Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Роль протеинкиназы РАК1 в регуляции роста эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы



На правах рукописи

Авилова Екатерина Анатольевна

Роль протеинкиназы РАК1 в регуляции роста эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы

Специальность 14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

15 СЕН 7015

Москва-2015

005562397

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Российский онкологический научный центр имени H.H.Блохи на» (директор-Д.М.Н., проф., академик РАН М.И. Давыдов).

Научный руководитель:

Красильников Михаил Александрович, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярной эндокринологии научно-исследовательского института канцерогенеза, заместитель директора по научной работе - директор научно-исследовательского института канцерогенеза федерального государственного бюджетного научного учреждения «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохнна».

Официальные оппоненты:

Сергеева Наталья Сергеевна, доктор биологических наук, профессор, руководитель отделения "Прогноза эффективности консервативного лечения" Московского научно-исследовательского онкологического института имени П.А. Герцена - филиала федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации;

Боженко Владимир Константинович, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный врач России, заведующий отделом патоморфологии и лабораторной диагностики федерального государственного бюджетного учреждения «Российский научный центр ренггенорадиолопш» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт онкологии им. H.H. Петрова" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссерт ации состоится 2015 года в ^часов на

заседании диссертационного совета Д 001.017.02 Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Российский онкологический научный центр имени НЛ.Блохнна» по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24.

С гексгом диссертации можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохнна» (115478, Москва, Каширское шоссе, 23) и на сайте www.ronc.ru

Авт ореферат разослан

2015 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 001.017.02, доктор медицинских наук, профессор

Барсуков Юрий Андреевич

Общая характеристика работы

Атуалышсть проблемы

На сегодняшний день содержание рецепторов эстрогенов (ER) относится к основным критериям определения чувствительности больных раком молочной железы (РМЖ) к гормональным противоопухолевым препаратам [М.А. Красилышкол, 2004, N. Nomiaruio et aL, 2005, R. Clarke et aL, 2003, V.C. Jordan, 2003, B.C. Герштейи и др., 2005, B.E. Henderson et al., 2003]. Ocuumioii причиной снижения эффективности гормональной терапии РМЖ является переход опухолевых клеток от эстрогензависимого к эетрогснлезаписнмому росту, что может быть обусловлено как уменьшением содержания рецептора эстрогена, так и рядом других факторов, таких как нарушение баланса между белками-активаторами и супрессорами ER, лиганд-независимая активация ER, а также стимуляция митогенных сигнальных путей, идущих в обход ER и поддерживающих тем самым рост РМЯС в отсутствие эстрогенов. Среди последних ведущее значение принадлежит реценторным тирозшисиназам. До сих пор остается неясным, какие из эффекторов тирозинкиназ шшююл ключевыми для йоддерзкания эстрогешшзависимого роста и могут ли oiui играть самостоятельную роль в развитии тормоналыгойрезистентпости РМЖ.

Одним из важнейших эффекторов тирозиикиназных рецепторов является РЛ1С (р21-активированная кшша) 1 — серии-треониновал нротеинкиназа, которая путем фософорилирования различных сигнальных бешеов участвует в регуляции кшочевых функций клетки: роста, выживаемости, организации цнтоскелета/клеточной подвижности [Z.S. Zliao, 2012]. Помимо этого, PAIC1 фосфоршшрует рецептор эстрогенов, причем независимо от лиганда, приводя тем самым к снижению гормональной зависимости ER-положительиых клеток РМЖ [A. Ghosh et al., 2013, М. ICok et al., 2011, J. Bostncr el al., 2010]. OG участии РАК в регуляции роста ER-негпгивного РМЖ известно значительно меньше, хотя о возможном включении РАК п эегрогешюзависимые сигнальные

пути косвенно свидельствует описываемая в литературе повышенная экспрессия РАК1 в ER-негативных опухолях молочной железы.

Основной темой диссертации явилось исследование внутриклеточных сигнальных, путей, ответственных за развитие гормональной резистентности злокачественных опухолей, в частности — изучение роли РАК-сигнального пути в регуляции и поддержании эстрогензавнсимого и эстрогеннезависимого роста опухолей молочной железы. Среди главных задач работы: исследование значения РАК для активации эстрогеннезавнснмых митогатых путей; изучение влияния гиперэкспресссии РАК на развитие гормональной резнстетности и анализ возможного механизма подавления РАК в эетро! еннезависнмых опухолях.

Цель исследования

Цслмо данной работы явилось изучение молекулярного механизма действия протеннкиназы РАК1 и ее роли в регуляции роста эстрогензавнсимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы.

Задачи исследования

1. Сравнительный анализ экспрессии РАК1 в клетках эстрогензавнсимого и эстрогашезависимого рака молочной железы; изучение зависимости экспрессии РАК-1 от стадии роста клеточной культуры;

2. Изучение роли РАК1 в регуляции роста клеток эстрогензавнсимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы: влияние РАК1 на рост клеток и активность митогенных сигнальных путей: AP-I, бета-катенина и Snail 1; роль a-Pix, ко-активатора РАК1, в регуляции активности клеточных сигнальных белков; влияние РАК1 на активность рецептора эстрогенов в клетках эстрогензавнсимого рака молочной железы MCF-7;

3. PAIC1 и выживаемость клеток: изучение роли РАК1 в регуляции роста меток в условиях гипоксии;

4. Анализ метилирования РАК] и его роли в регуляции дифференциальной экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы.

