Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Регуляция раневого процесса в роговице естественным комплексом цитокинов

рг 6 1>й

министерство здравоохранения и медицинской промышленности российской федерации

РЕГУЛЯЦИЯ РАНЕВОГО ПРОЦЕССА В РОГОВИЦЕ ЕСТЕСТВЕННЫМ КОМПЛЕКСОМ ЦИТОКИНОВ

14.00.36 — Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

институт иммунологии

На правах рукописи

КРАЙ НОВА Татьяна Александровна

Москва — 1994

Работа выполнена в Институте иммунологии Министерства здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации, и в Российском Государственном Медицинском университете.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор В. М. Манько, член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор Л. В. Ковальчук

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор И. П. Хорошилова-Маслова

Официальные оппоненты:

академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор А. А. Ярилин,

член-корреспондент РАЕН, доктор биологических наук, профессор В. Я. Арион

Ведущее учреждение: НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи.

Защита диссертации состоится 22 июня 1994 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета ДО 74.09.01 при Институте иммунологии Министерства здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Иммунологии Министерства здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации,

Автореферат разослан « » Ш&А 1994 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Л. С. Сеславина

общая характеристика работы.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПР08ЛЕМЫ. , В настоящее время ведется активное изучение роли цитоккнов в Физиологических к патологических реакциях организма.Показано, что данный класс веществ перспективен в использовании в качестве фармакологических средств для лечения различных заболеваний. Важной проблемой является поиск лекарственных средств, позволяющих регулировать регенераторные процессы: ускорять вялотекущее заживление ран и предотвращать образование грубых рубцов.особую актуальность эта проблема приобретает в офтальмологии,поскольку посттравматическое рубцевание даже при относительно небольшом повреждении глаза может вести к существенному нарушению зрения.

При разработке лекарственных препаратов на основа дитоки-нов возникают две основные проблемы. Во-первых, исследователи часто вынуждены работать не с естественными цитокинами, а с им-мунопептидами, получаемыми с применением рекомбииантной технологии. Такие белки не только на всегда обладают необходимыми биологическими свойствами, но и зачастую являются токсичными. Во-вторых, цитокины вырабатываются в пнкомолярных количествах, поэтому процесс получения чистых препаратов индивидуальных цк-токииов крайне затруднен. ( Метод аутолимфокинотерапяи.разработанный на кафедре иммунологии РГН^,позволяет успешно реаить обе проблемы.В качестве лечебного препарата используется комплекс кмиунопептидов, вырабатываемых клетками периферической крови пациентов при стимуляции ФГА. комбинация цитокииоа, сехретируемых клетками после стимуляции,обладает более выраженным действием,чем каждый отдельный компонент, кроме того,поскольку источником нммунопептн-

лов служат аутологичные клетки пациента, препарат требует минимальной очистки, показана эффективность применения естественного комплекса цитокинов в печении воспалительных заболеваний че-люстно-лицевой области (Ковальчук Л.В..Ганковская Л.В.,1990), кожно-фасциальных рак в эксперименте (Ковальчук Л.В.,Ганковская Л.В.,Баярт Б.,1989).

Вышеизложенные данные свидетельствуют об актуальности разработки методов получения естественного комплекса цитокинов, и изучения его влияния на воспалительные и регенераторные процессы при повреждении роговицы.

цель и задачи исследования.

Целью данного исследования явилось изучение механизмов влияния естественного комплекса цитокинов, секретируемых клетками периферической крови после стимуляции ФГА, на процессы заживления при повреждении роговицы, а также разработка оптимально й методики получения препарата на основе данного комплекса цитокинов. В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи:

1)Получение и частичная характеристика комплекса цитокинов, секретируемых клетками периферической крови, с использованием методов высокоэффективной жидкостной хроматографии и имму-ноферментногс анализа.

2)изучение механизмов влияния эндогенного комплекса'цитокинов на процессы .заживления ранений роговицы. ■

3)Ограниченные клинические испытания метода аутолимфокино-терапии в группе пациентов с повреждениями роговицы различной этиологии. . '

4)Определение содержания некоторых цитокинов (ИЛ-1р,фНО^) г слезной жидкости в норме и при патологии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

В данной работе впервые проведено изучение влияния естественного комплекса цитокинов, вырабатываемого мононуклеарными клетками и лейкоцитам» периферической крови, на заживление ран роговицы глаза. Показано, что применение комплекса цитокинов, содержащего ИЛ-1р, ИП-2, ФИО а,. ИФН-^ и другие иммунопептиды, способствует усилению миграции нейтрофилов к очагу повреждения, ускоренно резорбции фибрина, изменению пролиферативной активности фнбробластов и снижению выработки ими коллагена.Впервые проведено определение концентрации цитокинов - ИЛ-1р и ФНОгу, в слезной жидкости человека в норме и при патологии. Показана зависимость выработки <1Н0г^ от степени развития деструктивных изменения тканей глаза. Установлено, что наличие ФНСЦ в слезной жидкости до операции свидетельствует о повышении риска развития послеоперационного воспаления.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

В данной работе показано, что естественный комплекс цитокинов является перспективным лекарственным средством, способным предотвращать образование грубых рубцов роговицы после травмы. Разработка лекарственного препарата, позволяющего ускорить заживление раны я подавить процессы фиброгенеза в очаге повреждения, является актуальной проблемой.Полученные в работе данные позволяют выработать оптимальную схему производства лекарственного препарата на основе естественного комплекса цитокинов, секретируемых лейкоцитами периферической крови.Автором получено положительное решение на изобретение и способ предупреждения грубого рубцевания роговицы "(N04950578/14 от 30.07.92 г.).

