Автореферат и диссертация по медицине (14.00.04) на тему:Рекомбинантный интерлейкин-1β (Беталейкин) в лечении риносинусита с затяжным и хроническим течением

На правах рукописи

МАШКО ПАВЕЛ НИКОЛАЕВИЧ

РЕКОМБИНАНТНЫЙ ИНТЕРЛЕЙКИН 1р (БЕТАЛЕЙКИН) В ЛЕЧЕНИИ РИНОСИНУСИТА С ЗАТЯЖНЫМ И ХРОНИЧЕСКИМ ТЕЧЕНИЕМ

14.00.04 - болезни уха, горла и нося 14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в Башкирском государственном медицинском университете

Научные руководители:

- доктор медицинских наук, профессор АРЕФЬЕВА Нина Алексеевна

- доктор медицинских наук АЗНАБАЕВА Лилия Фаритовна

Официальные оппоненты:

- доктор медицинских наук, профессор

КИСЕЛЕВ Алексей Сергеевич

- доктор медицинских наук, профессор НАЗАРОВ Петр Григорьевич

Ведущая организация: Самарский государственный медицинский университет

Защита состоится «29» июня 2004 г. в_час. на заседании

диссертационного совета Д 208.091.01 в Санкт-Петербургском научно-исследовательском институте уха, горла, носа и речи (198013, Санкт-Петербург, ул. Бронницкая, д.9)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского научно-исследовательского института уха, горла, носа и речи.

Автореферат разослан «28» мая 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

ДРОЗДОВА Марина Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Хронический гнойный риносинусит (ХГРС) - это инфекционно-воспалительное заболевание слизистой оболочки носа и околоносовых пазух. Заболевание характеризуется длительным течением и рецидивами. Согласно сообщениям ряда авторов, антибактериальные препараты при хроническом локальном инфекционном воспалении малоэффективны (Пискунов Г.З. и др., 1994; Арефьева Н.А., 1997; Азнабаева Л.Ф., 2003 и др.). Применение радикальных методов лечения в виде хирургического вмешательства имеет ограниченные показания.

Возможность изменить характер и исход патологического процесса в околоносовых пазухах, по мнению многих ученых, связана с применением им-мунонаправленных препаратов (Джамалудинов Ю.А. и др. 1996; Кравченко О.В., Пискунов Г.З., 1996; Воробьев АА., 1998; Кортиков В.Н. и др., 1999; Плужников М.С. и др., 1999; Гуломов З.С., 2000; Мирошниченко А.П., 2004). Показанием к таким методам лечения служат патогенетические механизмы хронического воспаления в околоносовых пазухах. Многочисленными исследованиями показано, что ХГРС является маркером иммунного дисбаланса и недостаточного иммунного реагирования на инфекцию (Нестерова И.В., 1998; Н.М. Калинина и др., 1999; Гофман В.Р., 2000; Григорьева А.А., 2004 и др.). Однако характер и уровень дисбаланса (местный или системный) и причины формирования иммунодефицита нуждаются в уточнении с позиции значимости цитокинов в кооперации иммунокомпетентных клеток в иммунном ответе при хроническом гнойном риносинусите.

В настоящее время установлена роль цитокина интерлейкина в активации как врожденного (фагоцитоз), так и приобретенного иммунитета (кооперация иммунокомпетентных клеток). Имеются сообщения об эффективном использовании рекомбинантного 1Ь-1(5 (Беталейкина) в лечении ХГРС при локальном его введении в пораженную пазуху (Гуломов З.С., 2002). Однако, принимая во внимание, что иммунная система слизистой оболочки носа и околоносовых пазух находится в соподчинении системного иммунитета, представляется важным изучить перспективность применения Беталейкина при внутривенном введении в лечении больных ХГРС.

Цель исследования. Повышение эффективности лечения больных рино-синуситом с затяжным и хроническим течением на основе изучения участия интерлейкина - 8 в механизмах развития болезни и оценки влияния на его продукцию рекомбинантного интерлейкина -ривенно.

Задачи исследования:

1. Исследовать особенности клинического течения гнойного риносинусита с затяжным и хроническим течением в зависимости от продукции цитокинов (1Ь-8, 1Ь-1р и 1Ь-1Ка).

2. Оценить состояние фагоцитарного звена иммунной системы и продукцию цитокинов по данным периферической крови и в очаге воспаления.

3. Определить клиническую эффективность использования рекомбинатного ин-терлейкина- 10 (Беталейкина) для лечения больных при местном (в очаг воспаления) и системном (внутривенно) способе введения препарата.

4. Обосновать преимущества внутривенного введения Беталейкина на основе изучения особенностей реагирования иммунной системы больных в ответ на системное действие препарата.

Научная новизна.

Установлены клинические особенности проявления гнойного риносину-сита с затяжным и хроническим течением в зависимости от продукции интер-лейкина-8 на системном уровне. При низких значениях продукции Ш-8 отмечается отсутствие температурной реакции организма в период обострения заболевания, а также вовлечение в инфекционный процесс нескольких пазух.

Определена зависимость функционального состояния нейтрофильных лейкоцитов в очаге воспаления от продукции Ш-8 на системном уровне. При низких значениях продукции цитокина имеет место изменение функциональных свойств клеток на системном и местном уровнях: низкая способность к адгезии и фагоцитозу. При умеренно повышенных значениях продукции Ш-8 отмечается тенденция к снижению показателей активности нейтрофилов в очаге воспаления. При высоких значениях Ш-8 - увеличивается способность клеток к адгезии на системном уровне.

Установлено, что снижение функциональной активности нейтрофилов в очаге воспаления сочетается с дисбалансом в содержании цитокинов на местном уровне, что проявляется в виде отсутствия корреляционных связей между количеством провоспалительных цитокинов Однократное внутри-

венное введение экзогенного (Беталейкина) способствует повышению

синтеза эндогенного ГЬ-8 на системном уровне, восстановлению баланса в содержании провоспалительных цитокинов в очаге воспаления и активации функций нейтрофилов.

Научно - практическая значимость работы.

