Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Регуляция воспалительных реакций в легком при экспериментальном туберкулезе

Евстифеев Владимир Васильевич

На правах рукописи

Регуляция воспалительных реакций в легком при экспериментальном туберкулезе

14.03.09. «Клиническая иммунология, аллергология» 03.01.03. «Молекулярная биология»

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 < ДПР 2015

МОСКВА 2015

005567178

005567178

Работа выполнена в Федеральном Государственном Бюджетном Научном Учреждении «Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза»

Научный руководитель:

Александр Соломонович Лпт - доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией иммуногенетики ФГБНУ «ЦНИИТ»

Официальные оппоненты:

Татьяна Леодоровна Ажикина - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории структуры и функций генов человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова

Михаил Александрович Владимирский — доктор медицинских наук, профессор, заведующий лаборатории иммунологических исследований и молекулярной диагностики туберкулеза НИИ Фтизиопульмонологии Первого Московского Государственного Университета им. И.М. Сеченова

Ведущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г. Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора)

Защита состоится «22» мая 2015 г. в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.130.01 при ФГБУ "ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России (123098 Москва, ул. Гамалеи 18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ "ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России и на сайте www.gamaleya.org

Автореферат разослан «20» марта 2015 г.

Ученый Секретарь Диссертационного Совета Доктор медицинских наук, профессор

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы н степень ее разработанности Туберкулез (ТБ) до сих пор

занимает первое место в мире по смертности среди инфекционных заболеваний. Основными подходами к лечению и профилактике ТБ остаются химиотерапия и вакцинация BCG, однако оба они далеко не всегда эффективны. Это диктует необходимость разработки новых более эффективных лекарств и вакцин, а также методов регулирования врожденного и адаптивного иммунного ответа хозяина.

Иммунная система играет решающую роль в патогенезе ТБ. Тяжесть течения заболевания, степень деструкции легочной ткани и развитие кахексии существенно зависят от воспалительных процессов, контролируемых организмом хозяина. Патологически высокая реактивность, вызывающая значительные повреждения структуры инфицированных тканей, не менее опасна, чем неспособность организма хозяина ограничить диссеминацию микобактерий [Dannenberg, 1982; Cardonaetal., 1999; Hernandez-Pandoetal., 1996]. Туберкулезная гранулема ограничивает очаг инфекции, но представляет опасность для хозяина. В результате распада гранулем происходит распространение инфекции через лимфатическую и кровеносную системы.

В связи с вышеизложенным, одним из перспективных направлений повышения эффективности контроля заболевания представляется подавление избыточного воспаления и клеточной инфильтрации, то есть неконтролируемого иммунного ответа, путем блокирования медиаторов воспаления. Однако данных о том, как влияют противовоспалительные воздействия на течение ТБ очень мало. Не разработаны подходы к системному и локальному (в легочной ткани) снятию воспаления. Неизвестно, на каких стадиях процесса противовоспалительные воздействия могут способствовать уменьшению степени патологических изменений, а на каких - диссеминации микобактерий. Экспериментальной разработке этих проблем посвящена данная работа.

Целью настоящей работы стало изучение влияния блокирования факторов воспаления на тяжесть течения и иммунный ответ хозяина против возбудителя на модели туберкулеза у мышей, отличающихся высоким уровнем воспалительных реакций в легких при заражении - генетически чувствительной к ТБ линии I/St.

Задачи исследования

1. Провести эксперименты по модулированию легочного воспаления инъекциями диклофенака и введением выращенных in vitro незрелых дендритных клеток (ДК).

2. Провести эксперименты по блокированию легочного воспаления инъекциями пептида NBD, селективно ингибирующего ключевой транскрипционный фактор воспаления NF-kB.

3. Оценить эффективность блокирования воспалительного цитокина IL-11 путем системного введения антител.

4. Создать генетические конструкции, кодирующие синтетический ген IL-11 дикого типа и его мутантную форму, а также соответствующие белки, для получения новых инструментов воздействия на воспалительные реакции.

5. На модели ТБ у мышей оценить характер локального блокирования в легких IL-11.

Научная новизна

1. Впервые на модели экспериментальной инфекции оценены различные подходы к снятию туберкулезного воспаления в легочной ткани.

2. Впервые установлено, что однократное введение незрелых ДК, нагруженных антигеном, снижает тяжесть течения ТБ.

3. Впервые показано, что при высоком уровне восприимчивости к М tuberculosis происходит быстрое увеличение продукции IL-11 на ранней стадии инфекции.

4. Впервые продемонстрирована роль IL-11 как фактора, усиливающего миграцию нейтрофилов к очагам инфекции.

5. Впервые выявлено, что IL-11 при ТБ выступает в роли воспалительного цитокина, блокирование которого снижает тяжесть патологии.

