Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Реконструкция костной ткани с использованием скелета натуральных кораллов Acropora cervicornis у больных с доброкачественными образованиями костей (экспериментально-клиническое исследование)

На правах рукописи

Мыслевцев Игорь Валерьевич

Реконструкция костной ткани с использованием скелета натуральных кораллов Асгорога сетсогшБ у больных с доброкачественными образованиями костей (экспериментально-клиническое исследование)

14.01.12 - онкология 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

-1 ДЕК 2011

Москва-2011

005003463

Работа выполнена в Федеральном Государственном Бюджетном учреждении «Московский научно-исследовательский

онкологический институт имени П.А.Герцена» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, (директор - академик РАМН, профессор В.И. Чиссов)

Научные руководители:

доктор медицинских наук Тепляков Валерий Вячеславович

доктор биологических наук, профессор Сергеева Наталья Сергеевна

Официальные оппоненты:

Заведующий отделением вертебральной хирургии (№9) РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН

доктор медицинских наук Мусаев Эльмар Расимович

Руководитель группы нейрогенетики и генетики развития, Институт Биологии Гена РАН

доктор биологических наук Павлова Галина Валерьевна

Ведущая организация:

ФГУ «РНЦ Рентгенорадиологии» Минздравсоцразвития России

Защита диссертации состоится «20» декабря 2011 г. в «-/V » часов на заседании диссертационного совета Д 208.047.01 при «ФГБУ МНИОИ им. П.А.Герцена» (125284, Москва, 2-й Боткинский проезд, д.З)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «МНИОИ им. П.А.Герцена» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан » ноября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук Завалишина Лариса Эдуардовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность: Применение методов и принципов реконструктивно-пластической хирургии

при опухолевых поражениях костей позволило расширить показания к органосохранняющим

оперативным вмешательствам. В настоящее время для реконструкции костей используется

несколько типов имплантатов, основные достоинства и недостатки которых сравнительно

хорошо изучены и описаны. Так, в частности, применение костных аутотрансплантатов

("золотой стандарт") в ряде случаев ограничено размерами дефекта и необходимостью

дополнительного оперативного вмешательства для его забора; применение костных

аллотрансплантатов осложняется развитием аллергических реакций и реакций отторжения

[Бранд Я.Б. 1984, Ковалев В.И. 2001]. Преимуществом применяемых кальций-фосфатных

керамических аллотрансплантатов является высокая степень биосовместимости, а

недостатком - низкая скорость биорезорбции и недостаточная прочность [Баринов С.М.

2006, Деев Р.В. 2006, Чиссов В.И. 2008]. Металлические имплантаты обеспечивают

прочностные характеристики при реконструкции костной ткани, однако их сравнительно

низкая биосовместимость заставляет исследователей в последние годы разрабатывать

способы модификации или биологической активации их поверхности. Таким образом,

несмотря на всю широту спектра имплантатов для костной пластики, на сегодняшний день

ни один из них не отвечает всем требованиям современной реконструктивной хирургии.

Существующая ситуация делает актуальными разработки и поиск современных биосовместимых остеопластических материалов. Оптимальные материалы для реконструкции кости должны обладать целым комплексом свойств: остеоиндуктивностью, высокой скоростью резорбции, структурностью (степень пористости, размер пор, степень их взаимосвязи), необходимым микрорельефом поверхности (шероховатость и т.д.). Эти свойства обеспечивают адекватную адгезию клеток и последующую их экспансию, дифференцировку, а также васкуляризацию имплантата и его консолидацию с прилежащей костной тканью. В последние годы в качестве трансплантантов внимание исследователей все чаще привлекают материалы природного происхождения и, в частности, скелет натуральных кораллов (НК).

Уникальные механические свойства кораллов во многом определяются химическим составом (на 98% скелет НК представлен кальцитом - СаСОз, кристаллическая решетка - арагонит), развитой поверхностью и высокой степенью пористости. По предварительным результатам зарубежных экспериментальных исследований кораллы обладают остеоиндуктивными свойствами разной степени выраженности [Ma Q.2000, Terheyden Н. 2001, Knackstedt М.А. 2006], хотя детальные их исследования как остеозамещающего материала в литературе отсутствуют. Поэтому биологическая аттестация в экспериментах in vitro и in vivo и клиническая апробация скелета коралла Acropora cervicornis как остеозамещающего материала является перспективной и актуальной задачей.

Цель и задачи исследования: Медико-биологические испытания биоматериалов на основе скелета коралла Acropora cervicomis для восстановления костной ткани при реконструктивно-пластических операциях в онкологии у больных с доброкачественными (энхондрома, остеоид-остеома и т.д.) и опухолеподобными (аневризмальная киста, фиброзная дисплазия и т.д.) процессами.

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи.

1. Оценить in vitro цитотоксичность и матриксные для клеток свойства спектра

натуральных кораллов.

2. Исследовать in vivo биосовместимость натуральных кораллов в подкожном тесте у мышей.

3. Оценить in vivo в динамике на мелких лабораторных животных способность натуральных кораллов восстанавливать костную ткань.

4. Разработать модель замещения кости натуральными кораллами у крупных лабораторных животных и оценить их остеозамещающие свойства.

5. Разработать протокол ограниченного клинического исследования натуральных кораллов как остеозамещающих материалов у больных с доброкачественными

образованиями костной ткани.

6. Оценить результаты клинического исследования натуральных кораллов в динамике

наблюдения. Положения выносимые на защиту:

1. Все испытанные образцы натуральных кораллов не токсичны, обладают выраженными

матриксными, адгезивными и остеоиндуктивными свойствами для мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) in vitro, вызывая экспрессию в этих

клетках генов остеодифференцировки.

2. Натуральные кораллы семейства Acroporidae являются биосовместимыми. В качестве

иплантатов они ускоряют регенеративные процессы, инициируя органотипическое замещение дефектов путем периостального остеогенеза. Скорость биорезорбции этих материалов соответствует скорости неоостеогенеза.

3. В клинической группе сравнения первые признаки резорбции р-трикальцийфосфата

отмечаются через 8-12 месяцев; замещение костного дефекта идет медленно, в основном за счет разрастания соединительной ткани, что свидетельствует о низких остеоиндуктивных свойствах этих кальцийфосфатных материалов.

4. При динамическом наблюдении (к 18-24 месяцам) у всех пациентов основной группы

определяется практически полная резорбция натуральных кораллов (как вышедших в мягкие ткани, так и в зоне имплантации) сопоставимая со скоростью репарации кости и реконструкция костной ткани. Положительным свойством данных имплантатов является

отсутствие формирования вокруг них соединительнотканной капсулы, которая может отграничивать имплантируемые материалы и снижать их остеопластические свойства. Научная новизна: Впервые in vitro с помощью ПЦР-анализа доказаны остеоиндуктивные потенции биоматериала на основе скелета НК: установлена экспрессия в ММСК, культивируемых на коралловом матриксе, гена сиалопротеина, щелочная фосфатаза (ЩФ), коллагена I типа и остеопонтина.

Проведено систематическое исследование морфологической организации, химического и фазового состава скелета природных кораллов.

Впервые выявлены остеопластические свойства скелета натуральных кораллов вида Acropora cervicomis - способность органотипически реконструировать костную ткань как у мелких и крупных лабораторных животных, так и у больных с доброкачественными образованиями костной ткани. Установлено соответствие скорости биорезорбции НК в костном дефекте со скоростью остеогенеза.

Практическая значимость: На основании изучения пористости, прочностных

характеристик, химического состава скелета НК разных видов были выбраны наиболее

подходящие для доклинических медико-биологичских испытаний. Получены данные о

способности НК поддерживать пролиферацию фибробластов человека (ФЧ) и

остеодифференцировку ММСК in vitro, биосовместимости скелета НК, отсутствие у них

токсичности и способность к остеореконструкции у лабораторных животных с

органотипическим замещением коралловых имплантатов костной тканью.

с..

Положительные результаты ограниченных клинических испытаний НК у больных с доброкачественными образованиями костной ткани свидетельствуют о целесообразности расширения сферы применения НК в качестве имплантатов для реконструкции костной ткани при ее патологических состояниях различного генеза.

Внедрение результатов исследования в практику: Реконструкция костной ткани НК у пациентов с доброкачественными и опухоли подобными образованиями костей применяется в отделении онкологической ортопедии ФГУ МНИОИ им. П.А.Герцена Минздравсоцразвития.

Апробация диссертации: Апробация проведена на совместной научной конференции клинических и диагностических отделений МНИОИ им. П.А.Герцена 16 июня 2011г. Публикации: По теме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 3 статьи в центральной (рекомендованной ВАК РФ) печати. В указанных публикациях отражены основные фактические материалы и выводы диссертации. Основные положения диссертационной работы доложены на Всероссийской научной конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии» (г.Москва 2009г., 2010г.). Выступление на секции молодых ученых в рамках международной конференции «Нанотех 2009» удостоено диплома II степени.

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Текстовая часть содержит 37 рисунков и 9 таблиц. Библиографический указатель включает 145 источников (66 отечественных и 79 зарубежных).

Материалы и методы исследования: Согласно разработанному алгоритму испытания НК, на первом этапе в экспериментах in vitro проводили оценку острой токсичности и матриксных для клеток свойств поверхности НК, а также их способности поддерживать пролиферацию ФЧ и дифференцировку ММСК при достижении монослоя. В экспериментах in vivo на мелких и крупных лабораторных животных - исследовали биосовместимость этого материала и его остеозамещающие потенции. В клиническую часть исследования было включено 20 больных с доброкачественными и опухолеподобными заболеваниями костей, которым в отделении «онкологической ортопедии» ФГУ «МНИОИ им П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России в 2006-2010гг. были выполнены 20 оперативных вмешательств.

Подготовка и стерилизация натуральных кораллов.