- б -

АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета института Иммунологии Министерства здравоохранения й медицинской промышленности РФ 12.04.94 г.

ПУБЛИКАЦИИ.по материалам диссертации опубликовано 4 работы.

овьем и структура диссертации.Диссертация изложена на}33 страницах машинописного текста,состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав собственных исследований, заключения и выводов. Указатель литературы включает 215 источников, в том числе 11 отечественных и 204 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 19 рисунками и в таблицами.

содержание работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Естественный комплекс цитокинов получали при стимуляции фитогемагглютинином ("Б^со^сПА) мононуклеарных клеток и лейкоцитов периферической крови пациентов и экспериментальных животных. Мононуклеарные клетки выделяли в градиенте плотности фиколл-верографина (Воуив,1963).Лейкоциты получали при осаждении эритроцитов из цельной крови добавлением декстрана Т.-.500.

Изучение раноэаживлякяцего действия естественного комплекса цитокинов (ЕКЦ) проводили иа модели проникающих ранений рог -вицы глаза.Эксперимент был выполнен на 40 кроликах породы шиншилла массой 2-2,5 кг.У 12 животных лечение проводили естественным комплексом цитокинов,9 животных лечили фракцией цитокинов с молекулярной массой 10-30 кД,9 -фракцией, содержащей компоненты с

м.м. 30 кД; 10 животных составили контрольную группу -б-лечен-иые средой 199 с антибиотиками (100 мкг/мл стрептомицина и 100 ЕД/мя бензплпенициллина), 4 - фосфатио-солевым буфером (20мМ КН2Р04,150 мИ NaCl). Проникаюцие ранения роговицы наносили в центральной области роговицы, после предварительной анастезии дихаином.Оценку влияния цитокшюв проводили,анализируя следующие параметры:наличие слизистого отделяемого и реакции светобоязни в 1-2 сутки после нанесения рани,сроки исчезновения отека, характер рубцевания.исследования были выполнены совместно с аспиранткой кафедры глазных болезней РГМУ Балашовой Л.И.

Гистологический анализ влияния естественного комплекса ци-токинов был выполнен с использованием той же модели проникающих ранений роговицы.Исследования были проведены совместно с сотрудниками лаборатории морфологии MSBOi глазных болезней им.Гель-мгольца д.м.н.Хороииловой-Масловой И.П. и к.м.н.Илатовской Л.В. Эксперимент выполнен на 28 кроликах породы шиншилла массой 2-2,5 кг.В качестве источника ЕКЦ использовали лейкоциты периферической крови кролика. ЕКЦ получали за 2 дня до нанесения раны.В опытную и контрольную группу было включено по 14 животных. Лечение животных проводили дробной инсталляцией исследуемых препаратов 5 раз в день в течение 2 недель после нанесения раны. Лечение животных контрольной группы проводили надосадочной жидкостью 24-часовых культур нестимулированных лейкоцитов периферической крови.Животных забивали методом воздушной эмболии. Эиуклеированиые глаза кроликов фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина.Центральную часть глаза заливали в парафин, срезы окрашивали гематоксилином и зозинсм и по Ван-Гиззон. Подсчет клеток производили с использованием микроскопа MBL-6. Морфометрическне исследования осуществляли на полуавтоматическом анализаторе изображения ASH-68 фиркы "Leite".

Ограниченные клинические испытания метода аутолимфокиноте-рапии были выполнены в группе больных сахарным диабетом II типа, которым была проведена экстракапсулярная экстракция катаракты с имплантацией заднекамерной линзы Т-26. Эксперимент был проведен на базе МНТК "микрохирургия глаза" совместно с врачами Власовой Т.И. и Иолшкым И.Э.

Комплекс эндогенных цитокинов получали по обычной схеме, при стимуляции лейкоцитов периферической крови пациентов, взятой в количестве 20 мл.У 5 больных применяли местные инсталляции естественного комплекса цитокинов 4 раза в день в первые 2 недели после операции,одновременно с инсталляцией ОД % раствора дексаметазона,0,25% раствора левомицетина 4 раза в день до 1 месяца после операции.Контрольную группу составили 5 больных,у которых послеоперационное лечение , проводили по. общепринятой схеме:субконыонктивальные инъекции 1% раствора дексаметазона в первые 3-5 дней после операции,а такхг инсталляции 0,1%раствора дексаметазона и 0,25% левомицетина в течение 1 месяца. Оценивали сроки исчезновения послеоперационной реакции глаза (слезотечение, болевые ощущения, феномен Тнндаля во влаге передней камеры глаза) и сроки восстановления функциональных показателей (острота зрения выше 0,5).