Научная новизна

В настоящей работе был проведен сравнительный анализ изменений экспрессии РАК1 в эстрогензависимых и эстрогеннезависимых опухолях; выявлены возможные эпигенетические причины сниженной экспрессии РАК1 в ER-позитивных клетках рака молочной железы; исследован механизм поддержания эстрогеннезависимого роста ER-негативных клеток, в том числе с участием ключевых транскрипционных факторов АР-1, бета-катенина/TCF и Snail 1; установлена роль Pix в регуляции эффектов РАК1; впервые продемонстрировано участие РАК1 в поддержании роста клеток РМЖ в условиях гипоксии. Полученные данные свидетельствуют, что РАК1 является важным фактором, участвующим в поддержании эстрогеннезависимого роста РМЖ, и позволяют рассматривать РАК1 в качестве перспективного объекта таргетной терапии рака молочной железы.

Практическая значимость работы

Были получены новые данные о роли РАК-сигнального пути в развитии и поддержании гормональной резистентности клеток рака молочной железы, что позволяет установить роль РАК1 и его эффекторов в регуляции эстрогеннезависимого роста клеток РМЖ, а также оценить перспективность таргетной терапии РМЖ, направленной на подавление РАК.

Апробация работы

Диссертация апробирована и рекомендована к защите 30 марта 2015 года на объединенной научной конференции лабораторий молекулярной эндокринологии, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, механизмов гибели опухолевых клеток, молекулярной биологии вирусов, биохимии

опухолей, цитогенетики и отдела химического канцерогенеза НИИ Канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина».

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 38 рисунков. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Список литературы содержит 286 источников.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям учёной степени кандидата биологических наук.

Личный вклад автора

Автором самостоятельно проведен анализ отечественной и иностранной литературы по изучаемой теме, разработаны протоколы и проведены эксперименты, осуществлены анализ и интерпретация результатов исследования, статистическая обработка полученных данных, формулирование выводов и оформление диссертационной работы.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12. - «онкология», конкретно пункту 2.

Основное содержание работы Обзор литературы

Первый раздел обзора литературы включает в себя современные данные о механизмах действия стероидных гормонов. Вторая часть описывает возможные пути развития гормональной резистентности РМЖ: потеря рецептора эстрогена, лиганд-независимая активация рецептора эстрогена, активация митогенных сигнальных путей, поддерживающих рост РМЖ в

б

отсутствие эстрогенов. Третий раздел литературного обзора отражает использующиеся в настоящее время подходы в терапии эстрогензависимых и эстрогеннезависимых РМЖ. Заключительные части посвящены современным представлениям о протеинкиназах семейства РАК: структуре, механизму регуляции, выше- и нижележащим эффекторам РАК1, особенностям экспрессии РАК1 в опухолях РМЖ, а также ее роли в регуляции гормональной чувствительности РМЖ. Обзор дает представление о состоянии исследования затронутой проблемы, ее актуальности и практической значимости.

Материалы и методы

В работе использовались клеточные линии рака молочной железы человека: ER-позитивная эстрогензависимая линия MCF-7 и ER-негативные эстрогеннезависимые линии: MDA-MB-231, HBL-100, SKBR-3, а также устойчивая к гипоксии сублиния MCF-7/H, полученная в результате длительного культивирования клеток MCF-7 в условиях низкого содержания кислорода.

Методы исследования: транзиторная трансфекция экспрессионных и репортерных плазмидных конструкций, а также коротких интерферирующих РНК; определение транскрипционной активности методом репортерного анализа; определение скорости роста клеток МТТ-тестом; SDS-электрофорез белков в полиакриламидном геле с последущим определением уровня экспрессии белков методом иммуноблоттинга, определение метилирования гена в культуре клеток с помощью метилчувствительной ПЦР и бисульфитного секвенирования, статистическая обработка полученных данных.

Результаты исследования и обсуждение

1. Сравнительный анализ экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы

1.1. Определение содержания РАК1 и ER методом иммуноблотинга

Целью первой части работы явилось исследование экспрессии РАК1 в различных линиях рака молочной железы, выявление возможной корреляции с ER-положительным или ER-отрицательным статусом и гормональной зависимостью РМЖ. Эксперименты проводились in vitro на клетках эстрогензависимого ER-позитивного рака молочной железы человека (линия MCF-7) и эстрогеннезависимого ER-негативного рака молочной железы (линии HBL-100, MDA-MB-231, SKBR-3), культивируемых в стандартных условиях, описанных выше. Анализ содержания РАК1 и ER проводился методом иммуноблотинга с использованием моноклональных антител к РАК1 и а-тубулину (рис. 1).

a MCF-7

□ нвыоо

MCF-7 HBL-100 ЛИ5А SKBR-3

Pakl

тубулин

□ MDA-MB-231

Рисунок 1. Экспрессия РАК1 в клетках MCF-7, HBL-100, MDA-MB-231, SKBR-3.