Очистку НК семейства Acroporidae от мелких органических остатков и от коралловой пыли проводили в несколько этапов. На первом этапе ветви скелета НК подвергали грубой механической очистке далее дополнительно производили ультразвуковую очистку НК (ультразвуковая мойка Finn Sonic m 15, t - 60 "С, 20 минут). После высушивания образцы подвергали механическому измельчению до заданного размера частиц (0,2-0,6мм, 0,6-0,8мм, 0,8-1,2мм, 1,2-1,5мм, 1,-3,0мм, >3,0мм) на планетарной шаровой мельнице РМ 200; затем каждую фракцию частиц НК промывали в течение 3-4 часов в холодной проточной воде. На заключительном этапе частицы НК замачивали на 8 часов при комнатной температуре в дистиллированной воде в соотношении НК/Н20 (по объему) 1:10, заменяя дистиллированную воду каждые 2 часа на свежую порцию, затем высушивали их в сухожаровом шкафу при температуре 50-60°С в течение 8 часов и раскладывали по стеклянным флаконам объемом 10 см'. Далее проводили стерилизацию частиц НК у-облучением в дозе 20-25 кГр на установке РХМ- у -20. На заключительном этапе осуществляли бактериологический контроль стерильности НК (15% образцов из каждой партии, анализатор бактериологический «BioTrack 4250», SY-LAB GmbH, Австрия; анализатор бактериологический «Bactec 9120», Becton Dickinson, США), в соответствии с требованиями.

Исследования in vitro острой цитотоксичностн и матриксных свойств поверхности

образцов НК.

За сутки перед началом опыта стерильные коралловые частицы размером 0,2-0,6 мм помещали в 24-х луночные культуральные планшеты (Costar, США) и заливали полной ростовой средой (ПРС) следующего состава: среда ДМЕМ (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М П.Чумакова, РАМН, Москва), 10% эмбриональной телячьей

сыворотки (ПанЭко, Москва), глютамин (бООмг/л). Каждый образец НК в платах был представлен в триплетах.

Оценку острой цитотоксичность НК и динамики нарастания на них клеток выполнены на клеточной линии иммортализованных нормальных фибробластов человека (ФЧ, клон №1608), полученной из Медико-Генетического научного центра РАМН, г. Москва. Клеточную линию поддерживали в ПРС на основе среды ДМЕМ (см. выше). В экспериментах использовали клетки в логарифмической фазе роста (предконфлюэнтный монослой). Для получения суспензии одиночных клеток монослой ФЧ обрабатывали 0,25% раствором трипсина (Sigma,CШA), затем полученную взвесь клеток тщательно дважды отмывали центрифугированием в большом объеме ПРС, производили их подсчет и оценку жизнеспособности, окрашивая клеточную суспензию 0,04% раствором трипанового синего. Затем в платы с НК (опыт) и без них (контроль) помещали ФЧ (400тыс.кл. на лунку) в объеме 2мл ПРС и инкубировали: для определения острой цитотоксичности в течение 24 часов, для оценки матриксных свойств НК - 3, 7, 10, 14, 17, 21 и 28 суток. Полную замену ПРС. осуществляли дважды в неделю на протяжении первых 10-и суток эксперимента, а далее -вплоть до окончания опыта - ежедневно. Все операции с НК и ФЧ осуществляли в стерильных условиях, культивирование - в атмосфере влажного воздуха, содержащего 5% С02 при 37°С. Жизнеспособность ФЧ в динамике культивирования с НК оценивали с помощью МГТ метода. Для определения цитотоксичности материалов рассчитывали пул жизнеспособных клеток через 24 часа инкубации с ними по формуле:

Пул жизнеспособных клеток (ПЖК) = ОД*„„„ X 100%

ОД контр

(ОД*- оптическая плотность раствора формазана)

При оценке матриксных свойств НК определяли изменение пула ФЧ (А) в каждый конкретный срок по формуле:

ОД,+1-ОДп

А = --х 100%,

ОД„

ОД„»| - величина оптической плотности в конкретный срок, ОД„ - величина оптической плотности в предыдущий срок. Положительная величина пула свидетельствовала о приросте популяции ФЧ, отрицательная -о гибели части популяции.

Исследование остеоинду.шруюших свойств скелета НК как матрикса для культур

ммск.

Этот раздел работы был выполнен совместно с сотрудниками НИЛ генных и клеточных технологий факультета фундаментальной медицины МГУ им М.В. Ломоносова. Для оценки остеогенной дифференцировки ММСК человека была проанализирована транскрипция ряда маркерных генов: Osteoc (остеокальцина), AlcPho (щелочной фосфатазы), ВМР2, Sialopr II (костного сиалопротеина II типа), коллагена 1 типа и остеопонтина.

Источником ММСК человека служила подкожная жировая ткань (9 образцов, возраст доноров 17-64 года), которую получали во время лапаротомии при проведении оперативных вмешательств. Для эксперимента использовали культуры ММСК III (7 обр.) и V (2обр.) пассажей. При индукции остеогенной дифференцировки культуры ММСК III и V пассажей наращивали до состояния монослоя в обычных условиях, а затем культивировали в течении 14 суток в присутствии соответствующих дифференцирующих агентов: 15% Osteogenic Stimulatory Supplements, 3.5mM ß-Glycerophosphate, 10"8M Dexamethasone, 50pg/mL Ascorbic Acid в MesenCult Basal Medium (все реактивы фирмы StemCell Technologies, Канада).

Далее из клеток, культивированных в дифференцировочных условиях, была выделена РНК и методом ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ ПЦР) было проанализировано содержание транскриптов этих генов. Выделение РНК осуществляли с использованием коммерческих реагентов «RNeasy Miny Kit (50)», QIAGEN, США. Выделенную РНК обрабатывали ДНКазой для исключения загрязнений геномной ДНК.

Качество РНК оценивали электрофоретически в агарозном геле, количество -спектрофотометрически. Синтез первых цепей кДНК проводили согласно стандартному протоколу фирмы «Fermentas», используя олигснГГ-праймеры. Реакцию проводили в ПЦР -амплификаторе с горячей крышкой. Все манипуляции проводили в перчатках и в ламинарном

боксе во избежание контаминации.

Для анализа экспрессии генов проводили ПЦР в реальном времени с интернирующим красителем Sybr Green («Синтол», Россия) в амплификаторе «BIO- RAD ÍQ5. Multicolor Real-time PCR detection system». Праймеры к анализируемым генам подбирали

в программе DNASTAR (табл. 1).

ПЦР в реальном времени осуществляли в соответствии со стандартным протоколом фирмы «Синтол». Реакцию проводили с использованием градиента температур (подобранной для каждой пары праймеров - табл. 1). Схема реакции включала: первичную денатурацию (95°С, 5 мин), денатурацию (95°С, 20 сек), от^иг праймеров (59-64°С, 20 сек), элонгацию (72-С, 20 сек - 40 циклов) и плавление продуктов амплификации. Для дополнительного контроля чистоты реактивов и работы проводили контрольную реакцию, в которой присутствовали все компоненты, кроме матрицы. Для ан^иза специфичности амплификации

по окончании ПЦР-РВ проводили плавление продуктов с постоянным анализом флуоресценции и построение кривых плавления.

Таблица 1.

Праймеры к остеогенным маркерным генам

Forward primer Reverse primer T отж. Ампл икон (п.н.)*

Osteoc CACTCCTCGCCCTAT TGGC GCCTGGGTCTCTTCA CTACCT 62.2 138

AlcPho ATGGGATGGGTGTC TCCACA CCACGAAGGGGAACT TGTC 62.5 108

ВМР2 CGTGTCCCCGCGTG CTTCTTAG TGCTGGGGGTGGGTC TCTGTTTCA 62.5 261

Sialopr 11 TGGATGAAAACGAA CAAGGCA AAACCCACCATTTGG AGAGGT 60.4 200

Collagen 1 ATGGATTCCAGTTC GAGTATGGC CATCGACAGTGACGC TGTAGG 62.1 246

Osterix CCTCTGCGGGACTC AACAAC TAAAGGGGGCTGGAT AAGCAT 62.8 112

Osteopontin CTCCATTGACTCGA ACGACTC CAGGTCTGCGAAACT TCTTAGAT 60.2 230

" п.н. - пара нуклеотидов Анализ проводили методом ПЦР в реальном времени, уровень мРНК анализируемых генов выравнивали по отношению к двум генам неизменного уровня экспрессии (house keeping genes) (GAPDH, p-actin), (* - p<0,05, n=12 (количество проанализированных

образцов X количество измерений)).

Для оценки влияния условия культивирования дифференцированных ММСК на матриксе из коралла был также проведен сравнительный анализ транскрипции маркерных генов.

Оценка биосовместимости образцов коралла семейства Acroporidae в экспериментах in

vivo.

Для исследования биосовместимости образцов НК в экспериментах in vivo использовали модель подкожной трансплантации. Для этого крь.сам-самкам линии Wistar весом 180-200г под наркозом (кетамин/реланиум в отношении 1:1, внутрибрюшинно по 0,05мл) делали кожный надрез в области грудного отдела позвоночника. Тупым концом скальпеля кожу отсепаровывали от прилегающего слоя подкожной клетчатки и мышц и в

образованный «карман» имплантировал! предварительно подготовленный образец материала. Вес образцов НК был приблизительно одинаковым для всех животных и составлял ~ 120мг, На область раны накладывали 2 операционных шва, после чего животных оставляли под наблюдением. Далее крыс выводили из эксперимента с помощью летальной дозы эфира для наркоза через 2-, 4-, 8-, 10-ть недель эксперимента (по два животных на каждый срок, всего - 8 животных), образцы материалов извлекали и проводили их визуальную оценку (видеокомплекс на основе стереомикроскопа и цифровой видеокамеры Olympus, Япония). После фиксации образцов в 10% растворе формалина осуществляли декальцинацию материалов (0.3М раствор ЭДТА, 37°С ~ 30 дней), затем изготавливали из них парафиновые блоки, а далее - гистологические препараты. Препарата окрашивали гематоксилин-яозшюм, по стандартной методики и анализировали путем световой микроскопии (микроскоп Axioplan, OPTON, Германия).

Исследование остеозамещающих потенций образцов коралла семейства Acroporidae на модели дефекта большеберцовой кости крысы в экспериментах in vivo.

Работа выполнена на крысах - самках линии Wistar, массой 180-200г (по 20 животных в каждой серии экспериментов). Операции (краевую резекцию большеберцовой кости) осуществляли под наркозом (рис. 1),

Рисунок 1. Ход операции по заполнению костного дефекта бедренной кости крысы НК (во II группе): а) сформированный костный дефект; 6) заполнение костного дефекта материалом; в) вид раны перед ушиванием; г) рентгенологическое исследование через 3 недели после операции.