Исследования также были проведены в группе больных с кор-неосклеральнымн травмами на базе МШИ глазных болезней им.Гепь-мгольца,совместно с. сотрудниками института д.м.н.Слеповой o.e., врачом Макаровым П.А. и дипломницей кафедры РГМУ Гавриловой Я.А.

Аутолимфокинотерапию проводили у 14 больных с корнеоскле-ральнымн травмами различной тяжести.Проводили оценку образовавшегося рубца роговицы.У данных больных было проведено определение VUl-lp и ФНСЦ в составе ЕКЦ, полученного из культур лейкоцитов после стимуляции ФГА. определение lUl-lf было проведено так-

же в БКЦ,. полученных у больных увеитом (7 человек), и у страдающих близорукостью (4 человека).

Изучение содержания KJl-lf и 4>Н0\ в слезной жидкости человека проводили на базе МНТК "Микрохирургия глаза", совместно с сотрудницей лаборатории иммунологии МНТК Власовой Т.И.

Цитокнны определял« в слезной жидкости 55 больных с осложненной катарактой различной этнологии в возрасте от 35 до 87 лет.Контрольную группу составили 8 человек без клинически выявленной патологии органов зрения.Всем больным до операцини проводил« клинико-Фуикциональные исследования,которые включали: внэокетриго, периметрию, биомикроскопкю, тонометрию, топографию, биометрию, электрофизиологические исследования. По результатам дооперационного исследования пациенты были подразделены на 3 группы в зависимости от степени дистрофических изменений тканей переднего сегмента глаза.

Первую группу составили 15 больных с нормальной структурой радужки.Вторую группу составили 23 больных с умеренно выраженными изменениями переднего отрезка глаза.В третью группу с наиболее выраженными дистрофическими изменениями переднего отрезка глаза 80ШТК 17 больных с катарактой различной этиологии (глаукома III стадии,рецидивирующий увеит,диабетическая ангиоретино-патня с рубеозом радужки).

Взятие слезной жидкости производили до и на 3-4 день №><;ле операция а. объеме ¿коло 20 нкл. / ; '

Клиническую реакция глаза на хирургическую травму оценивали по классификации Фёдорова С.Н. и Егоровой Э.В.(1991)»включающей 4 степени воспалительной реакции глаза.

Определение ИЛ-lp и ФНОс^ в проводили Методом . иммунофер-ментного анализа с использованием диагностических наборов на основе моноклональных антител к ИЛ-lp и ФЖЦ человека (ВКИИ

особо чистых биопрепаратов,г.Санкт-Петербург).Полученные данные обрабатывали общепринятыми статистическими методами.

Фракционирование естественного комплекса цктокинов проводили с использованием методов гель-проникающей хроматографии низкого давления и ультрафильтрации.Гель-хроматографию осуществляли на колонке 1,6*100 см, производства фирмы"Pharaacia"(Швеция) ,заполненной сефадексом G-100 ("Pharmacia"), уравновешенной Физиологическим раствором ,рН 7,4. все эксперименты проводили с помощью системы для хроматографии низкого давления фирмы "LKB", состоящей из: холодильного шкафа "Minicoldlab",nacoca"Minlper-рех",проточного фотометра "Uvicord S", самописца"LKB 2210" и коллектора фракций "Redirac". Сконцентрированный супернатант в объеме 1-1,5 мл наносила на колонку. Проводили ретроградную элюцию со скоростью 15 мл/час. Время сбора фракций -6 минут, температура 4вС. Запись вели в автоматическом ревнме при длине волны 280 нм. Колонку калибровали смесью веществ с известной молекулярной массой : голубой декстран (2 000 ООО Д), БСА (67 КД), овальбумин (45 000 Д), химотрипсиноген (25 000 Д), ДНФ-лейцин (297 Д). В качестве элюэнта использовали фосфатно-солевой буфер: 0,15 М МаС1, 0,02 М КН2Р04, РН 7,5.

Ультрафильтрацию проводили с использованием ячеек обьемом 180,50 и 10 мл и мембранные фильтры РМ30 и РМ10 фирмы "Amicon" (Нидерланды).

Анализ состава ЕКЦ пациентов и фракций ЕКЦ,полученных из периферической крови свиньи,проводили методом гель-проникающей высокоэффективной жидкостной хроматографии.Аналитическую ВЭЖХ проводили с помощью системы "Ultrochrom GTi" (LKB,Швеция), включающей :насос "1KB 2150", петлю для ввода образцов "Injector 7125", проточный фотометр "Uvicord SD 2510", самописец "LKB 2230".В работе использовали колонки TSK-gel 2000SW

кожно-фасциальных ран различно; М-Фрахция (м.м. 15-30 кд) способствовала быстрому снятию отека,в то время как Л-фракция (м.м.б0-80 кД), усиливала пролиферацию фибробластов и ускоряла эпителизацию раны (Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В.,Ваярт В., 1989). Результаты эксперимента,выполненного на модели проникающих ранений роговицы,показали,что при использовании фракций не наблюдается существенной разницы в клиническом течении процессов заживления в двух экспериментальных группах. Кроме того, ранозвживляющий эффект каждой из фракций менее выражен, чем эффект исходного комплекса цитокинов. Так, при использовании ЕКЦ добиться предупреждения грубого рубцевания удавалось в 90% случаев, при использовании Фракций- в 60%.