Результаты иммуноблотгинга и денситометрии, выполненной в программе ImageJ; за 1 принимали значение показателя в линии MCF-7.

Определение уровня РАК1 выявило его высокое содержание в эстрогеннезависимых ER-негативных клеточных линиях РМЖ (HBL-100, MDA-MB-231, SKBR-3) по сравнению с клетками эстрогензависимой ER-позитивной линии MCF-7. Полученные результаты согласуются с данными других исследователей, демонстрировавших повышенный уровень РАК1 в ER-отрицательных клетках РМЖ, в то время как в ER-положительных он практически отсутствовал [С. Holm et al., 2006], а также с результатами

исследования клинических образцов, показавших гиперэкспрессию РАК1 более чем в 50% случаев РМЖ [S. Balasenthil et al„ 2004].

1.2. Изучение зависимости экспрессии РАК1 от плотности клеточной культуры

Для определения зависимости экспрессии РАК1 от стадии роста клеточной культуры клетки MCF-7, HBL-100 и MDA-MB-231 рассеивали в 3-х исходных вариантах таким образом, что к моменту снятия плотность клеток составляла 60, 80 и 100 % от максимального монослоя. Иммуноблотинг образцов проводили с антителами к РАК1 и а-тубулину (рис. 2).

MCF-7 HBL-100 MDA-MB-231

КОЛ-ВО клеток 20 35 70 20 35 70 20 35 70 на лунку, х 10г ___

Рисунок 2. Влияние плотности клеточной культуры на уровень PAK I в клетках MCF-7, HBL-100, MDA-MB-231. Результаты иммуноблоттинга.

Как видно из полученных данных, экспрессия РАК1 практически не изменялась в зависимости от плотности клеточной культуры и, следовательно, различия в экспрессии РАК1 между отдельными линиями сохранялись на любой стадии роста клеток (рис.2).

Для большинства последующих экспериментов были выбраны две линии клеток, максимально различающиеся по степени экспрессии РАК1: с низким уровнем РАК1 (ER-позитивная линия клеток MCF-7) и с максимально высоким уровнем РАК1 (ER-негативная линия клеток HBL-100).

2. Роль РАК1 в регуляции роста клеток эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы

Для определения роли РАК1 в регуляции роста клеток рака молочной

железы мы исследовали особенности роста клеток РМЖ при подавлении РАК1,

9

а также влияние РАК1 на некоторые эффекторы, задействованные в передаче митогенного сигнала в клетках РМЖ, в частности АР-1. бета-катенин и Snail.

2.1. Влияние РАК1 на рост клеток

Для изучения участия РАК1 в регуляции клеточного роста клетки MCF-7 и HBL-100 культивировали на 24-луночных планшетах в присутствии специфического ингибитора РАК 1 - IPA-3 в концентрации 10 мкМ в течение 3 суток, с последующим определением количества выживших клеток.

Результаты показали, что ингибитор РАК 1 IPA-3 приводит к торможению роста клеток, значительно более выраженному в ER-негативной линии HBL-100 по сравнению с ER-позитивной линией MCF-7, что свидетельствует об активном участии РАК1 в поддержании эстрогеннезависимого роста клеток (рис. 3) .

Рисунок 3. Влияние ингибитора РАК1 - IPA-3 в концентрации 10 мкМ на рост клеток MCF-7 и HBL-100.

2.2. Влияние РАЮ на активность митогенных сигнальных путей

Для дальнейшего изучения механизма рост-стимулирующих эффектов РАК1 исследовалось его влияние на активность митогенных транскрипционных факторов: АР-1, бета-катенина и Snail 1. Был применен метод репортерного анализа, позволяющий оценить транскрипционную активность факторов по их способности взаимодействовать со специфическими участками связывания на ДНК и активировать экспрессию гена-репортера люциферазы.

Для изучения роли РАК1 в регуляции активности АР-1 проводилась котрансфекция эстрогензависимых ER-положительных клеток MCF-7 и эстрогеннезависимых ER-отрицательных клеток HBL-100 плазмидными конструкциями, содержавшими дикий вариант гена РАК1 (контроль - пустой вектор CMV6), ген люциферазы под контролем АР-¡-чувствительного промотора (API/Luc), а также плазмидой с геном Р-галакгозидазы (для контроля эффективности трансфекции). Для исследования роли РАК1 в регуляции бета-катенина были использованы клеточные линии: MCF/TCF и HBL/TCF (клеточные линии MCF7 и HBL-100, стабильно экспрессирующие репортерную конструкцию, содержащую ген люциферазы под контролем TCF/LEF-промотора, чувствительного к бета-катенину), которые также были котрансфицированы плазмидами с диким вариантом гена РАК и Р-галакгозидазой.

