Автореферат и диссертация по медицине (14.00.08) на тему:Применение фетальных клеток эпителия и кератобластов роговицы человека в эксперименте

На правах рукописи РГБ ОД

2 2 АПР 2002

ФОМИНА ИНГА АЛЕКСАНДРОВНА

ПРИМЕНЕНИЕ ФЕТАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЭПИТЕЛИЯ И КЕРАТОБЛАСТОВ РОГОВИЦЫ ЧЕЛОВЕКА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.00.08. - глазные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2002

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте глазнь болезней им. Гельмгольца (директор - доктор медицинских наук, профессор А.1 Южаков)

Научный руководитель - доктор медицинских наук Е.В.Ченцова Научный консультант - доктор медицинских наук,

член-корр. РАМН, профессор Г.Г. Сухих

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук,

профессор Г.С. Полунин доктор медицинских наук, 'профессор Ю.М. Корецкая

Ведущая организация - ГУ МНТК «Микрохирургия глаза»

им. акад. С.Н. Федорова

Защита диссертации состоится « » 2002 года

в /9 часов на заседании диссертационного совета Д.208.042.01. при Московском научно-исследовательском институте глазных болезней им. Гельмгольца (103064, г. Москва, ул. Садовая-Черногрязская, д. 14/19).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского НИИ глазных болезней им. Гельмгольца.

$ "7 Р

Автореферат разослан « й » ¿У—> 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор М.Б. Кодзов

¡)ь ^МЬ<о '99с С£ .

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Поражения роговицы составляют свыше 25% всех заболеваний органа зрения. >говичная травма отмечается в 40 - 75% всех повреждений глаза (Гундорова P.A. и авт., 1986, и др.). На долю роговичной слепоты приходится около 10% слепоты в .звитых странах и 30% - в развивающихся (Майчук Ю.Ф., 1991).

Лечение эрозий и язв роговицы различного генеза (послеожоговых, авматических, нейротрофических) является серьезной медицинской проблемой ( iterson С.А., 1993; Каспаров A.A. 1995, 1998; Гундорова P.A., 1996, 1999; Ченцова В., 1996, 2000; Анджелов В.О. 1997; Казаченко М.А. 1997; Майчук Ю.Ф., 1997; '99; Полунин Г.С., 1997, 2000; Краснов М.М. 1998; Dodson J.W. 1984; Варданян Р., 2000; Капитонов Ю.А. 2000; Романова И.Ю. 2001, и др.). Язвенные процессы в товице нередко сопровождаются обширными и глубокими повреждениями руктур глаза, ведущими к стойкому ухудшению зрения на одном или обоих азах. Нарушение трофики и регенерации - один из важных компонентов .тогенетического механизма эрозий и язв роговицы. Снижение рецепторной оруженности клеточных мембран, нарушение основных ферментативных аимодействий, снижение продукции цитокинов способствует усилению структивных изменений пораженных тканей, замедлению внутри- и внеклеточных сстановительных процессов, что в конечном итоге приводит к удовлетворительным структурным и функциональным результатам (К.П. Кашкин, 98; Ю.Ф.Майчук, 1990, и др.).

При эрозиях и язвах роговицы глубокие патологические изменения, зникающие на клеточном и субклеточном уровне, затрагивают прежде всего ителиально - стромальные слои, что приводит к нарушению процессов диффузии эсмоса, отеку стромы, угнетению синтеза кератоцитов и замедляет восстановление лостности и прозрачности. Поэтому проблема восстановления физиологического меостаза и стимуляции регенерации на клеточном уровне не теряет своей туальности.

Предложено большое количество терапевтических и хирургических методо лечения дефектов роговицы. Традиционная терапия включает обычно применени препаратов этиопатогенетической направленности: ингибиторов протеа антибиотиков, стимуляторов репаративной регенерации, витаминов. Однако, аналг данных литературы показывет, что, несмотря на разнообразие применяемы терапевтических и хирургических методов лечения, нередко не удается добитьс стойкой эпителизации роговицы. Поэтому проблема поиска новых способе стимуляции регенерации роговицы, эффективных и коммерчески доступны; гипоиммуногенных, не требующих применения консервантов, остается крайк актуальной (И.Р. Варданян, 2000; R.A. Levinson, 1976; R.R. Prister, 1978, и др.).

Адекватным дополнением к традиционным способам стимуляци восстановительных процессов при серьезных нарушениях репаративно регенерации роговицы может стать использование культивированных фетальны клеток (ФК) эпителия и кератобластов роговицы человека, способны генерировать пролиферативные сигналы и сигналы цитодифференцировю мигрировать в зону дефекта, обладающих низкой антигенной активность* продуцирующих ростовые факторы, цитокины и тканевые гормоны, и сохраняющк биологические характеристики неизменными в течение длительного времени (Г.г Сухих, 1996; B.C. Репин, 1999; R.R. Prister, 1978, и др.). Проблема восстановлен!-физиологического гомеостаза, нормализации цитокиновых воздействий, активаци клеток, повышения их рецепторной вооруженности и усиления митотическс активности, не теряет своей актуальности.

Цель исследования - изучить в эксперименте воздействие культивированных: vitro фетальных клеток эпителия и кератобластов роговицы человека на процесс заживления эпителиально-стромального дефекта роговицы.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать и экспериментально апробировать оптимальную дозу и спосс введения культивированных in vitro фетальных клеток эпителия кератобластов роговицы человека.

2. Создать экспериментальную модель эпителиально-стромального дефекта роговицы для изучения воздействия фетальных клеток.

3. Провести клинико-экспериментальную и морфологическую оценку воздействия фетальных клеток роговицы на процессы регенерации роговицы.

4. Изучить механизм воздействия фетальных клеток роговицы на регенерацию поврежденной роговицы кролика с помощью иммуногистохимических исследований.

5. На основании результатов клинико-экспериментальных, морфологических и гистохимических исследований обосновать эффективность воздействия культивированных in vitro фетальных клеток на процессы заживления эпителиально-стромального дефекта роговицы кролика.

Для осуществления цели и решения поставленных задач проведено 5 серий экспериментальных исследований на 86 кроликах (172 глаза). Научная новизна и практическая значимость работы.

1. Впервые в офтальмологии разработан и экспериментально апробирован комбинированный способ введения культивированных in vitro фетальных клеток эпителия и кератобластов роговицы человека в виде инсталляций и субконъюнктивальных инъекций.

2. Экспериментально определена оптимальная рабочая доза вводимой суспензии ФК.

3. На модели эпителиально-стромального дефекта роговицы кролика клинико-экспериментальными методами показана эффективность воздействия ФК на репаративные процессы в роговице.

