФЛЖ) в разное время суток позволяет выявлять скрытую дисфункцию у больных артериальной гипертензией.

Исследование ДФЛЖ при холодовой пробе позволяет выявить её функциональную и органическую дисфункцию.

В эксперименте продемонстрирована роль адренергического и холинергического факторов в развитии фиброза миокарда, что указывает на необходимость изучения влияния используемых в клинике адрено- и холиномиметиков на ремоделирование сердца. Выявлены особенности

экспрессии факторов роста фибробластов в зависимости от преобладания холинергических или адренергических влияний, показана роль эндотелиоцитов в развитии фиброза миокарда у экспериментальных животных при остром стрессе.

Положения, выносимые на защиту

1. Изучение ДФЛЖ в различное время суток и при холодовой пробе позволяет выявить её ранние функциональные нарушения у больных АГ.

2. У больных АГ как с адренергическим, так и с холинергическим сопровождением стресса часто выявляется органическая ДДЛЖ, что свидетельствует о самостоятельном вкладе как адренергических, так и холинергических влияний в формирование интерстициального фиброза у больных АГ.

3. Моделирование как адренергического, так и холинергического стресса в эксперименте приводит к выраженным изменениям интерстиция миокарда в виде избыточного развития соединительнотканного компонента.

4. Экспрессия факторов роста фибробластов различна в зависимости от вида моделируемого стресса, при адренергических влияниях преобладает экспрессия РСР-2, при холинергических - ТСБ-^, что может свидетельствовать о различиях в патогенезе развития фиброза при разных моделях стресса.

Степень достоверности и апробация работы

Анализ результатов исследования основан на обследовании репрезентативной выборки пациентов, а также на использовании в работе современных параметрических и непараметрических методов статистики, что позволяет сделать вывод о высокой степени достоверности полученных выводов.

Апробация диссертации состоялась на совместном заседании научно-плановой экспертной комиссии, кафедры внутренних болезней, неврологии и психиатрии ИМО НовГУ им. Ярослава Мудрого (Великий Новгород, 4 апреля 2013г.). Результаты исследования были представлены на научно-практических конференциях молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Великий Новгород, 2009, 2010, 2011 гг.); Всероссийском конгрессе кардиологов (Москва, 2011, 2012 гг.), Всероссийской конференции молодых ученых по медицине (Тула, 2011 г.), Межгородской конференции по патофизиологии (Санкт-Петербург, 2012 г.). По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах (ВАК РФ).

Личный вклад автора в проведённое исследование

Автором лично обследовано 106 больных артериальной гипертензией II степени, всем больным выполнено эхокардиографическое исследование с определением ДФЛЖ в покое и при ХП. Также автором выполнено экспериментальное исследование на крысах с целью моделирования острого стресса с преобладанием адренергических и холинергических влияний.

Проведен обширный анализ литературных данных с привлечением большого количества отечественных и зарубежных источников по исследуемой проблеме.

Внедрение результатов работы

Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры внутренних болезней, неврологии и психиатрии и кафедры постдипломного образования и поликлинической терапии Института медицинского образования Новгородского государственного университета имени Ярослава Мудрого, в работу кардиологического отделения клиники №1, поликлиник №3 и №4 ГОБУЗ «Центральная городская клиническая больница» Великого Новгорода.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 119 листах машинописи, состоит из введения, 5 глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследования, результатов исследования и их обсуждение, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, состоящего из 220 источников, в том числе 119 на русском языке и 101 - на иностранном. Работа иллюстрирована 2 таблицами и 29 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Методология и методы исследования

Характеристика участников клинического блока исследования.

Обследовано 106 больных с АГ II степени (по классификации ЕОК/ЕОАГ, 2007), из них 65 женщин (средний возраст 50,1±1,2 лет) и 41 мужчина (средний возраст 49,7±1,4 лет). Условиями включения больных в исследование также являлись отсутствие признаков сердечной недостаточности и сопутствующих заболеваний, способных оказать влияние на структурно-функциональное состояние миокарда, и отсутствие регулярной антигипертензивной терапии.

Все больных АГ обследованы по общепринятой методике в условиях городской поликлиники №3 и Новгородской областной клинической больницы Великого Новгорода с целью исключения симптоматической АГ.

Некоторым больным (21 человек) выполнено исследование диастолической функции левого желудочка в утреннее (8.00) и вечернее время (19.00). Также хронодиагностика диастолической функции ЛЖ проводилась у 15 здоровых лиц.

Методы клинического блока исследования. В работе использованы следующие методы исследования:

1. Метод эхокардиографии и допплерэхокардиографии на аппарате «Phillips HD3» (США) в М- и В-режимах, в стандартных эхокардиографических позициях для исследования структурно-функционального состояния миокарда с определением показателей: фракция выброса (ФВ, %), конечно-диастолический, конечно-систолический размеры левого желудочка (КДР, мм; КСР, мм), конечно-диастолический и конечно-систолический объемы левого желудочка (КДО, мл; КСО, мл). Измерялась толщина межжелудочковой перегородки (МЖП, мм) и задней стенки левого желудочка (ЗСЛЖ, мм),

относительная толщина стенок (ОТС) рассчитывалась по формуле: ОТС=(МЖП+ЗСЛЖ)/КДР). Масса миокарда левого желудочка (ММЛЖ) рассчитывалась по формуле (Devereux R. et al., 1977):

ММЛЖ=1,04х[(МЖП+ЗСЛЖ+КДР)3-(КДР)3]-13,6 (Пенсильванская

конвенция).