6. Впервые продемонстрировано, что экспрессия IL-11 регулируется аутокринно и на транскрипционном уровне. При этом показано, что IL-11 участвует в запуске воспаления в легочной ткани, но не ингибирует иммунный ответ типа 1.

7. Впервые установлено, что селективное ингибирование пептидом N00 классического пути активации транскрипционного фактора ОТ-кВ при ТБ приводит к снижению патологических изменений в легочной ткани. Теоретическая и практическая значимость Хотя работа носит экспериментальный характер, полученные результаты существенны для понимания легочной патологии и динамики защитных и деструктивных тканевых реакций у больных туберкулезом. Это будет способствовать разработке новых средств патогенетической терапии, в частности целенаправленной регуляции воспалительных реакций при туберкулезе. Материалы диссертации используются в курсе лекций для аспирантов и ординаторов ФГБНУ «ЦНИИТ» и в лекциях для студентов кафедры иммунологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Основные положения, выносимые на защиту

• Подавление воспалительных реакций у мышей чувствительной к туберкулезу линии 1/81 на ранних стадиях инфекции приводит к снижению уровня патологии легких.

• 1Ь-11 при ТБ выступает в роли воспалительного цитокина, блокирование которого снижает тяжесть патологии.

• Ингибирование классического пути активации транскрипционного фактора ОТ-кВ при ТБ приводит к снижению патологии легких.

Апробация работы Основные положения диссертации были доложены на IX Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006), а также на ежегодной конференции молодых ученых, с международным участием, посвященной Международному дню борьбы с туберкулезом «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей» (Москва, 2015)

Апробация диссертации состоялась 29 января 2015 года на научной конференции отделов иммунологии и микробиологии ФГБНУ «ЦНИИТ». Публикации По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 5 статей в рекомендованных ВАК РФ изданиях.

Структура диссертации Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, методы

исследования, результаты и обсуждение, заключение, список литературы (208 источников) и выводы. Диссертация иллюстрирована 3 таблицами и 23 рисунками.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Животные Опыты проводили на мышах инбредной линии I/St, поддерживаемой в питомнике ФГБНУ «ЦНИИТ» в соответствии с этическими требованиями по содержанию животных. Воду и пищу животные получали ad libitum. В опытах использовали самцов и самок в возрасте 2-4 месяца. В пределах одного эксперимента использовали животных одного пола.

Приготовление культуры М. tuberculosis и заражение животных Использовали микобактерии М. tuberculosis штамма H37Rv Pastern, поддерживаемые и выращиваемые в стандартных условиях [Nikonenko et al., 2000]. В большей части экспериментов использовали модель аэрозольного заражения в дозе 100 КОЕ/мышь. В некоторых случаях применяли заражение через трахею под гексеналовым наркозом (1мг/г веса). У мышей вскрывали трахею и вводили 50 мкл суспензии, содержащей 103 КОЕ в 0,05 мл PBS.

Определение количества мнкобактерий в органах зараженных животных

Серийные десятикратные разведения гомогенатов органов высевали на чашки Петри с агаром Дюбо, растущие колонии подсчитывали на 21 день инкубации при 37°С.

Антнгены В качестве антигенов в экспериментах использовали ультразвуковой дезинтеграт М. tuberculosisH37R\ — водорастворимую фракцию разрушенных ультразвуком М tuberculosis (Авдиенко и др., 2006).

Получение полик~лопальных антител к IL-11 мыши Поликлональные антитела к IL-11 мыши, любезно предоставленные В.Г. Авдиенко, описаны ранее (Kapina et al., 2011). Контролем служил иммуноглобулин, полученный от тех же животных до иммунизации.

Получение суспензий клеток легкого Суспензии клеток легкого получали по ранее описанному методу [Holt et al, 1985]. Легкие извлекали, измельчали до кусочков размером 1-2 мм3 и инкубировали в течение 90 мин при 37°С и 5% СОг в присутствии 200 Ед/мл коллагеназы и 50 Ед/мл ДНКазы I (Sigma, USA). После

окончания инкубации суспензию интенсивно пипетировали, отмывали и переводили в среду для культивирования.

Получение культуры дендритных клеток Дендритные клетки (ДК) получали из костномозговых предшественников по модифицированному методу Lutz [Lutz et al., 1999]. Клетки костного мозга вымывали из бедренных костей 1-1,5 мл отмывочной среды. Полученную суспензию культивировали в чашках Петри в RPMI-1640, содержащей 10% FCS.

Нагрузка ДК антигеном Клетки, собранные на 7-й день культивирования, осаждали центрифугированием и переводили в свежую среду. 2х106клеток/мл инкубировали в присутствии 25 мкг/мл сониката микобактерий и 50 ед/мл GM-CSF при 37°С в 5% С02. В качестве контроля использовали клетки, выращенные без добавления антигена. Через 12-18 часов после добавления антигена энергичным пипетированием собирали неприлипшие клетки.