4. Морфологическими исследованиями доказано стимулирующее воздействие ФК эпителия и кератобластов роговицы человека на процессы пролиферации и дифференцировки эпителия и кератобластов роговицы кролика.

5. Впервые с помощью иммуногистохимических методов изучен механизм действия ФК эпителия и кератобластов роговицы человека.

Впервые предложен метод фетотерапии заболеваний роговицы, получены: патент и 1 положительное решение о выдаче патента.

Учитывая возможность постоянно располагать донорским материалол поддерживать запас ФК в виде культуры, а также эффективность и простот способа введения, предложенный метод фетотерапии может найти применение клинической практике при заболеваниях роговицы, связанных с дисфункцие клеток эпителия и стромы, замедлением репаративной регенерации, а также дл предупреждения образования грубых бельм роговицы. Своевременное применена данного метода лечения может уменьшить потребность в радикальны хирургических вмешательствах.

Положения, выносимые на защиту.

1.Впервые предложен йетод стимуляции регенерации роговицы путе комбинированного введения культивированных фетальных клеток эпителия кератобластов роговицы в виде инсталляций и субконъюнктивальных инъекци Выработана оптимальная доза введения.

2.Выявлено, что ФК роговицы человека оказывают в эксперименте выражение противовоспалительное и регенеративное действие на процесс заживлеш эпителиально-стромального дефекта экспериментальных животных и в отдаленнь сроки ведет к более совершенным процессам перестройки новообразование стромальной ткани.

3.Морфологическими методами доказано стимулирующее воздейсш культивированных in vitro ФК на все фазы раневого процесса при заживлен! эпителиально-стромального дефекта роговицы кролика.

4.Результаты иммуногистохимических исследований показали, что ускорен] процессов регенерации эпителиально-стромального повреждения происходит результате реализации неспецифического механизма действия ФК, обусловленно: воздействием цитокинов, факторов роста, тканевых гормонов, продуцируема фетальными клетками.

Апробация работы.

Основные положения работы доложены: на научно-практической конференции НИИ ГБ им. Гельмгольца «Современные лазерные технологии в диагностике и чении повреждений органа зрения и их последствий» (Москва, 1999); на Ученом вете МНИИ ГБ им. Гельмгольца (Москва, 1999); на VII Съезде офтальмологов ссии (Москва, 2000); на научно-практической конференции МНИИ ГБ им. льмгольца «Теоретические и клинические исследования как основа дикаментозного и хирургического лечения травм органа зрения» (Москва, 2000); Юбилейной Всероссийской научно-практической конфренции, посвященной 100-гию Московского научно-исследовательского института им. Гельмгольца [осква, 2000). Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 2 в зубежных изданиях. Получен 1 патент на изобретение: «Способ лечения 5олеваний роговицы» № 2157675 от 20.10.2000.; и положительное решение о даче патента «Способ лечения дефектов роговицы» по заявке №: 2000102601 от . 02. 2000.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 133 страницах, состоит из введения, 5 глав, стечения и выводов, практических рекомендаций, приложения и блиографического указателя. Содержит 20 таблиц, 34 рисунка. Список гературы включает 155 работ отечественных и 42 иностранных авторов. Работа выполнена в отделе травматологии, глазного протезирования и конструктивной хирургии (руководитель отдела - доктор мед. наук, проф. Р.А. ндорова) Московского НИИ глазных болезней им. Гельмгольца (директор -ктор мед. наук, проф. A.M. Южаков), в Институте биологической медицины и Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН г. Москвы ¡ректор - член корр. РАМН, проф. Г.Т. Сухих).

Выражаю благодарность научному руководителю - д.м.н. Е.В. Ченцовой и учному консультанту - проф. Г.Т. Сухих; сотрудникам Московского НИИ ГБ им. льмгольца: отдела травматологии, реконструктивной хирургии и глазного

протезирования (руководитель отдела - доктор мед. наук, проф. Р.А. Гундорова) отдела патологической анатомии и гистологии (под рук. проф. И.П. Хорошилово] Масловой); сотрудникам Института биологической медицины, в частности, отде; лаборатории клинической иммунологии (директор - член корр. РАМН, проф. Г.' Сухих) за практическую помощь при выполнении работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования:

Для осуществления цели и решения поставленных задач, проведено 5 сер* экспериментальных исследований. Весь экспериментальный материал (172 глаза, i кроликов) был разделен на 3 предварительные и 2 основные серии.

Клеточная культура эпителия и кератобластов.

Культура выращена на-полной питательной среде RPMI - 1640 с добавление 20% эмбриональной сыворотки теленка. Источником культуры служила тка! роговицы 14-22 недельных эмбрионов человека, полученных при искусственнс прерывании беременности по медицинским показаниям.

Аборты проводились в государственном учреждении - Научном цент] акушерства, гинекологии и перинатологии (НЦАГ и П) РАМН строго соответствии с основами законодательства об охране здоровья граждан - статья . 36, приказом МЗ РФ№302 от 28.12.93, рекомендациями ВОЗ, принятыми РФ, также нормами Этического Комитета и специально созданной комиссии i госпитализации (куда входят ведущие специалисты, а также юристы НЦАГ и П РАМН).

Для получения клеточных культур использовались только те плоды человек сыворотка крови которых, а также сыворотка крови их матерей дали отрицательнь результат при тестировании на сифилис, гепатит (В и С), вирус иммунодефици человека, цитомегаловирус, вирус простого герпеса и, кроме того, ря, внутриклеточных бактерий (хламидии, микоплазма, уреаплазма).

Этапы подготовки трансплантационного материала:

1-й этап - рассечение фетальной роговицы на 2 слоя: наружный и внутренни микродесекция наружного слоя, ферментативная дезагрегация с помощью 0,1

ютвора коллагеназы (Sigma), отмывание полученных в результате ферментативной эработки единичных клеток физиологическим раствором и использование их для элучения первичных культур эпителия и кератобластов; 2-й этап - адаптация к ;рвичной культуре, формирование монослоя в течение 15-30 суток; 3-й этап -штие монослоя трипсином, 2-х кратное отмывание фетальных клеток изиологическим раствором, проверка на отсутствие контаминированности етодом полимеразной цепной реакции (ПЦР); 4-й этап - подсчет количества изнеспособных клеток по исключению трепанового синего (как правило, 98%) и /спендирование в минимальном объеме физиологического раствора.

По данным литературы (И.Р. Арутюнова и др., 2001), при внутрикамерном и ^бконъюнктивальном введении суспензии ФК эндотелия роговицы человека, жцентрация 10б кл./мл является оптимальной рабочей концентрацией. В данном ^следовании также использовалась суспензия с концентрацией - 10б кл./мл., держащая (80%) эпителиальных клеток роговицы человека и (20%) кератобластов. ля трансплантации использовались клетки 5-7 пассажа.