Индекс массы миокарда левого желудочка (ИММЛЖ) рассчитывался по отношению ММЛЖ к площади поверхности тела. ИММЛЖ считается нормальным при значении менее 134 г/м2 для мужчин и менее 110 г/м2 для женщин (Devereux R. et al., 1984; Hammond I.W. et al., 1986).

ДФЛЖ определялась в режиме импульсного допплера из верхушечной позиции. Время изоволюмического расслабления левого желудочка было не менее 65 мсек. По характеру трансмитрального потока определялись: максимальная скорость кровотока в период раннего наполнения левого желудочка (Е, м/сек), и максимальная скорость кровотока в период позднего наполнения ЛЖ за счет систолы предсердий (А, м/сек). За основу взят показатель их отношения (E/A). Диастолическая функция ЛЖ оценивалась в покое и на фоне холодовой пробы. При показателе Е/А<1 в покое и на фоне ХП регистрировался органический тип диастолической дисфункции левого желудочка. В тех случаях, когда в покое показатель E/A был больше 1, а при ХП меньше 1, или в случае регистрации E/A менее 1 в покое и более 1 на фоне ХП - регистрировали функциональный тип ДЦЛЖ.

2. Для изучения функций вегетативной нервной системы использовался:

а) метод вариационной интервалометрии (Баевский P.M. и др., 2001, 2002). Запись ритмограммы проводилась в состоянии покоя и при холодовой пробе. Определялись следующие параметры: мода (Мо, сек) — наиболее часто встречающееся значение кардиоинтервала; амплитуда моды (АМо, %) - число значение интервалов R-R, соответствующих Мо; вариационный размах (BP, сек) - разница между максимальным и минимальным значением кардиоинтервалов; коэффициент монотонности (КМ) - рассчитывается по формуле КМ=АМо(%)/ВР; индекс напряжения (ИН), характеризующий активность механизмов симпатической регуляции, состояние центрального контура регуляции (Баевский P.M. с соавт., 2001), рассчитывается по формуле: ИН=АМо/Мо*ВР.

б) Спектральный метод анализа вариабельности сердечного ритма (ВСР). Определялись следующие параметры - низкочастотная составляющая компонента (медленные волны 2 порядка, МВ2), характеризующая активность симпатического отдела вегетативной нервной системы и высокочастотная компонента (большие волны, БВ), за формирование которых ответственна эфферентная парасимпатическая активность и их соотношение - МВ2/БВ (Баевский P.M. и др., 2001).

Была использована холодовая нагрузочная проба, которая выполнялась путем погружения кисти правой руки в воду с кусочками льда на 1 минуту.

Материал исследования экспериментального блока.

Экспериментальные исследования были проведены на крысах самцах линии Вистар, сопоставимых по возрасту и массе, в соответствии с Европейской конвенцией о защите животных, используемых в эксперименте (Директива 86/609/ЕЕС).

Острый опыт проводился на 3 сериях крыс, по 20 крыс в каждой серии, сопоставимых по возрасту и массе.

Во всех сериях эксперимента препараты вводились однократно интраперитонеально: I серия крыс - адреналин (из расчета 50мкг/кг), II серия -прозерин (20мг/кг), III серия — одновременное введение адреналина и прозерина (50мкг/кг и 20мг/кг, соответственно). В I, II и III серии эксперимента через 2, 6 и 24 часа и через 1 месяц после введения препаратов под эфирным наркозом проводилась декапитация и забор материала. В контрольную серию вошли 20 крыс, соответствующего возраста и массы, которые в течение месяца содержались в обычных условиях без медикаментозного и стрессового воздействий.

Методы исследования экспериментального блока.

После забора материала проводилось определение на торсионных весах массы миокарда левого желудочка (ММЛЖ) и правого желудочков (ММПЖ), расчет индекса массы миокарда (масса миокарда/масса крысы, мг/г) каждого желудочка. Кусочки тканей фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в парафин. Парафиновые срезы для морфологического исследования окрашивали гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону. С помощью сетки Г.Г. Автандилова проводилась морфометрия в 45 полях зрения в каждом желудочке в каждой серии эксперимента. Оценивалось содержание (в объемных процентах, об.%) коллагена.

Иммуногистохимические исследования проводились в срезах ткани, полученных из залитого в парафин материала с использованием автоматической установки для иммуногистохимического и иммуноцитологического окрашивания препаратов Autostainer 360 (Thermo Shandon, Великобритания). Использовались мышиные моноклональные антитела к TGF-ß1 (ТВ21) в разведении 1/100, кроличьи поликлональные антитела к FGF-2(147) в разведении 1/400 производства Santa Cruz Biotechnology, Inc., США, кроличьи поликлональные антитела к коллагену I типа производства Sigma (США) в разведении 1/100 без предварительной высокотемпературной обработки срезов, а также полимерная иммуногистохимическая система визуализации EnVision (DAKO, США) в соответствии с рекомендациями производителей реагентов. В качестве оптически плотной метки, визуализирующей продукт иммуногистохимической реакции, использовался диаминобензидин. После проведения иммуногистохимической реакции гистологические препараты докрашивались гематоксилином и заключались под покровные стекла. Учет результатов