X С i & 2 . * "о

Л =>

MCF-7

SCMV6 Q wtPAKI

HBL-100

1 tt л S

a 1

0 o * *

JE —i

ar O

1 i

8¿

X

as

Л-,

¡¡¡Я

fe ■

MCF-7

EJCMV6 O wtPAKI

HBL-100

Рнсунок 4. Влияние трансфекции PAK1 на транскрипционную активность АР-i (а) и Р-катенина (б). Результаты репортерного анализа.

Мы обнаружили, что гиперэкспрессия РАК1 приводит к выраженной стимуляции транскрипционной активности АР-1 и бета-катенина, причем в обеих линиях клеток: MCF-7 и HBL-100 (рис.4). Полученные результаты согласуются с литературными данными о роли РАК1 в стимуляции клеточного цикла и пролиферации [L.E. Arias-Romero et al., 2010, L.E. Arias-Romero et al., 2008, Z. Wang et al., 2013].

Последним из митогенных белков был исследован транскрипционный фактор Snail 1, один из ключевых белков эпителиально-мезенхимального перехода [V. Stemmer et al., 2008], повышенная экспрессия которого характерна для многих эстрогеннезависимых опухолей молочной железы, в том числе - для клеток HBL-100 [A.M. Scherbakov et al., 2013]. Примечательно, что фосфорилирование и активация Snail 1 регулируются с участием РАК1-сигнального пути [Z. Yang et al., 2005].

Клетки MCF-7 и HBL-100 трансфицировали плазмидными конструкциями, содержавшими дикий вариант гена РАК1, ген-репортер люциферазы под контролем Snail 1-чувствительного промотора (E-cad/Luc) и ß-галактозидазу. Результаты репортерного анализа показали, что РАК1 стимулирует трансрепрессорную активность Snail 1, определяемую по степени подавления экспрессии репортерного гена E-cad/Luc [Е. Batlle et al., 2000], но только в ER-негативных клетках HBL-100, тогда как в клетках MCF-7 активность Snail-1 практически не менялась (рис.5).

л ч

п ф

a d

ш о

•fr * ?

2 i с; -о л га

ь V 8 Щ.

SCMV6

DwPAKI

ел Hfl ■ gig IIU Им имя..........

MCF-7 HBL-100 Рисунок 5. Влияние трансфекшш РАК1 на транскрипционную активность SnaHl.

Проведенный нами генетический нокдаун Snail 1 в присутствии малых интерферирующих РНК приводил к значительному, более чем в 2 раза, снижению скорости роста ER-негативных клеток HBL-100, свидетельствуя о важной роли, которую играет Snail 1 в регуляции роста эстрогеннезависимых клеток (рис. 6).

s si-scrambled □ si-Snail1

■

HBL-100

Рисунок 6. Влияние si-Snaill на скорость роста клеток HBL-100.

Таким образом, на этом этапе работы было продемонстрировано участие РАК1 в регуляции эстрогеннезависимош роста клеток РМЖ, в том числе через активацию митогенных сигнальных путей: АР-1, ß-катенин и Snaill.

2.3. Роль a-Pix, ко-активатора РАК1, в регуляции активности клеточных сигнальных белков

Мы исследовали роль ко-активатора РАК1 - PIX, в регуляции митогенных сигнальных путей. Регуляция активности РАК1 происходит путем присоединения малых Rho- ГТФаз: Racl и Cdc42, переведенных с помощью гуанин нуклеотид-обменных факторов (GEF) в ГТФ-связанную активную форму, таким GEF-фактором для РАК1 является PDC, в частности, a-Pix. Ранее было показано, что РАК1, несмотря на то, что он является «downstream» эффектором a-Pix-Racl(Cdc42), в то же время фосфорилирует a-Pix по серину в 488-м положении [U.E. Rennefahrt et al., 2007]. Значение такого фосфорилирования для клетки до сих пор изучено не было. Мы предположили, что данное фосфорилирование может определять митогенные эффекты РАК1, в том числе влияние РАК1 на активность транскрипционных факторов АР-1, бета-катенина и Snaill. Действительно, было обнаружено, что трансфекция а-Pix-coдержащей плазмиды в клетки MCF-7 и HBL-10 приводит к активации бета-катенина (рис. 76), но никак не влияет на транскрипционную активность АР-1 (рис. 7а).

ecMV6

® a-Pix-wt

rb

.-100

Рисунок 7. Влияние трансфекцни a-Pix на транскрипционную активность AP-l -о; р-катенина -б. Результаты репортерного анализа.

С помощью репортерного анализа мы показали, что a-Pix стимулирует трансрепрессорную активность Snaill, но только в ER-негативных клетках HBL-100 (рис. 8а), что согласуется с данными, полученными нами ранее в отношении РАК1. Для исследования роли РАК 1-зависимого фосфорштирования a-Pix в регуляции Snail была использована мутантная форма a-Pix, в которой серин в 488-ом положении был заменен на аланин (a-Pix-A), что препятствует фосфорилированию киназой РАК1. Оказалось, что, если трансфекция a-Pix дикого типа приводит к повышению трансрепрессорной активности Snaill, то замена 488-го серина на аланин блокирует этот эффект, возвращая трансрепрессорную активность Snaill практически к исходному уровню (рис. 8(5).