В данной работе использовались следующие методы исследования: 1. Экспериментально-клинические: осмотр глаза с применением диффузного, эямого фокального, щелевого освещения, биомикроскопия с флюоресцеиновая юбой, фоторегистрация на ЩЛ «Opton», измерение размеров дефекта роговицы эи помощи калиброметра.

В I - III сериях эксперимента для оценки местнораздражающего действия етальных клеток на глаза кроликов использовались следующие критерии: ¡етобоязнь, гиперемия конъюнктивы, отек конъюнктивы, оцениваемые по 3-м -епеням выраженности: (0 степень - отсутствует, 1 степень - слабая, 2 степень -сраженная, 3 степень - резко выраженная). Отек роговицы оценивался по 3-м :епеням: (0 степень - отсутствие отека, 1 степень - структура радужки различается свозь отечную роговицу, 2 степень - определение цветного фона радужки сквозь гек в виде задней границы передней камеры, 3 степень - глубина передней камеры ; определяется).

В IV серии эксперимента клиническую оценку влияния фетальных клеток I регенерацию (на модели экспериментального эпителиально-стромального дефект; проводили по следующим критериям:

1/ выраженность-воспалительной реакции после кератэктомии (клинические признаки: светобоязнь, слезотечение, гиперемия конъюнктивы, отек конъюнктивы, оценивались по 3-м степеням выраженности (см. I - III серии); 2/ начало эпителизации роговицы;

3/динамика заживления эрозии роговицы (размеры эрозии измеряли горизонтальном и вертикальном меридианах калиброметром и высчитывали среда« значение размеров эрозии (в мм2) в каждой группе до наступления полис эпителизации);

4/полная эпителизация роговицы;

5/интенсивность помутнения роговицы оценивалась по 10-бальной шкале Войн! Ясенецкого (шкала степеней прозрачности представляет собой 10 расположенных ряд дисков, цвет которых от одного конца ее к другому постепенно переходит < черного к почти белому; черный кружок соответствует 1-й, наибольшей стеле* прозрачности, почти белый соответствует 10-й, наименьшей степени прозрачности 2. Морфологические: световая микроскопия, фоторегистрация окрашеннь микропрепаратов, морфометрические исследования.

Исследования проводили в отделении патологической анатомии и гистолоп глаза МНИИ ГБ им. Гельмгольца (рук.- проф. И.П. Хорошилова-Маслов совместно с проф. И.П. Хорошиловой-Масловой и старш. н.с., канд. биол. на] Л.В.Илатовской.

Изучение окрашенных срезов переднего отдела глаза проводили на 1, 3,7,14 30 сутки эксперимента. Всех животных умерщвляли методом воздушной эмболи глаза энуклеировали и подвергали обработке для гистологического исследовани На окрашенных гистологических срезах проводили морфометричесю исследование - подсчет количества кератобластов и воспалительных клеток на 1, 7, 14 и 30-е сутки. Подсчет производили в 3-х зонах: зоне ранения, переходш зоне, интактной зоне; с помощью масштабной стандартной сетки на площади О

ш2 в 20 полях. Исследовались 3 слоя роговицы: поверхностный, средний и глубокий.

Статистическая обработка материала производилась с помощью программы Student's t-test.

3. Иммуногистохимические: полимеразная цепная реакция - ПЦР.

Для определения наличия фетальных клеток человека в роговице глаза кролика ia 3-й сутки эксперимента на 6-ти глазах была произведена ПЦР. Реакцию фоводили в течение 45 циклов на программируемом термостате «PCR express» "Hybaid", Великобритания) при 95°С - 15 с, 60°С - 15 с, 72°С - 30 с. Продукты )еакции анализировали методом электрофореза в 1.5% агарозном геле. Результаты юкументировали с использованием системы Gel Doc 1000 ("Bio-Rad", США) и фограммы Molecular Analystт ("Bio-Rad", США).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе исследования были проведены V серий экспериментов.

В I и II предварительных сериях - 30 кроликов (60 глаз) - отрабатывались (оза и метод введения ФК.

В Ш предварительной серии - 10 кроликов (20 глаз) - проводилось истологическое исследование тканей глаза на токсичность.

В IV основной серии - 40 кроликов (80 глаз ) - изучалось влияние эпителия и :ератобластов ФК роговицы человека на процессы репаративной регенерации юговицы на модели эпителиально-стромального дефекта.

В V основной серии - 3 кролика (6 глаз ) при помощи иммуногистохимических гетодов был изучен механизм действия ФК.

Результаты I и II предварительных серий экспериментов показали, что при »днократном введении суспензии ФК в дозе 200 000 кл. в виде инсталляций и убконъюнктивальных инъекций клинически отсутствует местное раздражающее (ействие ФК на ткани глаза. При введении большей дозы - 400 000 кл., [аблюдалась местная реакция в виде гиперемии и отека конъюнктивы, что видетельствует о небольшом раздражающем действии; при введении дозы 500 000 л. наблюдалась выраженная гиперемия и отек конъюнктивы, отек роговицы 1-й

степени, что говорит о выраженном местном раздражающем действии при сроке наблюдения 10 дней.

Результаты III предварительной серии, в которой гистопрепараты глаз кроликоЕ исследовались на токсичность при помощи световой микроскопии на 1, 3, 7, 14 и ЗС сутки после введения ФК в дозе 200 ООО кл., показали, что патологически? изменений в роговице, хрусталике, радужной оболочке, цилиарном теле, хориоидее, сетчатке и зрительном нерве не выявлено.

Таким образом, экспериментально-клинические и морфологические результата проведенных 3-х серий эксперимента показали, что суспензия фетальных клеток содержащая 80% клеток роговичного эпителия и 20% кератобластов, вводимая I концентрации 10б кл./мл в виде инсталляций и субконъюнктивальных инъекций, не оказывает токсического действия на глаз в дозе 200 000 кл.

В IV серии проводилась клинико-экспериментальная оценка результате! воздействия фетальных клеток на модели эпителиально-стромального дефект; роговицы кролика. Основные клинические данные были фиксированы на 1, 3, 7, V и 30 сутки после кератэктомии.

Модель травмы: всем кроликам после анестезии на обоих глазах трепано!^ диаметром 8,0 мм с дозируемой насадкой была произведена трепанация в центр« роговицы на глубину 0,2 мм. Затем эпителий и 1/2 стромы роговицы были удалены < помощью круглого ножа. В опытных глазах сразу после кератэктомии вводилась -суспензия фетальных клеток в виде 4-х кратных инсталляций и с/к инъекций I дозе - 200 000 кл В контроле применялся - 0,9% физиологический раствор в вид< аналогичных инсталляций и инъекций.

