Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Реконструктивная хирургия органов и тканей с применением матричных форм препаратов (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

ПАНЬКО Сергей Владимирович

РЕКОНСТРУКТИВНАЯ ХИРУРГИЯ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ МАТРИЧНЫХ ФОРМ ПРЕПАРАТОВ

(ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.00.27. - хирургия и 14.00.25,- фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Н. Новгород -1997

Работа выполнена в Витебском филиале научно-исследовательского института радиационной медицины МЗ РБ (директор - доктор медицинских наук C.B. Жаворонок)

Научные консультанты:

Заслуженный деятель науки РФ, академик РАМН, профессор

Заслуженный деятель науки РБ, доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Б.А. Королев

И.Н. Гришин

A.Г. Сапожников

ДЛ. Пнковскнй Н.Г.Луд

B.Е. Новиков

Ведущая организация - Научный центр хирургии РАМН

Защита состоится "04 " Д к- |ре и. 1997 г. В_час. на заседании диссертац

онного Совета Д. 084.39.02 Нижегородской медицинской академии по адрес 603600 Н.Новгород, пл. Минина, 10/1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородской МГА. Автореферат разослан " " и ¿«а- т^ 1997 г.

Ученый секретарь Совета, д.м.н., профессор

IO.M. Зншаитович

АКТУАЛЬНОСТЬ И ОСОБЕННОСТИ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ПОДХОДОВ

Развитие хирургии сегодня невозможно без использования достижений фармакологии, физиологии, биохимии, генетики, биотехнологии, иммунологии и других фундаментальных наук. Современная хирургия обладает мощным арсеналом пластических способов и материалов, позволяющих реконструировать, а при необходимости и полностью замещать тот или иной орган или систему организма. Основные достижения в области пластической и реконструктивной хирургии обусловлены как совершенствованием техники хирургических вмешательств при пересадках, пластиках органов и тканей, так и внедрением новых подходов, способов, схем предупреждения и лечения послеоперационных осложнений с применением антибактериальных, иммунокорреги-рующих, антисептических, антикоагуляционных и других лекарственных препаратов.

При формировании концепции преимуществ применения мишенно-транспортных подходов с использованием пролонгированных форм лекарственных препаратов при реконструкции, замещении органов и тканей были использованы результаты наших собственных исследований и данные литературы, посвященные пластике кожи, сердечно-сосудистой реконструктивно-пластической хирургии [Б.А. Королев, 1984], хирургии трахеи с замещением окончатых и протезированием циркулярных дефектов [М.И. Перельман, 1988], пересадке костного мозга (ТКМ) и способам коррекции основных послеоперационных осложнений, возникающих при различных видах пластики и пересадки. Течение послеоперационного периода во многом определяется происхождением, составом и качеством используемого при выполнении реконструк-тивно-заместительных операций пластического материала и лекарственной формой препарата или композиций лекарственных веществ заданного действия, эффективность применения которых можно повысить с помощью адекватного изменения подходов к выполнению самих операций.

ОСНОВНАЯ КОНЦЕПЦИЯ исследования состоит в возможности улучшения результатов реконструктивного замещения патологически измененных органов и тканей за счет повышения направленности терапевтических эффектов препаратов селективного действия с помощью разработки технологий включения их в депонированные формы лекарственных веществ комплексного действия и посредством разработки хирургической техники рекопструктивно-восстановнтельных операций на органах и тканях с применением пролонгированных матричных форм лекарственных веществ, позволяющих осуществлять направленный транспорт лекарственного вещества к клетке-или органу- мишени и использовать его преимущества с целью уменьшения побочных действий препаратов, повышения их терапевтической эффективности при одновременном снижении доз.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование выполнено с целью разработки эффективных-способов и методов (операций) реконструкции и замещения морфо-функциональных дефектов органов и тканей, позволяющих использовать преимущества направленного транспорта и(или) депонирования пролонгированных лекарственных форм препаратов.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Сформировать концепцию приемлемости и преимуществ применения мишенно-транспортных подходов с использованием пролонгированных форм лекарственных препаратов при различных видах реконструкции органов и тканей.

2. Апробировать экспериментальные образцы композиционных пролонгированных форм лекарственных препаратов (иммуносупрессантов, цитоетатиков, антикоагулянтов и др.) на основе биополимеров медицинского назначения и изучить наличие у них свойств, необходимых для повышения селективности и эффективности действия основных терапевтических компонентов.

3. Разработать технику ' оперативных вмешательств замещения морфо-функциональных дефектов различных органов и тканей (кожа, трахея и костный мозг), позволяющую во время операций осуществлять направленный транспорт и(или) депонирование, аппликацию композиционных матричных форм, содержащих комплекс препаратов заданного действия.

4. Исследовать реконструктивио-замсстительныс возможности и преимущества разработанных лекарственных форм и способов их применения (операций) на моделях пластики кожи, гетеротопной пересадки сердца, а также операциях пластики и ал-лоперссадки трахеи, костного мозга.

5. Провести обоснование перспективности и эффективности клинического применения в реконструктивно-заместительной хирургии органов и тканей и других разделах хирур1 ии разработанных подходов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ И ОХРАНОСПОСОБНОСТЬ:

1. Получены новые технологии синтеза и проведена экспериментальная апробация пролонгированных матричных форм из биополимеров медицинского назначения: а) липосфер, содержащих маслорастворимые препараты - иммуносупрессангы циклоспорин А и FK-506 (tacrolimus); б) микросфер, содержащих цитостатик адриамицин; в)композици<мшых микрокапсул, включающих иммуиосупрсссант, антигены, гипокоа-гулянт и т.д.

2. Разработаны модели и техника выполнения операций реконструкции органов и тканей с применением пролонгированных матричных форм антибактериальных, иммуносу-прессивных, цитостатических и других препаратов и их комбинаций с различными биологически активными веществами.

3. Получены новые научные данные о высокой эффективности применения преимуществ теории и практики направленного транспорта различных лекарственных препаратов

в реконструктивно-заместительной хирургии за счет повышения селективности их действия, достигаемого с помощью совершенствования хирургических подходов.

Результаты исследования охраноспособны, о чем свидетельствуют положительные решения ВНИИГПЭ о выдаче авторского свидетельства СССР на изобретение и патента РФ, а также приоритетные справки Государственного патентного ведомства РБ на: "Способ получения магниточувствительных микросфер с адриамицином" ВНИИГПЭ №500356/14(072358) 27.05.92; "Способ пересадки костного мозга в область кости в эксперименте" ВНИИГПЭ № 503479/14(010517) 24.04.95. ; "Способ получения микрокапсул" ГПВ РБ за №960183/из от 16.04.96.; "Способ перссадки трахеи" ГПВ РБ за №960301/из от 13.06.96.; "Способ пересадки слизистой трахеи" №960485/из от 01.10.96.; "Способ пересадки трахеи в эксперименте" №960486/из от 01.10.96.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

1 .Разработаны технологии синтеза, созданы и апробированы опытно-экспериментальные образцы различных пролонгированных матричных форм из биополимеров медицинского назначения, содержащих селективно-действующие иммуно-супрсссанты, цитостатик и другие биологически активные компоненты, повышающие эффективность и избирательность их действия.

2.Показана перспективность разработки и клинического использования рскон-структьивно-заместительных операций органов и тканей с применением пролонгированных матричных форм антибактериальных, иммунокоррегирующих, антисептических, антикоагуляционных и других лекарственных препаратов, а также их комбинаций с различными биологически активными веществами, так как данные оперативные вмешательства обеспечивают в послеоперационном периоде избирательность действия терапевтических агентов и эффективное предупреждение основных послеоперационных осложнений.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ СЛЕДУЮЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1.Применение в реконструктивно-заместительной хирургии композиционных лекарственных форм препаратов, включающих в свой состав взаимопотенцирующис лекарственные вещества и биологически активные субстанции, повышающие избирательность (направленность) терапевтического действия, позволяет разрабатывать качественно новые операции пластики и замещения органов и тканей.

2.Совершенствование оперативных приемов, применяемых в реконструктивно-заместительной хирургии органов и тканей, с учетом теории и практики направленного транспорта композиционных пролонгированных лекарственных форм препаратов, позволяет существенно снизить или предотвратить развитие основных послеоперационных осложнений даже при введении субтерапевтических доз препаратов с одновременным снижением их побочных действий, а также усилением основного эффекта.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ: Основные положения диссертации внедрены1.

В научные исследования путем использования полученных результатов в работе следующих учреждений: лаборатории клеточного иммунитета НИИ РМ и НИИ Э и М им. Н.Ф.Гамалеи АМН РФ; г. Москва; лаборатории инфекционной и неинфекционной иммунологии ВФ НИИ РМ, г.Витебск. В учебный процесс путем использования полученных результатов при чтении лекций по оперативной хирургии студентам 3-4 курса лечебного факультета ВОДНМИ, г.Витебск. В клиническую практику путем; издания методических рекомендаций "Элементы пластики и трансплантации кожи, костного мозга и трахеи", утвержденных МЗ РБ в качестве официального документа от 04.06.96 г ; внедрения методов пластики слизистой трахеи в ЛОР отделении Витебской областной клинической больницы.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ

По данным исследования опубликовано 38 печатных работ, из них 9 за рубежом, монография "Протезирование трахеи", получено два положительных решения ВНИ-ИГПЭ на изобретения, а также четыре заявки с приоритетом ГПВ РБ. Основные положения работы доложены на болгаро-советском симпозиуме "Магнитобиология и магнитотералия"., София, 1989; XXIII General Assembly of the International Union of Radio Scicnce (URSI).- Prague, 1990.; 4-ой республиканской конференции "Научно-практические аспекты сохранения здоровья лиц, подвергшихся радиационному воздействию в результате аварии на ЧАЭС"., Могилев, 1994; Конференции "Фармакологические свойства новых химических соединений и некоторых лекарственных препаратов", Минск, 1994.; III съезде Белорусского научного общества иммунологов и аллергологов,- Гродно,1995.; XI Съезде белорусских хирургов,- Гродно,

1995.; International Congress of Mucosal Immunology,-San Diego, USA, 1995.; Joint Annual Meeting Allergologie and Immunologie, Vienna, Austria, 1995.; Международной конференции посвященной 10 летию аварии на ЧАЭС "Медико-биологические эффекты и пути преодоления последствий аварии на ЧАЭС",- Минск, 1996; Декабрьских чтениях по неотложной хирургии на секции "Новые направления в хирургии",- Минск,

1996. Диссертация апробирована на межинститутской конференции Витебского филиала НИИ радиационной медицины и Витебского медицинского института 18 октября 1996 х-ода.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 261 странице машинописного текста, включая 90 рисунков и 20 таблиц, и состоит из введения, шести глав, выводов, практических рекомендаций. Библиографический указателя включает 236 источников, из них 82 работы отечественных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Технологии получения опытных образцов матричных форм иммуносупрессан-тов, цитостатиков и композиционных микрокапсулированных препаратов разработаны совместно с сотрудниками кафедр технологии лекарств, аналитической химии и фармацевтической химии Витебского мединститута. При этом использовались следующие препараты: Адриамицин (Adr)- "Adriablastin" / Pharmitalia (Италия); Циклоспорин A (CSA)- "Sandimmun" / Sandoz (Швейцария); препарат и коммерческая форма FK-506 из Exploratory Research Laboratories, Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd., Tokodai, Tsukuba, Ibaragi (Япония) любезно предоставлены профессором Nabutaka Imamura.