Поскольку М- и Л-Фракции не отличались по своему действие друг от друга, но эффект каждой из них был менее выражением эффект комплекса, можно предположить, что их действие суммируется в комбинации. Вряд ли является целесообразным выделений отдельных компонентов из комплекса цитокинов с целью повышения эффективности действия препарата.

С целью выяснения возможного влияния комплекса цитокинов на последнюю стадию процесса заживления раны,включающую перестройку коллагена,нами было проведено лечение естественным комплексом цитокинов животных спустя 1 месяц после нанесения раны, препарат применяли у 4 животных 3 раза в день в течение 1 ме~я- ' да.Никаких видимых.изменений состояния роговицы в результате лечения не наблюдалось, кривизна и прозрачность роговицы оставалась существенно нарушенной, толщина рубца до и после начала лечения - около 1,5 мм. На основании полученных данных мы предположили, что лечение комплексом цитокинов целесообразно проводить в ранние сроки заживления раны.

(7,5«300 .nun) и TSK-gel 3000SW (8,0*300mm) (LKB.Швеция) . В качестве элюента использовали фосфатно-солевой буфер состава: 0,8 г/л НаС1, 0,04 г/я KCl, 0,006 Г/Л Na2HP04*2H20, 0,006 г/Л КН2Р04, 0,035 г/л ЛаНСОЗ, РН 7,3.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

а.ИЗУЧЕНИЕ КЛИНИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ВЛИЯНИЯ ЕСТЕСТВЕННОГО КОМПЛЕКСА ЦИТОКИНОВ НА ЗАЖИВЛЕНИЕ ПРОНИКАЮЩИХ РАНЕНИЙ РОГОВИЦЫ ГЛАЗА КРОЛИКА.

Было проведено изучение влияния комплекса эндогенных цитокинов на заживление проникающих ранений роговицы глаза кроликов. Результаты исследования показали, что при использовании естест-- венного комплекса цитокинов наблюдается уменьшение воспалительных явлений.Так, в опытной группе исчезновение отека роговицы наблюдалось на 5-7 сутки, а в контрольных группах- на 13-14 сутки. Реакция светобоязни и появление слизистого отделяемого в 1-2 сутки после травмы наблюдались только в контрольных группах. Заживление раны у животных обеих контрольных групп ( леченные средой 199 с антибиотиками и фосфатно-солевым буфером) не отличалось.При длительном применении ЕКЦ наблюдалось уменьшение толщины образующагося рубца, восстановление сферичности и прозрачности роговицы, тогда как в контрольных группах отмечалось образование грубых рубцов.На основании полученных данных был сделан вывод,что естественный комплекс цитокинов влияет на самые ранние стадии раневого процесса,умсныаая выраженность воспалительной реакции; я способствует предотвращений грубого рубцевания. Было проведено изучение, влияния отдельных фракций комплекса цитокинов на заживление проникающих ранений роговицы.

Ранее было показано, что влияние фракций ЕКЦ на заживление

ч

2.ГИСТОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ ЕСТЕСТВЕННОГО КОМПЛЕКСА ЦИТОКИНОВ НА ЗАЖИВЛЕНИЕ ПРОНИКАЮЩИХ РАНЕНИЯ РОГОВИЦЫ. Поскольку было установлено,что естественный комплекс ци-токинов способен влиять на заживление ран роговицы до формирования рубца,был проведен эксперимент по изучению механизмов действия комплекса цитокинов на регенераторные и воспалительные процессы на ранних стадиях заживления раны (в течение 1 месяца после нанесения раны).

В таблице X приведены данные морфометрического анализа - относительной плотности клеток воспалительной инфильтрации в раневом канале спустя 1 сутки после нанесения раны, в опытной группе существенно возрастает плотность клеток во всех слоях раневого канала (среднее значение 16,3*5,1 млн.клеток/мм2), по сравнению с контрольной группой (2,48 * 0,47 млн. клеток / , мм2).В течение первых суток после применения комплекса цитокинов наблюдалось значительное увеличение числа мигрировавших в зону повреждения нейтрофилов. Это можно объяснить синер-гистическим хемотактическим влиянием на нейтрофилы ИЛ-1^ и ФНО<1, входяцих в состав эндогенного комплекса цитокинов.

Можно предположить, что данные компоненты комплекса цитокинов играют существенную роль в каскаде .событий,индуцируемых при проведении аутолимфокннотерапнн.Естественный комплекс цитокинов позволяет ускорить миграцию к очагу повреждения не только нейтрофилов, но и макрофагов,фибробластов н кератоб-ластов.В результате усиления клеточной миграции к очагу пов-, рождения происходят более быстрое рассасывание Фибринозных масс и заполнение раневого канала Фибробластнческнми элементами. Активизация Фибробластнческтс элементов приводит к значительному уменьшению толиииы образующегося рубца (табл.2).