Установлены закономерности изменений функционального состояния нейтрофилов в очаге воспаления и продукции интерлейкина-8 на системном уровне, позволяющие оценить недостаточность продукции интерлейкина-8 в развитии гнойного риносинусита с затяжным и хроническим течением.

Выявлена существенная роль изменений продукции интерлейкина-8 на системном уровне в развитии клинических особенностей хронического гнойного риносинусита.

Показана целесообразность исследования продукции ГЬ-8 в крови у больных риносинуситами с целью оценки показаний к цитокиновой терапии.

Обосновано преимущество системного пути введения рекомбинантного интерлейкина- (Беталейкина) для стимуляции синтеза эндогенного интерлей-кина-8. Установлена приоритетность внутривенного введения препарата перед местным, что подтверждено лабораторными исследованиями иммунной системы в очаге воспаления, а также высокой клинической эффективностью.

Предложен метод, позволяющий оценить эффективность проводимой терапии (способ оценки эффективности лечения риносинуситов. - патент РФ на изобретение № 2200319 от 10 марта 2003 года).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Важным патогенетическим звеном развития гнойного риносинусита является недостаточность продукции интерлейкина-8 на системном уровне. Наличие связи продукции интерлейкина-8 на системном уровне с клиническими особенностями заболевания (отсутствие температурной реакции, поражение нескольких пазух) и функциональным состоянием нейтрофилов на системном (кровеносное русло) и местном (очаг воспаления) уровне свидетельствует о влиянии продукции интерлейкина-8 на развитие затяжного и хронического течения гнойного риносинусита.

2. Введение рекомбинантного интерлейкина- 1р (Беталейкина) значительно повышает эффективность терапии гнойных риносинуситов. При этом системный путь введения (внутривенно) более эффективен, чем местное введение (в очаг воспаления), что подтверждено клиническими и лабораторными показателями. Реализация иммунного ответа при системном введении рекомбинант-ного интерлейкина- 1Р (Беталейкина) идет через повышение продукции эндогенного интерлейкина-8 на системном уровне, что способствует активации функциональных свойств нейтрофилов как на системном, так и на местном уровне.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на Республиканских конференциях оториноларингологов (Мияки, 2001; Туймазы, 2003); Конференциях ринологов Российской Федерации (Курск, 2001; Новосибирск, 2003); 1-й Конференции иммунологов Урала (Екатеринбург, 2001); заседаниях Ассоциации оториноларингологов Республики Башкортостан (Уфа, 2002, 2003); Ученом Совете Башгосмедуниверситета (Уфа, 2004).

Внедрение результатов работы. Материалы диссертационной работы включены в лекционный материал обучения студентов кафедры оториноларингологии и врачей на курсах последипломного образования Башгосмедлунивер-ситета. Материалы диссертации вошли в учебное пособие «Иммуноцитологи-ческие исследования в ринологии» (Уфа, 2002). Разработанные способы лечения и диагностики внедрены в работу оториноларингологического отделения Республиканской клинической больницы им. Г.Г.Куватова, муниципальной больницы №5 г. Уфы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 5 работ в центральной печати, в том числе получен патент РФ на изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 171 страницах, содержит 33 таблицы и 26 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, собственных исследования (три главы), заключения и выводов. Библиографический список включает 184 источников (130 отечественных и 54 зарубежных).

Собственные исследования

1. Материалы и методы исследования

Под наблюдением находились 148 человек, из них: практически здоровых лиц - 54 (донорская группа) и больных гнойным риносинуситом с затяжным и хроническим течением - 94.

Полость носа и состояние ее латеральной стенки осматривались с помощью ригидных эндоскопов фирмы "Шторц" с оптикой 0°, 30°, 70°. Рентгенологическое обследование включало обзорную рентгенографию придаточных пазух носа в традиционной лобно-носовой и боковой проекциях. Компьютерная томография околоносовых пазух выполнялась на аппарате 3-го поколения Somaton CRX фирмы Simens в двух проекциях (аксиальной и коронарной), томографический шаг 5 мм.

Пациенты с грубыми анатомическими изменениями архитектоники полости носа и остеомиотального комплекса, нарушающими дыхательную функ-

цию носа и с наличием продуктивных процессов в верхнечелюстной пазухе, либо с костной деструкцией в верхней челюсти преднамеренно исключались из числа наблюдаемых.

Микробную флору определяли в бактериологической лаборатории. Для идентификации и определения антибактериальной резистентности использовали микробиологический анализатор АТВ "Expression" (Франция). Антибактериальную резистентность определяли также диско-диффузионным методом (ДДМ). Материалом для микробиологического исследования служило содержимое околоносовых пазух, полученное при пункции, а также мазки с поверхности слизистой оболочки среднего носового хода.

Лабораторному иммунологическому исследованию подвергались кровь, назальные смывы, патологическое содержимое воспаленных околоносовых пазух, мазки - перепечатки со слизистой оболочки носа.

Забор биологического материала производился следующим образом:

- кровь из локтевой вены брали утром натощак;

- назальный секрет собирали на смоченный физиологическим раствором (изотонический 0,9% раствор NaCl) ватный тупфер из-под средней носовой раковины, затем ватку переносили в 0,25 мл физиологического раствора, замораживали при температуре минус 86 °С, перед исследованием центрифугировали в течение 10 мин при 1500 об/мин и работали с надосадочной жидкостью;

- промывные жидкости из пораженной пазухи получали по трансназальному катетеру перед проведением лечебных манипуляций.. Промывные жидкости центрифугировали в течение 10 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость, замораживали при температуре минус 86 °С. Из части осадка каплю (50 мкл) центрифугата наносили на предметное стекло, делали мазок, высушивали, фиксировали 96° этиловым спиртом в течение 5 мин и окрашивали в течение 30 мин по методу Романовского - Гимза. Микроскопия проводилась под иммерсией при увеличении (окуляр 7, объектив 90). Остальной осадок ресуспендирова-ли, клеточные элементы использовали для функциональных проб;

- для приготовления мазков - перепечатков для оценки цитограмм материал забирали ватным тупфером из-под средней носовой раковины. Вращательными движениями без надавливания наносили его на обезжиренные этанолом предметные стекла. Полученные мазки высушивали на воздухе, фиксировали, красили по методу Романовского - Гимза и микроскопировали.