Изучение свойств матричных форм in vitro проведено совместно с сотрудниками лаборатории клеточного иммунитета НИИ ЭиМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН и лаборатории 2.4. ВФ НИИ РМ . При изучении in vitro депо-форм препаратов использовалась реакция смешанных культур лимфоцитов (РСКЛ) [N.G. Testa, 1993]. Замер количества включившегося в клетки меченого тимидина (Amersham, UK) производился коллектором Otto Hiller Scientific Equipment (USA). Результаты выражались в количестве импульсов бетта-распада в минутуДОРМ). Изучение функциональной активности пери-тонеальных макрофагов проводилось биохимическим способом по методу Диксоиа-Пурдом в модификации Г.Б.Кириличевой с соавт; 1987.

Исследование эффективности разработанных способов аллопластики кожи проводилось методом определения средних сроков приживления пересаженных лоскутов и с помощью морфологического исследования. Операция аллогенной гетеротопной трансплантации сердца проводилась по способу R.I. Fulmer et al., (1963) с последующей регистрацией его электрической активности на аппарате "ЭЛКАР".

Изучение динамики заживления окончатых дефектов трахеи проводилось с помощью планиметрии [K.M. Фснчин, 1979]. Коэффициент стенозирования циркулярных аллотрансплантатов трахеи определяли отношением диаметра аллозрансплантата до пересадки к его диаметру в разные сроки после операции.

При изучении эффекта удержания вводимых донорских клеток костного мозга применялся метод их радиоизотопной метки Fe-59, описанной C.D.P. Dunn et al., 1980. Количество импульсов в минуту (СРМ) определялось на счетчике Gamma 5500/ Becman (США). Исследование эффективности предупреждения отторжения костномозговых трансплантатов проводили с помощью получения эктопических очагов кроветворения [И.Л. Чертков, 1986] с оценкой морфологической структуры с помощью микроскопа МССО-2 и приготовления серийных микропрепаратов.

При изучении влияния разработанной операции на течение послеоперационного периода применялась модель индукции реакции "трансплантат против хозяина" (РТПХ) введением иммунокомпетентных клеток (ИКК) родительского штамма C57BL летально облученным (РУМ-17) реципиентам Fl (CBAxC57BL/6 [A.C. Шевелев, 1976] и исследование селезеночного индекса (СИ) [Р.В. Петров, 1989].

Для морфологического изучения структурных изменений препараты органон и тканей забирались в 10% раствор формалина, после недельной фиксации производилась их парафиновая заливка и приготовление серийных срезов на микротоме фирмы Richter (Австрия). Окраска материала производилась по общепринятым гематологическим методикам гсматоксилин-эозином или по Романовскому-Гимза, а также при изучении структуры трахеи по Харту, Гейденгейну, Футу [А.Г. Сапожников, 1984]. -

Экспериментальные животные. Подбор животных регламентировался приказом МЗ СССР №775 от 12.02.77 г. "О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм исследования экспериментальных животных". Использовались мыши инбредных линий СВА, C57BI/6, BALB/c и гибриды FI(CBAx С57В1/6), а также лабораторные кролики, крысы Wistar.

Полученные во вссх сериях исследовании результаты подвергались компьютерной (ПВМ) обработке с использованием пакета программ для статистической обработки - "Microsoft Excel" версия 5.

1. КОМПОЗИЦИОННЫЕ МАТРИЧНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Первоначальным этапом исследования явилось создание технологий синтеза и экспериментальных образцов композиционных пролонгированных форм лекарственных препаратов (иммуносупрессантов, цитостатиков и др.) с применением биополимеров медицинского назначения и изучение у них свойств, необходимых для повышения селективности и эффективности действия основных терапевтических компонентов.

1.1. Пролонгированная форма для Циклоспорина А и FK-506

В основу разработки технологии получения пролонгированных лекарственных форм иммуносупрессантов Циклоспорина А и FK.-506 (приоритет ГПВ РБ за №960183/из от 16.04.96) легли уже известные способы получения микрокапсул из производных целлюлозы [Н.Р. Merkle, 1973]. Нами разработана технология получения микрокапсулированных лекарственных форм препаратов, которая заключается в том, что на водный раствор натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, используемой в качестве эмульгатора для первичной эмульсии, содержащей масляный раствор лекарственного вещества или эмульсии типа "(вода в масле)- в воде", действуют при различных температурных условиях водным раствором соли поливалентного металла и затем полученную первичную оболочку капсул перешивают комплексообразователями. Данный способ позволяет осуществлять процесс микрокапеулирования без применения токсичных для организма органических и неорганических веществ. Выбор масляной фазы, как основы для включения супрессантов и физико-химических условий синтеза, обусловлен тем, что Циклоспорин А [И.Б. Обух, 1988] и FK-506 [Т. Kino, 1987] являются пептидными метаболитами и растворимы в масле и спирте. Модельные опыты показали, что данная технология позволяет включать в микрокапсулы от 60 до 80% маслорасторимого препарата. Для придания направленности действия препаратам с помощью введения "векторных" антигенов (Ag), были разработаны этапы тех-

нологии, включающие получение микрокапсул, содержащих белковые антигенные комплексы без нарушения их конформационной структуры. Предложенный способ микрокапсулироваиия позволяет эффективно микрокапсулировать водо-, масло- и нерастворимые препараты без применения токсичных для организма органических и неорганических веществ при значительном варьировании температурных условий, значений pH, эмульгаторов, составов масляной фазы, осадителей, комплексообразовате-лей. Пролонгированные формы разработаны совместно с сотрудниками кафедр технологии лекарств и фармацевтической химии ВОДНМИ.

1.2. Депо-форма Адриамицина

Из пролонгированных форм цитостатиков наиболее широкое применение в клинике и эксперименте нашли их депо-формы в виде микросфер, обладающие преимуществами в виде более выраженной пролонгации эффекта даже по сравнению с липо-сомами[р. Schoutcn, 1993].

Одним из способов повышения целенаправленности доставки пролонгированной формы цитостатика является применение матричных носителей, включающих в свой состав магнетит, что позволяет с помощью внешнего воздействия магнитным полем удерживать микросферы в опухолевой ткани при введении[К.1. Widder, 1980].

На основе метода фазового расслоения нами была разработана технология изготовление микросфер из смеси желатина и гуммиарабика, содержащих адриамицин, а также изучены параметры высвобождения цитостатика in vitro (ВНИИГПЭ №500356/14(072358) 27.05.92). Установлено, что синтезированные микросферы способны длительное время удерживать цитостатик в депонированной форме, так как за 30 суток исследований in vitro из них элюировалось только около 11% препарата. Такой выраженный пролонгированный выход препарата объясняется малыми размерами микросфер и применением поочередно двух дубящих реагентов (глутарового альдегида и формальдегида). При изучении выраженности ингибирующего влияния разработанной депонированной формы адриамицина на метаболическую функцию лимфоцитов и макрофагов было установлено, что внутрибрюшинное введение микросфер, содержащих адриамицин в дозе 0,8 мг/кг веса животного, вызывает достоверное снижение функциональной активности макрофагов перитонеального экссудата начиная с 15 по 30-ые сутки наблюдений, тогда как введение аналогичной аликвоты микросфер без препарата и равной дозы коммерческого адриамицина не вызывало подобного эффекта. Результаты экспериментов по определению эффективности применения депонированной в микросфсрах и растворимой формы адриамицина в РСКЛ периферической крови и костного мозга человека позволили сделать заключение, что адриамицин в депонированной его форме (по сравнению с коммерческой растворимой) обладает таким же или более сильным ингибирующим действием, причём с уменьшением концентрации адриамицина эти различия увеличиваются. Так, при концентрации 1 мг/кг веса растворимая форма практически не отличается от депонированной - 154,8±31,4

DPM от 105,25±9,7 DPM соответственно, P>0,05; но при концентрации 0,1 мг/кг - достоверно отличается - 608,2±60,25 DPM от 140,2± 12,4 DPM соответственно, Р<0,002; при 0,01 мг/кг - также достоверно отличается - 6815±692 DPM от 752,65+194 DPM соответственно, Р<0,001. Это усиление ингибирующего действия инкорпорированного в микросферах адриамицина по сравнению с его коммерческой растворимой формой может быть объяснено условиями опыта в конечном объёме лунки культуральной плашки, когда в отличие от целого организма утилизации и выведения цитостатика не происходит. В то же время, его всё-таки оказывается достаточно для создания действующих локальных концентраций и ингибирования адсорбированных клеток из-за малых пространственно-объёмных соотношений с ними [F. Olson, 1982], так как микросферы обладают неспецифической способностью к адсорбции на поверхности клеток при малых количествах инкорпорированного адриамицина. Данные литературы подтверждают, что большую роль в снижении общетоксического действия препаратов играют факторы близкоконтактного пространственного взаимодействия микрочастиц и клеток-мишеней и то, что та часть препарата, которая включена в микрочастицы обладает зачастую большими сорбционными способностями, чем свободная растворенная фракция [N. Willmott, 1992].