Иммунизация ДК ДК осаждали и дважды отмывали центрифугированием в PBS, содержащем 0,2% MC. Клетки вводили туберкулиновым шприцем в количестве 5х 10б/мышь в PBS в область ретро-орбитального синуса.

Анализ клеток методом проточной цитофлуорометрии Клетки окрашивали моноклональными антителами anti-CD4, anti-CD8, anti-CD 19, anti-Ly6G, anti-F4/80, меченными FITC, РЕ, РегСРи АРС,в соответствии с рекомендациями фирм-производителей (BDPharmingen, Biolegend).Анализ проводили на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (BecktonDickenson).

Определение продукции цнтокннов Продукцию IL-6, IL-10, IL-12, IFN-y и TNF-a определяли методом ELISA в гомогенатах легочной ткани с помощью наборов OptEIASet (BDPharMingen), а также наборов для определения Mip-2 (R&D, США) и IL-11 (R&D, США) в соответствии с рекомендациями фирм-изготовителей. Выделение суммарно» РНК из суспензии клеток и получение кДНК Выделение проводили из 1,5-5х106 клеток при помощи набора SV Total RNA Isolation System (Promega, США) в соответствии с рекомендациями фирмы изготовителя. Для получения кДНК проводили обратную транскрипцию 2мкг тотальной РНК с помощью обратной транскриптазы M-MLV (Promega, США), согласно инструкции производителя. Для того чтобы обратная транскрипция проходила только с мРНК, в качестве праймеров использовали oligo(dT)15.

Определение цитокинов и хемокинов методом ПЦР в реальном времени С

помощью полуколичественного ПЦР в реальном времени (TaqMan® с использованием зондов, несущих двойную метку) оценивали транскрипцию генов цитокинов, хемокинов и транскрипционных факторов в различных популяциях клеток, для чего использовали различные праймеры (ABI) и 2х PCR Master Mix Probe Assay (EGTGroup). Анализ экспрессии генов проводился на приборе iCycler (Bio-rad, Hercules, CA, USA) с использованием генов GAPDH и Actin в качестве контроля с постоянным уровнем экспрессии.

Определение цитокинов и хемокинов методом гибридизации на микрочипах

Качество и чистоту суммарной РНК контролировали с использованием Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Германия). 500нг суммарной РНК использовали для взаимодействия с флуоресцентной меткой СуЗ по протоколу QuickAmpLabeling (Agilent Technologies, Германия). Флуоресцентно меченную РНК гибридизовали с чипом Agilent's mouse 4x44k в течение 16часов при 68°С, сканировали на Agilent DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies, Германия). Экспрессию генов оценивали при помощи программы Feature Extraction 10.5.1.1 (Agilent Technologies, Германия).

Трансформация клеток Е. coli Для трансформации клеток E.coli использовали метод электропорации. Образец клеток Exoli штамма М15 размораживали на льду, смешивали 80мкл суспензии клеток с 2мкл плазмидной ДНК и оставляли на льду на 1-2 мин. Затем переносили смесь клеток и ДНК в кювету для электропорации, помещали кювету в камеру и доводили ее до контактов. После воздействия электрическим током, доставали кювету, добавляли 1 мл среды LB без антибиотиков. Суспензию клеток переносили в пробирку и «подращивали» 1 час на термостатном орбитальном шейкере при 200 об/мин, +37°С. Проверка индукции синтеза рекомбинантных белков в штамме М15 E.coli Из культур клеток E.coli, трансформированных рекомбинатными плазмидами, и контрольных клеток получали 18-часовые культуры на жидкой среде LB с Km. После доращивания добавляли 0,1 MIPTG (1 мкл индуктора на 1 мл среды) и растили пробы до стационарных значений оптической плотности (2-4 ч). Из каждой пробы отбирали по 500 мкл культуры (контроль индукции), центрифугировали, осадок хранили при - 20°С. Оставшиеся 2,5 мл культуры

(контроль растворимости белка) отбирали в чистую пробирку, центрифугировали и хранили сухой осадок при - 20°С.

Электрофорез белков в полиакриламндном геле Для обнаружения индуцированных белков в лизатах трансформированных клеток проводили электрофорез в полиакриламндном геле в денатурирующих условиях (ПААГ-SDS). Выделение и очистка белков Выделение и очистку белков проводили методом металл-хелатной хроматографии. Лизировали 1 г биомассы в буфере А (20мМ имидазол-HCl, рН7.5, 50мМ NaCl, 100мкг/мл лизоцима) с использованием ультразвука, осаждали при 14 OOOg 30 мин. К супернатанту добавляли NaCl до концентрации 0,5 М, полученный раствор белка наносили на колонку с 3 мл Ni-содержащего сорбента WB 40Ni, уравновешенного буфером Б (20мМ имидазол-HCl, рН7.5, 500мМ NaCl). Элюировали белок с колонки градиентом имидазола от буфера Б до буфера В (500мМ имидазол-HCl, рН7.5, 500мМ NaCl). Фракции анализировали с использованием ПААГ-SDS. Концентрацию белков определяли на спектрофотометре.