С целью изучения системного и местного иммунитета (слизистых оболочек носа и околоносовых пазух) были использованы методы исследования:

1. Оценка цитокинов:

Проводили определение уровня цитокинов (IL-8, IL-lp, IL-Ra) в суперна-танте клеток крови и в промывных жидкостях из воспаленных околоносовых пазух. Исследование способности клеток венозной крови к спонтанной и стимулированной продукции цитокинов проводили in vitro. Для этого использовали цельную венозную кровь, в одну пробирку добавляли неспецифический стимулятор фитогемагтлютинин 0,1% в дозе 10 мкл, во вторую - 10 мкл куль-туральной жидкости и культивировали при 1=37°С в течение 24 часов. После центрифугировали, надосадок переносили в чистые пробирки и замораживали. Впоследствии определяли концентрацию цитокинов в надосадке (супернатанте клеточных культур). Для определения концентрации цитокинов применяли твердофазный иммуноферментный анализ с использованием стандартных коммерческих тест-систем (ГосНИИ ОЧБ, СПб).

2. Исследования клеточного звена иммунитета включали в себя определение количественных и функциональных показателей состояния нейтрофилов венозной крови и клеток, полученных из очага воспаления, а именно из промывных жидкостей пораженных пазух и со слизистых оболочек носа (мазки-перепечатки).

Оценивали параллельно in vitro способность нейтрофилов венозной крови и очага воспаления (промывные жидкости):

1) к адгезии (Тышко НА, Гавриленко Т.И., 1992);

2) к фагоцитозу частиц латекса (Меньшиков В.В., 1987) с подсчетом фагоцитарного индекса (процент нейтрофилов, захвативших частицы латекса) и фагоцитарного числа (среднее количество частиц латекса в одном фагоцитирующем нейтрофиле);

3) метаболическую активность клеток в тесте восстановления нитросине-го тетразолия (НСТ-тест) спонтанного и индуцированного частицами латекса (Шишкин В.Л. и др., 1995);

4) секреторную миелопероксидазную активность (Хаитов P.M. и др., 1995); определение внеклеточной пероксидазной активности проводили в биологических жидкостях (носовые смывы и промывные жидкости из воспаленных околоносовых пазух) (Азнабаева Л.Ф. и др., 2002).

5) В РТМЛ оценивали интегральную способность иммунокомпетентных клеток вырабатывать факторы, удерживающие лейкоциты от миграции в очаге воспаления. Использовали тест-системы МигРоСкрин (СП Ниармедик, Москва), в качестве стимулятора применяли фитогемагглютинин (ФГА) в рабочей концентрации 20 мкг/мл.

Для оценки состояния нейтрофилов in vivo использовали данные цито-грамм промывных жидкостей (мазок, сделанный из осадка промывных жидкостей воспаленных пазух) и риноцитограмм (мазки-перепечатки со слизистой оболочки носа).

Оценивали клеточное представительство (лейкоциты, эпителиальные клетки, микроорганизмы), посторонние включения и слизь, целостность клеток, фагоцитарную активность нейтрофилов по отношению к аутофлорё. Вычисляли цитоз (подсчет всех клеток в мазке), удельный вес каждой клетки в процентах и абсолютных числах. Изучение деструктивных процессов в клетках, индекса модуляции цилиндрического эпителия, % метаплазии цилиндрического эпителия в плоский осуществляли по Л.А. Матвеевой (1986).

Фагоцитарную активность нейтрофилов со слизистых оболочек носа и околоносовых пазух оценивали по отношению к аутофлорё и исследовали при наличии микрофлоры в мазке, вычисляя процент фагоцитирующих аутофлору нейтрофилов. Показатель незавершенного фагоцитоза определяли по предложенному нами методу (патент РФ на изобретение №2200319 от 10.03.2003). Среди фагоцитирующих нейтрофилов учитывали процент целых нейтрофилов, содержащих внутри клетки микроорганизмы и процент разрушенных (деструктированных) фагоцитов, в протоплазме которых сохранились целые микроорганизмы - показатель незавершенного фагоцитоза.

Показатель незавершенного фагоцитоза (в %) рассчитывали по формуле: Nd/(Nc+Nd) х100, где Nd - число деструктированных нейтрофилов, содержащих в протоплазме непереваренные бактерии; Nc - число целых нейтрофилов, содержащих микроорганизмы.

Статистическую обработку фактического материала проводили на ЭВМ с использованием программных средств MS Excel 5,0. Определяли среднюю арифметическую (М), среднюю ошибку (m), достоверность данных оценивали с помощью критерия достоверности (р). Для выяснения зависимости между показателями применялся корреляционный анализ.

2. Общая клиническая характеристика больных

Больные с различными формами гнойного риносинусита (94 пациента) наблюдались в ЛОР - отделении Республиканской клинической больницы в период 1997 по 2002 годы. Из них было 54 мужчин и 40 женщин. Средний возраст пациентов составил 29,08 ±1,22 лет. В группе наблюдения были преимущественно лица молодого возраста до 40 лет (83%). У 45,7% отмечались рецидивы

вирусных заболеваний, у 19,1% - гнойно--воспалительных, аллергия в - 18,1% случаев.

Следовательно, клинически можно было предположить, что у обследованных больных имелись изменения в иммунной системе преимущественно в виде недостаточности клеточного и в меньшей степени - гуморального звена. У каждого пятого отмечены гиперэргические реакции (аллергия).

Заболевания слизистой оболочки верхних дыхательных путей в 64,9% случаев сочетались с заболеванием слизистых оболочек всей респираторной системы и других пограничных тканей: слизистые оболочки пищеварительной, мочевыделительной системы и др.