Результаты экспериментов по определению эффективности применения депонированной в микросферах и растворимой формы адриамицина в PCKJI периферической крови человека позволили выявить, что адриамицин в депонированной форме обладает более сильным ингибирующим действием Р<0,01 по сравнению с растворимой коммерческой, причем микрокапсулирование цитостатика вызывает отчетливое потенцирование ингибирующего эффекта как в терапевтической (0,212±0,05 - единицы оптической плотности по методу Т. Mossman, 1983), так и в субтрапевтических дозах, тогда как коммерческая форма адриамицина в дозе 0,01 мг/кг в данной модели in vitro не вызывала, ингибиции пролиферативного ответа на аллоантигены (0,364±0,03; Р>0,05) по сравнению с контролем.

• Из приведенных результатов можно заключить, что разработанная нами депонированная форма адриамицина более эффективно (по сравнению с коммерческой растворимой формой) ингибирует как функциональную активность антигенпрезенти-рующего звена трансплантационного иммунитета, так и пролиферацию активированных лимфоцитов, являющихся эффекторпым звеном феномена тканевой несовместимости. Разработка технологии получения микросфер и исследование их свойств проведено совместно с сотрудниками ЦНИЛ ВОДНМИ, лаборатории 2.4. ВФ НИИ РМ МЗ РБ и лаборатории клеточного иммунитета НИИ Э и М им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

1.3. Пластические материалы на ко.ъшгеновой основе

Для пластики окончатых дефектов трахеи нами использовались серийно выпускаемая коллагеновая губка с антисептиком хицоксидином из расчета 10 мг на 1 г белка, "коллартек" - композиционный биосинтетический материал, состоящий из 3 слоев:

внутреннего (предлежащего к просвету трахеи)- лавсановой сетки ПОСМ-2, среднего -уплотненного коллагена, дубленного в парах формальдегида для замедления его резорбции, и наружного - коллагсновой губки с иммобилизированным на ней метилура-цилом из расчета 50 мг на 1 г сухого веса коллагена, а также "трахекол" - антибактериальный композиционный биосинтетический имплантат на основе коллагена, обладающий герметичностью, различной скоростью резорбции в зависимости от технологии дубления, возможностью фиксирования на нем различных антисептиков, антибиотиков и репараптов, что важно для пластики дыхательных путей, где происходит непосредственный контакт с внешней средой. Составными элементами имплантата являются уплотненный коллаген, дубленный в парах формальдегида с антибиотиком гентамицином (5%), антисептиком хиноксидином (1%) и репарантом метилурацилом (5%), с гладкой поверхностью, прилежащей к просвету трахеи; трикотажная лавсановая сетка ПОСМ-2, расположенная в толще уплотненного слоя, пористая коллагено-вая губка с набором антибиотиков и репарантов. Отличающими особенностями данного имплантата являются следующие качества: наличие гладкой внутренней поверхности, прилегающей к просвету трахеи, способствующей сохранению хорошей дренажной функции трахсобронхиального дерева; различная скорость резорбции уплотненного и пористого слоев коллагена [A.M. Хилькин и соавт., 1976], что сохраняет ригидность внутренней части имплантата при рассасывании наружного слоя, наличие каркасной лавсановой сетки, ограничивающей рост грануляционной ткани в просвет трахеи, на которой формируется вновь образующаяся трахеальная стенка; фиксация на коллагене антибиотиков, антисептиков и репарантов, уменьшающих количество воспалительных осложнений и ускоряющих процессы репарации; возможность моделирования имплантата по форме трахеи. Стерилизуется имплантат гамма-излучением в дозе 2,5 Мрад. Перечисленные пластические матричные материалы изготовлены в ЦНИО НИИ ММА им. И.В.Сеченова.

2. ОПЕРАЦИИ РЕКОНСТРУКЦИИ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ (ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ)

В разделах основных исследований были проведены разработки новых способов оперативных вмешательств, позволяющих реконструировать морфо-функциональные дефекты различных органов и тканей и во время операций осуществлять направленный транспорт, депонирование или аппликацию композиционных матричных форм, содержащих комплекс препаратов заданного действия.

2.1. Пластика кожи

Современная пластическая хирургия кожи в основном базируется на концепции максимального замещения раневых дефектов собственными тканями- аутотканями. Однако, аллогенная кожа в виде расщепленных лоскутов является неотъемлемым элементом современного лечения термической травмы, сочетающейся с обширными ожо-

гами и лучевым поражением [И. Литтманп, 1985]. При лучевых ожогах, вызванных у-облучением или рентгеновским облучением, когда гибнет не только собственно кожа, но и подкожные ткани, образовавшийся кожный дефект нельзя заменить собственной расщепленной кожей из-за нарушения трофики подлежащих тканей. В таких случаях для свободной пересадки следует отдавать предпочтение аллопластическим тканям, кожным лоскутам донора или трупной консервированной коже, взятым в стерильных условиях, использование которых позволяет подготовить основание раны к последующей лоскутной аутопластике [D. Pitzlcr et al., 1995].

Целью данной серии экспериментов явилась разработка модели операции аллопластики обширных дефектов кожи с применением пролонгированной матричной формы иммуносупрессанта избирательного действия FK-506 (tacrolimus) j-i изучение влияния данной операции на приживление полнослойных кожных лоскутов. В качестве контрольных тестов эффективности метода использовались определение средних сроков приживления и морфологические исследования.

В предварительной серии экспериментов изучался вопрос сохранения биологического действия микрокапсулированной формы FK-506, наличие или отсутствие у нее пролонгированного действия, повышения эффективности и дозозависимости последней, а также подбор оптимальной дозы препарата для примененной модели. Было установлено, что как впутрибрюшинное введение в течение 10 суток после операции коммерческой формы FK-506 в дозе 0,1 мг/кг/сут (14,36±1,2 сут.), так и подкожное однократное введение липосфср с равной суммарной дозой иммуносупрессанта (20,62±1,24 сут.) не вызывает достоверного увеличения продолжительности жизни трансплантата по сравнению с соответствующими им контрольными группами (нслеченные 12,09±0,87 сут.) и реципиентами, леченными липосфсрами без препарата (плацебо; 15,54±1,66 сут.). Пятикратное увеличение дозы препарата- его коммерческой формы (впутрибрюшинное введение коммерческой внутривенной формы FK-506 в течение 10 суток после пересадки в дозе 0,5 мг/кг/сут; 35,18± 1,9 сут.) и пролонгированной (подкожное введение липосфер во время пересадки, содержащих FK-506 в дозе 5,0 мг/кг; 54,55±2,51 сут.) вызывало достоверное продление сроков приживления трансплантатов по сравнению с контрольными группами для обоих форм, а при использовании пролонгированной формы отмечалось так же достоверное увеличение (Р=0,018) сроков отторжения лоскутов и по сравнению с предыдущей скрининговой дозой (подкожное введение липосфер во время пересадки, содержащих FK-506 в дозе 1,0 мг/кг). Наиболее длительные сроки выживания пересаженного лоскута были отмечены при подкожном однократном введении липосфер, содержащих FK-506 в дозе 50,0 мг/кг (67,65-80,89), хотя и десятидневное курсовое введение равной дозы внутривенной формы препарата (51,73-65,37) вызывало не менее выраженное влияние на сроки его приживления, поскольку если сила влияния фактора увеличения дозы супрессанта в пролонгированной форме (h2APr) по сравнению с предыдущей скрининговой дозой составила 63,36%, то такое же увеличение дозы коммерческого препарата оказало влия-

12

ние (h2Acom) по данным однофакторного анализа равное 76,16%. Эти результаты позволяют заключить, что как в случае воздействия на процесс отторжения кожных лоскутов с помощью курсового введения FK-506 в виде его коммерческой формы, так и в случае введения разработанной пролонгированной формы, эффект в обоих случаях является дозозависимым, причем, как показал факторный анализ, наибольшее влияние этого фактора отмечается в обоих случаях при повышении общей дозы с 1,0 до 5,0 мг/кг веса реципиента (h2Apr=88,81% и h2Acom =85,06% соответственно).

По данным двухфакторного анализа было установлено достоверное влияние (Р<0,001) изменения дозировки FK-506 на сроки приживления, причем в первых группах препарат вводился в виде десятидневного курса, а микрокапсулированная форма -однократно. Исходя из вышеизложенного было установлено, что в данной модели замещения полнослойного кожного дефекта наиболее оптимальной дозой является доза препарата, лежащая в пределах 5,0-50,0 мг/кг веса реципиента.

Исследования по изучению эффективности операции аллопластического замещения кожных дефектов с введением композиционных микрокапсул, включающих FK-506 и донорспецифические антигены ("Ag-FK-506-DDS"), были проведены с помощью модели операции реципрокной пересадки аллогенных полнослойных лоскутов размером 1,0-1,2 см2. Сравнение средних сроков выживаемости аллотрасплангатов каждой группы по отношению к другим группам методом дисперсионного анализа показало, что наибольшая средняя продолжительность выживания кожных лоскутов (154,66 -208,87 суток) наблюдается при подкожном введение липосфер, содержащих AAg и FK-506 в дозе препарата по 15,0 мг/кг, за 7 суток до пересадки, в день пересадки, через 14 суток после и последующем ежемесячном введении комплекса "Ag-FK-506-DDS". Причем эта схема позволила почти в три раза увеличить (Р<0,001) выживаемость кожных аллотрансплантатов по сравнению с группой, где применялось подкожное введение ("Ag-FK-506-DDS") в дозе препарата по 15,0 мг/кг, за 7 суток до пересадки и в день пересадки (50,22-64,24 суток), несмотря на то, что и сам фактор микрокапсулиро-вания (применения депо формы) в последней группе оказал выраженное влияние h2A=65,54% на результативный признак (Р<0,001) по сравнению с коммерческой формой FK-506 (внутрибрюшинное введение AAg вместе с коммерческой в/в формой FK-506 в дозе 4,0 мг/кг/сут в течение 7 суток до пересадки и в день пересадки, 22,28-28,92 суток).

Данные морфологических исследований позволили подтвердить результаты кли-нико-эксперимепгальных исследований других авторов о том, что пересаженная алло-генная кожа надежно защищает рану от механических повреждений, инфицирования, стимулирует регенераторные процессы, предупреждает септические осложнения и т.д. [В.И. Говалло, 1979; Henckel-von-Donnersmarck G. et. al., 1995]. Таким образом, данный эксперимент на модели операции реципрокного замещения кожных дефектов обосновывает элементы новых подходов в пластической хирургии, обеспечивающих возможность продления сроков приживления полнослойных чужеродных лоскутов с

помощью введения пролонгированной композиционной формы иммунокоррегирую-щих препаратов, а также показывает высокую эффективность и перспективность данного подхода при пластике обширных кожных дефектов. Полученные результаты согласуются с данными Н. Suzuki, Х.Н. Li, М. Miyamoto (1995) о том, что иммунокорре-гирующая терапия, включающая введение CSA и донорских антигенов до аллопластики, позволяет продлить жизнеспособность пересаженного (при необходимости повторно) лоскута на время, необходимое для подготовки операционного поля к аутопластике или регенерации собственной кожи реципиента.