иммуногистохимической реакции проводился с использованием светооптического бинокулярного микроскопа AxioscopeAl (Carl Zeiss, Германия), TGF-ßi и FGF-2 - позитивные клетки имели отчетливое коричневое окрашивание. Подсчёт TGF-/^ и FGF-2 - позитивных клеток производился в 18 полях зрения миокарда каждой крысы в равном соотношении между правым и левым желудочками. В каждом поле зрения подсчитывалось количество клеток, экспрессирующих антиген (TGF-/?! или FGF-2) и рассчитывался индекс экспрессии (ИЭ) (в у.е.) - количество клеток, экспрессирующих антиген, на единицу площади (1 мм2) миокарда. Площадь одного поля зрения, с учётом увеличения микроскопа, составляла 0,088 мм2 (из расчёта: длина изображения 0,355 мм, умноженная на ширину изображения 0,248 мм). Так же определялся индекс активности (ИА) эндотелиоциов, который рассчитывался как % эндотелиоцитов, экспрессирующих факторы роста фибробластов от общего количества клеток, экспрессирующих фактор роста фибробластов (TGF-Д или FGF-2) и коллаген I типа (%).

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы «Statistica 6,0». В случае соответствия данных в группах нормальному закону распределения нами применялся t-критерий Стьюдента с учетом поправки Бонферрони. Из методов непараметрической статистики нами использовался критерий у\

Результаты собственных исследования и их обсуждение

Органическая и функциональная диастолическая дисфункция левого желудочка у больных артериальной гипертензией при различных вариантах вегетативного сопровождения стресса и типах ремоделирования сердца. При обследовании больных АГ II ст. ДДЛЖ в состоянии покоя была выявлена у 53,8% женщин и у 46,3% мужчин. Далее было проведено исследование ДФЛЖ на фоне ХП с целью изучения влияния холодового стресса на показатели трансмитрального потока крови. Исследование ДФЛЖ на фоне ХП позволило выделить две группы больных - группу с преимущественно органическим генезом ДДЛЖ, и группу. - с преимущественно функциональным. Так, органическая ДДЛЖ регистрировалась в 43,1% случаев у женщин с АГ II ст. и в 29,3% случаев у мужчин с АГ II ст. (р>0,05). ДДЛЖ функционального характера чаще наблюдалась у мужчин (в 26,8% случаев), тогда как у женщин - в 20% случаев (Х2=3,916; р=0,048).

Исходя из необходимости более раннего выявления функциональных нарушений ДФЛЖ и гипотезы о биоритмологическом изменении значения показателя трансмитрального потока, мы провели исследование ДФЛЖ у части больных дважды в день - в 8 и 19 часов.

Выявлено, что показатель E/A ЛЖ у больных АГ в вечерние часы менялся разнонаправлено. Из 21 больного АГ в 52,4 % случаев данный показатель значимо не менялся. У 28,6 % больных нормальный показатель E/A, зарегистрированный в утреннее время, значительно уменьшался в вечерние

часы и был меньше 1,0. Можно думать, что в связи с изменением вегетативной регуляции сердца вечером у этих больных развивается ДДЛЖ, в основе которой лежит функциональный компонент. Возможно, это связано с усилением симпатических влияний. У 52,4 % больных, у которых утром выявлялась выраженная ДДЛЖ (показатель E/A менее 0,8) в вечернее время показатель E/A увеличился в среднем на 20%, но все же оставался в зоне патологических значений. У 9,5% больных АГ, у которых в утренние часы наблюдалась ДДЛЖ (показатель E/A был в пределах 0,8-1,0), в вечернее время отмечалось увеличение показателя E/A больше 1,0. В данном случае можно говорить о наличии функциональной ДДЛЖ в утренние часы и её восстановлении практически до нормы к вечеру, что, возможно, обусловлено увеличением парасимпатических влияний в вечернее время у этих пациентов. И лишь у 9,5 % больных и утром, и вечером регистрировались нормальные значения показателя E/A. У здоровых лиц при исследовании ДФЛЖ как в утренние, так и в вечерние часы показатель E/A находился в диапазоне нормальных значений (>1).

Данное исследование показало целесообразность использования ХП для выявления различных вариантов ДДЛЖ в клинике, а также проведения исследования ДФЛЖ как утром, так и вечером, что позволяет определить именно тех больных АГ, у которых изменения ДФЛЖ носят еще преимущественно функциональный характер.

В ходе обследования больных АГ выявлены все известные варианты ремоделирования ЛЖ. Оказалось, что мужчин с нормальной геометрией ЛЖ гораздо больше, нежели женщин (56,1 % и 18,5 %, соответственно, р<0,05). Органическая ДДЛЖ у больных АГ мужчин и женщин с нормальной геометрией ЛЖ встречалась примерно с одинаковой частотой (в 30,4% и 25% случаев, соответственно, р>0,05). Также не было выявлено половых различий и по частоте развития функциональной ДДЛЖ у больных АГ П степени (у 25% женщин и у 26,1% мужчин, р>0,05). Таким образом, наличие нормальной геометрии ЛЖ не исключает развитие ДДЛЖ (рис.1). Наличие ДД сердца в отсутствие гипертрофии миокарда связано, по-видимому, со значительными изменениями интерстициального пространства и развитием фиброза миокарда.

Концентрический вариант ремоделирования (концентрическая перестройка и концентрическая гипертрофия) левого желудочка встречался в 52,3% случаев у женщин и в 24,4% у мужчин. При этом органическая ДДЛЖ у женщин (E/A менее 1,0 в покое и при ХП) встречалась в 94,1% случаев, тогда как функциональная лишь в 5,9%. У мужчин с концентрическим вариантом ремоделирования органическая ДДЛЖ встречалась в 40% случаев, а функциональная - в 10% (рис.2).