Гистологические исследования Для изучения патологических изменений в легких ткань замораживали в режиме температурного градиента от -60С до -20С в течение 1 часа в электронном криотоме (ThermoShandon, Великобритания). Получали срезы толщиной 8 мкм. Срезы высушивали на воздухе, фиксировали в метаноле и окрашивали гематоксилином и эозином.

Статистическая обработка результатов Полученные данные обрабатывали с помощью программы GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью метода Стьюдента (t-тест), корреляционного и вариационного анализа (ANOVA). Достоверными считали различия при р<0,05.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Модулирование воспаления введением диклофенака и выращенных in vitro дендритных клеток

Незрелые ДК, полученные в культуре in vitro, нагружали смесью антигенов микобактерий для индукции специфического иммунитета, и вводили реципиентам

внутривенно (5 х 105/мышь). Ранее было установлено, что такая доза клеток, введенных внутривенно, не обладает вакцинирующими свойствами [Rubakova et al., 2007]. Через неделю мышей инфицировали внутритрахеально вирулентным штаммом М tuberculosis. Вторая группа подопытных мышей, получила курс инъекций нестероидного противовоспалительного препарата - диклофенака (25 мкг/мышь диклофенака в течение 7 дней). В качестве контроля использовали инфицированных мышей линии I/St. Как видно из таблицы 1, введение незрелых ДК, нагруженных антигенами микобактерий, как и лечение диклофенаком, приводит к достоверному снижению количества М. tuberculosis?, легочной ткани.

Таблица 1. Количество микобактерий из легочной ткани через три недели после

инфицирования._

Экспериментальная группа КОЕ /мышь Достоверность различий с контролем (р)

контроль (1,2 ± 0,9) х 10" —

ДК + АГ (2,3 ±0,2) х 10' <0.05

диклофенак (4,3 ± 1,1) х 10' <0.05

Мы сравнили сроки выживания после заражения контрольной группы и подопытных животных. Оказалось, что предварительное введение нагруженных антигеном ДК и лечение диклофенаком приводит к достоверному (р< 0.01) увеличению срока жизни мышей (Рис. 1).

Анализ морфологической картины изменений в легких мышей показал, что по сравнению с контрольной группой (рис. 2А) у реципиентов, получавших диклофенак и ДК (рис. 2В и С), снижен уровень инфильтрации легочной ткани.

80

60-

£ 20

L—А

■Ir-*

И

20 40 60 80

день после заражения

100

Рисунок 1. Динамика гибели мышей линии 1/51 после инфицирования M.tuberculosis

зависимости от противовоспалительной терапии.А - контроль;| незрелые нагруженные ДК.

- диклофенак;* -

Рисунок 2. Различия в уровне инфильтрации и воспаления в ткани легкого между контролем (А), при введении диклофенака (В) или незрелых ДК (С) через три недели после инфицирования.

Таким образом, однократное введение незрелых ДК, нагруженных антигеном, снижает тяжесть течения ТБ по всем основным параметрам.

3.2. Роль IL-11 в воспалении 3.2.1. При туберкулезной инфекции у генетически чувствительных мышей увеличивается уровень 1L-11

Мы сравнили экспрессию гена, кодирующего IL-11, у генетически чувствительных к ТБ мышей линии I/St и более резистентных A/Sn, используя метод гибридизации на чипе (Agilent DNA Microarray). Исследования показали, что уровень экспрессии ¡1-11 после заражения мышей 1/St увеличивается приблизительно в 5 раз (2ЛС,=2.3) по сравнению с неинфицированным контролем, в то время как в легких мышей A/Sn экспрессия практически не изменяется (2ас'=0,7). Результаты были верифицированы методом ПЦР в реальном времени (Рис. 3). Через две недели после заражения уровень мРНК IL-11 не менялся у мышей A/Sn, но увеличивался в 10 раз у чувствительных мышей I/St (pcO.OOl). Таким образом, при высоком уровне генетической восприимчивости к М. tuberculosis наблюдается быстрое увеличение экспрессии гена для 1L-11.

На следующем этапе мы провели серию экспериментов in vivo, чтобы установить, может ли блокирование IL-11 привести к терапевтическому воздействию.

«наивные» инфицированные

Рисунок 3. Изменение уровня экспрессии гена il-U у чувствительных (I/St) и резистентных (A/Snl мышей в легочной ткани через две недели после заражения.