1/. Выраженность воспалительной реакции.

В первые сутки после кератэктомии в обеих группах (контрольной и опытной воспалительные явления были ярко выражены. Глаза раздражены, отмечалис! резко выраженные слезотечение, светобоязнь, смешанная инъекция. Конъюнктив; век гиперемирована и отечна. В центре роговицы наблюдалось формирован® округлого дефекта диаметром 8x8 мм, глубиной до 1/2 стромы с наложение!* фибрина, интенсивно прокрашиваемого флюоресцеином. В зоне дефекта роговиц;

гчная, мутная во всех контрольных и опытных глазах (отек 3 степени). Однако, ж роговицы в 6 опытных глазах (30 %), уменьшился до 2-й степени, в то время { во всех контрольных глазах сохранялась 3-я степень отека. Разница мистически достоверна (р<0,05). Результаты клинических исследований казали, что купирование симптомов воспаления по изучаемым нами показателям эпытных глазах произошло в среднем на 3 дня раньше, чем в контроле. В 2тности, отек роговицы купировался в опытных глазах, в среднем, к 14 дню, в то :мя, как в контрольных лишь к 17 дню после травмы. Гиперемия конъюнктивы сранялась в опытных глазах в среднем до 17 дня, в контрольных - до 20. Разница мистически достоверна (р < 0,05).

2/. Начало эпителизации.

Второй отличительной особенностью процесса заживления контрольных и ытных глаз является появление краевой эпителизации дефекта: в 17-ти опытных 1зах (85%) уже на первые сутки появилась тонкая полоса (0,5 -1,0 мм) вдоль края })екта (см.график 1), в то время как в контрольных глазах мы наблюдали ее лишь -ми глазах (35%) ( см. рисунок 1,2). 1сунок 1,2.

Начало эпителизации роговицы после кератэктомии в эксперименте (опыт)

15

85

□ краевая ! эпителизац! ия

□ отсутствие эпителизац ии__

Начало эпителизации роговицы после кератэктомии в эксперименте (контроль)

□ краевая эпителизация

! ^отсутствие ! эпителизации

3/. Динамика заживления дефекта роговицы.

Скорость заживления дефекта роговицы в опытной группе была более высокой все сроки наблюдения. Наиболее показательными были 4-е и 7-е сутки. На 4-е ки площадь дефекта роговицы составила в опытных глазах в среднем 5,8 мм2, а в ггрольных - 9,1 мм.2 На 7-е сутки площадь зоны ранения сократилась в опытных

глазах до 1,0 мм2, в то время как в контрольных она составила 4,0 мм.2 Разни статистически достоверна (Р=0,0001). 4/. Полная эпителизация роговицы.

Полная эпителизация наступила в опытных глазах на 7-10 сутки, в то время ка! контрольных - на 10-13 сутки. Разница статистически достоверна (Р=0,0471) .

Через 30 суток воспалительные явления полностью купированы в контрольны? в опытных глазах. Глаза спокойны, на месте дефекта - облаковидное помутнен роговицы. На 30-е сутки отмечалось формирование более нежных помутнен роговицы в зоне кератэктомии в опытных глазах, по сравнению с контрольными (с табл.1).

Таблица 1.

Степень выраженности по^мутнений роговицы через 30 суток после кератэктомии

Количество Прозрачная ткань Почти прозрачная Полупрозрачная ткань

глаз (№1-2 по шкале) ткань (№3 по шкале) (№4-5 по шкале)

Контроль 5(25%) 15(75%)

(п=20)

Опыт 3(15%) 13(65%) 4(20%)

01=20)

Результаты клинических исследований показали:

- купирование признаков воспаления в опытных глазах в среднем на 3-е суток раньше, чем в контрольных;

- достоверно раннее начало эпителизация дефекта в опытной группе (в среднем на 1 сутки);

- более высокую скорость эпителизации дефекта роговицы;

- более раннее завершение эпителизации роговицы в опытных глазах (в среднем на 3-е суток);

- формирование к 30-му дню менее интенсивных помутнений. В опытной группе преобладали помутнения 3 степени, в контрольной 4-5 степени, что свидетельствует о более качественном заживлении роговицы.

Морфологические результаты воздействия фетальных клеток на регенераторные процессы в роговице.

Эффект фетотерапии был отмечен уже на 1-е сутки: в контроле - раневая эверхность рыхлая, наблюдается некробиотический процесс во всех слоях, шболее выраженный в верхнем слое. Выраженный отек всех 3-х слоев: эверхностного, среднего и глубокого, отек десцеметовой оболочки, эндотелия, хлыпое скопление нейтрофильных элементов во всех слоях роговицы и эеобладание их над кератобластами (см. табл. 2).

В опытных глазах напротив, раневая поверхность роговичной ткани гладкая, >вная, признаки некробиоза и отек только в самых поверхностных слоях, >спалительная реакция менее выражена, что подтверждено статистически (см. 16л. 2). Количество кератоцитов в зоне ранения и в переходной зоне в опытных [азах во всех слоях превышает их число в контрольной группе (см. табл. 2). По >аю зоны дефекта в большинстве опытных глаз, в отличие от контрольных, уже в е сутки имеются признаки начальной эпителизации.

Таблица 2.

Количество фибробластических элементов и воспалительных [еток в гистологических срезах роговицы глаза кролика через 1 сутки

она реза Метод лече- Поверхностные слои п = 20 Средние слои п = 20 Глубокие слои п = 20

ого-ицы ния фибробла-стические элементы воспалительные клетки фибробла-стические элементы воспалительные клетки фибробла-стические элементы воспалительные клетки

она ане- Контроль 0,90 ±1,8 6,28 ±2,7 1,08 ±1,5 3,97 ±2,6 1,74 ±0,8 1,94 ±13

ия Опыт 1,58 ± 0,7 3,02 ± 1,6 2,42 ± 1,2 1,69 ±1,4 2,54 ± 1,3 1,13 ± 0,9

Р<0,05 + + + + + +

На 3-й сутки: в контроле - усиление воспалительной реакции, что щтверждено статистически (см. табл. 3), значительный отек роговицы. На фоне сраженной воспалительной реакции отмечается начало восстановительных юцессов: частично восстанавливается эпителий, который наползает с периферии I обнаженную поверхность стромы в виде одно-, двухрядного пласта, однако

большая ее часть остается открытой, наблюдается активизация фибробластичеси элементов (см. табл. 3).