о ч:

■9-2 2 * А а

I1

MCF-7

HCMV6

2

D 0-PiX-Wt

I .11

нвыоо

о

п

0 и

-9- >" s ~ =r а

s м = S

5 в

И

1

S

ь №

о

о

(V

MCF-7

Нв£

KCMV6 О a-Pix-wt

л ч

О <Ц

з. d

© о f * f 3

с В

ё? Н ш

ш

3 §

я

scMve

ED a-Pix-wt ■ a-Pix-А

Ш111

¡¡¡If

К

1

MCF-7

HBL-100

HBL-100

Рисунок 8. Влияние траисфекдии a-Pix на транскрипционную активность Snail I - а; роль РАК-зависимого фосфорилирования a-Pix по S488 в активации Snail - б. Результаты репортерного анализа.

Полученные данные свидетельствуют о важной роли РАК 1-зависимого фосфорилирования a-Pix (S488) в стимуляции трансрепрессорной активности Snail 1.

2.4. Влияние РАК1 на активность рецептора эстрогенов в клетках эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7

Мы изучали возможные изменения содержания ER при трансфекции в клетки MCF-7 плазмиды РАК1 или при действии на клетки специфического ингибитора РАК1 - IPA-3. Результаты иммуноблоттинга образцов показали, что трансфекция РАЮ приводит к заметному увеличению экспрессии ER в клетках MCF-7; при добавлении IPA-3 экспрессия ERa возвращается к исходному уровню (рис. 9).

Control

Pakl+IPA

Рисунок 9. Экспрессия ЕЯа в клетках МСР-7 при трансфекции РАК1+/- 1РА-3. Результаты иммуноблоттинга и денситометрии, выполненной в программе Ги^е!: за 1 принимали значение показателя в контроле. 15

Аналогичные данные были получены относительно влияния РАК1 на транскрипционную активность ER, для определения которой применялся репортерный анализ с использованием гена-репортера люциферазы под контролем эстроген-респонсивного элемента (ERE) (ERE/Litc). Мы продемонстрировали, что гиперэкспрессия РАК1 приводит к стимуляции активности ER, а подавление РАК1 в присутствии IPA-3 сопровождается ее снижением (рис. 10).

□ контроль ■ WPAK1 и IPA-3

3 et S

" О) (Ч

-

2 = о

с ш S fi ОС г

R В.

MCF-7

Рисунок 10. Анализ транскрипционной активности ЕЯ после трансфекции РАК1 или действия ингибитора РАК11РА-3 в клетках МСР-7. Результаты репортерного анализа.

В целом, полученные данные показали, что рост-стимулируюшее действие РАК1 на клетки ER-позитивного РМЖ ассоциировано как со стимуляцией канонических митогенных сигнальных путей: АР-1 и р-катенин, так и с активацией эстрогенового сигналннга.

3. РАК1 и выживаемость клеток: роль РАК1 в регуляции роста клеток в условиях гипоксии

Выше отмечалось, что ER-негативные клетки РМЖ характеризуются

высоким уровнем экспрессии РАК1 [С. Holm et al., 2006] и Snaill [A.M.

Schevbakov et al., 2013], в то время как ER-позитивные клетки, напротив, имеют

низкий уровень экспресии этих белков. Вероятно, причина низкого уровня

экспрессии РАК1 и Snaill в ER-положительных клетках может быть связана с

16

особенностями внутриклеточного сигналинга, ответственного за негативный контроль этих белков. Одним из механизмов такой негативной регуляции является подавление рецептором эстрогенов активности Snaill через ER-зависимую активацию специфического белка-супрессора Snaill - МТАЗ [А. Dhasarathy et al., 2007, N. Fujita et al„ 2003].

В наших исследованиях мы продемонстрировали активацию рецептора эстрогенов под действием РАК1, что можно рассматривать в качестве одного из факторов, ограничивающих уровень Snaill в ER-позитивных клетках РМЖ.

Участие РАК1 в поддержании роста клеток MCF-7 было продемонстрировано в экспериментах с IPA-3, специфическим ингибитором РАК1: оказалось, что добавление IPA-3 существенно снижает скорость роста клеток MCF-7. Для дальнейшего изучения протективной роли РАК1 и путей его физиологической регуляции в клетках РМЖ xn,i исследовали активность РАК1 в клетках MCF-7 в условиях гипоксии.

3.1. Сравнительный анализ чувствительности к гипоксии клеток MCF-7 и HBLi-100 (эксперименты выполнены совместно с В.А.Шатской)

Эксперименты проводились in vitro на клетках эстрогензависимого рака молочной железы человека MCF-7 и эстрогеннезависимого ER-негативного рака молочной железы линии HBL-100. Анализ скорости роста клеток после перевода в условия гипоксии (1% 0;) показал резкое снижение роста клеток MCF-7 при сохранении относительно устойчивой пролиферации ER-негативных клеток HBL-100 (рис. 11). Как уже отмечалось, клетки HBL-100 отличаются высоким уровнем РАК1, что позволило предположить участие последнего в регуляции чувствительности клеток к гипоксии.