В динамике каждого эксперимента (через 3,6, 9 и 12 недель, 6 месяцев) всем крысам проводили рентгенологическое исследование оперированных конечностей (рисЛг), после которого в каждый срок по 2 животных выводили го эксперимента (с применением летальной дозы эфирного наркоза), после приготовления срезов гистологических препаратов их окрашивали гематоксилин-эозином и проводили световую микроскопию.

Исследование остеозамещающих потенций НК на модели критического дефекта бедренной кости барана.

Работа выполнена на трех половозрелых баранах (8-12 месяцев; 40-60 кг). Перед операцией каждому животному по рентгенограммам производили замер бедренной кости для изготовления из НК индивидуальных имплангатов и подбора пластин для накостного остеосингеза. НК имплантаты очищали по разработанной и описанной выше методике и стерилизовали их у-облучением (доза 25 кГр).

Рисунок 2. Схема хирургического вмешательства у крупных лабораторных животных.

Операцию (сегментарную резекцию бедренной кости) осуществляли под наркозом. Производили сегментарную резекцию бедренной кости (Зсм), после чего в область дефекта устанавливали имплантат (НК) и фиксировали его при помощи накостного мегаллостеосинтеза (пластина - Ш>, Зул&ез, Швейцария) и серкляжной проволоки (рис. 2, 3).

Рисунок 3. а) подготовленный для имплантации НК; б) фиксация НК в области дефекта, тастиной накостного остеосинтеза и серкляжной проволокой.

В динамике наблюдения осуществляли рентгенологический контроль: сразу после завершения операции и через 1, 4, 6 месяцев. Гистологические исследования препаратов осуществляли совместно с руководителем отделения патоморфологии, чл.-корр. РАМН, проф. Г.А. Франком.

Клинический этап исследования

Результаты анализа экспериментальных данных явились основанием к подготовке документов и образцов НК для получения экспертного заключения о токсичности. Результаты официальной экспертизы в ФГУ «Всероссийский Научно-Исследовательский и Испытательный Институт Медицинской Техники»: «Материал для имплантатов из натурального коралла (вида Асгорога), предназначенный для восстановления костной ткани при реконструктивно-пластических операциях, разработанный ФГУ МНИОИ им П.А. Герцена, нетоксичен, стерилен, отвечает требованиям, предъявляемым к медицинским материалам для внутреннего протезирования».

Для апробации разработанных подходов в практике был подготовлен протокол клинического исследования: «Применение имплантатов на основе скелета натурального коралла вида Асгорога сетсопнз для реконструкции костей», утвержденный Этическим комитетом и Ученым советом ФГУ "МНИОИ им. П.А. Герцена " Минздрав соцразвития России.

В рамках разработанного и утвержденного протокола НК был использован для реконструкции костных структур у 10 больных с доброкачественными новообразованиями костной ткани (основная группа). В эту группу были включены 9 - женщин, 1 - мужчина; в возрасте от 21 до 54 лет; средний возраст - 35 лет с доброкачественными (энходрома - 5, остеобластокластома - 1, костно-хрящевой экзостоз - 1) и опухолеподобными (костная киста - 3) образованиями костей. У шести пациентов процесс локализовался в области фаланг пальцев; по одному - в крыле подвздошной и бедренной костях; двое больных имели поражение плечевой кости. Согласно протоколу, больным была произведена внутрикостная резекция очага поражения с реконструкцией гранулами НК семейства Асгоропс1ае, вида Асгорога сегасогшз (размер гранул - от 0,1см5 до 0,5см5) - основная группа.

В группе сравнения 10 больным для восстановления костной ткани использовали р-трикальцийфосфат (объем использованого материала 0,5см5 - 1 см5; (5-ТКФ - СЬгопОБ, БупШез, Швейцария). Эта группа включала 6 - мужчин и 4 - женщины в возрасте от 19 до 62 лет, средний возраст - 37 лет. У девяти из десяти больных оперативное вмешательство осуществлено по поводу доброкачественных образований костей (энходрома - 1, гагантоклеточная опухоль - 2, костно-хрящевой экзостоз - 1, костная киста - 3 и фиброзная дисплазия - 2). У десятого пациента выполнена резекция проксимального отдела бедренной кости с эндопротезированием тазобедренного сустава, по поводу метастаза рака предстательной железы в головку бедренной кости. Для имплантации чашки эндопротеза,

выполнена остеопластика дна вертлужной впадины блоками p-трикальцийфосфата. У пяти пациентов процесс локализовался в бедренной кости и по одному пациенту имели поражение лучевой кости, ключицы, фаланги пальца, пяточной и болынеберцовой костей.

Таким образом, в основной и группе сравнения преобладали (-60%) пациенты в возрасте от 19 до 40 лет. То есть, по возрасту эти группы были сопоставимы и представлены преимущественно лицами молодого возраста.

Методы статистического анализа: Обсчет результатов и статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерных программ Statistica, Biostat Exe и SigmaStat9.0. Рассчет достоверности (р) проводился по критерию Стьюдента. Результаты: Для проведения экспериментальных исследований «in vitro» и «in vivo» и клинической апробации мы использовали образцы НК вида Acropora cervicomis (spl - sp2). Нами было установлено, что этот вид кораллов имеет низкое содержание примесей (в пределах, разрешенных ГОСТ для имплантатов), обладает хорошо развитой поверхностью с зерном в нанодиапазоне, пористостью - до 50%, с наличием пор разного диаметра (от 100 до 1000 мкм), взаимосвязанных сквозными каналами, что значительно увеличивает удельную поверхность, повышая, таким образом, площадь соприкосновения и взаимодействия в различных средах.

При сравнении физико-механических свойств НК с современными кальций-фосфатными материалами нами отмечено, что кораллы на фоне такой же пористости обладают в 4-5 раз большей механической прочностью (до 19 мПа). Выявленное преимущество позволяет рассматривать возможность применения НК при реконструкции костей, несущих умеренную осевую нагрузку.

При исследовании НК in vitro на модели фибробластов человека (ФЧ) и при культивировании с мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (ММСК) обнаружено, что они не токсичны, обладают выраженными матриксными и адгезивными для клеток свойствами, способствуют распластыванию и активной экспансии клетками поверхности кораллов, включая поровые пространства (рис. 4).

Рисунок 4. Заселение клеточной культурой ФЧ поверхности НКа) 8 кратное увеличение; б) 64 кратное увеличение.

В среднем популяция ФЧ за время наблюдения (2 недели) увеличилась на данных образцах кораллов в 2-3 раза, что существенно и достоверно превышает контрольные значения (возрастание на 70-80% при культивировании на полистирене) (табл. 2).

Таблица 2.

Величина оптической плотности раствора формазана (усл.ед., МТТ-тест) в динамике культивирования ФЧ на полистирене (контроль) и образцах натуральных кораллов

(опыт)

Контроль/ образцы НК Величина оптической плотности раствора формазана (усл. ед., МТТ-тест) в динамике культивирования ФЧ на полистирене (контроль) и образцах натуральных кораллов (опыт) в различные сроки эксперимента (сутки)

1 3 7 10 14

Контроль 0,400±0,009 0,589±0,015 0,817±0,0П 0,9бб±0,014 1,090±0,021

1 0,476±0,007* 0,848±0,077* 1,443±0,028* 1,710±0,028* 1,850±0,054*

2 0,448±0,004* 1,007±0,04б* 1ДЗб±0,042* 1,419±0,021* 1,260±0,039*

3 0,497±0,069 0,948±0,050* 1,346±0,093* 1,691±0,030* 1,762±0,044*

4 0,539±0,006* 1,071±0,054* 1,601±0,124* 1,894±0,042* 1,938±0,083*

5 0,490±0,040* 1,126±0,016* 1,469±0,063* 1,832±0,009* 1,882±0,103*

6 0,51240,014* 0,807±0,035* 1,484±0,057* 1,76440,033* 1,921±0,042*

7 0,483±0,018* 0,937±0,014» 1,424±0,050* 1,775±0,054* 1,513±0,098*

8 0,550±0,017* 0,918±0,067* 1,835±0,073* 1,939±0,045* 1,654±0,004*

*- достоверность р<0,05 по критерию Стьюденга

Уникальная кристаллическая структура арагонита в сочетании с развитой структурой поверхности кораллов способствует эффективной адгезии, активной пролиферации и экспансии ММСК, а по достижению на коралле монослоя этих клеток в них запускается синтез щелочной фосфатазы, остеопоншна, сиалопротеина П и коллагена I типа за счет экспрессии генов остеодифференцировки (рис. 5).

ÍL

rJEiri

collagen I

AlcPho

Д

Sialoprotein osteopontin

□ контроль

остеодифференцировкз Н при химической остеоиндукции на пластике

дДиффсренцировка на _А_ матрикееНК

r-*—s...............

osteopontin * - pO.OS, 11=12

Рисунок 5. Относительная экспрессия остеогенных маркерных генов в ММСК при химической индукции остеогенной дифференцировки на пластике и спонтанной остеодифференцировки на скелете НК (ПЦР в реальном времени, уровень мРНК анализируемых генов выравнен по отношению к двум генам неизменного уровня экспрессии (house keeping genes) - GAPDH, fi-actin).

Следовательно, НК являются перспективным материалом для использования как самостоятельно, так и в качестве матриксов - носителей клеточных культур.

При морфологическом исследовании гранул коралла, имплантированных под кожу крыс, наблюдалась активная внутрикапсулярная неоваскулязация на всех сроках; ни в одном из препаратов не обнаружено признаков воспалительной реакции, некротических изменений и других проявлений несовместимости. Исходя из этого, натуральные кораллы вида Асгорога cervicomis можно рассматривать как биосовместимые материалы, пригодные для имплантации.

Отмечена достаточно высокая скорость резорбции этих материалов после имплантации в краевой дефект большеберцовой кости мелким лабораторным животным (крысы). На месте резорбированного НК, даже в ранние сроки после операции (7-9 недель), выявлено формирование новой костной ткани (рис. 6). Совпадение скорости резорбции и скорости формирования костной ткани является идеальным свойством остеопластического материала и дополнительно свидетельствует о перспективности этого биоматериала натурального происхождения.