Таким образом, у больных АГ мужчин преобладает нормальная геометрия ЛЖ, тогда как у женщин - концентрический вариант ремоделирования, приводящий у них к более частому развитию органической ДДЛЖ.

60% ■< 50% У 40% -К 30% -К

20% К

10% 4х

0% ¥■—

26,1%

р-0.05

Ш_________

Iшш

25>©% ....................к Функциональная ДДЛЖ

Л

5 Органическая ДДЛЖ

Мужчины

Женщины

Рисунок 1. Распределение вариантов ДДЛЖ по половому признаку при нормальной геометрии ЛЖ

0% ■¥■■■

Больные АГ женщины

-------- ™ Функциональная ДДЛЖ

Органическая ДДЛЖ

Больные АГ мужчины

Рисунок 2. Распределение вариантов ДДЛЖ по половому признаку при концентрическом варианте ремоделирования ЛЖ

При рассмотрении АГ как стресс-обусловленного заболевания обычно в литературе упоминают активацию САС и ренин-ангиотензин-альдостероновую систему и их неблагоприятное влияние на миокард. Данные о значении парасимпатической вегетативной нервной системы единичны, и в целом её значение при стрессе практически не изучено вследствие отсутствия адекватных методологических подходов. В связи с этим мы решили

исследовать разные варианты ДДЛЖ в зависимости от вегетативной реакции на холодовой стресс.

При исследовании вариантов диастолической функции у больных АГ при различном вегетативном сопровождении холодового стресса выявлено, что органический вариант ДДЛЖ чаще наблюдался у мужчин с симпатической вегетативной реакцией на ХП, нежели у мужчин с парасимпатической реакцией. Кроме того, частота выявления органической ДДЛЖ у мужчин с симпатическим сопровождением холодового стресса превышает данные значения у женщин с аналогичной вегетативной реакцией (рис. 3). У больных с парасимпатическим сопровождением стресса нередко встречается органическая ДДЛЖ, что может свидетельствовать о самостоятельном вкладе парасимпатического звена вегетативной нервной системы в процессы кардиального фиброгенеза (рис. 4).

100%

80%

р<(),05

60% 55,6%

36,4%

Органическая ДД

40%

Функциональная ДД

20%

0,0%

4,5%

0%

Мужчины

Женщины

Рисунок 3. Распределение различных типов ДДЛЖ у мужчин и женщин больных АГ при симпатическом сопровождении холодового стресса

50% | 40% Г

30% Г

20%

10% Г

{

0% -к

; 17-6

р<0,05

Мужчины

р<0,05

29,4Ш

5,9%

Женщины

5 Органическая ДД

Функциональная ДД

Рисунок 4. Распределение различных типов ДДЛЖ у мужчин и женщин больных АГ при парасимпатическом сопровождении холодового стресса

Фиброзная сеть миокарда левого и правого желудочков крыс линии Вистар при моделировании адренергического, холинергического и смешанного варианта острого стресса. Как выше упоминалось, возможности исследования структуры миокарда и её изменений при стрессе в клинике очень ограничены. Поэтому нами проведено экспериментальное исследование на крысах линии Вистар, в котором мы изучили влияние трех моделей острого стресса (адренергического, холинергического и смешанного) на структуру соединительнотканного компонента миокарда и сопоставили полученные результаты с нашим клиническим исследованием. Под воздействием адреналина в левом и правом желудочках (ПЖ) значительно увеличилась плотность коллагена уже через 2 часа после введения препарата (рис. 5). Через 2 часа после введения препарата увеличение плотности коллагена связано, вероятнее всего, с отеком. Под влиянием прозерина через 2 часа плотность коллагена также увеличилась, но в меньшей степени (рис. 6). Через 6 часов плотность коллагена оставалась высокой в обоих желудочках как под влиянием адреналина, так и под влиянием прозерина. Через 6 часов увеличение плотности коллагена связано, помимо отека, с появлением нитей коллагена. При исследовании влияния смешанного варианта острого стресса (совместного введения адреналина и прозерина) на миокард крыс обнаружено, что как в левом, так и в правом желудочках отмечалось увеличение плотности коллагена примерно в равной степени, при этом максимальные показатели выявлялись

уже спустя 2 часа от начала действия препаратов, оставаясь на сопоставимом уровне и через 6 и 24 часа.

об.%

Контроль 2 часа 6 часов 24 часа * - различия достоверны по сравнению с контролем (р<0,05)

Рисунок 5. Изменение плотности коллагена под влиянием адреналина в левом и правом желудочках об.%

Контроль 2 часа 6 часов 24 часа * - различия достоверны по сравнению с контролем (р<0,05)

Рисунок 6. Изменение плотности коллагена под влиянием прозерина в левом и правом желудочках

Интересно, что даже спустя месяц после однократного введения препаратов содержание коллагена достоверно превышало показатели

контрольной серии при всех вариантах стресса, но в большей степени при смешанном варианте стресса (рис. 7).

об.%

са 30 я

Щ

<§ 25

о ы и к я

9 15 р.

о о

и

20

10

р<0,05

р<0,05

0,83

15»6214,94

..р<0,05...