в контроль Ш ruiioKciiM, 1%02

MCF-7

HBL-100

Рисунок 11. Сравнительный анализ чувствительности к гипоксии клеток МСР-7 и НВЬ-100.

3.2. Роль РАК1 в адаптации клеток МСР-7 к гипоксии

Участие РАК1 в ответе клеток на гипоксию было подтверждено в экспериментах по сравнительному анализу содержания РАК1, показаших выраженное увеличение экспрессии РАК1 в клетках МСР-7 в условиях острой гипоксии (1% Ог, 18 час) (рис.12).

Ш контроль

контроль гипоксия гипоксия 6 час 24 час

Рак1

tubulin

□ тткаы 6 ч

□ пш<жши 24 н

Рисунок 12. Влияние острой гипоксии на содержание РАК1 в клетках МСР-7. Результаты иммуноблотгинга и денситометрии, выполненной в программе 1таце1; за 1 принимали значение показателя в контроле.

В какой мере РАК1 участвует в поддержании роста клеток при гипоксии -для ответа на этот вопрос следующая серия экспериментов была проведена на клетках МСР-7, культивированных в условиях хронической гипоксии. Для моделирования условий хронической гипоксии клетки эстрогензависимого рака молочной железы МСР-7 культивировали в атмосфере с пониженным (до 1%)

содержанием кислорода в течение 30 сут. Ранее мы продемонстрировали, что если острая, в течение 3 сут, гипоксия вызывает значительное торможение клеточной пролиферации, то на фоне хронической гипоксии торможение роста оказывается существенно меньшим. Полученная в условиях хронической гипоксии сублиния клеток получила название МСР-7/Н; в предыдущих работах мы показали, что подобная толерантность к гипоксии может сохраняться в течение не менее 60 суток после возвращения клеток в среду с нормальным содержанием кислорода [Д.В.Сорокин и др., 2015].

Было установлено, что базальный уровень РАК1 в клетках МСР-7/Н значительно выше, чем в МСБ-7 (рис. 13).

MCF-7 MCF-7/H

Pakl I

mbiiiin

В MCF-7 О MCF-7/H

Рисунок 13. Сравнительный анализ содержания РАК] в клетках MCF-7 и MCF-7/H. Результаты иммуноблоттинга и денситометрии. выполненной в программе ImageJ; за 1 принимали значение показателя в в линии MCF-7.

Подавление РАК1 в клетках MCF-7/H в присутствии IPA3 приводит к увеличению чувствительности клеток к гипоксии (рис. 14).

Вконтроль гипоксия 1%

-IPA

+ГРА

Рисунок 14. Влияние IPA-3 на чувствительность к гипоксии клеток MCF-7/H. Результаты МТТ теста.

Для дальнейшего изучения механизма протективного действия РАК1 в условиях гипоксии был проведен анализ влияния РАК1 на активность НИМ, одного из ключевых факторов, индуцируемых в условиях гипоксии. С помощью репортерного анализа с использованием плазмиды НЯЕ/Ьис, содержавшей ген люциферазы под контролем гипоксия-респонсивного элемента (ЕЖЕ), мы обнаружили, что трансфекция РАК1 в клетки приводит к увеличению транскрипционной активности Н№-1 на фоне острой гипоксии, демонстрируя непосредственное участие РАК1 в активации ЮТ-1-сигнальных путей (рис. 15).

Рисунок 15. Влияние трансфекции \vPAKi на транскрипционную активность НИМ.

Результаты репортерного анализа.

Как уже отмечалось, подобный протективный эффект РАК1 характерен и для клеток ЕЯ-негативного рака молочной железы: так, исследованные нами ЕЯ-негативные опухоли молочной железы отличались повышенной конститутивной экспрессией РАК1 и высокой чувствительностью к антипролиферативному действию 1РА-3. Таким образом, гиперэкспрессия РАК1, как приобретенная (в случае клеток МСР-7/Н), так и конститутивная (в случаях ЕЯ-негативных опухолей) может выступать в роли одного из факторов, поддерживающих автономный рост и выживаемость клеток.

Л

□ контроль

О \vPakl

-а £

Норма Гипоксия

4. Метилирование РАК1 и его роль в регуляции дифференциальной экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы

В качестве одного из вероятных путей регуляции РАК1 в клетках опухолей молочной железы мы исследовали возможность метилирования/ деметилирования специфических цитозин-гуанин богатых участков гена, располагающихся в 5'-регуляторных регионах [X. Zhang et al., 2013, С. Yi et al., 2008, Н.П. Киселева и др., 2007] и определяющих эффективность экспрессии РАК1.