Рисунок 6. Динамика замещения костного дефекта крысы с использование.» натурального коралла (а ~ 6 недель; б - 9 недель; окраска - гематокстиютта», увеличение х!00)

За весь период наблюдения у всех трех бараков «в отмечено нестабильности в зоне оперативного вмешательства или разрушения имшантнровшшого Ж, что свидетельствует о высокой механической прочности данных материалов и хорошей стабилизации конструкции. Эш наблюдения указывают на возможность применения НК в виде цельных имплатгшгов для реконструкции костной ткани после обширных сегментарных резекций.

При рентгенологическом, макроскопическом и микроскопическом исследовании зоны операции через 6 месяцев, у баранов наблюдалась полная реконструкция кости с формированием губчатой косшой ткани в центре и компактной снаружи. Замещение имплангата сформированной новой костью шло параллельно с восстановлением костномозгового канала (с губчатой костной тканью и костно-мозговым кроветворением), что свидетельствует о высокой скорости резорбции даже цельного имплангата из НК и способности этих материалов стимулировать орогенез и обеспечивать органотитшческое замещение дефекта (рис. 7, 8), с формированием остеонов (рис. 9).

Рисунок 7. Рентгенография бедренной кости барана: а - через 1 месяц после операции; б через 4 месяца после операции; в - через 6 месяцев после операции.

Рисунок 8. Оперированная бедренная кость барана на распиле (6 месяцев после операции).

Рисунок 9. Костная ткань разной степени зрелости на месте натурального коралла, на месте дефекта бедренной кости барана (а, б - 6 мес. после операции; гематоксилин -эозин, увеличение хЮО).

Таким образом в экспериментах по реконструкции натуральными кораллами искусственных костных дефектов у мелких и крупных лабораторных животных были доказаны их биосовместимость, наличие остеоиндуктивных и остеокондуктивных свойств. Полученные на доклиническом этапе результаты исследований натуральных кораллов «in vitro» и «in vivo» позволили нам перейти к этапу ограниченных клинических испытаний.

При клинической апробации исследовали основную группу (10 больных), в которой реконструкция костной ткани была выполнена имплантатами на основе НЕС. Группой сравнения выступали 10 больных с реконструкцией кости кальций-фосфатным материалом ((3-ТКФ - ChronOS, Synthes, Швейцария), который относится к современным кальций-фосфатным биодеградируемым материалам, с наличием выраженных остеокондуктивных свойств, широко распространенным в медицинской практике.

Во время всех оперативных вмешательств введение имплантатов для реконструкции костной ткани контролировалось под электронно-оптаческим преобразователем (ЭОП). В ряде наблюдений (30%), во время имплантации материала в группе сравнения отмечено разрушение имплангата на более мелкие гранулы, что свидетельствует о достаточно низких прочностных характеристиках р-ТКФ.

При динамическом рентгенологическом исследовании через один месяц после операции: в основной группе у всех пациентов полное заполнение полости дефекта гранулам! НК. У 3 из 10 пациентов выявлен выход материма в мягкие ткшш, который был связан с применением мелких гранул (0,1см5) и недостаточной иммобилизацией зоны операции. В дальнейшем применялись гранулы НК большего диаметра (0,3-0,5см3) с более длительным периодом иммобилизации оперированного сегмента (до 30 дней). Однако, учитывая достаточно быструю скорость резорбции гранул НК, вышедших в мягкие ткали, без каких либо клинически значимых последствий, данную ситуацию мы не рассматриваем как осложнение.

В контрольной группе выхода материи.™ » мягкие ткшш не было, однако в 3 га 10 наблюдений отмечено не полное заполнение полости дефекта (в связи с использованием блоков размерами Ю-20мм, при применении которых плотное заполнении небольших по

размерам полостей затруднено).

Через три месяца после опрации в основной группе у всех пациентов отмечено замещение НК по периферии (в зоне контакта с костной тканью) с формированием костной тешш и снижение плотности имплшгтата в центральной часта. Плотность материала, вышедшего в мягкий теши (3 пациента) мгачотелыю етшиаеь, выявлена практически полная резорбция НК, что говори 0 достаточие »ыеекоП скорости ршрбщш и наличии

остеоивдуюившх свойств у IIK,

При динамическом наблюдении у пациентов основной группы к 18-24 месяцам определялась практически полная резорбция НК с реконструкцией костной таани. Клинический пример.

Пациентка Б, 54 лет., ИБ ТА-6508. Диагноз: Энхопдрома проксимальной фаланги III пальца левой стопы. Считает себя больной с 2003г.. когда впервые отметила появление болей в области основной фаланги III пальца левой стопы. К врачам не обращалась. В мае 2008г. отметила ус,лете болей. Обратилась в Ш1ЮИ u.M. ПА Герцена о ноябре 2010г. Передвигается самостоятельно. без дополнительных средств опоры. Локально: при пальпации в оШсти проксимальной фаланги III пальца левой стопы зона выраженной болезненности, объемных образований не выявлено. Кожа не изменена. Сцинтиграфия скелета - отмечалась зона повышенного накопления радиофармпрепарата в области проксимальной фаланги III пальца левой стопы. При KT и рентгенологическом исследовании левой стопы - в проксимальной фаланге III пальца выявлен очаг вздутия кости, неоднородной, ячеистой структуры, размерами до 0,8см. протяженностью 1,1см. Заключение: картина очаговых изменений III пальца левой стопы, многокамерная киепш (рис. 10а). По результату морфологического исследования трепанбиоптата (Р13246-49/Б) -знхондрома. Больной 08.12.08г. выполнено оперативное вмеиштельство: внутрикостная резекция проксимальной фаланги III пальца левой стопы с реконструкцией НК.

Послеоперационный период без особенностей, швы сняты на 10 сутки. Пациентка была активизирована на 10 день после операции (иммобилизация в гипсовой лангете). Передвигалась при помощи костылей в течении месяца, без нагрузки на оперированную конечность. Послеоперационное гистологическое исследование: N° Р 42660-62/Б энхондрома. Левая стопа и голеностопный сустав были иммобилизированы в гипсовой лангете в течении 30 дней после операции. Больной проводилось рентгенологическое исследование проксимальной фаланги III пальца левой стопы в динамике (рис. 10б,в,г). Через 24 месяца после операции жалоб не предъявляет. Передвигается свободно, движения в III пальце левой стопы в патом объеме, безболезненные. Период наблюдения - 29 месяца.

Рисунок 10. а) В диафизе основной фаланги III пальца определяется очаг деструкции овальной формы, размером 1,5x0,9см, расположенный вдоль длинника кости, взывающий её и истончающий кортикальный слой до «волосовидного», но не нарушающий его целостности. Очаг четко отграничен от неизмененной кости, содержит мелкие хлопьевидные капьциевые включения Заключение: картина очаговых изменений III пальца левой стопы, более всего соответствует многокамернаой кисте: б) В послеоперационной полости мелкозернистые интенсивные кальциевой плотности тени коралла, часть теней располагается в мягких тканях по тыльно-латерапьной поверхности в месте нарушения кортикального слоя (патологический перелом с незначительным продольным и боковым смещением); в) На рентгенограмме через 2 месяца определяется начапо репарации в виде появления элементов костной мозоли по задне-медиальному контуру кости. Плотность коралла несколько уменьшилась, отдельные его элементы, как внутри кости, так и вышедшие в мягкие ткани полностью резорбировались: г) На рентгенограммах через 18 месяцев дапьнейшая репарация костной ткани в виде появления трабекулярных костных структур по периферии полости. Определяется консолидация перелома.

Скорость формирования новой костной ткани зависит от времени резорбции имплантата, наличия у него остеоиндуктивных свойств и от степени контакта материала с окружающими тканями (костной, соединительной и т.д.).

в группе сравнения первые признаки замещения р-ТКФ отмечались только через 8-12 месяцев после операции с незначительной краевой репарацией кости, что свидетельствует о достаточно медленной скорости резорбции свойственной керамическим материалам.

В группе сравнения к 18-24 месяцам после операциии - постепенная резорбция материала по периферии, полость уменьшается за счет формирования в основном соединительной ткани и лишь по периферии костной ткани. Данные наблюдения в группе сравнения свидетельствуют о практически полном отсутствии остеоиндукгивных свойств у Р-ТКФ, что приводит к формированию фиброзной ткани вокруг имплантата, и материал

оказывается "вмурованным" в нее.

По результатам клинического исследования можно отметить, что репаративные процессы в группе сравнения идут медленно, в основном, за счет разрастания соединительной ткани, что свидетельствует как о низкой скорости резорбции этих материалов так и о низких остеоиндукгивных свойствах. Кроме того, данный материал обладает присущей всем кальцийфосфатным керамикам недостаточными механической прочностью и трешиностойкостью, что ограничивает его применение, в частности для реконструкции костей, несущих осевую нагрузку. Полученные данные в группе сравнения позволяют заключить, что даже современные кальций-фосфатные материалы не отвечают всем требованиям, небходимым для реконструктивной хирургии.

Инфекционное осложнение возникло у одной пациентки в основной группе, что было обусловлено длительным стоянием дренажа в области раны (5 дней). Это осложнение мы не связываем с самим имплантатом учитывая, что воспалительные явления были купированы консервативным путем в течении двух недель. У других пациентов инфекционных осложнений не было.

По результатам клинического исследования НК можно отметить высокую скорость резорбции этих материалов (как вышедших в мягкие ткани, так и в зоне имплантации), сопоставимую со скоростью формирования костной ткани. Положительным свойством данных имплантатов является отсутствие формирования вокруг них соединительнои капсулы, которая может отграничивать имплантируемые материны от костной ткани и

снижать их остеопластические свойства.

Первые результаты ограниченного клинического испытания позволяют рассматривать скелет натуральных кораллов семейства Асгоропаае как перспективный биоматериал для реконструкции костной ткани при различных патологических состояниях, в том числе опухолевых процессах в костях, в сравнени с применяемыми в широкой практике кальцийфосфатными материалами.

