Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Модуляция метастатической активности клеток сирийского хомяка экзогенными онкогенами семейства Ras

На правах рукописи

МАРТЫНЮК АННА ВАСИЛЬЕВНА

Модуляция метастатической активности клеток сирийского хомяка экзогенными онкогенами семейства Ras

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА -

2006

Работа выполнена в ГУ Российский Онкологический научный центр им.Н.Н.Блохина Российской академии медицинских наук

Научные руководители: кандидат биологических наук Елена Максимовна Чевкина

доктор биологических наук, профессор

Александр Георгиевич Татосян

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ Богуш Татьяна Анатольевна

доктор биологических наук Калинина Наталья Олеговна

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится Лл>^р06 г. в часов на заседании Специализированного Совета (К.001.17.01) ГУ РОЩ им. H.H. Блохина РАМН по адресу 115478, г. Москва, Каширское шоссе, д.24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. , / .илМ^^

Автореферат разослан "2JL" -tXjy^ ' 2006 г. Ученый секретарь

специализированного диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Ю.А'. Барсуков

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность проблемы

Метастазирование - одно из опаснейших свойств злокачественных опухолей, являющееся основной причиной смертности от онкологических заболеваний.

Способность клетки к метастазированию - это результат отбора в популяции опухолевых клеток в процессе опухолевой прогрессии. Клетки должны приобрести способность выжить в условиях гипоксии, прорасти опухолевую массу, кровеносные и/или лимфатические сосуды, выйти в кровеносное русло, избежать гибели от иммунного ответа, прикрепиться к ткани во вторичном очаге и сформировать вторичный опухолевый узел.

На сегодняшний день имеется огромное количество данных о молекулярных механизмах отдельных составляющих этого процесса, однако они в значительной степени противоречивы. В этой связи особенно актуальным представляется использование биологических моделей, позволяющих изучать метастазирование как комплексный физиологический феномен in vivo.

Чрезвычайно перспективным представляется изучение клеточных линий одного происхождения, но с различным метастатическим потенциалом. Одной из таких моделей является коллекция клеточных линий эмбриональных фибробластов сирийского хомяка (Mesocricetus auratus Water/i), трансформированных вирусом саркомы Рауса и спонтанно трансформированных in vitro. Особенно актуальна возможность исследования метастазирования in vivo на иммунокомпетентных животных.

В изучении метастазирования большую роль играет выявление механизмов, определяющих опухолевую прогрессию.

Гены, кодирующие белки Ras, мутируют в 15% всех типов человеческих опухолей, при этом в большинстве опухолей обнаружены мутации только в одном из генов семейства Ras (Almoguera С. et al., 1988).

В настоящее время накопилось большое число работ, посвященных роли Ha-Ras в злокачественной трансформации клеток. Однако механизм его влияния на метастазирование до сих пор не ясен.

Более того, конкретные механизмы и роль отдельных эффекторов Ha-Ras в метастазировании варьируют в зависимости от используемых моделей. Получение разных результатов в разных моделях может зависеть от тканеспецифичности, видоспецифичности используемых моделей, а также от того, какой именно ген Ras использовался для модуляции метастазирования.

Вместе с тем, согласно литературным данным, среди представителей семейства Ras на метастазирование в наибольшей мере влияет Ha-Ras (Maruyama С. étal, 2001; Moon A. étal, 2000; Schlatter В. étal, 1992).

Настоящее исследование позволило углубить знания о механизмах канцерогенеза, вклада Ha-ras- и Ral- ассоциированных сигнальных путей в формирование метастатического потенциала клетки.

1.2 Цель и задачи исследования

Целью данной работы является анализ влияния Ha-ras на метастатическую активность трансформированных фибробластов сирийского хомяка и идентификация сигнальных путей, осуществляющих это влияние.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Трансфекция низкометастазирующих RSV (Rous Sarcoma Virus)-трансформированных фибробластов сирийского эффекторными хомяка мутантными вариантами активированного Ha-ras (Ha-rasV12, Ha-rasVl2G37, Ha-rasV12S35, Ha-rasV12C40) и сравнительный анализ метастатической активности полученных трансфектантов.