Субъективные ощущения больных имели следующие особенности: жалобы, характеризующие системные проявления заболевания (в виде головной боли) предъявляли 57,4% пациентов. При этом только в 23,4% наблюдений отмечалась температурная реакция. Следовательно, имелись признаки интоксикации, без активации острофазового иммунного ответа.

Преобладали симптомы местного характера в виде затрудненного носового дыхания - 62,8% и выделений из носа - 75,5%. Наличие гноя в среднем носовом ходе обнаружено в 52,1% случаев, полипозно-измененная слизистая оболочка среднего носового хода имела место в незначительном числе наблюдений, лишь в 5 3 % случаев.

Двусторонний воспалительный процесс обнаружен в 46,8% случаев и вовлечение всех синусов в воспалительный процесс — 28,7% наблюдений.

По длительности инфекционного заболевания преобладала группа пациентов (63,1%) у которых инфекционно-воспалительный процесс не мог завершиться в обычные сроки, имел затяжное течение (до года). Остальные пациенты отмечали рецидивы риносинусита и давность заболевания от 2 до 10 лет.

В значительном числе наблюдений (71% случаев) больные получали традиционное лечение: антибиотики - 26,6%, деконгестанты - 12,8%, гормональные и нестероидные противовоспалительные средства, пункцию пазухи - 28,7% случаев.

Таким образом, большинству пациентов в анамнезе проводилось традиционное лечение: пункция и дренирование пазух, антибиотики, деконгестанты и симптоматические средства, но они не обеспечили выздоровления.

Изучение роли бактериальной флоры в этиологии хронического гнойного риносинусита показало, что характер микроорганизмов в синусах был представлен преимущественно комменсальной флорой в 33,3% случаев и условно-патогенной - 49,0%, а патогенная высевалась лишь в 17,7% случаев.

Следовательно, у больных хроническим гнойным риносинуситом с затяжным и хроническим течением на слизистой оболочке носа и в воспаленных синусах высевалась в основном мало патогенная флора.

Таким образом, затяжное течение хронического гнойного риносинусита, рецидивы заболевания, присутствие преимущественно мало патогенной бактериальной флоры на слизистой оболочке верхних дыхательных путей, а также поражение слизистых оболочек других пограничных систем, позволяет предположить неполноценность иммунного ответа как на местном, так и системном уровне.

3. Фагоцитарное звено иммунной системы и цитокиновая сеть

Учитывая, что при гнойном воспалении основную роль играют нейтро-филы, мы провели оценку состояния фагоцитарного звена на системном уровне (клетки кровеносного русла) и местном (воспаленные пазухи) уровнях. Полученные результаты исследования представлены в таблице 1.

Таблица 1

Функциональное состояние нейтрофилов у больных гнойным риносинуситом и практически здоровых лиц

Показатели Нейтрофилы

Кровеносного русла Очага воспаления

Практически здоровые лица (п=54) Больные гнойным риносинуситом (п=86) Больные гнойным риносинуситом (п=52)

Адгезия, % Фагоцитоз, % Фагоцитарное число HCT спонтанный, % HCT индуцированный,% Индекс НСТ-теста 7,00±0,89 57,98±3,06 6,2010,37 13,04±0,75 29,43±1,88 2,47±0,43 6,8410,84 54,7612,01 5^510,19* 11,21Ю,45* 18,9910,92* 1,7910,09 4,4610,98 39,9812,35** 4,7710,25 41,8513,30** 36,5113,19** 1,0410,08

Примечание: * - показатели отличаются от данных практически здоровых лиц (Р<0,05);

** - показатели отличаются от данных клеток кровеносного русла (р<0,05).

Как видно из данных табл.1, у больных было установлено снижение способности нейтрофилов к адгезии и фагоцитозу менее выраженное у клеток кровеносного русла, и значительно - в очаге воспаления.

Снижение функциональных способностей нейтрофилов в очаге воспаления у больных сопровождалось увеличением их количества (2б,3б±5,47 против 1,39±0,62 клеток/мл в группе сравнения, р<0,001) и активацией процессов вне-

клеточного переваривания (внеклеточная пероксидазная активность 1291,92± 197,59 против 122,41±23,70 у.е. в группе сравнения, р<0,001). Однако нейтрофилы в большинстве своем были деструктированными, фагоцитоз чаще всего имел незавершенный характер (57,63±2,4б против 19,14±4,88% в группе сравнения, р<0,001). В качестве группы сравнения выступали реконвалесценты с отличным результатом лечения. Полученные данные свидетельствуют о наличии дисбаланса фагоцитарного звена.

В настоящее время известно, что ведущую роль в обеспечении функционирования иммунной системы играют цитокины. Для нейтрофилов основным цитокином является IL-8 — хемотаксический фактор, который обеспечивает направленность движения клеток в очаг воспаления и активацию их функционального состояния (Ройт А. и др., 2000), усиливает экспрессию молекул адгезии на фагоцитах (Хаитов P.M. и др., 1995). Другим необходимым цитокином является который индуцирует на клетках эндотелия сосудов очага вос-

паления экспрессию молекул адгезии, обеспечивая тем самым остановку ней-трофилов кровеносного русла в зоне воспаления (Lund VJ.et al., 1993; Toku-shige E. et al., 1994; Yamamoto Y. et al., 1998; Ройт А.и др., 2000). Интерлейкин-усиливает также синтез IL-8 (Ройт А. и др., 2000) и может сам выступать в качестве хемотаксического фактора для нейтрофилов, но менее выражено, чем IL-8 (Ярилин А.А., 1999). IL-IRa - рецепторный антагонист IL-1, блокирует биологические эффекты в том числе отменяет эффект повышения адге-

зивных свойств нейтрофилов к сосудистому эндотелию (Itoh К. et al., 1992).

Результаты оценки содержания цитокинов в очаге воспаления (п=38) представлены в таблице 2.