В опыте - воспалительные явления слабо выражены, отек лип межпластинчатый. Регенераторные процессы протекают более активно: отмечает» эпителизация в 1-2 слоя большей части раневой поверхности, значительн: активизация фибробластических элементов, что подтверждено статистически (а табл. 3). Таким образом, разница между контрольными и опытными глазал увеличивается к 3-м суткам - в опытных глазах значительно менее выражен от< роговицы, воспалительная инфильтрация затрагивает преимущественно верхш слои, фибробластические элементы активизированы, эпителий актив! регенерирует.

Таблица 3.

Количество фибробластических элементов и воспалительных клеток в гистологических срезах роговицы глаза кролика через 3-е суток

Зона среза роговицы Метод лечения Поверхностные слои п = 20 Средние слои 11 = 20 Глубокие слои п = 20

фибробластические элементы воспалительные клетки Фибробластические элементы воспалительные клетки фибробластические элементы воспалительные клетки

Зона ранения Контроль 0,73 ±1,3 6,44 ± 2,7 1,38 ± 1,5 3,25 ±2,6 1,66 ±0,8 1,12 ±1,3

Опыт 1,20 + 2,6 2,53 ± 2,4 1,99 ±2,2 1,06 ± 1,0 2,15 ±1,3 0,97 ± 1,8

Р < 0,05 + + + + + +

На 7-е сутки: в контрольной группе сохраняются признаки воспаления, слабь отек, нет полноценного эпителиального закрытия зоны ранения.

В опытных глазах - менее выражена воспалительная реакция, отек сохраняет лишь в поверхностных слоях, выраженная активизация кератобластичесю элементов, активная регенерация эпителия.

На 14-е сутки: в контроле сохраняется воспалительная инфильтрация, оте слабо выраженная активизация кератобластических элементов, слабая регенерац: эпителия (1 ряд клеток).

В опыте - воспаления практически нет, в строме отмечается преобладание астинчатого компонента, что говорит о формировании более зрелой ткани, ителий 3-4 рядный.

На 30-е сутки: в контроле - эпителий полностью покрывает дефект, но имеет равномерную толщину, истончен. Под эпителием - новообразованная ткань более [хлая, с преобладанием хаотично расположенных как клеточных элементов, так и астинчатых структур, мало волокон.

В опытных глазах - 5 слоев эпителия покрывают зону дефекта, отмечается

ратификация базального слоя. Новообразованная ткань имеет упорядоченное

сположение клеток и пластин, более правильный ход волокнистых структур.

роение ее близко к строению нормальной неповрежденной стромы.

Таким образом, данные морфологического исследования показали:

менее выраженную воспалительную реакцию в опытных глазах во все сроки

наблюдения;

более быстрое купирование отека в опытных глазах;

ускорение эпителизации зоны дефекта в опытных глазах по сравнению с контрольными;

восстановленный эпителий в опыте стратифицирован, имеет правильное расположение слоев и не склонен к десквамации;

новообразованная соединительная ткань роговицы имеет упорядоченное строение клеточных элементов и коллагеновых волокон, и содержит большее количество молодых фибробластических элементов в опытных глазах. Полученные результаты подтверждены морфометрическими данными.

Полимеразная цепная реакция.

Для определения механизмов действия ФК роговицы человека на регенераций эпителия и стромы роговицы, 6 глаз кроликов на 3-й сутки после кератэктомии i введения ФК в виде инсталляций и субконъюнктивальных инъекций был] исследованы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Чувствительность реакции, оцененная путем последовательного 10-кратноп разведения ДНК, составила около 10 геномов.

Экстракция и очистка ДНК.

Выделение и очистку ДНК проводили в соответствии с отдельным; модификациями. Роговицы глаза кролика, а также 10 и 100 тыс. клеток эмбрион человека помещали в отдельные пробирки, добавляли по 1 мл лизирующег раствора, содержащего 1%-ный SDS ("Sigma", США) и 100 мкг/мл протеиназы ] ("ICN", США) и инкубировали в течение 1 часа при 37°С при постоянном мягко] встряхивании на термомиксере ("Eppendorf, Германия). Добавляли равный объе: смеси: фенол, хлороформ, изоамиловый спирт (24:24:1), интенсивно встряхивали центрифугировали при 10 тыс. g в течение 5 минут. Супернатант отбирали повторяли процедуру фенольной экстракции ДНК. К супернатанту добавлял равный объем изопропанола, осторожно перемешивали и осаждали ДНК при 15 тьи g в течение 10 центрифугированием при 10 тыс. g в течение 5 минут. Осадо дважды промывали 75%-ным этанолом, тщательно высушивали и растворяли в 10 мкл деионизованной воды. В ПЦР использовали от 0.1 мкл (разведение до 1 геномов человека) до 1 мкл (100 геномов человека) раствора ДНК.

Реакцию амплификации проводили в объеме 25 мкл. В реакционную смес последовательно вносили деионизованную воду в количестве, необходимом да достижения заданного конечного объема, 2.5 мкл 10-кратного буфера для ПЦР (66 мМ трис-HCl, pH 8.8 ("Sigma", США), 166 мМ сульфата аммония ("Sigma", США 0.1% твин-20 ("Sigma", США), 0.01% желатина ("Serva", Германия), 30 м! хлористого магния ("Sigma", США)), по 250 мкМ каждого дНТФ ("ICN", США), г 1 пМ праймеров, 0.8 единиц активности Taq-полимеразы ("Promega", США), 5 mi раствора ДНК в деионизованной воде и 30 мкл минерального масла ("ICN", США).

Для контроля качества выделения ДНК из большого количества биологического териала (роговица глаза) были использованы праймеры к мРНК р-актина ловека, образующие специфическую полосу при наличии ДНК в исследуемом разце (матрицей служит нуклеотидная последовательность псевдогена р-актина), :акже обладающие специфичностью к ДНК кролика (см. табл. 4).

Таблица 4.

Праймеры, использовавшиеся для поиска и идентификации ДНК человека в образцах роговицы глаза кролика

доспеци- [ЧНОСТЬ аймера Название гена Нуклеотидная последовательность праймера Длина продукта ПЦР

$ар1еп$ Са2+-АТФ-аза б'-АТТСГГГССАТТТСССААТАС 920 п.н.

$ар!еп$ Са2+-АТФ-аза 5'-АТТСАССАСССТСТСССС 920 п.н.

вар^пв, О. гисЫиз Р-актин, псевдоген 5'- АССССААССвССАСААСАТСАС 280 п.н.

$ар!еп$, 0. 1 р-актин, псевдоген мсиИк | 5'- ТСС ССС СТО ОТСвТС, ЛАС С 280 п.н*

Результаты полимеразной цепной реакции.