2. Трансфекция спонтанно трансформированных и RSV-трансформированных линий фибробластов хомяка активной формой RalA. Трансфекция высокометастазирующих спонтанно трансформированных и RSV-трансформированных линий фибробластов хомяка доминантно негативной формой RalA. Сравнительный анализ метастатической активности полученных линий.

4. Сравнительный анализ молекулярно-биологических характеристик полученных линий: подвижности клеток, скорости пролиферации, способности к инвазии in vitro и колониеобразования.

5. Определение в полученой панели клеточных линий экспрессии белков S100A4, фосфо-паксилина, Erkl/Erk2, циклина D1.

6. Определение уровня секреции матриксных металлопротеиназ в исследуемых клеточных линиях.

7. Определение устойчивости исследуемых клеточных линий к перекиси водорода а также способности катаболизировать перекись водорода.

1.3 Научная новизна

Предыдущие исследования влияния Ha-Ras на метастатический потенциал клеток показали, что в мышиных клетках основным звеном, опосредующим вклад Ha-Ras в метастазирование, является Raf киназа (Cowley S.etal, 1994).

В данной работе впервые показано, что активация онкогена Ha-ras существенно увеличивает метастатическую активность RSV-трансформированных фибробластов сирийского хомяка, причем основной вклад вносит Ha-ras/Ral-GDS/Ral-ассоциированный сигнальный путь.

Показано, что в клетках сирийского хомяка стимуляция Raf-ассоциировапного сигнального пути не приводит к увеличению метастатической активности.

Обнаружено, что экспрессия конститутивно активной формы RalA достоверно увеличивает метастатическую активность как вирус-трансформированных, так и спонтанно трансформированных линий эмбриональных фибробластов хомяка.

Впервые показано, что приобретение высокометастатического фенотипа в ходе селекции RSV-трансформированных клеток in vivo ассоциировано с увеличением количества активной формы RalA.

Показано отсутствие зависимости между метастатическим потенциалом исследуемых клеток и уровнем активности матриксных металлопротеиназ 1, 2 и 9 типов. При этом обнаружено, что экспрессия экзогенной активной формы RalA приводит к снижению уровня экспрессии исследуемых металлопротеиназ.

Показано, что метастатическая активность клеток коррелирует с устойчивостью клеток к перекиси водорода.

Получена уникальная модельная система клеточных культур, экспрессирующих экзогенные последовательности различных мутантных вариантов белков Ha-Ras и RalA, и отличающиеся по метастатическим характеристикам in vivo. На данной модели показана возможность обратимой регуляции метастазирования. Дальнейшие эксперименты с полученными линиями позволят пролить свет на механизмы реализации Ha-Ras- и RalA-опосредованной модуляции метастазирования в клетках RSV-трансформированных и спонтанно трансформированных фибробластов сирийского хомяка.

1.4. Научно - практическая значимость работы

Научно - практическая значимость полученных результатов состоит в том, что на экспериментальной модельной системе была определена роль генов Ha-ras и RalA в метастазировании и выявлен ряд механизмов, ассоциированных с опухолевой прогрессией. Лучшее понимание механизмов

метастазирования позволит в дельнейшем разработать стратегию производства новых лекарственных препаратов для лечения онкологических заболеваний и выявить специализированные маркеры, ассоциированные с метастазированием.

Кроме того, существенное значение имеет получение экспериментальной модели, позволяющей обратимо регулировать уровень метастатической активности клеток.

1.5. Апробация работы

Диссертационная работа была доложена 30 сентября 2005 года на совместной конференции лабораторий регуляции клеточных и вирусных онкогенов, молекулярной биологии вирусов, иммунологии онкогенных вирусов, цитогенетики, генетики опухолевых клеток НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Материалы работы были доложены на симпозиуме «Рак, СПИД и родственные проблемы», Санкт-Петербург, 2003, конференции Molecular Mechanisms in Signal Transduction and Cancer, Greece, 2005.

По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы.

1.6. Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения собственных результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 125 страницах машинописного текста, включают 26 рисунков, 12 таблиц и список литературы из 249 источников.