Номер исследуемого препарата Относительная плотность клеток,млн./мм2 (в скобках - число измерений в опыте)

эпителий и строма Фибрин || среднее значение

1 2 3 Среднее Контроль 1.89 (122) 1.26 (60) 1.57 (182) 2.80 (85) 3.50 (4) 3.15 (89) 2.67 (66) 2.75 (8) 2.71 174) 2.45:10, 28 2.51±0,66 2.48Ю.47

4 5 6 Среднее Опыт 8.1 (81) 10.5 (4) 9.6 (85) 26.7 (82) 26.8 (9) 26.7 (91) 12.3 (67) 23.9 (18) 18.1 (85) 15.7*5,63 20.415,0 16.3±5,1

Таблица 1:Относительная плотность клеток воспалительной инфильтрации в раневом канале через одни сутки после проникающего ранения роговицы в контроле и. опыте.

Время после травмы Средняя толщина в миллиметрах эпителий Пролиферат Фибрин Рубец Раневой канал

Контроль

3 дней 0.08*0,03 - 0.33*0,14 0.41*0 20

7 дней 0.0310,01 0.2510,08 0.10x0,06 0.3810 10

30 дней 0.0510,02 0.42*0,09 - 0,47±0, 10

ОПЫТ

3 дня 0.1510,10 - 0.2410,12 0.39±С 20

7 дней 0.03*0,02 0.22*0,Об 0.0410,03 '0.29±0 10

30 дней 0.0710,03 0.21*0,05 - 0.28*0, 04

Таблица 2.-Показатели морфометрических измерений параметров раневого канала в разные сроки заживления ран роговицы в контроле и опыте.

Аудируемого клетками здоровых доноров.Было показано, что в остром периоде прободных ранений глаза наблюдается снижение пролиферативного ответа лимфоцитов на ФГА (Яхницкая,1991). Анализ состава ЕКЦ, полученных у разных пациентов, мето-

10

20

30

У.мл

Ю-

20

30

V,m

0 Ю 20 30 \,т

Ряс; 1.Профиль элшия с гвль-фжльтрущвй колонки tsk63000-sw ЕКЦ, полученных при стимуляции Лейкоцитов паркфераческой кровж ' пациентов с различными заболеваниям глаза: а) проникающее ранение роговицы; б; отторжение трансплантата рогов ицы;в) мяо-пяя.По оси сГрдянат-экстанкцая при дине волин .280 юл,по ося абиясс- объем элшяк,мл. Стреляема показан выход маркеров -

S.3 h^mñ 0?297 fl^' 0ВА ' 43 ^ ^ " 17 »*' ^

дом вэяпс,показал значительные различия в составе комплексов (рис.1). Комплекс цитокиноз содеряит компоненты с молекулярной массой 68, 55 , 30, 17, 11 кД, при проведении хроматографии также выявляется Фракция, содержащая компоненты с м.м.<1 кД.по-видимому, получение ЕКЦ со стандартным составом при

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА АУТОЛИМФОКИНОГЕРА1ПШ В ОГРАНИЧЕННОЙ ГРУШЕ ПАЦИЕНТОВ.

Ограниченные клинические испытания метода аутолимфокино-терапии проводили в группе больных сахарным диабетом II типа, которым была проведена экстракапсулярная экстракция катаракты с имплантацией заднекамерной линзы Т-26.

Отмечалось положительное влияние аутолкмфокинотерапни на течение послеоперационного периода при экстракции катаракты. Клиническое исчезновение послеоперационной реакции глаза (слезотечение,болевые ощущения,феномен Тиндапя во влаге передней камеры глаза,десцеметит) на фоне аутолимфокинотерапии происходило в среднем на 5-6 сутки (в контрольной группе на 10-12 день).Одновременно быстрее восстанавливались и функциональные показатели - острота зрения выше 0,5 в опытной группе отмечалась на 5-7 день, в контрольной группе - на 12-14 день. Коррекция послеоперационного периода с использованием ауто-лимфокинотерапии позволила достичь быстрого клинического выздоровления глаза и уменьшить дозировку стероидных препаратов.

Естественный комплекс цитокинов, полученный из периферической крови пациентов, применяли в послеоперационном лечении больных с корнеосклеральными травмами,на базе МШИ глазных болезней им.Гельмгольца. Результаты исследования показали, что при проведении аутолимфокинотерапии далеко не всегда удается добиться предотвращения грубого рубцевания роговицы (лишь в 5 случаях из 14).Несомненно, что тяхесть ранения различна у всех пациентов.

Возможно, однако, что уменьшение эффекта аутолимфокинотерапии могло быть обусловлено тем, что комплекс цитокинов, продуцируемый клетками пациентов,перенесших травму, значительно отличался по своим характеристикам от комплекса цитокинов, про-

- 17 -

использовании крови пациентов вряд ли возможно.