При уровне чувствительности не более 10 копий генома, ДНК человека в следованных образцах выявлено не было. Следовательно, можно предположить, о ФК человека через 3-е суток после введения суспензии в виде инстилляций и бконъюнктивальных инъекций в роговице глаза кролика отсутствуют. Однако, лученные данные нельзя считать статистически достоверными, так как материал следован в недостаточном количестве.

Таким образом, положительные механизмы терапии ФК, вероятно, связаны с специфическими механизмами, обусловленными воздействием :бриоспецифических ростовых факторов, цитокинов и других биологически тивных молекул, продуцируемых клетками. Весьма вероятна стимуляция тальными клетками интерфероногенеза и синтеза интерлейкинов, особенно ИЛ-1, о, в свою очередь, должно усиливать внутриклеточные репаративные процессы.

ВЫВОДЫ.

¡.Впервые в офтальмологии предложен, разработан и апробирован в эксперимен' новый способ комбинированного введения культивированных in vitro фетальнь клеток эпителия и кератобластов роговицы человека. Определена терапевтическ; концентрация и доза суспензии ФК.

2.Доказано, что суспензия фетальных клеток, содержащая 80% клеток роговично! эпителия и 20% кератобластов, вводимая в концентрации 10б кл./мл в ви; инсталляций и субконъюнктивальных инъекций не оказывает токсическо! действия на глаз' в дозе 200 000 кл.

3.Клинико-экспериментальное исследование восстановления поврежденного результате кератэктомии эпителиально-стромального слоя роговицы кроли] показало: купирование признаков воспаления в опытных глазах в среднем на 3 суток раньше, чем в контрольных; достоверно ранее начало эпителизации дефекта опытной группе (в среднем на 1 сутки); завершение эпителизации роговицы опытных глазах в среднем на 3-е суток раньше, чем в контрольных; формирован] к 30 дню менее интенсивных помутнений. В опытной группе преоблада] помутнения 3 степени, в контрольной 4-5 степени, что свидетельствует о бол качественном заживлении роговицы.

4.Данные морфологических исследований подтвердили клинические результат] применение ФК приводит к уменьшению проявлений травматического воспалени усиливает пролиферативную активность эпителия и кератобластов и ускоряет i дифференцировку, ведет к интенсификации процесса коллагеногенеза и бол совершенным процессам перестройки новообразованной стромальной ткани.

5. Иммуногистохимические исследования показали, что определяющую роль индукции положительных эффектов действия ФК играют неспецифичесю механизмы клеточной терапии, основанные на модуляции процессов регенераци пролиферации и дифференцировки.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ. 1.Метод фетотерапии (комбинированное применение суспензии ФК роговицы виде инсталляций и инъекций, однократная доза 200 000 кл.) может бы

сомендован для клинической апробации при лечении эпителиально-стромальных }>ектов роговицы человека.

'читывал стимулирующее действие фетальных клеток на регенераторные эцессы в роговице, можно рекомендовать их применение при рецидивирующих )зиях и язвах различного генеза, сопровождающихся замедлением эпителизации, тример, при ожоговой болезни глаз.

В связи с тем, что клинико-морфологические исследования подтвердили этивоотечное и противовоспалительное действие фетальных клеток, возможно дчение их клинической эффективности при заболеваниях роговицы, 1ровождающихся отеком, например, при травмах, ожогах, болезни трансплантата. 1оскольку в результате воздействия фетальных клеток формируется более нежная эцовая ткань, возможно рассматривать их применение как один из методов гения помутнений роговицы, для предотвращения грубого рубцевания при шалительных процессах и травмах органа зрения.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ НАУЧНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Применение фетальных клеток роговицы человека для лечения различной патологии органа зрения // Офтальмохирургия, 1999, №4, С.2-9. (соавт.

Е.В.Ченцова, Г.Г.Петриашвили, И.Р.Арутюнова, Р.А.Полтавцева, Г.Т.Сухих).

2. Изучение влияния трансплантации фетальных клеток на регенерацию роговицы в эксперименте // Современные лазерные технологии в диагностике и лечении повреждений органа зрения и их последствий: Материалы науч.-практ. конф. - М., 1999, С. 130. (соавт. Е.В.Ченцова, Г.Г.Петриашвили, Р.А.Полтавцева, И.Р.Арутюнова, Г.Т.Сухих).

3. Влияние применения фетальных клеток и раствора актовегина на регенерацию роговицы в раннем послеоперационном периоде после фоторефракционной кератэктомии // Современные лазерные технологии в диагностике и лечении повреждений органа зрения и их последствий: Материалы науч.-практ. конф. -М., 1999, С.39 (соавт. Е.П. Тарутга, Е.В.Ченцова, Т.С.Смирнова, Г.Г. Петриашвили, И.Р. Арутюнова).

4. Клинический опыт аллотрансплантации фетальных клеток роговицы в

офтальмологии // Глаз, 2000, N3, С.10-12 (соавт. Е.В.Ченцова, Р.А.Гундорова, Г.Г. Петриашвили, Й.Р Арутюнова, Р АЛолтавцева, Г.Т.Сухих.)

5. Первый опыт применения нового способа лечения дефектов роговицы с помощью культуры фетальных клеток // Теоретические и клинические иследования как основа медикаментозного и хирургического лечения травы органа зрения: Материалы науч.-практ. конф. - М., апрель 2000, С. 23-24, (соавт. Е.В.Ченцова, Г.Г.Петриашвили, И.Р.Арутюнова, Р.А.Полтавцева. Г.Т.Сухих).

6. Новый метод лечения заболеваний роговицы с использованием культивированных in vitro эмбриональных клеток роговицы // VII Съезд офтальмологов России. - Москва, 16-19 мая 2000, №2, С.50. (соавт, Е.В.Ченцова, Г.Г.Петриашвили, И.Р.Арутюнова, РА.Полтавцева, Г.Т.Сухих).

7. Трансплантация фетальных клеток роговицы человека для стимуляции репарации роговицы кролика // Клинические аспекты клеточной и тканевой терапии: Материалы 2-ой межрегиональной научной конференции, Омск, 2728 июня 2000,С. 178-179. (соавт. Е.В.Ченцова, Г.Г.Петриашвили Р.А.Полтавцева, Г.Т.Сухих).

8. Effect of transplantation of fetal corneal cells on corneal wound healing // XI] Congress European Society of Ophthalmology // Stockholm, Sweden, July 1999, S 204, (S P 442) // Chentsova K.V., Petriashvili G.G., Suhkihk G.T., Arutunova I R., Grechko G. K.