2.2. Влияние комплексных матричных форм на функцию пересаженного миокарда

Целью данной серии явилась разработка экспериментальной модели операции гетеротоппой пересадки сердца с применением композиционной депо-формы селективно-действующего иммуносупрессанта FK-506 в комплексе с антигенами и гепарином ("Ag-FK-506-Hp-DDS"), а также изучение влияния разработанного способа на продолжительность функционирования трансплантата и реакции на него окружающих тканей реципиента.

Создание специфической неотвечаемости к чужеродным тканям и ее длительное поддержание является оптимальным вариантом курации послеоперационных осложнений, возникающих при аллогенном замещении органов и тканей [А.Ройт, 1991]. Подобные подходы при пересадке сердца в эксперименте уже разрабатываются за рубежом [J.J. Jeekel et al., 1973; В. Wasowska et al, 1989], однако, без учета преимуществ пролонгации данной системы "Ag-tacrolimus" [A. Romaniuk et al., 1989; К. Hisatomi et al., 1995].

Результаты исследования сроков функционирования (сутки) гетеротопно пересаженного миокарда показали, что практически все варианты предупреждения реакции отторжения (внутрибрюшипное - в/б введение коммерческой внутривенной формы FK-506 со дня пересадки в дозе 0,4 мг/кг/сут в течение 10 суток- 21,40±0,85; подкожное введение липосфер с гепарином без антигена и супрессанта 11,30±0,63; подкожное введение липосфер содержащих аллоантигены 12,20 + 0,73; подкожное - п/к введение липосфер, содержащих FK-506 в дозе 4,0 мг/кг- 21,70±0,82; в/б введение коммерческой внутривенной формы FK-506 в дозе 4,0 мг/кг, гепарина и аллоантигенов- 15,05±0,76; п/к введение "Ag-FK-506-Hp-DDS" в дозе FK-506 -4,0 мг/кг (31,80± 1,45); двукратное п/к введение "Ag-FK-506-Hp-DDS" в дозе FK-506 - 4,0 мг/кг, в день пересадки и на 14 сутки- 47,40±2,49) кроме однократного в/б введения во время пересадки коммерческой формы FK-506 в дозе 4 мг/кг (10,7±0,62), оказывают по данным дисперсионного анализа достоверное влияние на пролонгацию сроков функционирования трансплантата по сравнению с группой контроля реакции отторжения (8,85±0,43). Такой результат в группе с однократным внутрибрюшинным введением коммерческой формы FK-506 во время пересадки закономерен, поскольку несмотря на введение довольно-таки высокой дозы парентеральной формы препарата (4,0 мг/кг) эффект не наступает из-за

быстрого выведение иммуносупрессанта из организма. Исследованиями также установлено, что однократное подкожное введение синтезированной пролонгированной формы FK-506 в дозировке 4,0 мг/кг (21,7±0,82) обладает практически одинаковым терапевтическим действием с 10-ти дневным курсом послеоперационной терапии коммерческим иммуносупрессантом в дозе 0,4 мг/кг/сут (21,4±0,85). Наиболее же выраженное действие оказывает подкожное введение разработанной композиционной депо-формы FK-506 - "Ag-FK-506-Hp-DDS" (28,1-35,5), особенно при их повторном одновременном введении (41,0-53,8), причем ведущую роль в данных случаях играет фактор воздействия пролонгированной формы как для иммуносупрессанта, так и антигенов, что подтверждает достоверное различие результатов этих групп (Р<0,005 и Р<0,001) по сравнению с группой, где препараты и антиген вводились в виде раство-ра(15,05±0,76). В основных опытных группах (п/к введение "Ag-FK-506-Hp-DDS" и дозе КК-506- 4,0 мг/кг, а также двукратное п/к введение "Ag-FK-506-Hp-DDS" в дозе FK-506 - 4,0 мг/кг в день пересадки и на 14 сутки) явно прослеживается синергизм действия именно пролонгированных форм иммуносупрессанта и аллоантигенов, так как на 99% уровне достоверности имеются различия в длительности функционирования аллотрансплантатов между ними и группами, где вводились либо только липосферы с антигенами (12,20+0,73), либо только депо-форма препарата (21,7+0,82). Не исключено, что некоторую роль в усилении эффективности воздействия на реакцию отторжения в многокомпонентной системе "Ag-FK-506 -Hp-DDS" играет и сам носитель препаратов - липосферы (гепаринизированная оболочка), поскольку подкожное введение последних без антигена и препарата (11,30±0,63) достоверно, хотя и не на высоком уровне значимости (Р=0,05 - по данным дисперсионного анализа), продлевает функцию трансплантата по сравнению с контролем. Подобный вывод позволяют сделать и исследования других авторов об иммуномодулирующих свойствах полимеров, являющихся, например, носителями цигостатиков и позволяющих находить подходы к лечению резистентных к ним опухолей [С. Cuvier et al., 1992]. По данным К. Moloyama (1995) эффективным в эксперименте также является сочетанное применение интрати-мической инокуляции донорспецифических спленоцитов и подкожное введение FK-506 за семь дней до операции пересадки сердца, причем комбинированное применение этих подходов позволяет продлить время функционирования трансплантатов почти на порядок по сравнению с раздельным введение клеток и препарата за счет, вероятно, индукции временной специфической иммунологической толерантности [M. Tsugita et al., 1995], причем продления последней можно добиться повторными введениями разработанной композиционной микрокапсулированной формы. Кроме того известно, что сочетанное введение иммуносупрессантов CSA и FK-506 с гепарином, дипиридамолом при гетеротопной аллоперссадке сердца у крыс снижает уровень экспрессии антигенов МНС-П и отложение IgM и СЗ в интиме коронарных артерий аллотрансплантата [К. Hisatomi et al., 1995], которую можно увеличить по нашему мнению посредством повышения специфичности (направленности) воздействия самих иммунокорректоров

по принципу магической ловушки ("magic trap")- "там где антшен - там и нммуносу-прессант".

Таким образом, полученные в данной серии экспериментов результаты позволяют сделать.вывод, что экспериментальная модель операции гетеротопной пересадки сердца с применением пролонгированной формы FK-506 в комплексе с донорспецифи-ческими антигенами и гипокоагулянтом позволяет существенно продлить функционирование пересаженной миокардиальной ткани.

2.3. Замещение окончатых дефектов трахеи с применением матричных форм на ко.иагеноаой основе

Наиболее оптимальным материалом для пластики обширных окончатых дефектов трахеи следует считать собственные ткани организма, особенно аутотрахею и бронхи, однако опасность рецидива злокачественных опухолей препятствует широкому клиническому применению этих оперативных вмешательств. Использование для этих целей других тканей организма также возможно лишь для закрытия небольших отверстий трахеобронхиального дерева, так как при пластике больших дефектов необходимо дополнительное армирование трансплантата более жесткими конструкциями (проволока, спираль, сетка, протектор), которые осложняют как выполнение самой операции, так и течение послеоперационного периода. Кроме того, не во всех клинических случаях возможно "выкраивание" необходимых размеров лоскута ввиду тяжести состояния больного, большого объема оперативного вмешательства [М.И. Перель-ман., 1972; М.Г. Сачек, 1995].

Целью данной серии экспериментов явилось изучение эффективности применения биосинтетических матриц, имеющих в своем составе лекарственные препараты, при пластике окончатых дефектов трахеи и возможности предупреждения послеоперационного стенозирования пластически замещенного участка окончатого дефекта трахеи с помощь микрокапсулированпой формы антирепаранта, подавляющего соединительнотканные регенеративные процессы в тканях [H.R. Kimura et а!., 1992]- адриамицина.

При разработке операций пластики окончатых дефектов трахеи были проведены исследования с применением следующих биосинтетических матриц, имеющих в своем составе лекарственные препараты: коллагеновой губки(1 серия- 15 животных), коллар-тека (2 серия -21 животное), разработанного нами биосинтетического материала "трахскол" (3 серия- 24 наблюдения), в группе сравнения пластика дефектов трахеи производилась собственными мышцами шеи животного, окружающими трахею (4-серия - 7 кроликов); кроме того, в 5-ой серии (17-животных) изучена эффективность комплексного применения "трахекола" и гуммиарабик-желатиновых микросфер, содержащих адриамицин, полученных по разработанной нами технологии.

Анализ результатов замещения окончатых дефектов трахеи пластическими материалами показал, что послеоперационная летальность в первых четырех сериях составила 43,3%. Из 28 погибших животных в ближайшем и ранцем послеоперационном

периодах (1-30 сутки наблюдений) умерло 19 кроликов, а остальные 9 в различные сроки после пластики. Наименьшую послеоперационную летальность (20,0%) регистрировали при замещении дефектов "трахеколом". В зависимости от вида используемого пластического материала количество осложнений и послеоперационная летальность выглядели следующим образом. В первой серии осложнения развились у 8 животных. Наиболее частыми из них были стенозирование трахеи с абсцедирующей пневмонией, которые в 40% случаев приводили к гибели животных. При замещении дефектов "заплатой" из коллартска во второй серии опытов из 21 оперированного животного осложнения зарегистрированы у 11 кроликов. В различные сроки после операции летальные исходы зафиксированы в 10 случаях (47,6%). Анализ данных показывает, что в этой серии превалируют нагноительные процессы в легких (8 случаев), грануляционные стенозы трахеи (7 случаев) и осложнения, вызванные техническим несовершенством пластического материала (5 случаев). В четвертой серии из 7 оперированных животных у всех кроликов возникли осложнения (абсцедирующая пневмония, стеноз трахеи, паратрахеальная флегмона), приведшие к гибели в течение 2-х месяцев после операции. Основной причиной нарушения воздухопроходимости дыхательных путей в абсолютном большинстве случаев явилось стенозирование трахеи в области пластики. В третьей серии экспериментов из 24 оперированных кроликов осложнения (стеноз трахеи) наблюдали у 4-х животных, а послеоперационная летальность составила 20,5%. В пятой серии опытов на 10-ые сутки после пластики стандартного оконча-того дефекта "трахеколом" в область формирующегося кожного и трахсального рубцов с помощью чрескожной пункции вводилась суспензия микрокапсулированной формы адриамицина в субтерапевтической дозе 0,01 мг/кг в объеме 0,5 см3 в физрастворе с целью предупреждения гипергрануляций и стенозирования трахеи. В этой серии опытов в 100% случаев удалось избежать гибели животных от стеноза трахеи, а общая послеоперационная летальность составила 17,7%.