Таблица 2

Цитокины в промывных жидкостях воспаленных пазух

больных гнойным риносинуситом и практически здоровых лиц

Цитокины Исследуемые группы

Группа сравнения (п=8) Больные гнойным рино-синуситом (п=38)

IL-8, пкг/ мл IL-lp, пкг/ мл IL-8/IL-ip IL-IRa, пкг/ мл IL-8/ IL-IRa 208,88±48,78 154,63± 14,54 1,32±0,28 117,00±25,23 1,91 ±0,59 641,731125,12* 182,35±31,89-3,9311,26* 10б,73±17,92 8,11+3,00*

Примечание: * - показатели отличаются друг от друга (р<0,05);

группа сравнения - реконвалесценты с отличным результатом лечения.

Как видно из данных табл.2, в воспаленных пазухах цитокины характеризовались повышенным содержанием Ш-8, что согласуется с литературными

данными (Buehring I. et al., 1997; Demoly P. et al., 1997; Grevers G., Sturm C, 1997; Suzuki H. et al., 1996,1999; Suzuki M. et al., 1998; Rudack C. et al., 1998). Однако его концентрация значительно меньше, чем при остром синусите (Глазников Л.А. и др., 2001). В то же время было отмечено нарушение согласованности увеличения провоспалительных цитокинов - уровень IL -1 р практически не отличался от данных в группе сравнения, что подтверждалось отсутствием корреляционных связей в продукции ИЛ-8 и IL-1 р (г=-0,22).

Полученные данные можно расценить как дисбаланс цитокиновой регуляции процессов иммунной защиты в очаге воспаления.

Учитывая, что функциональные показатели нейтрофилов отличались в сторону снижения не только у клеток в очаге воспаления, но и циркулирующих в кровеносном русле, представлялось важным изучение продукции цитокинов на системном уровне.

Исследование продукции IL-8, IL-1 р и IL-IRa на системном уровне провели у 84 больных путем определения спонтанной способности клеток крови in vitro отвечать продукцией цитокинов и в ответ на стимуляцию фитогемагтлю-тинином. Показатели спонтанной продукции цитокинов имели незначительные отличия между собой. В то же время в показателях индуцированной продукции IL-8 был установлен большой разброс - от 25,4 до 8329,9 пкг/мл (у практически здоровых лиц - 2097,01+269,39 пкг/мл).

В зависимости от продукции IL - 8 (здесь и далее по тексту читать как индуцированная продукция) на системном уровне было проведено разделение больных на три группы и проанализированы данные продукции интерлейкина-1р и его антагониста IL-IRa. I группа - показатели ниже, чем у практически здоровых лиц, II группа - умеренно повышенные и III группа - значительно повышенные показатели. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3

Продукция интерлейкина-1 Р и его антагониста IL-IRa на системном уровне в

зависимости от синтеза IL -8 (пкг/ мл)

Цитокины Исследуемые группы

Практически здоровые лица (п=20) Больные гнойным риносинуситом

I группа (п=32) II группа (п=30) III фуппа (п=22)

IL-8 IL-lp IL-IRa 2097,01±269,39 508,50±123,13 1265,79± 150,66 949,47±94,82* 503,89±90,76 886,13±396,20 3134.16*104.82* 5847.34±193.08*

706,94±143,52 1638,57±266,12 1213.78±214.73* 1579,99±177,47

Примечание: * - показатели отличаются от данных практически здоровых лиц (р<0,05); XX - подчеркнутые цифры отличаются отданных I группы (р<0,05).

Как видно из данных табл.3, у больных I (38%) и II групп (36%) продукция интерлейкина- и его антагониста IL-IRa не отличались от данных практически здоровых лиц. В III группе больных (26 %), наряду со значительно повышенными значениями продукции Ш-8, отмечалось также увеличение продукции 1Ь-1р, но не !Ь-Ша.

Оценка состояния содержания цитокинов в очаге воспаления (п=38)у больных в зависимости от продукции ГЬ -8 на системном уровне показала выраженные отличия. Полученные данные отображены на рис.1.

Рис.1. Содержание IL-8 и IL-lß в очаге воспаления больных гнойным риноси-нуситом с затяжным и хроническим течением в зависимости от продукции IL-8 на системном уровне (* - р<0,05); (ПЗЛ - реконвалесценты с отличным результатом лечения).

Как видно из рис.1, у больных I группы отмечался выраженный дисбаланс продукции провоспалительных цитокинов в сторону преобладания IL-8 (IL-8/ IL-1 ß >6,0). Для больных II и III групп было характерно более сбалансированное соотношение цитокинов (около 2,0). Более того, у больных III группы показатели содержания провоспалительных цитокинов практически не отличались от данных группы сравнения.

Также у больных, в зависимости от продукции IL-8 на системном уровне, были выявлены значительные отличия функциональных показателей фагоцитарного звена, как на системном, так и на местном уровне.

Показатели способности клеток к адгезии и фагоцитозу представлены на

рис.2.

ПЗЛ 1 группа 2 группа 3 группа

П нейтрофилы кровеносного русла

П нейтрофилы в очаге воспаления Рис.2. Способность нейтрофилов к адгезии (верхний рисунок) и фагоцитозу (нижний рисунок) у больных гнойным риносинуситом в зависимости от продукции ¡Ь-8 на системном уровне (* отмечены показатели, отличающиеся от данных ПЗЛ с р<0,05); ПЗЛ - практически здоровые лица.

Как видно из рис.2, в группе практически здоровых лиц способность нейтрофилов к адгезии была более выражена у клеток, вышедших на поверхность

слизистой оболочки околоносовых пазух, чем у клеток кровеносного русла. В отличие от группы сравнения (ПЗЛ), во всех группах больных отмечалась обратная тенденция - показатели адгезии нейтрофилов были выше у клеток кровеносного русла, чем у клеток в очаге воспаления.

Фагоцитарная активность нейтрофилов была снижена преимущественно у больных I группы.

В целом, отмечались более выраженные изменения функциональных показателей нейтрофилов у больных I группы, где продукция ГЬ - 8 на системном уровне была менее чем у практически здоровых лиц. Было характерно значительное снижение способности нейтрофилов к адгезии и фагоцитозу, как у клеток кровеносного русла, так и у клеток в очаге воспаления.