3.2.2. Блокирование IL-11 антителами

В первой серии экспериментов мы исследовали влияние на тяжесть течения инфекции блокирования IL-11 у мышей линии I/St с помощью введения антител, полученных при многократной иммунизации кроликов рекомбинантным IL-11 мыши. Как видно из рисунка 4, блокирование IL-11 антителами в течении 24 дней после заражения приводит к достоверному снижению степени инфильтрации легочной ткани и роста микобактерий в легком.

Для определения влияния инъекций антител к IL-11 на клеточную инфильтрацию мы исследовали содержание различных популяций клеток в легочной ткани у мышей контрольной и подопытной групп. Из таблицы 2 видно, что статистически значимая разница в количестве клеток в легких между мышами двух групп касается только нейтрофилов. Таким образом, данные, полученные в нашей работе, демонстрируют роль IL-11 в качестве фактора, усиливающего приход нейтрофилов к очагам инфекции.

I»

р = 0.038 *

гЬ

контроль anti-IL-11

X JO

5

а. ю

л

X

■е- о

X X

зг

р = 0.024

*

+

контроль entí-[L-ll

Рисунок 4. Введение антител к IL-ll приводит к уменьшению тяжести течения ТБ у мышей линии 1/St. А - трехкратное уменьшение КОЕ М. tuberculosis и по сравнению с контрольными животными; Б - статистическая оценка инфильтрации легочной ткани.

Таблица. 2. Инъекции антител к IL-11 приводят к снижению миграции нейтрофилов в _легкие инфицированных М tuberculosis мышей._

Клеточный состав легочной ткани группы

контроль анти-IL-11 Р

% млн. на долю легкого % млн. на долю легкого

CD4+ 40,6 ± 2,4 6,1 ±0,5 40,7 ± 2,3 5,2 ± 0,5 >0,7

CD8+ 19,6 ± 1,8 3,0 ±0,2 19,4 ± 1,2 2,5 ± 0,4 >0,5

CD19+ 14,1 ± 1,2 2,2 ± 0,2 19,9 ± 2,6 2,6 ± 0,3 0,384

F4/80+ 8,7 ±0,6 1,3 ± 0,2 9,1 ±0,6 1,2 ±0,1 >0,8

Ly6G+ 15,2 ± 2,5 2,3 ± 0,3 8,4 ± 1,2 1,1 ±0,2 0,024

Суммарное количество клеток 15,1 ± 1,5 12,8 ± 1,3 0,278

Мы также исследовали, как блокирование IL-11 на ранней стадии инфекции влияет на продукцию основных цитокинов в легких инфицированных мышей. Инъекции антител к IL-I1 достоверно снижали уровень экспрессии самого IL-11. Кроме того, понижался уровень продукции основных воспалительных и регуляторных цитокинов и хемокинов - IL-6, TNF-a и MIP-2 (Рис. 5). С другой стороны, введение антител не влияло на адаптивный иммунный ответ на уровне Т-клеток: уровень продукции IFN-y и его индуктора IL-12 был одинаков у контрольной и подопытной групп, а IL-10 синтезировался в ничтожных количествах (Рис. 6). Таким образом, путем блокирования IL-11 антителами удалось показать, что IL-11 участвует в запуске воспаления в легких, но не ингибирует иммунный ответ типа 1.

Поскольку раннее блокирование IL-11 привело к уменьшению воспаления в легочной ткани и снижению продукции ключевых цитокинов воспаления, нам было важно узнать, изменяется ли под действием IL-11 экспрессия генов, кодирующих другие воспалительные цитокины. Мы исследовали уровень mRNA для генов НИ, ¡16, tnfa и mip2 у зараженных мышей контрольной и подопытной групп. Было показано, что блокирование IL-11 антителами in vivo приводит к снижению экспрессии mRNA только для самого IL-11 (Рис. 7А). Эти результаты дали основание полагать, что экспрессия IL-11 регулируется аутокринно на

транскрипционном уровне, а продукция других воспалительных цитокинов, вероятно, является следствием самого усиления воспалительных реакций в органе. Для проверки гипотезы о наличии положительной петли обратной связи в регуляции экспрессии 1L-11 мы оценили уровень raRMA для 1L-11 в клетках легкого при культивировании их in vitro в присутствии и в отсутствии рекомбинантного IL-11.

зооо

2500

2000

i 1500 oj

1000 500

о

it.

IL.11 11.-6 ТЫР-аМ1Р-2 11.-12 11.-10

Р = 0.02 0.04 0.03 0.03 0.8 0.2 0.4

Рисунок 5. Введение антител к 1Ь-11 приводит к снижению экспрессии не только 1Ь-11. но и воспалительных цитокинов.

Как показано на рисунке 6Б, после двенадцатичасовой инкубации клеток легкого с рекомбинантным IL-11 в концентрации 100 нг/мл происходит достоверное (р<0,01) увеличение уровня mRNA ill 1 по сравнению с контролем.