При анализе выработки ИЛ-1р и ФИО а, лейкоцитами пациентов с корнеосклеральными травмами было показано, что данные цито-кины вырабатываются в количествах,не всегда достаточных для анализа.ФНОц вырабатывался в значительно меньших количествах, чем ИЛ-1р. В 11 пробах нз 14 его концентрация была меньше 50 пкг/мл.Поэтому нами была изучена продукция ИЛ-1^> лейкоцитами пациентов с различной патологией глаза.

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНТЕРЛЕЙКИНА-1В В СОСТАВЕ ЕСТЕСТВЕННОГО КОМПЛЕКСА ЦИТОКИНОВ,ПОЛУЧЕННОГО ИЗ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПАЦИЕНТОВ. '

С целью установления возможных причин неэффективности проведения аутолимфокинотерапки, было проведено определение содержания КП-1р в ЕКЦ, вырабатываемых лейкоцитами пациентов, получивших травму за 1-5 дней и за 1 месяц до начала проведения аутолимфокинотерапии, больных увеитом (хроническим воспалительным заболеванием сосудистой оболочки глаза) и больных миопией. Результаты исследования показали достоверное снижение продукции ИЛ-1_р в остром периоде травмы, как по сравнению с группой здоровых людей, так и больных увеитом (рис.2). При сравнении выработки т-1р лейкоцитами больных увеитом и близорукостью, также отмечалась достоверная разница. Между пока-, эателями выработки ИЛ-1^ лейкоцитами 2-х групп пациентов, перенёсших травму, не удалось установить достоверной разницы. Это можно объяснить тем, что тяжесть поражения и индивидуальная реакция на травму у пациентов значительно различалась.таким образом, при наличии патологических процессов в пределах глаза может наблюдаться значительное снижение продукции цитокинов лейкоцитами периферической крови.Поэтому целесообразна

разработка методов получения естественного комплекса цитоки-нов из периферической крови либо здоровых доноров.либо лабо-

раторных животных.

яг/мл 10

7,5

2,5

Ряс.2.Уроввнь продуши лейко-

цитам» палиентов с различной патологией глаза

1 - корнеосклеральная травма, полученная 1-5 суток назад,

2 - корнеосклеральная травма, полученная 1-1,5 месяца назад.

3 - увеят,

4 - миопия.

По осп айнясс - концентрация ИЛ-1в в естественном комплексе штокинов, полученном у пациентов данных групп, нг/мл.

5.ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ И ЧАСТИЧНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЕСТЕСТВЕННОГО КОМПЛЕКСА ЦИТОКИНОВ,ПОЛУЧЕННОГО ИЗ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ свиньи.

в настоящее время ведется разработка получения ЕКЦ из крови лабораторных животных. Наиболее удобным источником клеток для получения цктокинов является свиная кровь. Нами был

внесен ряд изменений в методику получения ЕКЦ п его фракций.

#

В частности, было предложено заманить ИНК как источник цнто-кинов на лейкоциты. Это позволило суцэственно упростить п ускорить получение ЕКЦ. Из комплекса вдтокинос выделягат 2 фракции, содержала компоненты с молекулярной массой 60-00 кД и 15-30 кД. однако, нспользооашай ранее метод фракционирования с использованием гепь-прош.кавчай хроматографии низкого давления не позволяет добиться полного разделения Фракций.Это особенно выражено в случае фракционирования ЕКЦ, полученного

0

О 50 100 150 200 . 250- V ыл

Рис.3.Провяль элшии- ЕКЦ,полученного аз культур ЫНК(а)и,лейкоцитов (б), регистрируемый в ходе гвль-фальтраняя на сефадексе С-100. По оси ординат - эксгинкиия при ддяяв волна 280 нм, по оси айшсс - обьэм элиния, мл. Сверху обозначая выход маркеров. Л - я. М - фракция заштрихованы.

аз лейкоцитов ¡рис.3) .Кромё~того,"метод получения М- и Л-Фрак-ций комплекса «итокиноэ путем гель-проникающей хроматографии на сефадексе С-100 является крайне трудоемким н долгим (около 24 часов),и не позволяет осуществить Фракционирование бояыгах количеств биологического материала.

При разделения И- и Л-фракций комплекса цитоктюв методом ультрафяльграцпи^в составе Н-фракции были обнаружены белки с молекулярной массой порядка 55 кд (рис.4). Даипый факт нельзя обьясннть какими-либо погрешностями метода ультрафильтрации.В Л-Фракции содержание компонентов с молекулярной массой около 30 кД в несколько раз выше,чем в Н-Фракции.Это возможно лишь в том случае,если молекулы с массой более 30 кД задерживаются Фильтром.Следовательно,некоторые компоненты,содержащиеся в н-фракцки, ассоциируют,обра-

зуя комплексы. Интересно «отметить,что активная форма $H0q -одного из цитокинов,продуцируемых при стимуляции клеток ФГА, является тримером с молекулярной массой 56 кД (Smith R.A., Baglloni е.,1987). .