По данным планиметрического исследования у животных всех серий в первые сутки после оперативного вмешательства площадь раны не изменялась и соответствовала исходной - 32 мм2. Динамика процессов репарации при пластике коллагеновой губкой выглядела следующим образом: к 10-ым суткам размеры раны уменьшились на половину (15,6+0,60 мм2; Р<0,05) с хорошо заметной краевой эпигелизацией. Причем, различия в площади раневого дефекта к этому сроку были статистически достоверны в сравнении со всеми последующими сериями экспериментов. На 20-ые сутки послеоперационного периода при благоприятном течении раневого процесса размеры раны дыхательной трубки уменьшались вдвое и достигали 7,87±0,23 мм2 (Р<0,01). Это значение достоверно отличалось от размеров ран во 2-ой и 4-ой серии опытов, но не было статистически значима по отношению к 3-ей и 5-ой группам. Через 30 дней после операции площадь раны составила 2,96±0,12 мм2 (Р<0,01) и являлась минимальной по сравнению с оставшимися сериями.

При использовании колларгека для замещения раневого дефекта трахеальной

стенки динамика заживления раны была замедленной по сравнению с предыдущей серией опытов. К 7-ым суткам послеоперационного периода площадь дефекта уменьшалась лишь на 0,15 мм2 (Р<0,05), что являлось следствием прогрессирования воспалительного процесса со стороны трахеи и легких. На 15-ые сутки после операции размеры раны составляли 29,16±1,11 мм2, что достоверно (Р<0,01) превышало площадь дефекта в 1-ой и 2-ой сериях. Лишь через месяц после пластики трахеи размеры раны уменьшились приблизительно на половину (17,0±1,0 мм2; Р<0,05), но различия оставались статистически значимыми по отношению к остальным группам (Р<0,05), а завершение репарации трахеального дерева не наблюдалось даже через 90 дней, когда размеры раны становились минимальными (3,0±0,1 мм; Р<0,05).

В третьей серии опытов, где в качестве пластического материала применяли "трахекол", заживление раны происходило достаточно быстро: к 7-м суткам послеоперационного периода размеры раневого дефекта составили 24,0±2,3 мм2; Р<0,05), а через 15 суток площадь раны уже равнялась 11,510,28 мм (Р<0,01). Эти результаты достоверно отличались от 2-ой и 4-ой серии экспериментов и были недостоверны в сравнении с 1-ой и 5-ой сериями. Значительное уменьшение площади раневого дефекта (8,00±0,23; Р<0,01) зафиксировано к 20-м суткам после пластики, а через месяц после операции отмечалась хорошо выраженная эпителизация раны.

При пластике дефектов трахеи мышцами через 10 дней после хирургического вмешательства на трахее площадь раны уменьшилась до 25,3610,45 мм2 (Р<0,05), к 20-м суткам размеры дефекта трахеи равнялись 19,23+0,34 мм2 (Р<0,05), что достоверно отличалось от 1-й (Р<0,05) и 3-й (Р<0,05) и не было статистически достоверным (Р<0,05) в сравнении со 2-й серией экспериментов. В 5-ой серии опытов, где комплексно применялся "трахекол" и локальное введение в субтерапевтической дозе пролонгированной формы адриамицина, по данным планиметрии наблюдались существенные изменения по отношению к 3-ей группе в виде распределения пика заживления дефекта с 10-ых по 15-ые сутки (группа №3) на более поздние сроки (на 15-ые сутки размер раны 18,3+1,1 мм2, а через 30 суток 6,6+0,45 мм2). Такое смещение пика раннего закрытия дефекта трахеи, очевидно, обусловлено воздействием адриамицина, как аитирепа-ранта, что неоднократно подтверждено при местном апплицировании и инъецировании именно продленных микрокапсулированных форм этого цитостатика как в эксперименте, в частности, с целью предупреждения пролиферативной витреопатии, так и в клинике с целью предупреждения Рубцовых стриктур после операций по поводу глау-комы[Н. Кнтшга, 1992].

Таким образом, анализ динамики заживления ран трахеи при пластике различными материалами по данным планиметрического исследования показал, что наиболее быстрое уменьшение размеров дефекта трахеи происходит з 1-ой и 3-й сериях, где уже к 15-м суткам его площадь уменьшилась до 29,7-35,1% от исходных размеров. В то же время процесс репарации раны во 2-ой и 4-ой сериях оставался резко замедленным, и к этому сроку наибольшая площадь раневого дефекта составляла 91,12% и 77,4% со-

ответственно. На 30-е сутки послеоперационного периода в 1-й, 3-ей сериях опытов размеры раны уменьшались до 9,25%, 10,9%, в 5-й серии до 20,6%, а во второй серии площадь раневого дефекта к этому времени составила 59,1% от первоначального. К 45-м суткам дефект в зоне пластики определялся только во 2-ой серии опытов, а полное заживление здесь отмечалось лишь в третьем месяце наблюдений.

Гистологическое изучение структуры имплантата и зоны пластики в различные сроки после операции указывало на раннее восстановление функциональных свойств воздухоносной трубки в серии экспериментов с использованием разработанного нами биосинтетического материала "трахекола" (серия №3 и №5), где уже к 10-м суткам наблюдали практически полную эпителизацию тканевого сегмента, соединяющего края раны, а на 15-е сутки структура его слизистой практически не отличалась от интактной слизистой трахеи за исключением меньшего содержания реснитчатых клеток. В эти сроки начиналось довольно интенсивное формирование хрящевых колец в зоне пластики, проявляющееся в раннем периоде скоплениями небольших групп хондроцитов, а через месяц после операции - развитием хрящевых закладок во всех слоях тканевого сегмента с образованием хрящевых дубликатур на отдельных участках. Восстановление полноценного хрящевого каркаса трахеи завершалось к 1,5-2 месяцам эксперимента и характеризовалось своеобразным соединением хрящевых закладок "внахлест" либо их полной консолидацией с образованием целого хрящевого кольца, причем осуществлялась компенсация прилегающих друг к другу поверхностей хрящей путем прорастания участков одного хрящевого фрагмента в западения поверхности другого.

Активация процессов хрящеобразования в обоих сериях связана с наличием естественного новообразования хрящей стенки трахеи, а также с миграцией хондроцитов в коллагеновой губке и получением новых хрящевых закладок в тканевом мостике. Немаловажное значение на процессы репарации оказывали стимулирующие свойства коллагеновой губки, уплотненный слой которой сохранял свою структуру в виде отдельных фрагментов ячеек и перегородок, выполняя функцию каркасной основы в зоне "заплаты" до восстановления функционально полноценной трахеальной трубки.

Следовательно, применение в качестве пластического материала разработанной композиции "трахекол" способствовало более ранней по сравнению с другими материалами эпителизации тканевого сегмента в области дефекта стенки трахеи и обеспечило активную стимуляцию хрящеобразования. С другой стороны введение в комплексную систему лечения сублокальной инъекции субтерапевтической дозы депо-формы цитостатика после развития репаративных процессов предупредило в послеоперационном периоде сращение раневого дефекта трахеи с рубцовой тканью около-трахеальных оболочек без нарушения микроморфологической динамики заживления дефекта слизистой трахеи и процесса хрящеобразования.

Интерпретируя полученные данные с клинической точки зрения можно сделать заключение, что использование такого уникального по своей широте и эффективности в отношении новообразований (остеосаркома груди, рак головы, шеи) цитостатика

как адриамицин, применение его продленных форм позволяет на порядки усилить его основной эффект [A. Raham et al., 1990 ] при одновременном снижении побочных проявлений [M.V. Pimm et al., 1982], что подтверждает целесообразность применения разработанной депо-формы в хирургии трахеобронхиального дерева, так как пластика различных дефектов трахеи зачастую связана с лечением осложнений, вызванных онкологическими процессами. Кроме того, по нашему мнению, разработанные методы пластики с применением матриц на коллагеновой основе имеют практически неограниченные возможности к совершенствованию. Например, возможно сочегание данной операции с пересадкой лоскутов аутологичной слизистой дыхательных путей методом свободных трансплантатов слизистой [Z. Wang et al., 1995]. Нами был разработан подобный "Способ пересадки слизистой трахеи" (ГПВ РБ №960485/из от 01.10.96.), включающий трансплантацию эпителиального покрова в область раневой поверхности дыхательной трубки посредством интраоперационной или эндоскопической инокуляции культуры аутоэксплантата слизистой оболочки трахеи, не исключающий возможность "подсадки" аутологичной слизистой на коллагеновую основу пластического материала. Было установлено, что инокулированная культура слизистой оболочки дыхательной трубки способствует полной эпителизации раневого дефекта с сохранением обычной структуры эпителиального покрова.

Таким образом, разработанная операция пластики окончатых дефектов трахеи с применением полимерной матричной композиционной системы- "трахекол", состоящей из.пористого и уплотненного слоев коллагена с различной скоростью резорбции и армированного лавсановой сеткой наружного слоя, обладает рядом преимуществ, так как обеспечивает морфологически более полное восстановлению структуры трахеаль-ной стенки. Кроме того, комбинированное применение пластики "трахеколом" с суб-.локальным введением пролонгированной формы антирепаранта адриамицина подавляет избыточный рост грануляционной ткани и позволяет практически полностью избежать осложнений, связанных с послеоперационным стенозом трахеи.