Был проведен сравнительный анализ метилирования промотера гена РАК1 в клетках MCF-7 и HBL-100 методом метичувствительной ПЦР, основанной на использовании метилчувствительных рестриктаз, которые разрезают ДНК по определенным сайтам при отсутствии в них метилированных цитозинов; в результате последующая ПЦР соответствующего фрагмента ДНК будет приводить к образованию продукта только в случае метилирования сайтов рестрикции. Применение двух независимых метилчувствительных рестриктаз (Hpall и Hhal) продемонстрировало наличие метилирования гена РАК1 в клетках MCF-7 и его отсутствие в клетках HBL-100 (рис. 16).

a MCF-7 Hbl-100

Hpall

MCF-7

Hbl-100

Рисунок 16. Анализ метилирования промотора РАК! методом метипчувствительной ПЦР. а)

ПЦР после рестрикции Нра11. Определяются два фрагмента, верхний соответствует промотору РАК!, нижний - внутреннему контролю СЦХ1; б) ПЦР после рестрикции НЬа1. Определяется один фрагмент, соответствующий промотору РАК1. В клетках МСР-7 рестрикции ДНК не происходит из-за метилирования цитозинов в Св-динуклеотидах, синтез фрагмента РАК! сохраняется. В клетках НВЬ-100 происходит рестрикция ДНК, фрагмент с промотора РАК1 не синтезируется.

Полученные данные были подтверждены с помощью бисульфитного секвенирования, в основе которого лежит бисульфитная конверсия неметилированного цитозина в тимин (рис. 17).

6САОТТССССТСТССТСА66ССАОССС|СССА|С60САС|6|С6|С0106|СССАОСА60 САОАААСТ6ААС|ССТАССТ|6|ОСАСАСТЙ5ЁССССТСАСТССЙООСТАСС|СОСАССС АС|БС|ввеА66АС6АС6АССАСС|бА6АбеАССТОА<^САб|с|б6ААСОТ6АвАО|бе бсстАс|эсссАвтАссест|бШстсс|б0бст(ЗССАе0<зствссс|е|б0беетбСббА §5в6Т96А5ТС06СЭТСТ0С0СССАТ

НВ1. 100

Рисунок 17. а) Нуклеотидная последовательность Срв-островка, расположенного в промоторной области РАК! Цветом выделены метилированные цитозины, которые не изменяются в результате бисульфитной конверсии, б) Бисульфитное секвенирование промотора РАЮ в клетках НВЬ-100 и МСР-7. Результаты метил-специфического секвенирования СрС-островка, расположенного в промоторе РАК1 в культурах клеток НВЬ-100 и МСР-7. Метилированный цитозин обнаруживается только в промоторе РАК1 клеток

МСР-7.

Вместе с тем, аналогичное исследование метилирования РАК] в клетках МСР-7/Н не выявило существенных изменений в уровне метилирования РАК1 -несмотря на увеличение содержания РАК1 в клетках МСР-7/Н по сравнению с клетками МСР-7 (рис.18).

МС¥11Н

Рисунок 18. Бисульфитное секвенирование промотора РАК1 в клетках МСР-7/Н .

Каков механизм активации РАК1 в случае клеток МСР-7/Н - остается до

конца непонятным, скорее всего подобная активация РАК1 может быть

результатом действия определенных сигнальных белков — позитивных

22

регуляторов РАК1. Мы предполагаем, что в качестве таких регуляторов могут выступать белки, ассоциированные с гипоксией, в том числе - HIF-1. Учитывая описанную выше способность РАК1 стимулировать активность HIF-1, можно предположить, что эти белки связаны положительными регуляторными связями, которые и обеспечивают конститутивное повышение их уровня при хронической гипоксии.

Заключение

На сегодняшний день основным критерием определения чувствительности к гормональным противоопухолевым препаратам является содержание рецепторов эстрогенов [М. А. Красильников, 2004, N. Normanno et al., 2005, R. Clarke et al., 2003, V.C. Jordan, 2003, E.C. Герштейн и др., 2005, B.E. Henderson et al., 2003]. Однако, гормональная резистентность может развиваться и при сохранении ER: в результате дисбаланса белков-корегуляторов ER, лиганд-независимой активации ER, стимуляция сигнальных путей, независимых от ER и поддерживающих тем самым рост РМЖ в отсутствие эстрогенов. Развитие гормональной резистентности рака молочной железы связано с переходом опухолевых клеток от эстрогензависимого к эстрогеннезависимому росту.

В настоящей работе при исследовании факторов, регулирующих развитие гормональной резистентности клеток рака молочной железы, мы продемонстрировали участие серин-треониновой протеинкиназы РАК1 в поддержании эстрогеннезависимого роста опухолевых клеток. Мы установили, что подобные митогенные эффекты РАК1 ассоциированы со стимуляцией ключевых сигнальных путей опухолевой клетки: МАРК/ АР-1 каскада, WNT-P-катенинового пути, Snail 1-сигнального пути. Продемонстрировано, что для реализации действия РАК1 ключевым фактором является фосфорилирование а-Pix, ко-активатора РАК1, по серину в положении 488. Показано значение РАК1-сигнальной системы в регуляции выживаемости опухолевых клеток, в том числе в условиях гипоксии.

Полученные данные легли в основу предлагаемой схемы действия РАК1 с участием его некоторых вышележащих и нижележащих эффекторов, а также значения РАК1 в поддержании роста клеток РМЖ (рис. 19).