Ранее при определении биологической активности ФНОг^ в ИЛ-lp в М- и Л-Фракциях ЕКЦ бияа показано,что данные иммуно-пептиды входят, в состав обеих Фракций (Осмоловская c.b.,1989).Таким образом, разделение комплекса цитокинов на фракции вряд ли позволит добиться выделения некоторых цитокинов s составе определенных фракций. Вероятно, оптимальным лекарственным средством является исходный комплекс цитокинов, а не его фракции.

S xw

0 10 1 20 V.мл

Рмс.4а.Проф1Ш. элшжи с гвдь-фильтрующэй колонки ТдаЭЭООЗ^ М-фраюти ЕКЦ .По осг аЗцисс - объем элаощш, пл. По оси ординат- зкстеякпйя при джпв волки 283 км. Вверху указан вюсод маркеров.

410

' 0

es ы ä

. • 10 20 V,iu .

гас'.^.Брофиль элкша с гэль-^альтруэдэй колонки T5K<530005W

^Ä^L™*'11? ося а0цнсс - мзш.ш . По оса оряяяаг - эксгиккцяя прк ялгше ведан 280 пи . Вверху указан выход маркеров. К '

6.ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИТОКИНОВ В СЛЕЗНОЙ ЖИДКОСТИ ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ.

Нами было проведено определение ШЫв и ФИО а в слезной жидкости больных катарактой различной этнологии и здоровых ладей. •

ИЛ-1р при проведении анализа был обнаружен лишь в слезной жидкости 2 пациентов 2-й группы, что составило 3% от общего количества проб.

ФНО^ также был обнаружен лишь в определенном проценте проб. Отмечались значительные колебания концентрации - фноа в пробах слезной жидкости всех исследуемых групп (рис.5). Сле-

Кщнтрация кг/мл ' 15

10'

5 -

слезная жадность больного глаза п- слэзная падкость парного глаза

К 1 2 3

■ Содержание ФН0е\ в слезной жидкости пациентов с различной степенью выраженности деструктивных-изменений тканей переднего отрезка глаза. К - контрольная группа, 1 - слабые,

2 Средние, $ - сильные'деструктивные изменения.

группы количество количество проб слезной

пациентов обследованных жидкости,содержащих ФНОа

пациентов больной парный

глаз глаз

1 9 2 3

2 12 а 8

3 8 в 6

Таблица 3.Сравнительный анализ содержания ФНО^ в слезной жидкости больного и парного глаза.

дует отметить, что <ХНОг\ был выявлен в слезной жидкости людей без патологии глаз (контрольная группа). Важным фактом является и то,что процент положительных проб был практически одинаков для слезной жидкости больного и парного глаза,во всех исследуемых группах (табл.3).Это свидетельствует о том, что наличие ФНОа, в слезной жидкости отнюдь не обьясняется его секрецией клетками,находящимися в очаге воспаления.

Анализируя зависимость содержания ФН0<\ в слезной жидкости от степени поражения тканей глаза, мы пришли к выводу, что значимым является скорее сам факт наличия <ШОг\ в слезной жидкости,» не его концентрация. Поскольку определение ФНОа проводится в слезе, полученной при стимуляции слезоотделения, разница в значении концентрации цитокина обьясняется различной выраженностью реакции глаз пациентов на стимул,и, как следствие, разной степенью разведения ФНОг\ в пробах. Однако, процент положительных результатов (т.е. процент проб слезной жидкости, где был обнаружен ФНОц), увеличивался при усилении деструктивных изменений тканей глаза. Наибольшим -64%- он был в 3-й группе пациентов, наименьшим - в 1 группе (28%). Послеоперационная- воспалительная реакция у пациентов могла развиваться и в том случае,если 4>НОа, в слезной жидкости не был обнаружен, но наличие ФНОг\ в слезной жидкости свидетельствовало о повышении риска развития послеоперационного воспаления. Б 1 группе пациентов при наличии вНОг^ в слезной жидкости риск развития воспаления II степени был повышен в 2,2 раза, в 3 группе риск развития III степени реакции - в 3,4 раза.. Однако, у пациентов 2-й группы риск разьития воспаления II степени повышался при наличии ФНО^ в 6,5 pasa, е развитие IIS, тяжелой степени ьоспалеиия ив зависело от наличия в слез-и»й аадкости (ряс.6). Вероятие, cyescrsywr впгвАзасгало маха-

Ряс.6. Зависимость развития послеоперационной воспалительной реакции от степени деструктивных изменений тканей глаза при наличия (+) а отсутствии (-) ФНОд в слезной жидкости. Группы патентов - 1 - со слабыми, 2 - со средними, 3-е сильными деструктивными изм9н8ншшя тканей переднего отрезка глаза. По оса ординат отложен процент проб, в которых был обнаружен (+) пли отсутствовал (-) СНОц. Штриховкой обозначена степень послеоперационной воспалительной реакции :0 -1,0-П, ЕЗ - Ш. Цифрами укезал процент слетев развития воспаления определенной стапони в каждой из групп. ■

низмы развитая воспалительной реакции, не зависящие от ФНО^.