Таким образом, наши результаты дают возможность предположить, что в ответ на инфекцию продукция IL-II быстро повышается и самостоятельно поддерживается в легких мышей генетически чувствительных к ТБ. Это способствует развитию раннего воспаления со значительным вкладом нейтрофилов, которые, в свою очередь, смещают противотуберкулезный ответ в сторону формирования некротических гранулем с массовым размножением микобактерий [Rüssel, 2007].

А.

0.01

"к" 8

X 0.008 i

I °т

S

« о.ом

IL-11

Рисунок 6. Уровень белка IL-11 влияет на экспрессию mRNA для iL-ll.(A) Блокирование in vivo IL-11 приводит к селективному снижению уровня mRNA IL-11 у мышей подопытной группы сО по сравнению с контроле») ( . (Б) Рекомбинантный 1L-11 повышает экспрессию мРНК, кодирующей этот белок.

3.2.3. Блокировка рецептора IL-11 мутантной формой IL-11

В следующей серии экспериментов мы проверили, насколько достижимо блокирование IL-11 с помощью локального введения искусственно полученной измененной (мутантной) молекулы самого цитокина. Мутантная форма 1L-11 отличается от цитокина дикого типа заменой одной аминокислоты (W147 —» А) в той области, которая взаимодействует с глобулиновым доменом второй молекулы рецепторного комплекса gp!30 [Underhill-Day et al., 2003]. Мутантный белок -высокоспецифичный антагонист IL-11, поскольку он взаимодействует с рецепторным комплексом lLll-R/gpl30 с высокой аффинностью, но не образует многокомпонентный сигнальный комплекс. Для получения искусственного гена il-11 использовали аминокислотную последовательность гена из GeneBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). С помощью программы VectorNTI Advance аминокислотный код последовательности переводили в «часто используемые» кодоны для E.coli. В нуклеотидную последовательность гена il-11 вводи последовательности эндонуклеаз рестрикции, необходимые для клонирования в вектор pQE13, а затем последовательность делили на пять фрагментов размером около 90 оснований. Синтезированные олигонуклеотиды попарно отжигали и клонировали в кодирующий вектор (pQE13 (Quagen, США) для экспрессии в E.coli штамма M15 (Рис. 7) через две промежуточные плазмиды.

Й

IL-6 TNF-a Mip-2

0.04 0.03 0.02 < 0.01 •

л

rh

) 10 нг;мп ЮОнг'мл кониенюаиия rlL-11

Рисунок 7. Карта вектора pQE-13 с клонированным синтетическим геном мышиного белка IL-11. - синтетический ген мышиного белка IL-11.

Для получения синтетического мутантного гена ¡111 мыши синтетический ген дикого типа подвергли in vitro мутагенезу методом «Quickchange» ПЦР с помощью набора для мутагенеза in vitro (Stratagene, США), согласно рекомендациям фирмы производителя. Рекомбинантные цитокины получили путем экспрессии в Е. coli. IL-II дикого типа и его мутантную форму использовали в серии экспериментов, аналогичных проведенным с антителами.

Рисунок 8. Введение рекомбинантного стимулирует размножение микобактерий в

легких.

Через 24 и 32 дня после заражения исследовали степень поражения легочной ткани и рост микобактерий в легком (Рис. 8-10). В легких мышей, получавших 1Е-11 дикого типа, накапливается больше микобактерий по сравнению с двумя контрольными группами (Рис. 8). Однако введение мутантной формы 11 не привело к подавлению размножения микобактерий.

Затем мы сравнили тяжесть поражения легочной ткани у контрольных и подопытных мышей. У мышей двух контрольных групп обнаруживались

А

Б

2.MV

s 4,0*10*

диффузные очаги воспаления как вокруг бронхов, так и по периферии. Наблюдается общее полнокровие и умеренный отек ткани (Рис. 9А.Б). У мышей, получавших 1Ь-11 дикого типа, обнаруживаются участки ткани, содержащие мелкие некротические зоны (Рис. 9Б). У группы, получавшей мутантную форму 1Ь-11, уровень воспаления был значительно снижен по сравнению с двумя контрольными группами (Рис. 9В).

Рисунок 9. Различия в уровне инфильтрации и образования очагов воспаления в ткани легкого на 32 день после инфицирования в контроле (А), при введении 1Ь-11 дикого типа ГБ) и мутантной Формы 1Ь-11 (В). Окраска гемотоксилин/эозин, увеличение х90. —> - очаги некроза

Таким образом, результаты экспериментов с мутантной формой 1Ь-11 ; показывают, что ранние повышение уровня 1Ь-11 в ответ на инфекцию оказывает

неблагоприятный эффект, подтверждая данные, полученные при использовании антител к 1Ь-11.