.......13,:

10,79

шлж ж ПЖ

Контроль Смешанный стресс Адренергический Холинергический

стресс стресс

* - различия достоверны по сравнению с контролем (р<0,05) ** - различия достоверны между собой (р<0,05)

Рисунок 7. Изменение плотности коллагена в желудочках сердца спустя месяц при моделировании различных вариантов острого стресса

Учитывая полученные результаты, можно предположить, что развитие избыточной жёсткости миокарда у людей возможно не только в случае наличия выраженной гиперсимпатикотонии (как это обычно и рассматривается), но и, вероятно, при ваготонии. Последнее утверждение полностью согласуется с полученными нами ранее клиническими данными при сопоставлении вегетативного профиля пациентов с показателями диастолической функции сердца как одного из главных косвенных маркёров фиброза миокарда.

Роль эндотелия и значение факторов роста фибробластов (ТСР-^В) и КСР-2) при фибропластическом процессе в миокарде экспериментальных животных при остром стрессе. Патогенез фиброза миокарда при АГ сложен и до конца не изучен, но именно в его раскрытии заключается будущий секрет эффективности терапии этого патологического процесса. Поскольку, как показали результаты нашего экспериментального исследования, избыточное развитие соединительной ткани в миокарде возможно как при адренергическом, так и при холинергическом стрессе, можно предположить, что патогенетические механизмы фиброза несколько различаются при этих вариантах стресса.

В развитии фиброза миокарда, как указывалось выше, задействованы многочисленные агенты, однако на сегодняшний день известно, что факторы роста фибробластов (ТОР-^и и РОР-2) играют решающую роль в активации фибробластов с дальнейшим накоплением коллагена в интерстиции. Однако в доступной нам литературе к настоящему моменту отсутствуют данные о четкой роли каждого из факторов роста при развитии фиброза миокарда у больных АГ, также нет полного понимания их возможного взаимовлияния в ходе фибропластического процесса, кроме этого представляют интерес и возможные отличия в экспрессии факторов роста фибробластов в зависимости от типа острого стресса.

0:3

—УУ.декс сильной экс.-сессцк средней эмпрехм |

ж

£ 80

= 70

I 60

2 часа 6 часоа 24 чзса 1 месяц

[*■♦■-Индекс сильной зкспресс-иц Индекс средней аспрессии

*- различия достоверны между собой в соответствующих контрольных точках при разных моделях стресса (р<0,05)

Рисунок 8. Индекс экспрессии ТОР-/3>1 в левом желудочке при адренергическом варианте стресса

Рисунок 9. Индекс экспрессии TGF-.pi в левом желудочке при холинергическом варианте стресса

В ходе экспериментального исследования было выявлено, что даже однократное введение адреналина и прозерина крысам приводит к выраженной экспрессии факторов роста фибробластов. Было выявлено, что выраженность экспрессии факторов роста неодинакова при разных моделях острого стресса. Показано, что экспрессия более выражена при

моделировании холинергического острого стресса (рис. 8-11), тогда как активность РОР-2 в большей мере была выявлена при адренергическом варианте острого стресса (рис. 12-15).

6 часов 24 часа

-/Ущехс сильной ак-пресс!* ■ ■•-■»-■••Инде-«, средне-') экспрессии

—Инд?«: сильной экспрессии Индекс средней экспресс г

■ различия достоверны между собой в соответствующих контрольных точках при разных моделях стресса (р<0,05)

Рисунок 10. Индекс экспрессии ТСИ-]^ в правом желудочке при адренергическом варианте

стресса

Рисунок 11. Индекс экспрессии ТвР-^ в правом желудочке при холинергическом варианте

стресса

2 чаев 6 часов 24 час« 1 месяц

сильно» аспреосци --••■у----Ииде:з: средней аспрессии1

*- различия достоверны между собой в соответствующих контрольных

точках при разных моделях стресса (р<0,05) Рисунок 12. Индекс экспрессии Рисунок 13. Индекс экспрессии РОР-2 в левом желудочке при РОР-2 в левом желудочке при адренергическом варианте холинергическом варианте стресса стресса

s

i го

|

5 16

i

I 10

S 5

° 0

| « Индекс сильной экспрессии *№»Индекг средней экспрессии

—Икаекс сильной arenpecctw ••■•»••ЧЧндехс средней экспрессии

*- различия достоверны между собой в соответствующих контрольных точках при разных моделях стресса (р<0,05) Рисунок 14. Индекс экспрессии Рисунок 15. Индекс экспрессии FGF-2 в правом желудочке при FGF-2 в правом желудочке при адренергическом варианте стресса холинергическом варианте стресса

Как известно, основными регуляторами фибропластического процесса являются в нормальных условиях фибробласты, а также миофибробласты в условиях патологии (Dixon I., 2012). Однако известно, что эндотелиоциты кровеносных сосудов миокарда играют значительную роль в развитии миокардиального фиброза. Эндотелиоциты вырабатывают факторы роста фибробластов. Экспрессия эндотелиоцитами фактора роста FGF-2 влияет на активацию фибробластов, вырабатывающих TGF-уЗ/, который является одним из основных регуляторов кардиофиброза.

Известно, что одним из самых радикальных изменений эндотелиоцитов является эндотелиально-мезенхимальная трансформация при патологических процессах, в результате которой эндотелиоциты дополняют пул фибробластов миокарда.