2.4. Операция пересадки трахеи с депонированием микрокапсулированпых форм

Оптимальным вариантом завершения циркулярной резекции трахеи и её бифуркации является наложение трахеального или трахеобронхиального анастомоза конец в конец [М.И. Перельман и Ю.Н. Левашов, 1987; Н.С. Grillo et al., 1986]. Однако возможности для циркулярного шва трахеи не беспредельны. Наиболее адекватным материалом для пластики циркулярных дефектов являются аутоткани, и в особенности ау-тотрахея. Однако, её применение противопоказано при: тотальной трахеомаляция трахеи, необратимых изменения в легких, вызванных длительным нарушением вентиляции, тяжелых сопутствующих патологиях. По данным литературы результаты алло-трансплаптации консервированной и неконсервированной трахеи оказались малоутешительными. Положительные непосредственные результаты, как правило, заканчивались постепенным некрозом аллотрансплантата, рассасыванием и замещением

хрящевых колец соединительной тканью [Л.Ф. Копылов, 1980].

Ткань трахеи не обладает выраженной аллоантигенной экспрессией [Ю.М.Лопухин, 1978]. Поэтому вряд ли целесообразно при разработке иммуноселек-тивных подходов акцентироваться на мишенности к антигенам. В данном случае учитывая, что основным фактором, оказывающим влияние на результаты аллопластики трахеи, является скорее кровоснабжение трансплантата, чем гистологическая совместимость гканей[А.В. Королев, 1990] более приемлем подход местного комплексного воздействия. С другой стороны несмотря на многочисленные попытки аллопересадки трахеи сразу же после её забора подобные операции по результатам большинства авторов заканчиваются рубцовым стенозированием трансплантата. Поэтому нами была разработана оперативная техника реконструктивного замещения трахеи, позволяющая использовать преимущества направленного транспорта лекарственных веществ, а также проведено изучение эффективности применения локального введения микрокап-сулированных форм селективно-действующих иммуносупрессантов FK-506 и Циклоспорина А.

В ходе эксперимента была разработана следующая техника операции замещения циркулярного дефекта трахеи с оментопексией и депонированием в пряди большого сальника пролонгированной формы лекарственных веществ, включающая два этапа:

1-ый Этап "замещение циркулярного дефекта трахеи", когда после рассечения претрахеальной фасции и мобилизации шейного участка трахеи резецировали 8 тра-хеальных колец и на введенном поэтапно в краниальную часть трахеи, аллотрансплан-гат и дистальный сегмент дыхательной трубки полимерном катетере, проводили наложение анастомозов "конец в конец" трансплантата с краниальным и каудальным сегментами трахеи 5-6 узловыми швами атравматической иглой;

2-ой Этап - "фиксация сальника с депо-формой иммуносупрессанта", когда верх-не-срединным разрезом вскрывали брюшную полость, большой сальник выводили в рану и в него вводили липосферы с CSA или FK-506 в дозе 150 мг/кг и 30 мг/кг соответственно , затем через шейный разрез тупо формировали тоннель до лапаротомной раны, прядь сальника проводили на шею и выполняли оментопексию к аллотранс-плантату и зонам анастомозов с помощью шовных лигатур.

Из полученных морфометрических данных по выраженности процесса стенози-рования трахеи (%) в течение первых тридцати послеоперационных суток при введение циклоспорина А было установлено, что как введение коммерческой формы препарата (33,50±2,92 ), так и разработанной нами микрокапсулированной формы (45,5114,15) оказывает выраженный превентивный эффект на процесс раннего стенозирования ал-лотрансплантата по сравнению с контрольными группами без иммуносупрессивного лечения (Р<0,01). Операция-фиксация сальника на питающей ножке (63,50+2,13) практически не оказывала в данной модели никакого влияния (Р=0,35) на развитие раннего процесса стенозирования аллотрансплантата трахеи в сравнении с обычной операцией пластики шейного отдела трахеи аллотрансплантатом(64,98±3,17). Несмотря на то,

что ежедневное введение коммерческой формы иммуносупрессанта является мощным фактором (сила влияния фактора h2Ai=45,10%), предупреждающим раннее стенозиро-вание трансплантата, очевидным, однако, оказалось и влияние способа введения и формы иммуносупрессанта на данный показатель, так как по данным дисперсионного факторного, анализа сила влияния способа введения препарата h2A2 составила 23,76% (Р=0,029).

Результаты морфометрических данных по выраженности процесса стенозирова-ния трахеи в течение послеоперационных тридцати сутск в серии экспериментов с применением FK-506 также показали, что как введение коммерческой формы этого селективно действующего иммуносупрессанта (47,4212,43), так и его пролонгированной формы (27,97±3,49) оказывает выраженный превентивный эффект на процесс раннего стенозирования аллотрансплантата по сравнению с контрольными группами (Р<0,01). Установлено, что ежедневное введение коммерческой формы иммуносупрессанта FK-506 является мощным фактором (сила влияния фактора h2Ai =53,72%, Р<<0,001), предупреждающим раннее стенозирование трансплантата. Данными дисперсионного факторного анализа четко подтверждено влияние способа введения и формы иммуносупрессанта на указанный показатель, так как сила влияния h2A2 способа введения и формы препарата была ещё более выраженной, чем в предыдущей серии и составила 53,69% (Р=0,000235).

Следовательно, результаты, полученные в двух сериях эксперимента, подтверждают выраженное превентивное действие разработанного способа пересадки трахеи на процесс стенозирования аллотрансплантата при однократном введении в аутосаль-ник как микрокапсулированной формы циклоспорина А так и FK-506, причем превентивный эффект при введении равных доз коммерческой и пролонгированной форм иммуносупрессантов более выражен в последнем случае, несмотря на однократность введения препаратов.

Имеет ли будущее аллопсрссадка трахеи? По нашему мнению безусловно, так как, несмотря на многочисленные экспериментальные неудачи аллотрансплантации трахеи К. Rose и соавт.(1979) впервые осуществлена в клинических условиях успешная аллопластика трахеи с сосудистым анастомозом больному с обширным стенозом шейного отдела трахеи. ИШ. Левашов и соавт.(1993) описали случай успешной аллотрансплантации грудного сегмента трахеи в клинике у 24-х летней пациентки с идиопатиче-ским фиброзирующим медиастинитом, осложненным выраженным стенозом трахеи. Окутывание трансплантата и зон анастомозов большим сальником для улучшения кровоснабжения, проведение интенсивной иммупосупрессивной терапии, введение ан-титимусного глобулина и больших доз кортикостероидов позволили стабилизировать состояние больной и добиться эпителизации анастомозированных участков. Однако, в большинстве случаев подобные операции заканчивались рубцовым стенозированием трансплантата.

Очевидно также, что разработанный способ позволяет одновременно использо-

вать оменгопексию как надежный и относительно простой способ предупреждения развития недостаточности анастомозов трансплантата и трахеи реципиента, восстановления кровоснабжения трансплантата [D.E. Smith et al., 1994] ], а также избежать длительного системного введения иммуносупрессантов и цитостатиков, таких как Циклоспорин Л и/или азатиоприн, метилпредпизолон, которые оказывают негативное воздействие на общую резистентность организма и провоцируют развитие инфекционных осложнений [A.B. Королев, 1990], вызывают нарушения функций выделительных систем (почки, печень) и других систем организма [Т. Kovithavougs et al., 1984]. С другой стороны данный метод применения полимерных матричных форм имеет скрытые и явные резервы, заключающиеся в возможности покрытия трахеальных алло-трансплантатов полупроницаемыми мембранами и включением в данную оболочку пролонгированных форм препаратов различного действия, например, индукторов роста сосудов и т.д.

2.5. Операция пересадки костного мозга с применением депо-форм

В настоящее время ТКМ широко применяется при различных злокачественных заболеваниях, когда степень угнетения КМ в ответ на лечение является основным лимитирующим фактором для продолжения терапии. Однако применение такого высокоэффективного метода, как ТКМ ограничено из-за трудности регулирования разнонаправленных иммунологических конфликтов, возникающих после пересадки [Е.Д. Томас, 1988]. В основу разработки нового способа пересадки костного мозга были положены приведенные выше данные о преимуществах внутрикостной трансплантации, а также результаты исследований свойств синтезированной магнитоуправляе-мой пролонгированной формы адриамицина.

При разработке техники выполнения операции пересадки костного мозга с направленным введением пролонгированной формы цитостатика адриамицина преследовалась цель одновременного решения триединой задачи: а) предотвращения основного послеоперационного осложнения (проявлений "вторичной болезни"); б) снижения общетоксического действия цитостатика; а также - в) повышения целенаправленности его действия.

В качестве носителя для направленного транспорта цитостатика использовались описанные выше магнпточувствительные микросферы C^vls) из гуммиарабика ("Merck) и желатина ("Serva") размером 3-5 мкм, содержащие адриамицин (Adr) и обладающие выраженными депонирующими свойствами. При изучении возможности депонирования пролонгированной магниточувствительной лекарственной формы адриамицина в области пересадки костного мозга с помощью постоянного магнитного поля (ПМ11) при введении костномозгового трансплантата в смеси с микросферами в губча-тую(грудина) и трубчатую (бедренная) кости, а также наличия или отсутствия в этом случае эффекта депонирования пересаживаемых клеток донорского костного мозга в области трансплантации, была разработана хирургическая техника проведения опера-

ции внутрикостпого введения донорских, клеток КМ ("Способ пересадки костного мозга в область кости в эксперименте" ВНИИГПЭ № 503479/14(010517) 24.04.95.).

В серии опытов по изучению эффекта депонирования, меченых 1-е-59 микросфер с помощью ПМП, проведенной на 20-ти кроликах, было установлено, что применение магнитного поля достоверно (Р<0,05) повышает процент депонирования разработанной лекарственной формы в области трансплантации (группа №1) в различные сроки наблюдений по сравнению с группой №2, где ПМП не применялось, а выведение из области пересадки костного мозга микросфер в этом случае происходит достоверно (Р<0,01) медленнее (40%), чем в контрольной группе №1 (60%).

При изучении возможности депонирования Мв с помощью предложенного способа в трубчатой кости у мышей была разработана подобная техника операции с использованием ПМП меньшей индукции (0,18 Тл) и помещением животного после введения донорских клеток с Мб в камеру установки для намагничивания магнитов. Были выделены 4 группы, в каждой из которых результаты снимались через 1 и 24 часа после введения радиоизотопномеченных Ре-59 микросфер, для изучения динамики их выхода из области трансплантации.

Установлено, что при введении Мв в смеси с донорскими клетками разработанным способом (группа №4) удается депонировать в области трансплантации до 54,2%±1,5 М5 в течение 1 часа после операции, тогда как при введении Мв без донорских клеток эффект депонирования составляет всего 11,4%±1,1. Результаты дисперсионного анализа этих двух групп говорят о сильном влиянии (Иа2=0,83; Р<0,01) фактора введения донорских клеток в суспензию Мэ на эффект депонирования последних в области пересадки. Вероятнее всего это объясняется явлением неспецифической абсорбции микросфер на вводимых клетках, так как по литературным данным практически все пролонгированные магниточувствительные формы препаратов обладают данными свойствами [Ь. Шит, 1989 ].