2. Содержание работы

2.1. Обзор литературы

Обзор литературы посвящен обобщению данных о роли ГТФаз семейства Ras в прогрессии опухолей и метастазировании. Описаны известные

молекулярно-генетические механизмы различных процессов, сопряженных с метастазированием.

2.2. Материалы и методы исследования

В работе были использованы следующие методы исследования: трансформация бактериальных клеток, выделение и анализ плазмидной ДНК из бактериальных клеток, электрофорез нуклеиновых кислот, трансфекция, лентивирусная и ретровирусная инфекция клеток млекопитающих, выделение и анализ белковых фракций клеток млекопитающих (иммуноблотинг), иммунопреципитация активной формы ГТФазы RalA, желатиназная зимография в ПААГ, а также определение отдельных свойств клеток в культуре, таких как динамика роста, интенсивность катаболизации перекиси водорода in vitro, устойчивость к перекиси водорода, скорость миграции в рану в монослое (wound healing assay), способность к инвазии in vitro, колониеобразование, анализ туморогенности, спонтанной и экспериментальной метастатической активности (СМА и ЭМА). Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью пакета статистических программ GraphPad Prism ver.4.0. Для сравнения двух групп использовался двухсторонний критерий Стьюдента с поправкой Ньюмана-Кейлса, для сравнения нескольких групп использовался дисперсионный анализ (ANOVA) с поправкой Даннетта.

В качестве экспериментальной модели для данного исследования использовались линии эмбриональных фибробластов сирийского хомяка, трансформированные штаммом Шмидт-Руппин D вируса саркомы Рауса и спонтанно трансформированные in vitro. Эти линии были получены в лаборатории противоопухолевого иммунитета РОНЦ РАМН под руководством д.м.н. Г.И. Дейчман (Deichmann G.I. et al, 1989). В работе были использованы следующие родительские линии:

HET-SR — RSV-трансформированные клетки, высокая ЭМА, низкая

СМА.

HET-SR8 - RSV-трансформированные клетки, высокая ЭМА, высокая

СМА.

ÍÍET-SR2SC - производная линии клеток HET-SR, полученная в процессе селекции in vivo. Высокая ЭМА, высокая СМА. Для ее получения клетки линии HET-SR вводили животным подкожно, после образования первичной опухоли отбирали клетки из метастазов в лимфоузлы, снова вводили подкожно и из метастазов в региональные лимфоузлы получили данную линию.

STHE - спонтанно трансформированные в культуре in vitro клеткиэмбриональных фибробластов хомяка, низкая ЭМА, низкая СМА.

STHE83/20 — производная линии STHE, полученная в процессе селекции in vivo. Получена из легочных метастазов, образовавшихся через 20 дней после внутривенного (внутриорбитального) введения клеток STHE. Высокая ЭМА, высокая СМА.

STHELNM8 — производная линии STHE, полученная из метастаза в легком, образовавшегося через 50 дней после подкожной инъекции клеток STHE. Высокий уровень метастатической активности по тестам ЭМА и СМА.

Метастатическая активность исследуемых клеточных линий оценивалась путём подсчета количества метастазов в легких, возникших после введения исследуемых клеток сирийским хомякам. При этом различали спонтанную и экспериментальную метастатическую активность (СМА и ЭМА). Экспериментальную метастатическую активность оценивали через 24 дня после внутривенного (внутриорбитального) введения клеток путем подсчета количества легочных метастазов. В каждой серии экспериментов для анализа одной клеточной линии использовали 10 животных. Для изучения спонтанной метастатической активности клетки вводили хомякам подкожно. Первичные опухоли появлялись в течение месяца. Через 2 месяца после инъекции подсчитывали количество легочных метастазов. Туморогенную активность

опухолевых клеток определяли методом количественного трансплантационного теста.

Для трансфекции клеток и получения новых векторов использовались последовательности мутантных форм онкогена Ha-Ras, любезно предоставленные проф. Дж.Донвардом, (Imperial Cancer Research Fund, UK). Мутантные последовательности гена RalA были любезно предоставлены др. Койде (Kanazawa University, Japan) и др. Ямазаки (Yamazaki Y. et al., 2001).