выводы

1. Исследована морфологическая организация, химический, физический состав, пористость и прочностные свойства скелета натуральных кораллов семейства Асгороп<1ае. Установлено, что все образцы (за исключением вида МопПрога Л©1а1а) представлены закристаллизованным арагонитом, имеют сквозные мелкие и крупные (диаметром от 0,1 до 1,0 мм) поры с тонкими стенками, обладают развитой поверхностью с зерном в нанодиапазоне и по прочностным свойствам (19,2-29,2 МПа) в 4 - 6 раз превосходят традиционно используемые кальций-фосфатные керамические материалы.

2. Все испытанные образцы натуральных кораллов не токсичны, обладают выраженными матриксными и адгезивными для клеток свойствами, способствуют распластыванию и активной экспансии фибробластами человека и мультипотентными мезеннхимальными стромальными клетками (ММСК). Натуральные кораллы обладают остеоиндуктивными свойствами для ММСК вызывая в них экспрессию генов остеодифференцировки - щелочной фосфатазы, остеопонтина, сиалопротеина II и коллагена I типа.

3. В экспериментальных исследованиях на лабораторных животных установлено, что натуральные кораллы семейства Асгоропёае являются биосовместимыми, ускоряют регенеративные процессы, инициируя органотипическое замещение костных дефектов путем периостального остеогенеза.

4. При клинических исследования подтверждена высокая скорость резорбции натуральных кораллов (как вышедших в мягкие ткани, так и в зоне имплантации) сопоставимая со скоростью репарации костной ткани.

5. В группе сравнения замещение костного дефекта р-трикальцийфосфатом идет медленно, в основном за счет разрастания соединительной ткани, что свидетельствует о низких остеоиндуктивных свойствах этих кальцийфосфатных материалов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Разработанные модели искусственных дефектов костных структур у мелких и крупных лабораторных животных целесообразно использовать для изучения закономерностей посттравматического остеогенеза, влияния на этот процесс различных факторов, в том числе новых методов костной пластики и новых остеопластических материалов.

2. Натуральные кораллы могут быть рекомендованы в качестве остеопластических материалов как в гранулированном виде, так и в виде цельных блоков (в зависимости от места и объема дефекта) для реконструкции костных структур (в том числе несущих осевую нагрузку), т.н. после травматических переломов, остеотомий и резекций при доброкачественных опухолевых поражениях костной ткани.

3. Обязательными условиями костной пластики являются полное заполнение дефекта коралловым имплантатом, плотный контакт с костным ложем, хорошая стабилизация конструкции и достаточная иммобилизация оперированного сегмента.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мыслевцев И.В. Замещение дефекта бедренной кости барана биоинженерной конструкцией на основе кораллов Acropora Cervicornes (кАС) и аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга (КМ) /

B.И. Чиссов, Н.С. Сергеева, И.К. Свиридова, В.В. Тепляков, Г.А. Франк, В.А. Кирсанова,

C.А. Ахмедова, Д.С. Агзамов, В.В. Козлов, Ю.Д. Хесуани, И.В. Мыслевцев // VI Международная конференция «Высокие медицинские технологии XXI века», Бенидорм, Испания, 2007, 28 октября - 4 ноября, с.48.

2. Мыслевцев И.В. Использование кораллов Acropora Cervicornes в качестве матриксов для аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в замещении бедренной кости барана / В.И. Чиссов, И.К. Свиридова, Д.С. Агзамов, Н.С. Сергеева, Г.А. Франк, В.А. Кирсанова, С.А. Ахмедова, В.В. Тепляков, В.В. Козлов, И.В. Мыслевцев, Ю.Д. Хесуани // Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Клеточные нанотехнологии в биологии и медицине». Курган, 3-4 октября 2007, с. 134-135

3. Мыслевцев И.В. Разработка подходов для заместительной клеточной терапии костных дефектов у экспериментальных животных на основе ЗО-материалов синтетического и природного происхождения и аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в замещении бедренной кости барана / В.И. Чиссов, Н.С. Сергеева, И.К. Свиридова, С.М. Баринов, Г.А. Франк, В.В. Тепляков, В.А. Кирсанова, С.А. Ахмедова, И.В. Решетов, Д.С. Агзамов, В.В. Козлов, И.В. Фадеева, B.C. Комлев, М.М. Филюшин, И.В. Мыслевцев // Российский Медицинский Форум, Москва 17-19 октября, 2007г. Материалы II конгресса РМФ. 2007, с. 154-155

4. Мыслевцев И.В. Доклинические исследования . синтетических и натуральных биоматериалов для замещения костных дефектов в онкологии / И.К. Свиридова, Н.С. Сергеева, С.М. Баринов, В.А. Кирсанова, С.А. Ахмедова, Г.А. Франк, В.В. Козлов, И.В. Решетов, В.В. Смирнов, М.М. Филюшин, И.В. Мыслевцев // Материалы V съезда онкологов и радиологов СНГ. Ташкент, 2008, с.346

5. Мыслевцев И.В. Биоинженерная конструкция [коралл Acropora Cervicornes (кАС) и аутологичные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК)] для замещения костных дефектов / В.И. Чиссов, В.В. Тепляков, Н.С. Сергеева, Д.С. Агзамов, И.К. Свиридова, Г.А. Франк, В.В. Козлов, В.А. Кирсанова, С.А. Ахмедова, И.В. Мыслевцев // Материалы V съезда онкологов и радиологов СНГ. Ташкент, 2008, с.353

6. Мыслевцев И.В. Тканеинженерная конструкция на основе натуральных кораллов Acropora Cervicornes (кАС) и аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) для замещения протяженных костных дефектов в эксперименте / В.И. Чиссов, В.В. Тепляков, И.К. Свиридова, Н.С. Сергеева, Д.С. Агзамов, С.А. Ахмедова, И.В. Мыслевцев//Журнал Онкохирургия, Москва, 2008, №1, с. 102

7. Мыслевцев И.В. Натуральные материалы (скелет кораллов сем. Acropora) как эталон для создания нового поколения керамических материалов для биоинженерных конструкций с аутологичными мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (ММСК) с целью замещения костных дефектов / В.И. Чиссов, Н.С. Сергеева, С.М. Баринов, И.В. Решетов, В.В. Тепляков, И.К. Свиридова, В.А. Кирсанова, B.C. Комлев, И.В. Фадеева, В.В. Смирнов, С.А. Ахмедова, М.М. Филюшин, Д.С. Агзамов, И.В. Мыслевцев, А.С. Фомин // VII Международная конференция «Высокие медицинские технологии XXI века», Бенидорм, Испания, 2008,26 октября -2 ноября, с.26-27.

8. Мыслевцев И.В. Замещение костных дефектов материалами искусственного и натурального происхождения / И.В. Мыслевцев, Н.С. Сергеева, В.В. Тепляков, И.К. Свиридова, В.А. Кирсанова, С.А. Ахмедова, Г.А. Франк, В.В. Козлов, С.М. Баринов, В.В. Смирнов, С.А. Лазуткин // Всероссийская научная конференция с международным участием «Нанотехнологии в онкологии», Москва. 2008. Тезисы доклада с.26-28

9. Мыслевцев И.В. Тканеинженерная конструкция (ТКИК) на основе натуральных кораллов (НК) и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) для остеопластики костных дефектов / В.И. Чиссов, Н.С. Сергеева, Г.А. Франк, В.В.

Тепляков, И.К. Свиридова, В.А. Кирсанова, С.А. Ахмедова, И.В. Мыслевцев, Я.Д. Шанский // Пятый международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 18-20 марта 2009г., часть I, с.94-95

10. Myslevtsev I.V. Skeleton of corals Acropora as a "gold standart" for development of new materials for bone substitution / N.S. Sergeeva, I.K. Sviridova, V.A. Kirsanova, S.A. Achmedova, I.V. Myslevtsev, ja.D. Shansky // 12th Ann. Seminar and Meeting "Ceramics, cells and tissues". Faenza- Italy. 19-22 May 2009, p.72

11. Мыслевцев И.В. Первые данные клинического применения материала на основе скелета натурального коралла семейства Acropora (НК) для замещения костных дефектов у больных с доброкачественными процессами костей / В.И. Чиссов, В.В. Тепляков, Н С. Сергеева, И.В. Мыслевцев, И.К. Свиридова, Г.А. Франк, Е.Б. Ахмерова, В.А. Кирсанова, С.А. Ахмедова // Тезисы конференции «Нанотехнологии в онкологии 2009», Москва, 9-10 октября 2009г., с.25

12. Мыслевцев И.В. Сравнение остеоиндуктивных свойств ряда биоматериалов и тканеинженерных конструкций с аугологичными мультапотентными мезенхимальными стромальными клетками на их основе / Н.С. Сергеева, И.К. Свиридова, Г.А. Франк, В.А. Кирсанова, С.А. Ахмедова, B.C. Комлев, И.В. Фадеева, И.В. Мыслевцев, А.Ю. Федотов // Всероссийский симпозиум по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий». Санкт-Петербург 12-14 октября 2009. Тезисы доклада. Журнал Цитология. Т. 51, №9, с.784-785

13. Мыслевцев И.В. Разработка и доклинические испытания синтетических и натуральных остеопластических материалов / Н.С. Сергеева, С.М. Баринов, И.К. Свиридова, B.C. Комлев, И.В. Фадеева, В.А. Кирсанова, С.А. Ахмедова, В.В. Смирнов, М М. Филюшин, И.В. Мыслевцев, Я.Д. Шанский // Международный онкологический научно-образовательный форум «0нкохирургия-2010». «В будущее через новые технологии». Москва, 31 мая - 2 июня 2010г. Тезисы, с.205

14. Мыслевцев И.В. Скелет натуральных кораллов сем. Acropora в замещении дефекта костной ткани у мелких и крупных лабораторных животных / И.К. Свиридова, Н.С. Сергеева, Г.А.-Франк, В.В. Тепляков, В.А. Кирсанова, С.А. Ахмедова, И.В. Мыслевцев, Я.Д. Шанский // Журнал Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2010г. Москва, Т.5, №4, с.43-48

15. Myslevtsev I.V. Tissue engineering constructions (TECs) based on natural and synthetic materials with autologous multipotential mesenchymal stromal cells (MMSCs) for bone defect substitution / I.K. Sviridova, N.S. Sergeeva, S.M. Barinov, G.A. Frank, V.A. Kirsanova, S.A. Akhmedova, I.V. Fadeeva, V.S. Komlev, A.Yu. Fedotov, Ja.D. Shansky, I.V. Myslevtsev // 5th World Congress of Preventive and Regenerative medicine, Hannover, 2010