Анализ клеточного состава легких подтверждает этот вывод. Введение мутантного 1Ь-11 приводит к достоверному снижению содержания в легочной ткани основных клеток воспаления - макрофагов и нейтрофилов уже на первый срок наблюдения (Рис. 10). Введение мутантного 1Ь-11 приводит к значительному снижению инфильтрации легочной ткани всеми клетками иммунной системы -нейтрофилами, макрофагами, Т- и В-лимфоцитами. Напротив, введение 1Ь-11 дикоготипа приводит к резкому возрастанию инфильтрации, что согласуется с результатами гистологических исследований (рис. 9).

Анализ экспрессии в легочной ткани генов, кодирующих основные факторы воспаления, показал, что введение мутантной формы 1Ь-11 привело к снижению экспрессии генов, кодирующих воспалительные и иммуномодулирующие цитокины и хемокины: 1Ь-11, 1Ь-6, ттр8, М1р-1а, ТЫР-а, ШМ-у и 1Ь-12 (рис. 11). Напротив, введение 1Ь-11 дикого типа привело к увеличению экспрессии воспалительных факторов М1р-1а и 1Ь-6.

5 Б.ОхЮ6 -

И

день после инфицирования

день после инфицирования

8.0x10"

|

ш 6.0x10е Н

с:

ш

5 4.0x10е ■ 2.0x10е

8 о

0

Д-

1.0х10к

| 8.0x10'

с:

ш 6.0*10'

|

| 4.0*10'

ь 2.0*10'

§

В.

24 32

день после инфицирования

И

день после инфицирования

I

32

день после инфицирования

Рисунок 10. Содержание лимфоидных клеток в легких зараженных мышей.□ -общий контроль; ■-1Ь-11 дикого типа; - мутантный 1Ь-11.

I

^ 2

Щ|

□ Л ¡о 5Ъ П, . , > .л л

* «0я ^ ^

Рисунок 11. Селективный блок рецептора 1Ь-11 приводит к снижению экспрессии генов для факторов воспаления.□ - общий контроль;» - 1Ь-11 дикого типа; -мутантный 1Ь-11.

Таким образом, наши исследования дают возможность предположить, что 1Ь-11 при туберкулезе является воспалительным фактором. Увеличение содержания 1Ь-11 в очаге инфекции ведет к прогрессированию воспаления и секреции воспалительных факторов 1Ь-6 и М1р-1а, что смещает ответ в сторону

формирования некротических очагов. Селективный блок рецепторного комплекса IL-llR/gpl30 снижает тяжесть патологии. При этом блокирование рецептора не влияет на рост микобактерий в легких. Таким образом, удаление IL-11 или блокирование его сигнала усиливает защитный ответ хозяина при ТБ.

3.3. Блокировка туберкулезного воспаления ткани легкого пептидом NBD.

Исследования последних двух десятилетий показали ключевую роль транскрипционного фактора NF-kB в регуляции процессов острого и хронического воспаления [Barnes, Karin, 1997; Bohrer et al., 1997; Lawrenceetal., 2001]. Нарушение активации NF-kB приводит к несбалансированному воспалительному ответу, что имеет тяжелые последствия при самых разных заболеваниях. Поскольку при ТБ основным механизмом патогенеза является хроническое воспаление, мы решили изучить влияние селективной супрессии NF-kB на развитие экспериментальной инфекции у мышей. Селективное ингибирование классического пути активации NF-kB за счет блока у-субъединицы комплекса IKK (NEMO) пептидом NBD, приводит к подавлению хронического воспаления in vivo [Jimi et al., 2004]. Пептид NBD -искусственно синтезированный фрагмент ß-субъединицы 1КК-комплекса (Т735 -> Е745 TALDWSWLQTE), который отвечает за взаимодействие с NEMO. NBD предотвращает образование IKK-комплекса [May et al., 2000]. Пептид, который не способен блокировать IKK-комплекс -TALDASALQTE - обычно используется в качестве контроля в подобных экспериментах. Для доставки пептидов в цитоплазму эти пептиды синтезировали совместно с последовательностью пептида antennapedia из Drosophilla melanogcister.

Мышей I/St инфицировали вирулентным штаммом М. tuberculosis. На третьей неделе после заражения мышам подопытной группы аэрозольным путем вводили NBD-пептид (0,01 мкг/25 мкл/мышь трижды за неделю), а мышам контрольных групп -либо контрольный пептид (0.01 мкг/25 мкл/мышь), либо раствор 0,9М NaCI по аналогичной схеме. На 32 день после инфицирования исследовали степень поражения легочной ткани и рост микобактерий в легком (рис. 12 и 13).