Следует отметить, что в результате лечения, спустя 3-4 дня после операции, процент проб, содержавших ФНОа^, снижался во всех исследуемых группах (рис.7). Однако, при наличии III степени послеоперационной реакции глаза, не удавалось снизить процент содержащих фжц проб до нормальных значений (28-31%).

. ТО

60

д

• 50

О,

40

I Рис.7,- Наличие ФН0й,в стазкой жвдхостк до -СИ к после -СИ операции, в различных группах пациентов. Слева - группы пашентов' с различной степенью развитая деструктивных изменений тканей переднего отрезка глаза: 1 - слабые , 2 - сведши, 3 - сильные изменения. Справа -группы пациентов с различной степенью послеоперационной воспалительной реакции. К - контрольная группа. По оси ординат отложено количество проб слезной жадности, в которых был обнаружен Ф1КЦ, в % от общего числа проб данных групп.

Важным фактом является.то, что количество ФЮа^, вырабатываемого тканями глаза, значительно превыпает содержание данного иммунопептида в ЕКЦ, используемом для печеная. Незначительные количества СНОа, вносимые при проведении аутолимфо-кинотералии, вряд ли могут способствовать развития воспаления, напротив , ИЛ- - один из основных цнтокниов, продуцируемых МНК и лейкоцитами при стимуляции ФГА, в слезной жидкости обнаружен не бьга.Возможно, что ИЛ-1р является главным компонентом, определяющим действие ЕКЦ.

ВЫВОДЫ.

1.Естественный комплекс цитокинов, вырабатываемый моно-нуклеарными клетками и лейкоцитами периферической крови после стимуляции фитогемагглютинином, обладает противовоспалительным и ранозаживляюцим действием при лечении повреждений роговицы в эксперименте: ускоряет исчезновение отеков (с 14 суток в контрольной группе до 6 суток в опыте), предотвращает образование грубых рубцов роговицы.Данный комплекс цитокинов стимулирует миграцию нейтрофилов в 1-3 сутки после нанесения раны, и ускоряет резорбцию нейтрофилами Фибрина, способствует изменении структуры Формирующегося рубца-приобретению им пла-

'стинчатого строения, сходного со строением нормальной ткани.

2.На экспериментальной модели проникающих ранений роговицы показано, что естественный комплекс цитокинов, продуцируемый лейкоцитами периферической крови, обладает более выраженным действием, чем его фракции, содержащие компоненты с молекулярной массой 30-80 и 10-30 кД. При изучения эффекта указанных Фракций не было обнаружено .существенных различий между ними.

3.При анализе выработки ИЛ-1р лейкоцитами периферической крови пациентов было установлено достоверное снижение продукции цитокина клетками пациентов, перенесших травму, и больных увентом, по сравнению со здоровыми' донорами.

4.Проведен анализ содержания ИЛ-1/з в слезной жидкости человека в норме и при патологии (катаракта). Показано, что ИЛ-1р удается выявить лишь в 3% исследуемых проб.

5.При определении ФНО^ в слезной жидкости человека установлена зависимость между его наличием и развитием деструктивных изменений тканей переднего сегмента глаза, наличие

.ФНОа, в слезной жидкости свидетельствовало о повышении риска развития послеоперационных осложнений. В результате лечения отмечалось снижение процента проб, содержащих ФНОа,, во всех исследуемых группах, однако при наличии тяжелого послеоперационного воспаления не удавалось полностью нормализовать данный показатель.

РАБОТЫ,ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Крайнева Т.А,, Ганковская Л.В., Балашова л.М. Лимфо-кинотерапия проникающих ранений роговицы // Тезисы докладов 1 Сьезда иммунологов России,Новосибирск. -1992.-с.249.

2.Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Крайнова т.А.,Матаи-пова А.К., манько В.М., Хорошилова-Маслова И.П. Естественный комплекс цитокинов в лечении проникающих ранений роговицы глаза кролика в эксперименте// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,- 1993.- N0.3,- с.284-287.

3.Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Крайнова т.А., Егорова Э.В., Власова Т.И., Иошин И.Э. Аутолимфокинотерапия в стимуляции репаративных процессов тканей глаза// вестник офтальмологии.- 1993.- N0.3.- с.8-9.

{.Ковальчук Л.В., ганковская Л.В., Крайнова Т.А., Хоро-шилова-Маслова И.П.,Нанысо В.Н. Новые принципы локальной нм-кунокоррекции в печенки ран роговшщ //Тезисы докладов 6 съезда офтальмологов Госсии.- 1994.- с.303.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

ВЭ1Х - высокоэффективная Еидиостнаа хрокатография

ЕКЦ - естественный комплекс цитокинов

- интерлейкин - 1 -бета •

Ш-2 - интерлейкин - 2

-ИЛ-6 - интерлейкин - 6'

"ИФН/ - интерферон-гамма

ОШ - фактор, угнетавций ииграциа макрофагов

мнк - мононуклеарные клетки

ФГД - фитогемагглптинин

ФН0а: 5фактор некроза опухоли - альфа

МП «Пета» 3ix.5LX.-10O