16. Мыслевцев И.В. Разработка и исследование спектра наноструктурированных материалов и тканеинженерных конструкций с аутологичными мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками на их основе для замещения костных дефектов / И.К. Свиридова, Н.С. Сергеева, С.М. Баринов, В.А. Кирсанова, С.А. Ахмедова, B.C. Комлев, И.В. Фадеева, В.В. Смирнов, Я.Д. Шанский, И.В. Мыслевцев // Тезисы. Конференция с Международным участием «Нанотехнологии в онкологии». Москва, 2010, с.30-33

17. Мыслевцев И.В. Скелет кораллов семейства Acropora в качестве материала для замещения костных дефектов у больных с доброкачественными опухолями костей (экспериментально-клиническое исследование) / В.В. Тепляков, И.В. Мыслевцев, A.B. Бухаров, Н.С. Сергеева, Г.А. Франк, И.К. Свиридова, В.Ю. Карпенко, В.А. Кирсанова, С.А. Ахмедова, Е.Б. Ахмерова // Российский онкологический журнал, №3,2011, Москва, с.32-35

Подписано в печать: 27.10.2011 Объем: 1 усп.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ №732 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Ленинградский пр-к, д.74, корп.1 (495) 790-47-77; www.reglet.ru

Доклинические исследования остеопластических свойств натурального коралла семейства Acroporidae были проведены на базе отделения «Прогноза эффективности консервативного лечения» ФГУ «Московский научно исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» МЗ и CP РФ. Согласно разработанному алгоритму испытания НК, на первом этапе в экспериментах in vitro проводили оценку острой токсичности и матриксных свойств поверхности НК, а также их способности поддерживать пролиферацию ФЧ и пролиферацию/дифференцировку ММСК, а далее - в экспериментах in vivo на мелких и крупных лабораторных животных - исследовали биосовместимость этого материала и его остеозамещающие потенции.

В клиническую часть исследования было включено 20 больных с доброкачественными и опухолеподобными заболеваниями костей, которым в отделении «онкологической ортопедии» ФГУ «МНИОИ им П.А. Герцена МЗ и CP РФ» в 2006-2010гг. были выполнены 20 оперативных вмешательств.

2.2 Доклинические исследования натурального коралла семейства Acroporidae в экспериментах in vitro и in vivo 2.2.1 Подготовка и стерилизация натуральных кораллов

Очистку НК семейства Acroporidae от мелких органических остатков и от коралловой пыли проводили в несколько этапов. На первом этапе ветви скелета НК подвергали грубой механической очистке щеткой с жесткой синтетической щетиной под струей проточной воды, осуществляя на этапах микроскопический контроль. Далее дополнительно производили ультразвуковую очистку НК (ультразвуковая мойка Finn Sonic m 15, t - 60 °C, 20 минут). После высушивания образцы подвергали механическому измельчению до заданного размера частиц (0,2-0,6мм, 0,6-0,8мм, 0,8-1,2мм, 1,2-1,5мм, 1,-3,0мм, >3,0мм) на планетарной шаровой мельнице РМ 200; затем каждую фракцию частиц НК промывали в течение 3-4 часов в холодной проточной воде. На заключительном этапе частицы НК замачивали на 8 часов при комнатной температуре в дистиллированной воде в соотношении НК/Н20 (по объему) 1:10, заменяя дистиллированную воду каждые 2 часа на свежую порцию, затем высушивали их в сухожаровом шкафу при температуре 50-60°С в течение 8 часов и раскладывали по стеклянным флаконам объемом 10 см3.

Далее проводили стерилизацию частиц НК 7-облучением в дозе 20-25 кГр на установке РХМ- у -20. На заключительном этапе осуществляли бактериологический контроль стерильности НК (15% образцов из каждой партии, анализатор бактериологический «BioTrack 4250», SY-LAB GmbH, Австрия; анализатор бактериологический «Bactec 9120», Becton Dickinson, США), в соответствии с требованиями.

2.2.2 Исследования in vitro острой цитотоксичности и матриксных свойств поверхности образцов НК

За сутки перед началом опыта стерильные коралловые частицы размером 0,2-0,6 мм помещали в 24-х луночные культуральные планшеты (Costar, США) и заливали полной ростовой средой (ПРС) следующего состава: среда ДМЕМ (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова, РАМН, Москва), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ПанЭко, Москва), глютамин (бООмг/л). Каждый образец НК в платах был представлен в триплетах.

Оценку острой цитотоксичность НК и динамики нарастания на них клеток выполнены на клеточной линии иммортализованных нормальных фибробластов человека (ФЧ, клон №1608), полученной из Медико-Генетического научного центра РАМН, г. Москва. Клеточную линию поддерживали в ПРС на основе среды ДМЕМ (см. выше).

В экспериментах использовали клетки в логарифмической фазе роста (предконфлюэнтный монослой). Для получения суспензии одиночных клеток монослой ФЧ обрабатывали 0,25% раствором трипсина (Sigma,США), затем полученную взвесь клеток тщательно дважды отмывали центрифугированием в большом объеме ПРС, производили их подсчет и оценку жизнеспособности, окрашивая клеточную суспензию 0,04% раствором трипаново синего. Затем в платы с НК (опыт) и без них (контроль) помещали ФЧ (400тыс.кл. на лунку) в объеме 2мл ПРС и инкубировали: для определения острой цитотоксичности в течение 24 часов, для оценки матриксных свойств НК - 3, 7, 10, 14, 17, 21 и 28 суток. Полную замену ПРС осуществляли дважды в неделю на протяжении первых 10-и суток эксперимента, а далее - вплоть до окончания опыта -ежедневно. Все операции с НК и ФЧ осуществляли в стерильных условиях, культивирование - в атмосфере влажного воздуха, содержащего 5% СО2 при 37°С.

Жизнеспособность ФЧ в динамике культивирования с НК оценивали с помощью МТТ метода, который основан на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать 3-(-4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромистый (МТТ, Sigma, США) в голубые кристаллы формазана, нерастворимые в воде [119]. Как было показано ранее [37], количество образовавшегося формазана отражает пролиферативную активность (жизнеспособность/количество) различных клеток человека и животных in vitro. Для проведения МТТ-теста в опытах in vitro по окончанию срока культивирования ФЧ на культуральном пластике-полистерене (контроль) и на образцах НК в полистереновых лунках (опыт) из каждой лунки отбирали по 1,5 мл среды и вносили по 125мкл раствора МТТ в концентрации 5мг/мл. Через 3 часа инкубации (5% С02, 37°С) из каждой пробы полностью декантировали ПРС и осуществляли растворение образовавшегося формазана с помощью изопропилового спирта (1 мл на лунку). От осадка, образующегося в результате преципитации белков в изопропаноле, освобождались центрифугированием плат в течение Юмин. при ЗОООоб/мин. Далее из каждой лунки переносили по ЮОмкл супернатант в 96-луночный плоскодонный планшет (Costar, США) и оценивали оптическую плотность раствора формазана на спектрофотометре

МСС-340 (Швеция) при длине волны 540нм. В качестве спектрофотометрических контролей (бланк) использовали пробы с чистой ПРС и пробы, содержащие тестируемые образцы НК в ПРС (без клеток).

Для определения цитотоксичности материалов рассчитывали пул жизнеспособных клеток через 24 часа инкубации с ними по формуле:

ОД* опыт.

Пул жизнеспособных клеток (ПЖК) = - X 100%

ОД контр.

ОД*- оптическая плотность раствора формазана)

При оценке матриксных свойств НК определяли изменение пула ФЧ (А) в каждый конкретный срок по формуле:

ОД+, - ОД,

А = - х 100%,

ОДп.

ОД п+1 - величина оптической плотности в конкретный срок, ОД п - величина оптической плотности в предыдущий срок.

Положительная величина пула свидетельствовала о приросте популяции ФЧ, отрицательная - о гибели части популяции.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерных программ Statistica и Biostat Exe.

2.2.3 Исследование остеоиндуцирующих свойств скелета НК как матрикса для культур ММСК

Этот раздел работы был выполнен совместно с сотрудниками лаборатории факультета фундаментальной медицины МГУ им М.В. Ломоносова. Для оценки остеогенной дифференцировки ММСК человека была проанализирована транскрипция ряда маркерных генов: Osteoc (остеокальцина), AlcPho (щелочной фосфатазы), ВМР2, Sialopr II (костного сиалопротеина II типа), коллагена I типа и остеопонтина.

Источником ММСК человека служила подкожная жировая ткань (9 образцов, возраст доноров 17-64 года), которую получали во время лапаротомии при проведении оперативных вмешательств. Образцы ЖТ весом 7,0-41,0гр. помещали в стерильную емкость со средой следующего состава: среда ДМЕМ (ПанЭко, Россия), гентамицин (100 мкг/мл) и транспортировали в лабораторию, где они сохранялись при температуре +4°С не более 1 часа до начала процедуры выделения клеток. Для выделения ММСК из ЖТ использовали сочетание механической и ферментативной дезагрегации. Для этого в чашке Петри образцы ЖТ тщательно измельчали ножницами на холоде в фосфатно-солевом буфере с антибиотиками до получения грубой гомогенной взвеси. К измельченной ткани добавляли равный объем 0,025% раствора трипсина (ПанЭко, Россия) и помещали на шейкер (25 мин., температура 37°С). Полученную в результате трипсинизации клеточную взвесь фильтровали через сито (размер пор 70 цт) и отмывали от трипсина центрифугированием в течении 10 минут, при 1000об./мин. Для отмывки использовали ПРС следующего состава: среда ДМЕМ/Р12 (1:1), глутамин (65 мг/мл), 10 мм буфера Hepes (все реактивы фирмы ПанЭко, Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Eurobio, Франция) и гентамицин 50 мкг/мл (Респ. Беларусь). Осадок клеток ресуспендировали в 5 мл ПРС и оставляли при температуре +4°С для последующего объединения с новыми порциями выделенных клеток. Для этого циклы ферментативной дезагрегации повторяли дважды, используя во втором цикле раствор трипсина с коллагеназой, а третьем - 0,075% раствор коллагеназы. Полученные фракции клеток объединяли, повторно отмывали, супернатант декантировали, осадок тщательно ресуспендировали в ПРС и производили подсчет жизнеспособных клеток (0,4% раствор трипанового синего) в камере Горяева. Из одного грамма ЖТ таким способом удавалось выделять от 60 до 270 тысяч клеток с 95% жизнеспособностью. Клеточную суспензию рассеивали по культуральным флаконам при плотности посева 10,0 тыс. ядросодержащих клеток на см поверхности флакона и помещали в С02 инкубатор (37°С, 7,5% СО2). Через двое суток производили удаление неприкрепившихся клеток из флаконов и добавляли свежую порцию ПРС. По достижении культурой состояния предконфлюэнтного монослоя (70-80% культуральной поверхности занято клетками) проводили перепассирования. Для эксперимента использовали культуры ММСК III (7 обр.) и V (2обр.) пассажей.