9. The pilot application of fetal corneal cells in the treatment of corneal endothelia disorders // XII Congress European Society of Ophthalmology // Stockholm Sweden, July 1999, S. 61 (FP68) // Chentsova K.V., Gundorova R.A., Petriashvil G.G., Suhkihk G.T., Arutunova I. R.

СПИСОК ИЗОБРЕТЕНИЙ.

1.Патент на изобретение «Способ лечения ожогов глаз» N 2140241 от 30.07.97.

2.Положительное решение о выдаче патента «Способ лечения дефектов роговицы» по заявке №: 2000102601 от 04.02.2000.

Актуальность проблемы.

Поражения роговицы составляют свыше 25% всех заболеваний органа зрения. На долю роговичной слепоты приходится около 10% всей слепоты в развитых странах и 30 % - в развивающихся. По данным различных авторов, роговичная травма отмечается в 40 - 75% всех повреждений глаза (2,23, 24, 25, 26,90,91, 92, 126, и др.).

Лечение эрозий и язв роговицы различного генеза (послеожоговых, травматических, нейротрофических) является серьезной медицинской проблемой. Язвенные процессы в роговице нередко сопровождаются обширными и глубокими повреждениями структур глаза, ведущими к стойкому ухудшению зрения на одном или обоих глазах (23, 24,25, 27,38, 47, 48,90, 97,98,99,100,126,177,178,180,181, 182, 183,184, и др.).

Нарушение трофики и регенерации - один из важных компонентов патогенетического механизма эрозий и язв роговицы. Снижение рецепторной вооруженности клеточных мембран, нарушение основных ферментативных взаимодействий, снижение продукции цитокинов способствует усилению деструктивных изменений пораженных тканей, замедлению внутри- и внеклеточных восстановительных процессов, что в конечном итоге приводит к неудовлетворительным структурным и функциональным результатам (36,32,48,90, 98,99,100, и др).

При эрозиях и язвах роговицы глубокие патологические изменения, возникающие на клеточном и субклеточном уровне, затрагивают прежде всего эпителиально - стромальные слои, что приводит к угнетению синтеза кератоцитов, нарушению процессов диффузии и осмоса, отеку стромы и замедляет восстановление целостности и прозрачности. Миграция эпителиальных клеток в сторону дефекта сопровождается снижением их митотической активности. Медленная эпителизация или полное ее отсутствие создают условия для истончения, инфицирования и перфорации роговицы, что в свою очередь может привести к гибели глаза. Изменение адгезивных свойств эпителия, ослабление связи с боуменовой мембраной, приводит к десквамации его, что нередко обусловливает рецидивирующее течение эрозий и язв роговицы. Многочисленными исследованиями подтверждено искажение и замедление биосинтеза белка в строме, непокрытой эпителием. Замедление репаративных процессов при поражениях роговицы обусловлено не только изначальным нарушением обмена веществ, воздействием инфекционных агентов и аллергизирующих факторов, но и токсическим действием некоторых применяющихся лекарственных препаратов, особенно антибиотиков и противовирусных. Таким образом, лечение дефектов роговицы различного генеза остается социально значимой и далеко не решенной проблемой офтальмологии. Основной целью лечения эрозий и язв роговицы является ускорение эпителизации поврежденной корнеальной поверхности, позволяющее избежать таких грозных осложнений, как истончение, расплавление и перфорация роговицы (23, 24, 25, 26, 32,48, 54, 92, 93, 94, 99, 141,181,182, 183,184, и др.)

Проблема восстановления физиологического гомеостаза, нормализации цитокиновых воздействий, активации клеток, повышения их рецепторной вооруженности и усиления митотической активности, не теряет своей актуальности. Поиск новых способов стимуляции регенерации роговицы, эффективных и коммерчески доступных, гипоиммуногенных, не требующих применения консервантов и сохраняющих биологические характеристики неизменными в течение длительного времени, крайне необходим (32, 36,48, 32, 51, 52, 53, 54, 183, 184, и др.).

Адекватным дополнением к традиционным способам стимуляции восстановительных процессов при серьезных нарушениях репаративной регенерации роговицы может стать использование культивированных фегальных клеток эпителия и кератобластов роговицы человека, способных генерировать пролиферативные сигналы и сигналы цитодифференцировки, мигрировать в зону дефекта, обладающих низкой антигенной активностью и продуцирующих ростовые фаторы, цитокины и тканевые гормоны.

Цель исследования - изучить в эксперименте воздействие культивированных in vitro фегальных клеток эпителия и кератобластов роговицы человека на процессы заживления эпителиально-стромального дефекта роговицы.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать и экспериментально апробировать оптимальную дозу и способ введения культивированных in vitro фегальных клеток эпителия и кератобластов роговицы человека.

2. Создать экспериментальную модель эпителиально-стромального дефекта роговицы для изучения воздействия фетальных клеток.

3. Провести клинико-экспериментапьную и морфологическую оценку воздействия фетальных клеток роговицы на процессы регенерации роговицы.

4. Изучить механизм воздействия фетальных клеток роговицы на регенерацию поврежденной роговицы кролика с помощью иммуногистохимических исследований.

5. На основании результатов клинико-экспериментальных, морфологических и гистохимических исследований обосновать эффективность воздействия культивированных in vitro фетальных клеток на процессы заживления эпителиально-стромального дефекта роговицы кролика.

Для осуществления цели и решения поставленных задач проведено 5 серий экспериментальных исследований на 86 кроликах (172 глаза).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

РАБОТЫ.

1. Впервые в офтальмологии разработан и экспериментально апробирован комбинированный способ введения культивированных in vitro фетальных клеток (ФК) эпителия и кератобластов роговицы человека в виде инсталляций и субконъюнкгивальных инъекций.

2. Экспериментально определена оптимальная рабочая доза вводимой суспензии ФК.

3. На модели эпителиально-стромального дефекта роговицы кролика клинико-экспериментальными методами показана эффективность воздействия ФК на репаративные процессы в роговице.

4. Морфологическими исследованиями доказано стимулирующее воздействие ФК эпителия и кератобластов роговицы человека на процессы пролиферации и дифференцировки эпителия и кератобластов роговицы кролика.

5. Впервые с помощью иммуногистохимических методов изучен механизм действия ФК эпителия и кератобластов роговицы человека.

Впервые предложен метод фетотерапии заболеваний роговицы, получены: 1 патент и 1 положительное решение о выдаче патента.

Учитывая возможность постоянно располагать донорским материалом, поддерживать запас ФК в виде культуры, а также эффективность и простоту способа введения, предложенный метод фетотерапии может найти применение в клинической практике при заболеваниях роговицы, связанных с дисфункцией клеток эпителия и стромы, замедлением репаратнвной регенерации, а также для предупреждения образования грубых бельм роговицы. Своевременное применение данного метода лечения может уменьшить потребность в радикальных хирургических вмешательствах.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1.Впервые предложен метод стимуляции регенерации роговицы путем комбинированного введения культивированных фетальных клеток эпителия и кератобластов роговицы в виде инсталляций и субконъюнктивальных инъекций. Выработана оптимальная доза введения.