Результаты статистического анализа не выявили достоверного влияния применения ПМП на эффективность депонирования радиоизотопномеченных Мв в области пересадки костного мозга через 1 час после их введения. Однако, изучение динамики выведения Мб из созданного депо показало, что через сутки после операции с применением ПМП (группа №4) в области трансплантации сохраняется достоверно большее количество микросфер 28,1%±0,7 (Р<0,01) по сравнению с группой №3, где операция производилась без применения ПМП. Данное влияние ПМП на динамику выхода Мэ из бедренной кости вероятно объясняется индуцированием ПМП магнитного момента у микросфер и ориентацией их по силовым линиям ПМП, приводящей к адгезии Мв между собой, что затрудняет попадание образовавшихся конгломератов в капилляры, а, следовательно, и рециркуляцию их из созданного депо. Изучение внутривенного введения меченых Мб в смеси с донорским костным мозгом показало, что лишь незначительная их часть попадает в область кроветворения - бедренную кость 1,0%±0,1, тогда как основная часть вводимой аликвоты задерживается в таких мощных гема-

циркуляторных барьерах, как легкие и печень 86,8%±1,7. В опытной группе №4 этот показатель через 1 час после операции был всего лишь 29,6%±1,0 и 65,1%±1,1 через 24 часа. Это говорит о невозможности целенаправленного транспорта синтезированной магниточувствительной лекарственной формы адриамицина при внутривенном способе введения, что согласуется с данными литературы. Полученные результаты позволяют заключить, что разработанная операция ТКМ позволяет создать депо пролонгированной магниточувствительной лекарственной формы (Ms) в области се введения, причем использование ПМП позволяет пролонгировать эффект депонирования Ms, тогда как при системном введении основная их часть задерживается в печени и легких. Конечно же, распределение препарата между мишенью и печенью, другими органами не исчерпывает вопроса об эффективности действия лекарств, транспортируемых на матричных носителях и в не меньшей степени зависит от механизма его действия [M.L Papeisov, V.P. Torchilin, 1987], а также адресности его транспорта. Поэтому при разработке операции внутрикостной пересадки костного мозга с депонирование цито-статнка проведено изучение наличия и выраженности эффекта удержания клеток донорского костного мозга в области трансплантации, так как весь смысл разработанного метода пересадки костного мозга заключается в возможности обработки донорских клеток в организме реципиента пролонгированной формой лекарственного препарата в послеоперационном периоде. Следовательно, если при разработанной операции имеет место депонирование микросфер и эффект удержания донорских клеток в области операции, то такое сочетание двух факторов позволит значительно повысить целенаправленность доставки препарата к клеткам мишеням и добиться желаемого эффекта с помощью применения субгерапсвтичсских доз цитостатика.

Таким образом, разработанная операция ТКМ с депонированием пролонгированной формы цитостатика позволяет увеличить время выхода микросфер из области трансплантации как при введении их в губчатую кость- грудину(кролики), так и при введении в бедренную кость (мыши).

Серия экспериментов по изучению эффекта депонирования донорских клеток в области грудины, выполненная на 30-ти кроликах, показала, что наибольший процент (54,1 ±1,75) удержания донорских клеток в грудине реципиепта наблюдается при введении клеток в смеси с микросферами (группа №2). Достоверная разница (Р<0,01) по сравнению с контрольным внутрикостным введением (группа №1) наблюдалась и в случае применения ПМП (группа №3), несмотря на меньшую выраженность эффекта депонирования (Р<0,01) в группе с опытом, где магнитное поле не применялось (группа №2). Последнее, вероятно, обусловлено стимулирующим действием примененных параметров ПМП на рециркуляцию ретикулоцитов костного мозга. С.А. Гребенников с соавт., (1984), исследуя зависимость реакции эритрона от напряженности и длительности воздействия ПМП, как фактора противорадиационной зашиты, показали, что ПМП вызывает стимуляцию пролиферативных и биосинтетических процессов в эритроидных клетках костного мозга. Анализ этих данных по изменению абсолюг-

ного количества ретикулоцитов в периферической крови при воздействии ПМП показал, что ПМП напряженностью 100 и 300 мТл при длительности воздействия 3 и 24 часа вызывает однотипную реакцию эритрона в виде перемещения ретикулоцитов костного мозга в периферическую кровь через 1 час и стимуляцию эритропоэза через 72 часа. При этом перемещение ретикулоцитов костного мозга в периферическую циркуляцию и связанное с ним снижение общей эритроидной клеточности КМ количественно не зависит от напряженности и длительности воздействия ПМП. Нами этот факт расценивается как положительный, поскольку, таким образом воздействие ПМП "выводит" красные клетки-предшественники в ранние сроки из-под митостатического "удара" и повышает целенаправленность способа в плане элиминации ИКК. Наши данные по изучению динамики выхода донорских клеток из области пересадки выявили, что нежотря на достоверное (Р<0,01) ее превосходство в опытных группах №2 и №3 по сравнению с контролем (группа №1) через 36 часов после операции в этих группах, однако, остается достоверно большее количество донорских клеток в оперированной кости (Р<0,05).

Изучение эффекта депонирования донорских клеток костного мозга в области трансплантации (бедренная кость) у облученных в дозе ЬБ 100/20 реципиентов выявило, что через 1 час после внутрикостного введения суспензии клеток с микросферами (группа №3; в/к 1х106 клеток с Мб) в области пересадки депонируется 49,2%±1,3 пересаженных донорских клеток, причем воздействие ПМП в данном опыте (группа №4; в/к 1x106 клеток с Мб +ПМП) не влияло на этот показатель, так как сравнение групп №3 и №4 в разные сроки наблюдений не выявило достоверной разницы между ними (Р>0,05). Дисперсионный анализ групп №3, №4 с контрольной группой №2 (в/к 1х106 клеток), в которой клетки вводились внутрикостно без микросфер, выявил выраженное влияние фактора введения микросфер в трансплантат (112а=0,80-0,88, Р<0,01) на эффект депонирования донорских клеток в области пересадки. Это, вероятно, объясняется также явлением неспецифической абсорбции микросфер на донорских клетках и образованием конгломератов, состоящих из клеток и микросфер, что детально было описано выше. Сравнение внутривенного, внутрикостного и разработанного способов пересадки костного мозга выявило, что наибольший процент удержания донорских клеток в области пересадки (44,2-49,2%) наблюдается при предложенном способе введения трансплантата в смсси с микросферами, достоверно меньший эффект наблюдался при внутрикостной пересадке 21,3%±0,6 (Р<0,01); совсем незначительный часть вводимой аликвоты донорских клеток попадает в бедренную кость реципиента при традиционной внутривенной инфузии (3,9%). Эти результаты коррелировали(обрагная связь) и с данными по рециркуляции клеток в легкие и печень при различных способах пересадки костного мозга (Ь2в=0,66; Р<0,01). Результаты по изучению длительности удержания клеток донорского костного мозга в области пересадки выявили, что через 24 часа в общий кровоток рециркулирует около 50% депонированных в течении первого часа донорских клеток, причем применение ПМП не оказывает влияния на этот

26

процесс (группы №3 и №4 Р>0,05).

Однако, и в данный срок наблюдений процентное содержание клеток донорского мозга в бедренной кости (22,5-26,7%) было достоверно выше в этих группах по сравнению с обычным внутрикостным (12,3%±0,8; Р<0,0!) и тем более внутривенным введением (6,4%±0,3; Р<0,01). Сам факт "расселения" донорских клеток костного мозга по организму облученного реципиента надо расценивать как положительный, так как в случае полного его отсутствия трансплантированные кроветворные клетки не смогли бы выполнить своей заместительной функции, которая играет основную роль при лечении аплазии костного мозга, возникающей после облучения. С другой стороны, довольно-таки выраженное удержание донорских клеток в области депонирования микросфер создает благоприятные условия для пролонгированной обработки ¡n vivo и.ч-мунокомпетентных клеток адриамицином. С целью подтверждения этого положения было проведено изучение влияния разработанного способа пересадки костного мозга и самой пролонгированной формы цитостатика на течение послеоперационного периода в условиях индукции РТПХ.

Исследования показали, что как внутривенная, так и внутрикостная трансплантации одинаково "успешно" вызывают развитие острой РТПХ при введении равного количества ИКК высокоинбредной родительской линии C57BL облученным реципиентам (LD-100/20), поскольку значения СИ и в этих группах было наиболее высоким -1,5. Развилась к 10-м суткам и выраженная спленомегалия у реципиентов, которым применялась трансплантация костного мозга с помощью разработанной операции без содержания в микросферах адриамицина (СИ=1,67±0,1). При морфологическом изучении лимфоузлов, селезенки, толстого кишечника и печени реципиентов данной группы были выявлены классические морфологические признаки острой РТПХ. Наименьшее значение СИ (0,49±0,01) при введении ИКК в смеси с клетками донорского костного мозга наблюдалось в опытной группе, где была применена доза Adr 1 мг/кг веса животного, включенного в Ms. Такая резко выраженная аплазия селезенки реципиентов в данной группе говорит о том, что примененная дозировка цитостатика даже в пролонгированной его форме оказывает не только выраженное лимфотоксичсское действие, но и сильный митостатический эффект, отменяющий заместительную роль донорских клеток не только в селезенке, но и других органах, что подтверждают морфологические исследования печени, лимфоузлов и кишечника, в котором в данные сроки наблюдений отмечалась десквамация и некроз поверхностных участков крипт, отсутствие типичных бокаловидных клеток и замена их на крупные базофильные клетки. Совсем иная морфологическая картина наблюдалась в органах и тканях животных, которым пересадка костного мозга осуществлялась разработанным способом, но вводились микросферы с включением цитостатика в дозе 0,1 мг/кг веса реципиента. В данном случае не было выраженной аплазии кроветворных и лимфоидных органов, а значения СИ были близкими к единице (1,03±0,01), что говорит о выполнении донорскими кроветворными клетками их заместительной функции. С другой стороны, вы-