Во II группе больных отмечалось умеренное повышение продукции ГЬ -8 на системном уровне. Имело место отсутствие адекватных воспалению признаков активации функциональных свойств нейтрофилов кровеносного русла. В очаге воспаления отмечалось снижение адгезивных свойств нейтрофилов.

В III группе больных было отмечено выраженное увеличение продукции на системном уровне, что сопровождалось повышенной способностью нейтрофилов к адгезии (в кровеносном русле).

Оценка данных цитограмм промывных жидкостей показала, что именно в III группе больных были самые высокие показатели содержания целых, по-видимому, недавно вышедших из кровеносного русла нейтрофилов (40,43+4,85 по сравнению в I и II группах больных соответственно 25,05+4,54 и 25,46+4,43%, р<0,05).

В зависимости от продукции ГЬ -8 на системном уровне были выявлены также определенные особенности клинического течения заболевания. Установлено, что такие клинические особенности как распространенность инфекционного процесса (поражение несколько пазух) (рис.3) и отсутствие температурной реакции на воспаление (рис.4) сопряжены с невысокой способностью организма продуцировать - 8 на системном уровне.

Рис.3. Количество пораженных околоносовых пазух у больных риносину-ситом с затяжным и хроническим течением и продукция 1Ь-8 на системном уровне (* - р<0,05).

Рис.4. Наличие температурной реакции в анамнезе больных риносинуси-том с затяжным и хроническим течением и продукция 1Ь-8 на системном уровне (* -р<0,01).

Полученные результаты позволяют сделать заключение о ведущей роли И.-8 в патогенезе гнойного риносинусита. Значимость продукции цитокина на системном уровне обусловлена подготовкой нейтрофилов к процессам адгезии (прикрепления), в том числе и к сосудистому эпителию в очаге воспаления, с целью последующего их выхода в очаг воспаления и фагоцитирования микроорганизмов и некротических масс.

Отсутствие реакции организма больных гнойным риносинуситом отвечать на воспаление повышением продукции Ш • 8 на системном уровне, и более того, наличие недостаточности продукции цитокина, свидетельствует о наличии дисбаланса активации иммунного ответа. Низкие значения продукции ГЬ- 8 сопровождались невысокими показателями синтеза Невысокие значения

продукции 1Ь -10 на системном уровне были выявлены в 73,8% случаев.

В то же время выявленная нами согласованность продукции провоспали-тельных цитокинов (1Ь - 8 и 1ИР) на системном уровне у больных (г=0,41) позволяет предположить о возможном активирующем воздействии 1Ъ -1Р на продукцию ГЬ-8, что согласуется с литературными данными (Фрейдлин И.С., 1999). На рисунке 5 представлены выявленные корреляционные связи продукции цитокинов на системном уровне с состоянием фагоцитарного звена.

Рйс.5. Корреляционные связи между продукцией 1Ь-1Р и 1Ь-8 на системном уровне с состоянием нейтрофильного звена (в том числе в очаге воспаления) у больных ГРС с затяжным и хроническим течением.

Вышеизложенное обосновывает возможность регулирования продукции цитокина 1Ь-8 путем активации синтеза эндогенного 1Ь -1р. Для этой цели довольно широко в клинической практике используются иммунопрепараты бактериального происхождения. Другое направление - введение экзогенного 1Ь -1р. В настоящее время в ГосНИИ особочистых биопрепаратов разработан ре-комбинантный 1Ь -1р — Беталейкин.

Однако, с учетом полученных данных роли интерлейкина-8 в иммунном ответе на системном и местном уровнях, представлялось возможным оценить влияние рекомбинантного 1Ь -1р (Беталейкина) на показатели цитокиновой сети и клинические проявления ХГРС в зависимости от способа введения препарата.

4. Лечение больных гнойным риносинуситом с затяжным и хроническим течением рекомбинантным интерлейкином-1 (Беталейкином)

Лечение проводено 94 больным гнойным риносинуситом с затяжным и хроническим течением. 30 больных получали традиционную терапию, 20 больных - лечение местным введением Беталейкина в синус, 44 больным - Беталей-кин вводили в вену.

Клинические результаты имели следующие характеристики.

При традиционной терапии улучшение состояния больных наступало с 3 дня лечения (20,0%), а у большинства (80%) - с 6 по 11 сутки от начала лечения. Полное клиническое выздоровление отмечалось на 6-8 сутки у 23,4% больных, у остальных (76,6%) - с 12 по 16 сутки.

В группе, получавших Беталейкин исследуемые показатели были лучше за счет сокращения сроков лечения, улучшения состояния и периода выздоровления. Однако эти показатели тоже были неоднозначны в зависимости от способа введения препарата.

При местном применении Беталейкина улучшение состояния и сокращение гнойного отделяемого отметили в первые двое суток 60% больных, а полное выздоровление наступило на 4-6 сутки у 80% больных

При системном применении Беталейкина улучшение почувствовали в первые два дня 75,1% больных, выздоровление наступило в первые шесть суток у 79,9% больных.

Обращало на себя внимание, что во время внутривенного введения Бета-лейкина в первые сутки имели место симптомы обострения заболевания с системными проявлениями в виде повышения температуры, озноба, головной боли

(75,0%). Мсстно, уже на следующие сутки промывная жидкость очищалась от гноя (81,1%).

В другой группе больных, получавших Беталейкин местно, в околоносовую пазуху, признаки обострения заболевания наблюдались к третьему дню лечения и имели преимущественно местный характер в виде увеличения гнойного отделяемого в. воспаленном синусе. Отчетливая положительная динамика и очищение содержимого синуса от гноя наступало после четвертого дня лечения (75,0%).

Таким образом, при оценке результатов лечения при традиционном методе не отмечалось ни одного отличного результата, а 40% были признаны как "без эффекта". Полученные результаты представлены в табл.4.