В связи с этим весьма интересным представляется изучение роли эндотелиоцитов в формировании фиброза миокарда при остром стрессе. В процессе анализа полученных данных были выявлены эндотелиоциты, экспрессирующие факторы роста фибробластов TGF^/3-i и FGF-2. Помимо макрофагов, фибробластов в фибропластическом процессе участвуют эндотелиоциты, экспрессирующие как факторы роста фибробластов, так и коллаген I типа. При моделировании как адренергического, так и холинергического стресса (АС и ХС) обнаружена активность эндотелия в отношении синтеза факторов роста фибробластов. При этом, если экспрессия FGF-2 при обоих вариантах стресса была выражена практически одинакова и составляла 1-7 кл./мм.^ в обоих желудочках, то экспрессия трансформирующего фактора не была так равномерно представлена в контрольных точках в ЛЖ и ПЖ.

Его экспрессия была в большей степени выражена в ЛЖ при обоих вариантах стресса, в ПЖ синтетическая активность эндотелиоцитов была выражена при холинергическом варианте стресса через 24 часа и через 1 месяц. Через 1 месяц при АС не было выявлено активности эндотелия в отношении синтеза ТСР-Д, при этом при ХС через 1 месяц она оставалась значимой, что может говорить о продолжающемся вкладе эндотелия в фибропластический процесс.

При иммуногистохимическом исследовании выявлена коллаген-синтетическая активность эндотелиоцитов, причем уже начиная с контрольной точки «2 часа», что, возможно, свидетельствует о начавшейся эндотелиально-мезенхимальной трансформации, при этом отмечается продолжающаяся активность эндотелиоцитов и спустя месяц после однократного введения препаратов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, выявлены разные типы ДДЛЖ (функциональный и органический) у больных АГ, показана целесообразность применения ХП и хронодиагностики ДДЛЖ в клинике. Выявлено, что органическая ДДЛЖ диагностируется не только у пациентов с симпатическим сопровождением стресса, но и с парасимпатическим, при этом в ходе экспериментального моделирования острого стресса также было показано, что избыточное развитие коллагена в интерстиции возможно как при адренергическом, так и при холинергическом стрессах, что указывает на самостоятельное значение парасимпатической нервной системы в отношении патологического фиброза при реагировании на стресс. При иммуногистохимическом исследовании выявлены различия в экспрессии факторов роста фибробластов в зависимости от типа стресса, что может указывать на некоторые отличия в патогенетических механизмах формирования фиброза при разных моделях стресса, кроме того установлена активность эндотелиоцитов в отношении экспрессии факторов роста и коллагена I типа, что указывает, возможно, на существенный вклад эндотелия сосудов миокарда в избыточное накопление коллагена при стрессе.

ВЫВОДЫ

1. Исследование ДФЛЖ у больных АГ в покое и на фоне ХП позволило выявить 2 варианта ДДЛЖ: органический и функциональный. Органическая ДДЛЖ регистрировалась в 43,1% случаев у женщин и в 29,3% случаев у мужчин (р>0,05). ДДЛЖ функционального характера чаще наблюдалась у мужчин (в 26,8% случаев), чем у женщин - в 20% случаев (х2=3,916; р=0,048). Исследование ДФЛЖ у больных АГ в различное время суток позволяет выявить больных с начальными, функциональными, нарушениями ДФЛЖ.

2. У больных АГ выявлены все варианты ремоделирования сердца, при этом нормальная геометрия ЛЖ достоверно чаще встречается у мужчин в сравнении с женщинами. Наличие ДДЛЖ (как функциональной, так и органической) нередко встречается и при наличии нормальной геометрии ЛЖ.

Концентрический вариант ремоделирования сердца (концентрическая перестройка и концентрическая гипертрофия) был выявлен у 52,3% женщин и у 24,4% мужчин. При этом варианте ремоделирования в большинстве случаев развивается органическая ДЦЛЖ (в 94,1% случаев у женщин и 40% - у мужчин)

3. При исследовании вариантов ДФЛЖ у больных АГ II ст. с различным вегетативным сопровождением холодового стресса выявлено, что органический вариант ДДЛЖ чаще (в 55,6% случаев у мужчин и в 36,4% - у женщин) встречается при симпатической вегетативной реакции больных на ХП. Установлено, что и у больных с парасимпатическим сопровождением стресса возможно развитие органической ДДЛЖ (в 17,6% случаев у мужчин и в 29,4% - у женщин).

4. При экспериментальном моделировании адренергического, холинергического и смешанного вариантов острого стресса отмечено выраженное развитие коллагена в миокарде при всех трех вариантах. Максимально выраженный фиброз миокарда развивался при моделировании смешанного варианта острого стресса. Выраженное увеличение содержания коллагена при преобладании холинергических влияний острого стресса свидетельствует о значимом вкладе не только симпатической, но и парасимпатической нервной системы в накопление интерстициального коллагена при стрессе.

5. Иммуногистохимическое исследование с определением содержания факторов роста фибробластов в миокарде экспериментальных животных показало, что выраженность экспрессии факторов роста неодинакова при разных моделях острого стресса. Экспрессия ТСР-Д более выражена при моделировании холинергического острого стресса, тогда как активность РвР-2 в большей мере была выявлена при моделировании адренергического варианта острого стресса.

6. При моделировании как адренергического, так и холинергического стресса обнаружена активность эндотелия в отношении синтеза факторов роста фибробластов. При этом, если экспрессия РОР-2 при обоих вариантах стресса была выражена практически одинакова в обоих желудочках, то экспрессия трансформирующего фактора не была так равномерно представлена в контрольных точках 2 ч. - 6 ч. - 24 ч. - 1 мес. в ЛЖ и ПЖ. Его экспрессия была в большей степени выражена в ЛЖ при обоих вариантах стресса в первые 24 часа. В ПЖ синтетическая активность эндотелиоцитов была выражена при холинергическом варианте стресса в большей степени через 24 часа и через 1 месяц.