раженное снижение СИ в этой группе по сравнению с контрольными группами (Р<0,01) указывает на то, что разработанный способ пересадки костного мозга с депонированием пролонгированной лекарственной формы адриамицина в дозе 0,1 мг/кг практически вызывает полную отмену острой РТПХ. Сравнение результатов данной группы с результатами групп, в которых применялось внутривенное введение донорских клеток с Ms, содержащими Adr соответственно в дозировках 0,1 и 1 мг/кг, подтвердило предположение о том, что только при разработанном способе пересадки костного мозга есть смысл применения данной формы цитостатика, так как в обоих группах значения СИ были достоверно выше (Р<0,01) и не отличались от таковых по сравнению с контрольными группами(Р>0,05). Последний факт объясняется, вероятно, тем, что по данным радиоизотопного исследования при внутривенном введении практически все микросферы с препаратом оседают в печени и легких, а так как донорские клетки костного мозга после внутривенного введения быстро рециркулируют из этих органов в кроветворные и лимфоидные органы и структуры, то практически не создается условий для обработки трансплантата цитостатиком in vivo. Подтверждает жизнеспособность предложенного способа и тот факт, что при введении коммерческой формы адриамицина в дозе 0,1 мг/кг значение СИ (1,5810,02) достоверно выше (Р<001) по сравнению с опытной группой, где проводилось внутрикостное введение иммуно-компетентных клеток (ИКК) и микросфер с адриамицином в дозе 0,1 мг/кг. По результатам данной серии опытов было сделано заключение, что разработанный способ ТКМ с депонированием пролонгированной формы Adr позволяет при использовании малых доз (0,01 мг/кг) препарата оказывать выраженное ингибирующее действие на развитие основного послеоперационного осложнения, возникающего при операциях замещения системы кроветворения.

По данным теста на выживаемость вследствие развития РТПХ к 60-ым суткам исследований наблюдается достоверно больший процент гибели реципиентов в группах, где производилась традиционная в/в и в/к ТКМ (группы №1 и №2) по сравнению с опытной группой (Р< 0,05), в которой использовался новый метод пересадки с депонированием пролонгированной формы Adr в дозе 0,1 мг/кг (группа №4). Однако, в/в введение Ms с Adr в дозировке 0,1 мг/кг (группа №6) и даже дозе 1 мг /кг (группа №8) не вызывало подавления РТПХ, так как летальность реципиентов в них к 60-м суткам составила 100%.

Сравнительный анализ выживаемости реципиентов в группах №4 и №7 (в/к трансплантация клеток с Ms, содержащими Adr в дозе 1,0 мг/кг) показал, что несмотря на больший (Р<0,05) процент выживаемости реципиентов к 60-ым суткам в группе №4, основной причиной снижения выживаемости реципиентов в группе №7 является гибель животных от облучения (до 20-ых суток). Это говорит о возможности варьирования депо-дозой препарата в зависимости от дозы облучения реципиента, что особенно актуально при лечении злокачественных заболеваний системы кроветворения, когда органом-мишенью выступает пораженный КМ. Применение в последнем случае

"супертсрапевтических" доз цитостатиков в виде депо-форм вполне оправдано, так как за счет пролонгации выхода препарата из матричных структур МБ существенно снижаются его токсические свойства [Б. КароИ, 1992]. Данные морфологических исследований подтвердили, что к 60-ым суткам наблюдений в опытной группе №4 не было резко выраженных явлений аплазии лимфоидных органов и структур, характерных для хронической формы РТПХ, тогда как у выживших реципиентов контрольной группы №3 (в/к трансплантация с МБ) и группы №5 (в/к трансплантация и в/в введение коммерческого Ас1г в дозе 0,1 мг/кг) подобные изменения имели место. В опытной группе №4 к данным срокам наблюдений не отмечалось и внешних признаков вторичной болезни, таких как потеря массы тела, летаргия, сколиоз, взъерошивание шерсти с частичным облысением, тогда как у выживших животных контрольной группы №3 к 60-м суткам наблюдений все эти признаки присутствовали. Такая высокая действенность разработанного способа ТКМ в плане предупреждения РТПХ с помощью малых доз депо-формы Лёг вероятно объяснима механизмами короткодистантного взаимодействия с ИКК комплексов анчрациклинов с полимерами, которые в данном случае могут эффективно реализовать цитостатические свойства не только за счет модификации внутриклеточного распределения лекарства р. Вепшв с1 а1., 1994] , но и на уровне клеточной мембраны без проникновения внутрь клетки [Т.А. Богуш с соат., 1994].

Следовательно, разработанная модель ТКМ с депонированием МЭ обладает существенными преимуществами по сравнению с традиционными методами пересадки, гак как она позволяет с помощью субтерапевтических доз цитостатика предупредить развитие не только ранних, но и основных отдаленных послеоперационных осложнений, а также снижает системное токсическое действие Ас1г, позволяя варьировать его дозой без снижения эффективности действия за счет направленного транспорта. Еще одним аргументом в пользу применения разработанной операции именно в данном виде являются полученные буквально в последние годы результаты исследований по характеру репарации гемопоэза после цитостагического воздействия адриамицина, в которых установлено, что он наименее значительно из всех традиционных цитостатиков снижает клеточность костного мозга, что обусловлено ускоренным восстановлением структурно-функциональной организации КМ и секреторной активности элементов гемопоэзининдуцирующего микроокружения [А.М. Дыгай с соавт., 1995], которое при разработанном способе ТКМ, вероятно, реконструируется за счет донорских стромальных клеток. Кроме того, разработанная операция ТКМ обладает практически неограниченными резервами к повышению ее эффективности за счет комбинационного включения в депо-формы различных лекарственных препаратов, например, эритропоэтина и других индукторов роста и/или дифференцировки клеточных популяций костного мозга донора и реципиента.

Таким образом, разработанная операция пересадки костного мозга с депонированием микрокапсулированной формы цитостатика адриамицина позволяет не только осуществить депонирование препарата, но и существенно повысить процент удержа-

ния донорских клеток в области пересадки по сравнению с внутрикостной их инфузи-ей, что создает условия для целенаправленной обработки лекарственными веществами донорских клеток в организме реципиента. Использование методов определения выраженности митостатического действия при разработанном способе ТКМ позволяет осуществить подбор дозы препарата не снижающей эффективности заместительной функции донорских клеток. Основным преимуществом нового способа ТКМ является возможность предупреждения основных послеоперационных осложнений, возникающих после операций замещения системы кроветворения, с применением субтерапевтических доз препаратов заданного действия.

ВЫВОДЫ:

1. Апробированные композиционные матричные лекарственные формы препаратов обладают комплексом необходимых свойств для осуществления длительного направленного терапевтического (антибактериального, иммуномодулирующего и др.) действия в организме, что подтверждает перспективность их применения в рекон-структивно-заместительной хирургии органов и тканей.

2. Экспериментальная модель операции пластики дефектов кожи с применением пролонгированной матричной формы иммуносупрессанта избирательного действия FK-506 (tacrolimus) обеспечивает длительное приживление кожных аллогенных лоскутов, что открывает новые возможности в пластической хирургии глубоких, обширных кожных дефектов, вызванных термической, лучевой или комбинированной травмой.

3. Разработанная операция замещения окончатых дефектов трахеи с применением матричной композиционной системы- "трахекол", состоящей из пористого и уплотненного слоев коллагена с различной скоростью резорбции и армированием наружного слоя лавсановой сеткой, обладает рядом преимуществ при реконструировании дефектов трахеи, так как обеспечивает морфологически более полное восстановление структуры трахеальной стенки. Комбинированное применение пластики "трахекола" с сублокальным введением пролонгированной формы антирепаранта ад-риамицина подавляет избыточный рост грануляционной ткани и позволяет практически полностью избежать осложнений, связанных с послеоперационным стенозом трахеи.

4. Предложенная техника операции реконструктивного замещения циркулярных дефектов трахеи отличается от существующих введением пролонгированных форм лекарств (микрокапсулы, микросферы и т.д.) в прядь большого сальника при проведении этапа оментопексии к замещаемому сегменту и обладает существенными преимуществами, поскольку позволяет одновременно использовать прядь аутосальника как источник реваскуляризации аллотрансплантата, и как депо лекарственных препаратов, целенаправленно транспортируемых кровотоком сальника. Это позволяет избежать основного послеоперационного осложнения- раннего отторжения, причем депониро-

вание микрокапсулированной формы циклоспорина А и РК-506 оказывает более эффективное действие по сравнению с системным введением равных доз коммерческих форм препаратов.

5. Разработанная техника операции замещения костного мозга, отличающаяся от традиционной внутрикостной пересадки введением пролонгированной формы лекарственных препаратов- микросфер вместе с клетками трансплантата, депонирующихся во время операции в области пересадки - кости, создаст условия для целенаправленной обработки лекарственными веществами пересаженных клеток в организме реципиента и позволяет реализовать возможность продолжительного предупреждения развития основных послеоперационных осложнений, возникающих при операциях замещения системы кроветворения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. При совершенствовании способов и операций реконструкции и замещения органов и тканей целесообразно комплексное применение хирургического, биотехнологического и иммунологического подходов, позволяющих использовать преимущества направленного транспорта препаратов с целью снижения послеоперационных осложнений.

2. Для более эффективного и длительного действия лекарственных веществ (антибиотиков, цитостатиков, антикоагулянтов, иммунодспрессантов и т.д.) в послеоперационном периоде предпочтительнее применение их пролонгированных форм, синтезированных на основе биополимеров медицинского назначения.

3. Учитывая, что при реконструктивно-восстановительных операциях на органах и тканях с применением пролонгированных форм лекарственных препаратов эффективная терапевтическая доза иммуносупрессаитов, цитостатиков и других препаратов находится, как правило, в субтерапевтических границах, необходимо осуществление тщательного подбора их дозировок с помощью иммунологических, гематологических, морфологических, и других тестов, наиболее адекватно отражающих динамику рекон-валнеценции.

4. С целью снижения побочных эффектов действия сильнодействующих лекарственных веществ необходимо руководствоваться методами комплексной коррекции послеоперационных осложнений, возникающих при замещении и реконструкции органов и тканей. Сочетание как можно большего числа требований к пластическому (донорскому) материалу и факторов воздействия на последний и реципиента с применением матричных форм препаратов позволяет добиваться максимально селективного действия терапевтических компонентов, что значительно уменьшает дозы препаратов и, как следствие, их побочные действия.