Таблица 4

Результаты лечения больных гнойным риносинусотом _в зависимости от проведенной терапии_

Варианты лечения

Традиционное Местное Внутривенное

Результаты лечение применение введение

лечения (п=30) Беталейкина Беталейкина

(п =20) (п=44)

Абс.ч. % Абс.ч. % Абс.ч. %

Отличный 0 0 6 30,0 25 56,8

Хороший 5 16,7 9 45,0 13 29,5

Удовлетворительный 13 43,3 5 25,0 5 11,4

Без эффекта 12 40,0 0 0 1 2,3

Итого: 30 100,0 20 100,0 44 100,0

Как следует из табл.4. При местном применении препарата отличные и хорошие результаты составили 75%, неудовлетворительных результатов не было. При системном применении более половины больных были выписаны с отличным результатом, неудовлетворительный результат был у 1 человека.

Следует также отметить, что имелась прямая зависимость результатов лечения от наличия температурной реакции в анамнезе и в процессе лечения. Среди больных без температурной реакции в анамнезе и в процессе лечения (25%) в 60,0% случаев отмечался отличный результат лечения, но в 20,0% -удовлетворительный. В группе больных, отмечавших температурную реакцию и в анамнезе и в процессе лечения - в 70,0% случаев отмечался отличный результат лечения, и не было ни одного случая удовлетворительного результата.

Во всех группах наблюдения проведено изучение отдаленных результатов лечения. На анкету ответили 44 больных. Результаты были следующими: в группе традиционного лечения рецидивы в течение года наблюдались в 44,4%

случаев; в группах больных, получавших Беталейкин рецидивы были в 20,6% случаев. Отдаленные результаты были значительно лучше, чем при традиционном лечении и не зависели от способа введения препарата.

Оценка иммунологических показателей в динамике при системном (в/в) введении рекомбинантного IL-lß (Беталейкина) показала значимые изменения.

На рисунке 6 представлены показатели продукции цитокинов (IL-8, IL-lß и IL-IRa) на системном уровне в динамике лечения Беталейкином. Оценка динамики показателей проводилась с учетом исходных значений (I группа - показатели ниже, чем у практически здоровых лиц, II группа - умеренно повышенные и III группа - значительно повышенные показатели).

Рис.6. Иммунокорригирующее влияние Беталейкина на продукцию IL-8 И IL-lß на системном уровне (* - р<0,05).

Как видно из рис.6, отмечалось значительное увеличение показателей продукции провоспалительных цитокинов на системном уровне у лиц с исходно низкими значениями (больные I группы). Отмечалась выраженная тенденция к увеличению показателей у больных II группы (р>0,05). У больных с вы-

сокими показателями продукции IL-8 (III группа) синтез цитокина имел тенденцию к снижению.

Одновременно у больных I группы повышалась способность клеток кровеносного русла к адгезии (рис.7).

Результаты оценки показателей состояния нейтрофилов в очаге воспаления в динамике лечения Беталейкином (п=34) в исследуемых группах больных представлены в табл.6.

Таблица 6

Функциональные показатели нейтрофилов в очаге воспаления больных гной-

ным риносинуснтом в динамике при лечении Беталейкином (внутривенно)

Больные гнойным риносинуснтом

Показатели I группа (п=8) II группа (п=10) III группа (п=16)

Адгезия, %

До лечения 1,90+1,41 7,5913,94 6,8812,56

Пик 18,7015,44** 13,1713,59 16,0313,08*

После 11,9316,92 4,5711,07 12,7514,01

Фагоцитоз, %

До лечения 36,1313,42 42,5015,06 42,1315,16

Пик 56,0017,63* 52,7814,36 51,0015,70

После 52,8818,11 48,5615,78 44,1916,31

Примечание: * - показатели отличаются от данных до лечения со стати стической достоверностью р<0,05; ** - р<0,01.

Как видно из данных табл.6, во всех группах больных отмечалось повышение способности нейтрофилов к адгезии и фагоцитозу.

Одновременно наблюдалось значительное снижение доли фагоцитов с незавершенным фагоцитозом (р<0,01) и уменьшение внеклеточной пероксидаз-ной активности (р<0,05).

Оценка данных содержания цитокинов в очаге воспаления после лечения свидетельствовала о сбалансированности их соотношений.

Клинически это сопровождалось значительным снижением гнойного отделяемого уже в первые сутки лечения и выздоровлением на 5 - 6 день.

Были выявлены значимые изменения показателей после первого введения Беталейкина. Отмечена тенденция к повышению продукции IL -8, что сопровождалось увеличением количества и функциональных показателей фагоцитарного звена иммунной системы. Наблюдалось повышение количества лейкоцитов > за счет сегментоядерных нейтрофилов. Наряду с увеличением количества ней-трофилов, отмечалась выраженная тенденция к повышению показателей их функционального состояния . - способности к адгезии, фагоцитарного показателя и метаболической активности.

Реагирование иммунной системы в очаге воспаления также, уже после первого внутривенного введения препарата характеризовалась тем, что именно в этот период концентрация провоспалительных цитокинов доходила до своих максимальных значений.

Увеличение уровня IL-8 сопровождалось повышением до своих максимальных значений способности нейтрофилов к адгезии не только клеток, расположенных в кровеносном русле, но и в очаге воспаления. Одновременно также наблюдалось повышение до своих максимальных значений и других показателей функциональной активности нейтрофилов. Увеличивалась фагоцитарная активность нейтрофилов in vitro и in vivo, повышалась их. метаболическая способность. Отмечалось снижение доли нейтрофилов с незавершенным фагоцитозом с 55,17+2,93 до 29,93±1,77, % (р<0,001).

Наряду с активацией функции нейтрофилов, имело место снижение количества клеток в промываемых жидкостях. В это время снижалось количество цитоза в промывных жидкостях из воспаленных пазух с 17,68±3,10 до 6,20±3,10,109/мл(р<0,05).

Таким образом, иммунная система больных гнойными риносинуситами уже после первого введения Беталейкина (внутривенно) отвечала активацией, как на системном, так и на местном уровне. Введение экзогенного спо-

собствовало практически немедленному запуску адекватного иммунного ответа на системном и затем — на местном уровнях.