7. При иммуногистохимическом исследовании выявлена коллаген-синтетическая активность эндотелиоцитов, причем уже начиная с контрольной точки «2 часа» при обоих вариантах стресса, что свидетельствует о начавшейся эндотелиально-мезенхимальной трансформации под влиянием

При этом отмечается продолжающаяся активность эндотелиоцитов спустя месяц после однократного введения препаратов.

Практические рекомендации

1. Рекомендовано проводить исследование диастолической функции ЛЖ у больных АГ в клинической практике не только в утреннее, но и в вечернее время суток с целью выявления ранних её нарушений и своевременного начала терапии выявленной диастолической дисфункции.

2. Исследование диастолической функции ЛЖ у больных АГ рекомендуется выполнять не только в покое, но и при холодовой пробе для определения функциональной и органической дисфункции.

3. Проведённое исследование демонстрирует необходимость оценки вегетативного профиля в клинической практике у больных АГ в покое и при холодовой пробе, что позволит выявить в ходе медикаментозной терапии выраженный вегетативный дисбаланс в виде гиперактивности симпатической нервной системы или появления ваготонической реакции на стресс.

Перспективы дальнейшей разработки темы

Выполненное исследование раскрывает дальнейшие перспективы для научного поиска в рамках изучения влияния стресса на состояние миокарда у больных АГ. На сегодняшний день очевидно, что механизмы реализации ответа на стресс всё еще далеки от полного понимания. Участие вегетативной нервной системы при формировании реакции на стрессорное воздействие изучено недостаточно, что обусловливает необходимость дальнейшего её исследования, как в клинике, так и в условиях эксперимента на животных. Также вызывает интерес дальнейшее изучение механизмов ремоделирования сердца и его соединительнотканного компонента при АГ в зависимости от состояния вегетативной нервной системы с определением уровня экспрессии коллагена I и Ш типа, ключевых участников фиброгенеза (факторов роста фибробластов, матриксных металлопротеиназ, тканевых ингибиторов матриксных протеиназ). Перспективным представляется изучение особенностей фиброгенеза не только на животных моделях в эксперименте, но и в ходе исследования аутопсийного материала. Учитывая значение роли субклинического воспаления в ремоделировании внеклеточного пространства миокарда при АГ, перспективным будет также и исследование иммунологического статуса в зависимости от состояния вегетативной нервной системы. Несомненно, что успешные научные исследования вышеобозначенных вопросов приведут к более комплексному пониманию проблемы ремоделирования сердца при АГ и появлению более эффективных лекарственных средств, учитывающих состояние иммунологического статуса и вегетативной нервной системы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Жмайлова C.B. Морфоструктурные изменения миокарда крыс под влиянием катехоламинов в условиях острого опыта / С. В. Жмайлова, М. П. Рубанова, П. М. Губская, В. Е. Горицына, Ж. А. Горностаева, В. С. Бондаренко // Клин. мед. Вопр. клиники, диагностики, профилактики и лечения. Межвузовский сборник стран СНГ. Великий Новгород-Алматы. -2007.-Т. 15.-С. 88-92.

2. Жмайлова C.B. Обратное развитие структурных изменений миокарда левого и правого желудочков сердца крыс линии Вистар при моделировании острого стресса с преимущественной активацией холинергический влияний / С. В. Жмайлова, М. П. Рубанова, В. Р. Вебер, П. М. Губская, В. С. Бондаренко // Вестн. Рос. воен.-мед. акад., приложение, часть 1 (Материалы IX Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении», 21-22 апреля 2009). - 2009. - №1(25). - С. 344-345.

3. Рубанова М.П. Ремоделирование левого и правого желудочков сердца при трех различных моделях острого стресса в эксперименте / М.П. Рубанова, В.Р. Вебер, C.B. Жмайлова, П.М. Губская, Л.Г. Прошина, Т.М. Нуржанова, B.C. Бондаренко // Клин. мед. Вопросы клиники, диагностики, профилактики и лечения. Межвузовский сборник стран СНГ. Великий Новгород-Алматы. -2009.-Т. 17.-С 55-58.

4. Рубанова М.П. Адаптация и дезадаптация к холодовому стрессу / М.П. Рубанова, В.Р. Вебер, C.B. Жмайлова, А.И. Виноградов, B.C. Бондаренко //Артериал. Гипертенз., прилож. №2. (материалы П Международного конгресса «Артериальная гипертензия от Короткова до наших дней»), - 2009. -Т. 15.-С. 93-94.

5. Жмайлова C.B. Зависимость показателя E/A диастолической функции левого и правого желудочков сердца от гемодинамических и вегетативных показателей у больных артериальной гипертензией женщин / C.B. Жмайлова, М.П. Рубанова, В.Р. Вебер, B.C. Бондаренко // Кардиоваск. тер. и профил., приложение 1 (материалы Российского национального конгресса кардиологов «Кардиология: реалии и перспективы»). - 2009. — № 8(6). - С. 133.

6. Рубанова М.П. Три модели острого стресса и отдаленные последствия структурных изменений миокарда крыс линии Вистар / М.П. Рубанова, В.Р. Вебер, C.B. Жмайлова, П.М. Губская, Т.М. Нуржанова, B.C. Бондаренко // Научные труды X международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке» «Инновационные технологии в биологии и медицине». - М.: РУДН, 2009.-С. 823.