При индукции остеогенной дифференцировки культуры ММСК III и V пассажей наращивали до состояния монослоя в обычных условиях, а затем культивировали в течении 14 суток в присутствии соответствующих дифференцирующих агентов: 15% Osteogenic Stimulatory Supplements, 3.5mM /?о

Glycerophosphate, 10" M Dexamethasone, 50|ig/mL Ascorbic Acid в MesenCult Basal Medium (все реактивы фирмы StemCell Technologies, Канада).

Далее из клеток, культивированных в дифференцировочных условиях, была выделена РНК и методом ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ ПЦР) было проанализировано содержание транскриптов этих генов.

Выделение РНК осуществляли с использованием коммерческих реагентов «RNeasy Miny Kit (50)», QIAGEN, США. Выделенную РНК обрабатывали ДНКазой для исключения загрязнений геномной ДНК.

Качество РНК оценивали электрофоретически в агарозном геле, количество - спектрофотометрически. Синтез первых цепей кДНК проводили согласно стандартному протоколу фирмы «Fermentas», используя олиго-dT-праймеры. Реакцию проводили в ПЦР - амплификаторе с горячей крышкой. Все манипуляции проводили в перчатках и в ламинарном боксе во избежание контаминации.

Для анализа экспрессии генов проводили ПЦР в реальном времени с интеркалирующим красителем Sybr Green («Синтол», Россия) в амплификаторе «ВЮ- RAD iQ5. Multicolor Real-time PCR detection system». Праймеры к анализируемым генам подбирали в программе DNASTAR (табл. 1).

ПЦР в реальном времени осуществляли в соответствии со стандартным протоколом фирмы «Синтол». Реакцию проводили с использованием градиента температур (подобранной для каждой пары праймеров - табл. 1). Схема реакции включала: первичную денатурацию (95°С, 5 мин), денатурацию (95°С, 20 сек), отжиг праймеров (59-64°С, 20 сек), элонгацию (72°С, 20 сек -40 циклов) и плавление продуктов амплификации. Для дополнительного контроля чистоты реактивов и работы проводили контрольную реакцию, в которой присутствовали все компоненты, кроме матрицы. Для анализа специфичности амплификации по окончании ПЦР-РВ проводили плавление продуктов с постоянным анализом флуоресценции и построение кривых плавления.

Таблица 1.

Праймеры к остеогенным маркерным генам

Рогшагё рптег Яеуегзе рптег Т отж. Ампликон (п.н.)*

С^еос САСТССТСОСССТАТТ всс вССТСООТСТСТТСА СТАССТ 62.2 138

А1сРЬо АТСООАТСООТОТСТ ССАСА ССАССААвССОАЛСТ тете 62.5 108

ВМР2 СОТОТССССОСОТСС ТТСТТАв тсстооооотссотс ТСТвТТТСА 62.5 261

81а1орг II ТООАТОААААСОААС ААСвСА АААСССАССАТТГСО ЛвЛввТ 60.4 200

Со1^еп I АТООАТТССАОТТСО АвТАТССС САТСОАСАОТОАССС ТвТАвв 62.1 246

СЫепх ССТСТОССвОАСТСА АСААС ТАААОвОООСТООАТ ААвСАТ 62.8 112

С^еоропйп СТССАТГСАСТСОАА СвАСТС САСОТСТССОАААСТ ТСТТАвАТ 60.2 230 п.н. - пара нуклеотидов

Анализ проводили методом ПЦР в реальном времени, уровень мРНК анализируемых генов выравнивали по отношению к двум генам неизменного уровня экспрессии (house keeping genes) (GAPDH, jS-actin), (* - p<0,05, n=12 (количество проанализированных образцов X количество измерений)).

Для оценки влияния условия культивирования дифференцированных ММСК на матриксе из коралла был также проведен сравнительный анализ транскрипции маркерных генов.

Статистический анализ данных осуществляли с использованием программы SigmaStat9.0; для сравнения групп использовали U-критерий Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при уровне значимости р<0,05.

2.2.4 Оценка биосовместимости образцов коралла семейства Acroporidae в экспериментах in vivo

Для исследования биосовместимости образцов НК в экспериментах in vivo использовали модель подкожной трансплантации. Для этого крысам-самкам линии Wistar весом 180-200г под наркозом (кетамин/реланиум в отношении 1:1, внутрибрюшинно по 0,05мл) делали кожный надрез в области грудного отдела позвоночника. Тупым концом скальпеля кожу отсепаровывали от прилегающего слоя подкожной клетчатки и мышц и в образованный «карман» имплантировали предварительно подготовленный образец материала. Вес образцов НК был приблизительно одинаковым для всех животных и составлял ~ 120мг. На область раны накладывали 2 операционных шва, после чего животных оставляли под наблюдением. Далее крыс выводили из эксперимента с помощью летальной дозы эфира для наркоза через 2-, 4-, 8-, 10-ть недель эксперимента (по два животных на каждый срок, всего - 8 животных), образцы материалов извлекали и проводили их визуальную оценку (видеокомплекс на основе стереомикроскопа и цифровой видеокамеры

Olympus, Япония). После фиксации образцов в 10% растворе формалина осуществляли декальцинацию материалов (0,3М раствор ЭДТА, 37°С -30 дней), затем изготавливали из них парафиновые блоки, а далее -гистологические препараты. Препараты окрашивали гематоксилин-эозином, по стандартной методики и анализировали путем световой микроскопии (микроскоп Axioplan, OPTON, Германия).

2.2.5 Исследование остеозамещающих потенций образцов коралла семейства Acroporidae на модели дефекта большеберцовой кости крысы в экспериментах in vivo

Работа выполнена на крысах - самках линии Wistar, массой 180-200г (по 20 животных в каждой серии экспериментов). Операции (краевую резекцию большеберцовой кости) осуществляли под наркозом. Для этого животным проводили предварительную седацию 0,25% раствором дроперидола (0,5мл внутрибрюшинно) и 0,25% раствором кетамина (0,25мл внутримышечно). Далее, в положении животного на спине, по внутренней медиальной поверхности голени, отступая от коленного сустава приблизительно на 8мм, производили кожный разрез протяженностью 2,0 -2,5см. Кожу отсепаровывали, производили мобилизацию мышц голени отведением их в сторону и обнажали болыпеберцовую кость. Для исключения физиологической регенерации костной ткани отсепаровывали и удаляли надкостницу. Затем на границе верхней и средней трети кости посредством фрезы диаметором 2,5 мм формировали «окончатый» дефект следующего размера: длина 6-8мм, ширина 1,5-2мм, глубина 2,5-Змм, то есть с проникновением в костномозговой канал. Область дефекта полностью заполняли пластическим материалом во II группе (20 крыс), в I - контрольной группе (20 крыс) дефект не заполнялся. На заключительном этапе послойно накладывали швы на мышцы (укрывая место дефекта) и кожу голени (рис.1).

2.2.6 Исследование остеозамещающих потенций НК на модели критического дефекта бедренной кости барана

Работа выполнена на половозрелых баранах (8-12 месяцев; 40-60 кг). Перед операцией каждому животному по рентгенограммам производили замер бедренной кости для изготовления из НК индивидуальных имплантатов и подбора пластин для накостного остеосинтеза. Подготовленный коралловый имплантат представлял собой цилиндр с выступами для фиксации в костномозговом канале (рис. 2а): высота цилиндра 2,0 см с радиусом 0,88 см; высота выступов 1,4 см, с радиусом 0,68 см. Далее НК имплантаты очищали по разработанной и описанной выше методике и стерилизовали их у-облучением (доза 25 кГр).

Операцию (сегментарную резекцию бедренной кости) осуществляли под наркозом. В положении животного на боку производили разрез кожи и подкожно-жировой клетчатки в проекции бедренной кости от тазобедренного до коленного сустава. После выделения бедренной кости, при помощи распатора, в средней трети удаляли надкостницу. Далее при помощи пилы Джильи, в средней трети диафиза производили сегментарную резекцию бедренной кости (Зсм). После чего в область дефекта устанавливали имплантат (НК) и фиксировали его при помощи накостного металлостеосинтеза (пластина - ЬСР, БупШеБ, Швейцария) и серкляжной проволоки (рис. 26). Далее рану послойно ушивали. Описанное оперативное вмешательство проведено у трех баранов.

Асгорога), предназначенный для восстановления костной ткани при реконструктивно-пластических операциях, разработанный ФГУ МНИОИ им П.А. Герцена, нетоксичен, стерилен, отвечает требованиям, предъявляемым к медицинским материалам для внутреннего протезирования» [приложение 1].