Селективный блок «классического» пути активации транскрипционного фактора NF-kB привел к возникновению выраженных различий в гистологической картине воспаления. В группе с пептидом NBD участки воспаления были

небольшого размера и хорошо отграничены от окружающей легочной ткани, а степень инфильтрации была ниже (рис. 12В). Гранулемы в этой группе состояли из крупных макрофагов и эпителиоидных клеток, практически отсутствовали лимфоциты (рис. 12Е). Напротив, в двух других группах в гранулемах присутствовало большое количество лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов (рис. 12Г. Д).

А. Б. В.

Рисунок 12. Различия в уровне инфильтрации и образования очагов воспаления в ткани легкого на 32 день после заражения. Пептид N130 (В, Е), контрольный пептид (Б, Д) и общий контроль (А, Г).

Таким образом, селективное ингибирование «классического» пути активации транскрипционного фактора ОТ-кВ при ТБ привело к снижению степени инфильтрации, и уровня воспаления в легочной ткани, но не влияло на количество микобактерий в легких.

Результаты анализа клеточного состава легких соответствовали данным гистологии: введение пептида N80 приводило к уменьшению инфильтрации легкого Т-клетками и нейгрофилами (Рис. 13).

Рисунок 14 показывает, что блокирование активации NF-kB с помощью пептида N60 приводит к снижению уровня экспрессии воспалительных факторов 1Ь-6, М1р-1а и ЮТ-а.

| 5.0.10'

ЯП.

Рисунок 13. Селективный блок «классического» пути активации №-кВ снижает

инфильтрацию легочной ткани.п - общий контроль;« - контрольный пептид; пептид.

2»,

ИВО-

; 2-Ю-

2-15

Рисунок 14. Блокирование классического пути активации №-кВ приводит к снижению экспрессии генов воспаления. □ -общий контроль;« -пептидЫВО; в -контрольный пептид.

Таким образом, наши результаты подтверждают, что блокирование «классического» пути активации транскрипционного фактора №-кВ приводит к уменьшению уровня воспаления в легочной ткани.

выводы

1. Подавление воспалительных реакций у мышей чувствительной к туберкулезу линии I/St на ранних стадиях инфекции приводит к снижению уровня патологии легких.

2. Однократное введение незрелых дендритных клеток, нагруженных антигенами микобактерий, как и введение диклофенака, снижает тяжесть течения инфекции у мышей генетически чувствительных к туберкулезу.

3. При туберкулезе IL-11 выступает в роли воспалительного цитокина, продукция которого усиливается на ранней стадии инфекции.

4. IL-11 регулируется аутокринно на транскрипционном уровне.

5. IL-11 участвует в запуске воспаления в легочной ткани и усиливает миграцию нейтрофилов к очагам инфекции при экспериментальном туберкулезе.

6. Блокирование IL-11 ведет к амелиорации туберкулезного воспаления у мышей I/St.

7. Селективное ингибирование «классического» пути активации транскрипционного фактора NF-kB пептидом NBD приводит к уменьшению патологических изменений в ткани зараженных легких.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Радаева Т.В., Сосунов В.В., Евстифеев В.В., Апт А.С. Влияние уровня экспрессии Сс120 и некоторых других хемокинов на характер воспаления при туберкулезной инфекции. Медицинская иммунология. 2006, Том 8, №23:169-170.

2. Кондратьева Т.К., Рубакова ЭЛ., Евстифеев В.В., Сосунов В.В., Петровская С.Н., Кондратьева Е.В., Апт А.С. Эффективность противовоспалительной терапии экспериментального туберкулеза у генетически чувствительных к инфекции мышей. Проб. Туберк. Болези. Легк., 2006, 10:63-65.

3. Kondratieva TK, Rubakova EI, Lingc IA, Evstifeev VV, Majorov KB, Apt AS. В cclls delay neutrophil migration toward the site of stimulus: tardiness critical for effective bacillus Calmctte-Gucrin vaccination against tuberculosis infection in mice. J Immunol. 2010,184(3):1227-1234.

4. Kapina MA, Shepelkova GS, Avdcenko VG, Guseva AN, Kondratieva TK, Evstifeev VV, Apt AS. Intcrleukin-11 drives early lung inflammation during Mycobacterium tuberculosis infection in genetically susceptible mice. PLoSONE. 2011, 6(7):e21878.

5. Шепелькова Г.С., Евстифеев B.B., Лит A.C. Исследование молекулярных механизмов патогенеза туберкулеза на экспериментальных моделях. Туберкулез и болезни легких. 2012, №7:311.

6. Shepelkova G, Pommerenke С, Alberts R, Geffers R, Evstifeev V, Apt A, Schughart K, Wilk E. Analysis of the lung transcriptome in Mycobacterium tuberculosis-infected mice reveals major differences in immune response pathways between ТВ-susceptible and resistant hosts. Tuberculosis (Edinb.). 2013, 93(2):263-269.

А--

О \

-о

Подписано в печать: 18.03.2015

Заказ № 10634 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

- "О

Л.ГО \ V

С*!

"СГ