2.Выявлено, что ФК роговицы человека оказывают в эксперименте выраженное противовоспалительное и регенеративное действие на процесс заживления эпителиально-стромапьного дефекта экспериментальных животных и в отдаленные сроки ведет к более совершенным процессам перестройки новообразованной стромапьной ткани.

3.Морфологическими методами доказано стимулирующее воздействие культивированных in vitro ФК на все фазы раневого процесса при заживлении эпителиально-стромального дефекта роговицы кролика.

4.Результаты иммуногистохимических исследований показали, что ускорение процессов регенерации эпителиально-стромального повреждения происходит в результате реализации неспецифического механизма действия ФК, обусловленного воздействием цитокинов, факторов роста, ткане^х гормонов, продуцируемых фетальными клетками.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Впервые в офтальмологии разработаны и апробированы доза и метод введения культивированных in vitro ФК эпителия и кератобластов роговицы человека. Экспериментально-клинически, на модели эпителиально-стромального дефекта установлено, что ФК оказывают выраженный противовоспалительный, противоотечный эффект, стимулируют регенерацию эпителия и стромы роговицы и предупреждают образование грубых помутнений.

Учитывая возможность постоянно располагать донорским материалом, поддерживать запас ФК в виде культуры, а также эффективность и простоту способа введения, предложенный метод фетотерапии может найти применение в клинической практике при заболеваниях роговицы, связанных с дисфункцией клеток эпителия и стромы, замедлением репаративной регенерации, а также для предупреждения образования грубых бельм.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1.Впервые предложен метод стимуляции регенерации роговицы путем комбинированного введения культивированных фетальных клеток эпителия и кератобластов роговицы в виде инсталляций и субконъюнктивальных инъекций. Выработана оптимальная доза введения.

2.Выявлено, что ФК роговицы человека оказывают в эксперименте выраженное противовоспалительное и регенеративное действие па процесс заживления эпителиально-стромального дефекта экспериментальных животных и в отдаленные сроки ведет к более совершенным процессам перестройки новообразованной стромапьной ткани.

3.Морфологическими методами доказано стимулирующее воздействие культивированных in vitro ФК на все фазы раневого процесса при заживлении эпителиально-стромального дефекта роговицы кролика.

4.Результаты иммуногистохимических исследований показали, что ускорение процессов регенерации эпителиально-стромального повреждения происходит в результате реализации неспецифического механизма действия ФК, обусловленного воздействием цитокинов, факторов роста, тканевых гормонов, продуцируемых фетальными клетками.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные положения работы доложены: на научно-практической конференции МНИИ ГБ им. Гельмгольца «Современные лазерные технологии в диагностике и лечении повреждений органа зрения и их последствий» (Москва, 1999); на Ученом совете МНИИ ГБ им. Гельмгольца (Москва, 1999); на VII Съезде офтальмологов России (Москва, 2000); на научно-практической конференции МНИИ ГБ им. Гельмгольца «Теоретические и клинические исследования как основа медикаментозного и хирургического лечения травм органа зрения» (Москва, 2000); на Юбилейной Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию Московского научно-исследовательского института им. Гельмгольца (Москва, 2000).

ПУБЛИКАЦИИ.

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 2 -в зарубежных изданиях. Получены: 1 патент на изобретение - «Способ лечения заболеваний роговицы» № 2157675 от 20.10.2000. и 1 положительное решение о выдаче патента - «Способ лечения дефектов роговицы» по заявке № 2000102601 от 04. 02.2000.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ :

Диссертация изложена на 133 страницах, состоит из введения, 5 глав, заключения и выводов, практических рекомендаций, приложения и

выводы.

1. Впервые в офтальмологии предложен, разработан и апробирован в эксперименте новый способ комбинированного введения культивированных in vitro фетальных клеток эпителия и кератобластов роговицы человека. Определена терапевтическая концентрация и доза суспензии ФК.

2. Доказано, что суспензия фетальных клеток, содержащая 80% клеток роговичного эпителия и 20% кератобластов, вводимая в концентрации 106 кл./мл в виде инстилляций и субконъюнктивапьных инъекций не оказывает токсического действия на глаз в дозе 200 ООО кл.

3. Клинико-экспериментапьное исследование восстановления поврежденного в результате кератэктомии эпителиально-стромального слоя роговицы кролика показало: купирование признаков воспаления в опытных глазах в среднем на 3-е суток раньше, чем в контрольных; достоверно ранее начало эпителизации дефекта в опытной группе (в среднем на 1 сутки); завершение эпителизации роговицы в опытных глазах в среднем на 3-е суток раньше, чем в контрольных; формирование к 30 дню менее интенсивных помутнений. В опытной группе преобладали помутнения 3 степени, в контрольной 4-5 степени, что свидетельствует о более качественном заживлении роговицы.

4. Данные морфологических исследований подтвердили клинические результаты: применение ФК приводит к уменьшению проявлений травматического воспаления; усиливает пролиферативную активность эпителия и кератобластов и ускоряет их дифференцировку; ведет к интенсификации процесса коллагеногенеза и более совершенным процессам перестройки новообразованной стромальной ткани.

Иммуногистохимические исследования показали, что определяющую роль в индукции положительных эффектов действия ФК играют неспецифические механизмы клеточной терапии, основанные на модуляции процессов регенерации, пролиферации и дифференцировки.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Метод фетотерапии (комбинированное применение суспензии ФК роговицы в виде инстилляций и инъекций, однократная доза 200 ООО кл.) может быть рекомендован для клинической апробации при лечении эпителиально-стромальных дефектов роговицы человека.

2.Учитывая стимулирующее действие фетальных клеток на регенераторные процессы в роговице, можно рекомендовать их применение при рецидивирующих эрозиях и язвах различного генеза, сопровождающихся замедлением эпителизации, например, при ожоговой болезни глаз.

3.В связи с тем, что клинико-морфологические исследования подтвердили противоотечное и противовоспалительное действие фетальных клеток, возможно изучение их клинической эффективности при заболеваниях роговицы, сопровождающихся отеком, например, при травмах, ожогах, болезни трансплантата.

4.Поскольку в результате воздействия фетальных клеток формируется более нежная рубцовая ткань, возможно рассматривать их применение как один из методов лечения помутнений роговицы, для предотвращения грубого рубцевания при воспалительных процессах и травмах органа зрения.