На основании полученных закономерностей был разработан способ оценки эффективности лечения риносинуситов по определению показателя незавершенности фагоцитоза по данным риноцитограмм (Патент РФ № 2200319 от 10.03.2003 г.).

Таким образом, у больных гнойным риносинуситом имеется несостоятельность иммунной системы, как на местном, так и на системном уровне, обусловленная снижением функций клеток фагоцитарного звена, состояние которых регулируется 1Ь -8, синтезируемым на системном уровне.

Способность к продукции 1Ь -8 на системном уровне регулируется 1Ь -Введение рекомбинантного (Беталейкина) внутривенно способство-

вует активации продукции эндогенного 1Ь -8 и, как следствие, повышению числа лейкоцитов, сегментоядерных нейтрофилов и увеличению способности ней-трофилов кровеносного русла к адгезии и выходу их в очаг воспаления.

В очаге воспаления обеспечивается приток новых клеток с повышенными функциональными свойствами, которые способны завершить воспалительный процесс. Клинически это проявляется в значительном повышении эффективности лечения больных гнойным риносинуситом с затяжным и хроническим течением и стабильности полученных результатов на протяжении не менее одного года.

ВЫВОДЫ:

1. Выявлены клинические особенности проявления гнойного риносинуси-та с затяжным и хроническим течением в зависимости от продукции интерлей-кина-8 на системном уровне. У лиц со сниженной продукцией цитокина отмечается отсутствие температурной реакции на воспаление и увеличение распространенности инфекционного процесса (поражение нескольких пазух).

2. Установлена прямая зависимость функционального состояния (адгезивная и фагоцитарная активность) нейтрофилов крови и очага воспаления от продукции интерлейкина-8 на системном уровне.

3. Применение рекомбинантного интерлейкина- (Беталейкина) в медикаментозном лечении больных гнойным риносинуситом с затяжным и хроническим течением повышает число выздоровевших с 60,0% в группе контроля до 97,7% - в группе наблюдения. Клиническая эффективность применения Бета-лейкина повышается при системном способе введения препарата.

4. Преимущество внутривенного введения Беталейкина основывается на реализации иммунного ответа через повышение продукции эндогенного интер-лейкина-8 с активацией функциональных свойств нейтрофилов на системном (кровеносное русло) и местном (очаг воспаления) уровнях. Такой путь иммунного ответа обеспечивает незамедлительный клинический эффект.

Практические рекомендации

1. В выборе тактики лечения следует учитывать клинические особенности течения хронического гнойного риносинусита, а именно поражение нескольких околоносовых пазух и отсутствие температурной реакции при обострении воспалительного процесса, а также оценить эти симптомы как клинический маркер несостоятельности иммунного реагирования.

2. При выборе способа лечения целесообразно отдавать, предпочтение системному (в вену) введению Беталейкина как более рациональному, так как этот путь введения позволяет получить лучшие клинические и лабораторные результаты, свидетельствующие о восстановлении адекватного иммунного ответа за счет нормализации продукции провоспалительных цитокинов IL-8 и IL-lß-

3. Для определения эффективности проводимой терапии гнойных рино-синуситов рекомендуется использовать метод оценки цитограмм промывных жидкостей. Увеличение показателей незавершенного фагоцитоза (более 32%) следует расценивать как неблагоприятный признак в прогнозировании завершенности воспалительного процесса.

Список трудов, опубликованных по теме диссертации

1. Продукция интерлейкина-lb и состояние макрофагально-фагоцитарного звена иммунной системы у больных гнойными формами риносинусита // Российская ринология. - 2002. - №2. - С. 127 - 129. (Соавт. Азнабаева Л.Ф., Арефьева Н.А., Кильсенбаева Ф.А.).

2. Оценка эффективности лечения гнойных риносинуситов // Российская ринология. - 2002. - № 2. - С. 125 - 127. (Соавт. Кильсенбаева Ф.А., Арефьева Н.А., Азнабаева Л.Ф.).

3. Интерлейкин-lb и функциональное состояние иммунной системы при хроническом гнойном риносинусите // Цитокины и воспаление. - 2002. - Т.1, № 2. -С. 60. (Соавт. Азнабаева Л.Ф., Симбирцев А.С., Арефьева Н.А., Кильсенбаева Ф.А.).

4. Иммуноцитологические исследования в ринологии: Учебное пособие. // Уфа: Издательство "Здравоохранение Башкортостана", 2002.-88с. (Соавт. Арефьева НА, Кильсенбаева ФА, Азнабаева Л.Ф., Хафизова Ф.А.).

5. Беталейкин в лечении больных гнойным риносинуситом с затяжным и хроническим течением //Методические рекомендации. - Уфа, 2003.- 19с. (Соавт. Азнабаева Л.Ф.,Арефьева НА, Шарипов Р.А., Муртазин З.Я.).

6. Влияние Беталейкина на продукцию интерлейкина-8 и функциональную активность нейтрофилов при гнойных воспалительных заболеваниях околоносовых пазух с затяжным и хроническим течением // Цитокины и воспаление. - 2003. - Т.2, №3. - С39. (Соавт. Азнабаева Л.Ф., Арефьева НА, Кильсенбае-ва Ф.А.).

7. Цитокины в иммунопатогенезе гнойного риносинусита с затяжным и хроническим течением // Российская ринология. - 2004. - №1. - С. 68-71. (Соавт. Азнабаева Л. Ф., Арефьева Н.А., Кильсенбаева ФА).

ИЗОБРЕТЕНИЕ

1. Способ оценки эффективности лечения риносинуситов // Патент РФ № 2200319, МПК 7 в 01 N 33/48; опубликован 10.03.2003, Официальный бюллетень «Изобретения. Полезные модели.» № 7. - с. 454.

Формат 60x84/16. Бумага «Снегурочка» 80 г/см2. Компьютерный набор. Times New Roman. Печать на ризографе- Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 153.

Отпечатано в типографии ООО «Штайм» Лицензия № 225 от 03.08.2000 г. 450005, г. Уфа, ул. 8-е Марта, 12/1. Тел. 28-42-23.

Р12 9 15