Эстрогеннезависимый рост Эстрогензависимый рост

Рисунок 19. Роль РАК1 и его эффекторов в поддержании эстрогензависимого и эстрогеннезависимого роста рака молочной железы.

В целом, полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования РАК1 в качестве маркера развития гормональной резистентности РМЖ и потенциального объекта таргетной терапии опухолей молочной железы.

Выводы

1. Сравнительный анализ содержания серин-треониновой протеинкинаэы РАК1 в клетках культивируемых in vitro эстрогензависимой и эстрогеннезависимых линий рака молочной железы показал значительное превышение уровня РАК1 в эстрогеннезависимых сублиниях

2. Продемонстрировано, что РАК1 является одним из факторов, необходимых для поддержания роста клеток рака молочной железы, в большей степени — для роста эстрогеннезависимых опухолей молочной железы

3. Установлено, что митогенный эффект РАК1 ассоциирован со стимуляцией ключевых сигнальных путей опухолевой клетки: МАРК/ АР-1 каскада, WNT-|3-катенинового пути, Snail 1-сигнального пути. Для реализации действия РА1С1 необходимым фактором является фосфоршшрование a-Pix, ко-активатора РАК1, по серину в положении 488.

4. Продемонстрировано участие РАК1 в регуляции выживаемости клеток рака молочной железы, в частности — в условиях хронической гипоксии. Одним из возможных механизмов участия РАК1 в поддержании роста опухолевых клеток в условиях гипоксии является обнаруженная нами способность РАК1 стимулировать транскрипционную активность H1F-1, одного из основных гипоксия-зависимых протективных факторов клетки.

5. При определении статуса метилирования промотора гена РАК1 установлено, что низкий уровень РАК1 в эстрогензавиеимых линиях ассоциирован с высоким уровнем метилирования, в то время как в эстрогеннезависимых линиях, отличающихся высоким содержанием РАК1, его промотор полностью деметилирован.

6. В целом, полученные данные свидетельствуют, что эпигеномная регуляция PAIC1, в частности — метилирование ДНК, может являться одним из факторов, определяющим повышение уровня РАК1 в эстрогеннезависимых клетках рака молочной железы. Продемонстрированная нами протективная функция РАК1 позволяет рассматривать его в качестве перспективной мишени дня таргегной терапии рака моло'шой железы.

Список работ по теме диссертации п журналах, рекомендованных ВАК:

1. Авилова, 1£.А. Значение протеинкнназы РАК1 в регуляции эстрогецнсзшисимого роста клеток рака молочной железы / ЕА Авилова, ОЛ. Андреева, В А. Шатская, М.А. Красильннкоп // Биомедицинская химия — 2014. — Т. 60, №3 — С.322-331 (статья также опубликована в английском переводе в Biochemistry (Moscow) Supplement Series В: Biomedical Chemisuy (Avilova, E.A. The Role of Protein Kiuase PA1C1 in the Regulation of Estrogen-Independent Growth of Breast Cancer Protein Kiija.se Pakl and Breast Cancer / E.A. Avilova, OJL Andreeva, V.A. Shatskaya, M.A. Kiasil'nikov // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry- 2015. - VoL 9 - No. 1 - P. 58-62).

2. Авилова, ЕА. Метилирование PAK1 в клетках опухолей молочной железы / Е.А. Авилова, Е.Б. Кузнецова, М.В.Немцова, А.М.Щербаков, В.А. Шатская, М.А. Красильннков // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии — 2015. — № 5 — С. 39-46.

Тезисы конферепцнн:

1. Авилова, Е.А. Роль PAKl-a-Pix-сигнальиого пути в регуляции роста онухолевыл клеток/ Авилова ЕА. // Биология — наука XXI иска: 19-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых Сборник тезисов. Пущило, 2015,—2015.— С. 215.

2. < aiij.üus, ЕА. Foj» PAKl-сигаалыюго пути в развитии гормональной резистентности клеток рака молочной железы / ЕА Авилова, O.E. Андреева, В.А. Шптская, М.А. Красильннкоп // 1-й Российский онкологический научно-образовательный форум с международным участием «Белые Ночи —2015». Сборник тезисов. М., 2015,— С. 418.

3. Авилова, ЕА. РА1С1 и выяшваемость клеток: роль PAICI в регуляции роста клеток в условиях гипоксии / ЕА. Авилова, В.А. Шатская, М.А. Красилышкои // 1-й Российский онкологический научно-образовательный форум с международным участием <сБелые Ночи — 2015». Сборник тезисов. М., 2015. - С. 419.

4. Сорокин, Д.В. Молекулярные механизмы регуляции' чувствительности клеток рака молочной железы к противоопухолевым агентам в условиях гипоксии / Д.В. Сорокин, С.Е. Семина, ЕА. Авилова, И.А. Якушина, МА. Красильннкоп // Экспериментальная и фундаментальная онкология -2014.-С. 123.

Подписало в печать 25 6-15 Формах 60x84/16.

. Бумага офисная «SvetoCopy». Тираж 100 экз. Заказ № ? 1 7 Отпечатано на участке множительной техники ФГБНУ «РОНЦ им. Н-Н-Блохипа» 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24