7. Weber V.R. Biorythmological changes of endothelial function at patients with arterial hypertension / V.R. Weber, I.A. Suhenko, V.S. Bondarenko, A.S. Diakov, E.K. Antonov //14th Congress of the Internetional Society for Holter and NoninvasiveElectrocardiology (ISHNE2011). -M., 2011.-C. 180-181.

8. Жмайлова C.B. Частота органической и функциональной диастолической дисфункции левого желудочка у больных артериальной гипертензией II степени с нормальной массой миокарда левого желудочка / C.B. Жмайлова, М.П. Рубанова, В.Р. Вебер, П.М. Губская, B.C. Бондаренко, И.А. Сухенко // Материалы Российского национального Конгресса кардиологов.-2011.-С. 116.

9. Рубанова М.П. Жесткость миокарда у больных АГ женщин с концентрическими вариантами ремоделирования ЛЖ / М.П. Рубанова, В.Р. Вебер, C.B. Жмайлова, П.М. Губская, B.C. Бондаренко // Материалы Российского национального Конгресса кардиологов. — 2011. - С. 273.

10. Рубанова М.П. Диастолическая дисфункция левого желудочка у больных артериальной гипертензией с различными вариантами вегетативного сопровождения холодового стресса / М.П. Рубанова, В.Р. Вебер, C.B. Жмайлова, П.М. Губская, B.C. Бондаренко, А.И. Виноградов // Материалы Российского национального Конгресса кардиологов. — 2011. - С. 273—274.

11. Бондаренко B.C. Объемная фракция интерстициального коллагена и диастолическая функция / В. С. Бондаренко [и др.] // Кардиология в Беларуси. -2011.-№5.-С. 54-55.

12. Рубанова М.П. Отдаленные последствия структурных изменений миокарда при одновременном введении прозерина и преднизолона в остром эксперименте / М.П. Рубанова, В.Р. Вебер, В.Е. Карев, C.B. Жмайлова, B.C. Бондаренко // Материалы VIII Всероссийского конгресса «Артериальная гипертония: от А.Л. Мясникова до наших дней». - Москва, 2012. - С 53-54.

13. Zhmailova S.V. Long-term effects of myocardial structural changes owing yo experimental stress / S.V. Zhmailova, M.P. Rubanova, V.R. Weber, V.E. Karev, P.M. Gubskaya, V.S. Bondarenko // Abstracts ESH SATELLITE SYMPOSIUM "RESISTANT HYPERTENSION". St. Petersburg, Russia, 24-26 May. - 2012. - P. 27.

14. Weber V.R. Structural changes of heart in experimental animals in modeling of different versions of acute stress and opportunities for medical correction / V. R. Weber, P. M. Gubskaya, V. S. Bondarenko // Vestnik of Novgorod State University. - 2011. - №62. - C. 39-43.

15. Бондаренко В. С. Ремоделирование миокарда под влиянием преднизолона и возможности превентивного действия преднизолона при моделировании различных вариантов острого стресса в эксперименте / В. С. Бондаренко, Н. А. Кулик, M. Е. Евсеев // Вестн. Новгородского гос. универ. - 2012. - №66. - С. 78-83.

16. Рубанова М. П. Органическая и функциональная диастолическая дисфункция левого желудочка у больных артериальной гипертензией при разных вариантах вегетативного сопровождения стресса и типах ремоделирования сердца / М. П. Рубанова, В. Р. Вебер, С. В. Жмайлова, П. М. Губская, В. С. Бондаренко, В. С. Виноградов // Рос. мед. журн. - 2012. -№3. - С. 7-9.

Перечень используемых сокращений

FGF - fibroblast growth factor

TGF - transforming growth factor

A - скорость кровотока во время систолы предсердий

АГ - артериальная гипертензия

АМо - амплитуда моды

АС - адренергический стресс

БВ - большие волны

ВНС - вегетативная нервная система

BP - вариационный размах

ВСР - вариабельность сердечного ритма

ГЛЖ - гипертрофия левого желудочка

ДДЛЖ - диастолическая дисфункция левого желудочка

ДФЛЖ - диастолическая функция левого желудочка

Е - скорость кровотока в период раннего наполнения

Е/А - показатель отношения скорости кровотока в период раннего наполнения к скорости кровотока во время систолы предсердий ЗСЛЖ - задняя стенка левого желудочка ИА - индекс активности

ИММЛЖ - индекс массы миокарда левого желудочка

ИН-индекс напряжения

ИЭ - индекс экспрессии

КДО - конечно - диастолический объем

КДР - конечно-диастоличский размер

КМ - коэффициент монотонности

КСО - конечно-систолический объем

КСР - конечно-систолический размер

ЛЖ - левый желудочек

МВ2- медленные волны 2 порядка

МЖП- межжелудочковая перегородка

ММЛЖ - масса миокарда левого желудочка

ММПЖ - масса миокарда правого желудочка

Мо - мода

ОТС - относительная толщина стенок

ПЖ - правый желудочек

ПНС - парасимпатическая нервная система

САС - симпатоадреналовая система

ФВ - фракция выброса

ХП - холодовая проба

ХС — холинергический стресс

Подписано к печати 28.08.2013. Формат 60x84/16 Усл. печ. л. 1,86 Тираж 100 экз. Заказ X® 1120 Отпечатано в типографии ООО «Литера » ИНН 5321015720 173003,Великий Новгород, ул. Б. Санкт-Петербургская,39 тел/факс (8162) 33-89-58