Для апробации разработанных подходов в практике был подготовлен протокол клинического исследования: «Применение имплантатов на основе скелета натурального коралла вида Асгорога сегасотеБ для реконструкции костей», утвержденный Этическим комитетом и Ученым советом ФГУ "МНИОИ им. П.А. Герцена " Минздравсоцразвития России. Протокол клинического исследования:

ПРИМИНЕНИЕ ИМПЛАНТАТОВ НА ОСНОВЕ СКЕЛЕТА НАТУРАЛЬНОГО КОРАЛЛА вида АСКОРОЯА СЕЮТСОКМЕЗ ДЛЯ РЕКОНСТРУКЦИИ КОСТЕЙ»

Цель исследования:

Исследование возможности использования скелета коралла Асгорога сетсогпеБ для восстановления костной ткани с определением времени до исчезновения клинических проявлений основного заболевания и оценкой эффективности проведенного лечения. Исследуемая популяция:

В исследование будет включено 10 пациентов с поражением костной ткани различной локализации с доброкачественными (энхондрома, остеоид-остеома и т.д.) и кистоподобными процессами (аневризмальная киста, фиброзная дисплазия и т.д.) с подтвержденным гистологическим диагнозом. Критерии включения:

Для включения в исследование пациенты должны удовлетворять следующим критериям: 1. Мужчины и женщины в возрасте от 14 до 60 лет; 2. Гистологически подтвержденный диагноз доброкачественного или кистоподобного процесса (энхондрома, остеоид-остеома, аневризмальная киста, фиброзная дисплазия и т.д.).

Критерии исключения:

Пациенты, которые соответствуют любому из указанных ниже критериев, не могут быть включены в настоящее исследование:

1. Вовлечение в процесс суставных поверхностей;

2. Предполагаемое несоблюдение пациентом процедур протокола;

3. Беременные и кормящие грудью женщины;

4. Наличие в анамнезе какого-либо злокачественного новообразования (кроме адекватно леченных базально-клеточного рака или рака шейки матки in situ);

5. Нестабильное, требующее постоянного мониторинга и корригирующей терапии состояние при заболеваниях сердца, включающее застойную сердечную недостаточность или стенокардию, инфаркт миокарда в течение 1 года до включения в настоящее исследование, неконтролируемая артериальная гипертензия или аритмия;

6. Активный вирусный гепатит, острое или хроническое заболевание печени;

7. Активная гастродуоденальная язва;

8. Сахарный диабет;

9. Острое или хроническое заболевание почек;

10. Сопутствующая активная и/или неконтролируемая инфекция с поражением костной ткани (остеомиелит);

11. Тяжелое системное заболевание. Планируемое оперативное вмешательство:

Оперативное лечение предусматривает проведение резекции сегмента кости с доброкачественным образованием и замещение его кораллом, соответствующим по форме и протяженности дефекту или экскохлеацию (внутрикостную резекцию) с заполнением образовавшейся полости гранулами коралла размером от 1 до 4 мм в диаметре. Оценка эффективности лечения: щ

Будет осуществляться путем выполнения рентгенологического или КТ исследований области имплантации НК. Лабораторные анализы и клинические исследования: 1 .Общий анализ крови - перед началом лечения.

2.Биохимический анализ крови - перед началом лечения (с обязательным определением ЩФ).

3.Клинические и инструментальные исследования (оценка эффективности лечения):

• R-графия первичной опухоли в двух проекциях - перед началом лечения и после операции (не позднее чем через 7-х суток).

• R-графия легких - перед лечением,

• КТ и МРТ первичной опухоли - по показаниям,

• РИД скелета - в начале исследования,

• ЭКГ и Эхо-КГ - перед началом лечения и по показаниям,

• КТ грудной, брюшной полости - по показаниям. Динамическое наблюдение:

Динамическое наблюдение после окончания первичного лечения (оперативное вмешательство) осуществляется с частотой 1 раз в 1 месяц в течение первых 6 месяцев после окончания лечения, затем 1 раз в 6 месяцев в течение 5 лет.

Объем лабораторных и инструментальных обследований - общий, биохимический анализы крови, R-графия скелета. КТ, РИД скелета, R-графия легких, УЗИ брюшной полости - 1 раз в год или по показаниям.

В рамках разработанного и утвержденного протокола НК был использован для реконструкции костных структур у 10 больных с доброкачественными новообразованиями костной ткани (основная группа). В эту группу были включены 9 - женщин, 1 - мужчина; в возрасте от 21 до 54 лет; средний возраст - 35 лет с доброкачественными (энходрома - 5, остеобластокластома - 1, костно-хрящевой экзостоз - 1) и опухолеподобными (костная киста - 3) образованиями костей. У шести пациентов процесс локализовался в области фаланг пальцев; по одному - в крыле подвздошной и бедренной костях; двое больных имели поражение плечевой кости (табл. 2). Согласно протоколу, больным была произведена внутрикостная резекция очага поражения с реконструкцией гранулами НК семейства Асгоропёае, вида Асгорога сегласогпеБ (размер гранул - от 0,1см3 до 0,5см3) - основная группа.

В группе сравнения 10 больным для восстановления костной ткани использовали /3-трикальцийфосфат (объем использованого материала 0,5см3 - 1 см3; /З-ТКФ - СЬгопОБ, БупШез, Швейцария). Эта группа включала 6 - мужчин и 4 - женщины в возрасте от 19 до 62 лет, средний возраст - 37 лет. У девяти из десяти больных оперативное вмешательство осуществлено по поводу доброкачественных образований костей (энходрома - 1, гигантоклеточная опухоль - 2, костно-хрящевой экзостоз - 1, костная киста - 3 и фиброзная дисплазия - 2). У десятого пациента выполнена резекция проксимального отдела бедренной кости с эндопротезированием тазобедренного сустава, по поводу метастаза рака предстательной железы в головку бедренной кости. Для имплантации чашки эндопротеза, выполнена остеопластика дна вертлужной впадины блоками /3-трикальцийфосфата. У пяти пациентов процесс локализовался в бедренной кости и по одному пациенту имели поражение лучевой кости, ключицы, фаланги пальца, пяточной и большеберцовой костей (табл. 2).

Таким образом, в основной и группе сравнения преобладали (-60%) пациенты в возрасте от 19 до 40 лет. То есть, по возрасту эти группы были сопоставимы и представлены преимущественно лицами молодого возраста. Среди патологических процессов в обеих группах преобладали костные кисты и энхондромы (табл. 2).

Таблица 2.

Распределения больных по локализации поражений костной ткани доброкачественными и опухолеподобными процессами в основной группе и группе сравнения Локализация Заболеваний Основная группа -1; Группа сравнения -II. Фаланга Пальца Ключица Лучевая кость Пяточная Кость Больше-берцовая кость Бедренная кость Плечевая кость Подвздошна я кость

Остеобласто-кластома I 1

II 1 1

Энхондрома I 4 1

II 1

Костная киста I 1 1 1

II 1 2

Фиброзная дисплазия I

II 1 1

Костно-хрящевой экзостоз I 1

11 1

Метастаз рака предстательной железы I

11 1

ВЫВОДЫ

1. Исследована морфологическая организация, химический, физический состав, пористость и прочностные свойства скелета натуральных кораллов семейства Acroporidae. Установлено, что все образцы (за исключением вида Montipora digitata) представлены закристаллизованным арагонитом, имеют сквозные мелкие и крупные (диаметром от 0,1 до 1,0 мм) поры с тонкими стенками, обладают развитой поверхностью с зерном в нанодиапазоне и по прочностным свойствам (19,2-29,2 МПа) в 4 - 6 раз превосходят традиционно используемые кальций-фосфатные керамические материалы.

2. Показано, что все испытанные образцы натуральных кораллов не токсичны, обладают выраженными матриксными и адгезивными для клеток свойствами, способствуют распластыванию и активной экспансии клетками поверхности кораллов, включая поровые пространства, способствуя их пролиферации. Натуральные кораллы (в отличие от кальций-фосфатных керамических материалов) как матриксы для мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток in vitro обладают остеоиндуктивными свойствами, вызывая экспрессию в этих клетках генов остеодифференцировки, кодирующих щелочную фосфатазу, остеопонтин, сиалопротеин II и коллаген I типа.

3. В эксперименте, на группе лабораторных животных (8 крыс) установлено, что натуральные кораллы семейства Acroporidae являются биосовместимыми: при динамическом морфологическом исследовании подкожно введенных лабораторным животным имплантатов отмечена их постепенная биорезорбция, образование правильно организованной соединительной ткани с выраженной неоваскуляризацией; признаков воспалительных реакций, некрозов и других проявлений отторжения на всех сроках до 13 недель не выявлено.

4. При репарации окончатого костного дефекта у крыс гранулами натурального коралла установлено, что этот биоматериал ускоряет регенеративные процессы, инициируя органотипическое замещение дефекта путем периостального остеогенеза, в течение 6-9 недель.

5. Рентгенологическая и морфологическая картина реконструкции костной ткани в зоне обширного сегментарного дефекта бедренной кости барана монолитным коралловым имплантатом свидетельствует о том, что скорость биорезорбции этих материалов соответствует скорости неоостеогенеза и натуральные кораллы обладает остеокондуктивными свойствами, что и обеспечивает быстрое органотипическое восстановление костной ткани, в течение 4-6 месяцев.

6. По результатам клинического исследования можно отметить высокую скорость резорбции натуральных кораллов (как вышедших в мягкие ткани, так и в зоне имплантации) сопоставимую со скоростью репарации кости. Так, при динамическом наблюдении (к 18-24 месяцам) у всех пациентов в основной группе определяется практически полная резорбция натуральных кораллов с реконструкцией костной ткани. Положительным моментом этих имплантатов является отсутствие формирования вокруг них соединительнотканной капсулы, которая может отграничивать имплантируемые материалы и снижать их остеопластические свойства.

7. В группе сравнения первые признаки резорбции /З-трикальцийфосфата отмечаются через 8-12 месяцев. Замещение костного дефекта в этой группе идет медленно, в основном за счет разрастания соединительной ткани, что свидетельствует о низких остеоиндуктивных свойствах кальцийфосфатных материалов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанные модели искусственных дефектов костных структур у мелких и крупных лабораторных животных целесообразно использовать для изучения закономерностей посттравматического остеогенеза, влияния на этот процесс различных факторов, в том числе новых методов костной пластики и новых остеопластических материалов.

2. Натуральные кораллы могут быть рекомендованы в качестве остеопластических материалов как в гранулированном виде, так и в виде цельных блоков (в зависимости от места и объема дефекта) для реконструкции костных структур (в том числе несущих осевую нагрузку), т.н. после травматических переломов, остеотомий и резекций при доброкачественных опухолевых поражениях костной ткани.

3. Обязательными условиями костной пластики являются полное заполнение дефекта коралловым имплантатом, плотный контакт с костным ложем, хорошая стабилизация конструкции и достаточная иммобилизация оперированного сегмента.