2.3. Результаты исследования и их обсуждение

2.3.1.1 Ha-Ras - зависимая модуляция метастатической активности RSV-трансформироваиных фибробластов хомяка

Нами была поставлена задача - исследовать влияние онкогена Ha-Ras на метастатический потенциал клеток данной экспериментальной модели. Для этого мь! использовали последовательность Ha-rasV12, которая кодирует конститутивно-активный (постоянно связанный с ГТФ) белок. Мутант На-RasV12 способен связываться со всеми эффекторами, в том числе и с тремя основными: Raf, PI3K и Ral-GDS.

Последовательность мутантной формы Ha-rasV12 в ретровирусном векторе pLXSN была трансфицирована в клетки низкометастатической по СМА тесту RSV-трансформированной линии HET-SR.

Клетки HET-SRHa-Ras V12 мы тестировали на уровень СМА. Метастатическая активность здесь и далее приводится в виде среднего значения количества метастазов в легких на одно животное (А). Суперэкспрессия Ha-Ras VI2 в клетках HET-SR вызвало увеличение СМА с Д=1,7 (контроль, трансфекция пустого вектора pLXSN) до Д=107,2. Можно заключить, что активированная форма Ha-Ras значительно усиливает метастатическую активность исследуемой линии.

Полученные в результате контрольной трансфекции пустым вектором клетки HET-SRpLXSN достоверно не отличались от родительских клеток HET-SR по уровню СМА: Д=1,7 и Д=7 (р < 0.01).

Для идентификации Ras-ассоциированных сигнальных путей, опосредующих его способность к стимуляции метастазирования, мы использовали так называемые эффекторные мутанты активированного Haras VI2. Они обладают свойством избирательного связывания с эффекторами благодаря точечным аминокислотным заменам в эффекторном домене белка Ha-RasV12 (Yamazaki Y. et al, 2001). Такие дефектные белки не способны к связыванию двух из трех основных (Raf, PI3K, RalGDS) эффекторов Ras. Введение в клетки конструктов, экспрессирующих такие последовательности, активирует лишь те сигнальные пути, которые проходят через «неблокированные» эффекторы Ras.

Так, V12Ha-RasS35 взаимодействует только с белком Raf, индуцируя Raf-MAPK-ERKl/2 сигнальный каскад; V12Ha-RasC40 активирует PI3K-PKB сигнальный путь; V12Ha-RasG37 связывается только с RalGDS, активируя RalGDS-Ral зависимый путь.

Последовательности данных мутантных форм Ha-ras были трансфицированы в исходную линию HET-SR с последующим анализом СМА отобранных трансфектантов (см. рис. 1). Введение Ha-rasV12S35, как и введение Ha-rasV12C40, достоверно не повысило СМА, (Д=1,8 и Д=1,0 соответственно). В линии HET-SRHa-rasV12G37, как и в линии HET-SRHa-RasV12, метастазирование значимо отличалось от контрольной группы (Д=107,2 и Д=111,8 ).

T 107,2 У 111,8

100 -

Т 107,2

НЕТ- HET-SR На- HET-SRHa- HET-SRHa- HET-SRHa-

SRpLXSN Ras V12 ra»V12S35 rasV12G37 rasV12C40

Рисунок 1. CMA Ha-ras-трансфектантов линии HET-SR. Д - среднее значение количества метастазов в легких на одного хомяка.

Для контроля экспрессии вектора в отобранных клеточных линиях методом Вестерн блот анализа была проверена экспрессия Ha-Ras белка во всех трапсфектантах. Наблюдалось увеличение количества соответствующего белкового продукта по сравнению с контрольной линией во всех клетках, содержащих экзогенные Ha-ras последовательности, в том числе и в тех, которые не изменили своей метастатической активности (см. рис. 2).

Х- HET-SRpLXSN 2-HET-SRHa-rasV12S35 лм^м На Ras 3-IIET-SRHa-rasV12 «Ok ^ 4-HET-SRHa-rasV12G37

1 2 3 4 5 5- IIET-SRHa-rasV12C40

Рисунок 2. Экспрессия белка Ha-Ras в Ha-ras-производных линии HET-SR

Поскольку Ha-rasV12G37 мутант преимущественно активирует Ral-GDS, можно сделать вывод, что в данной модели именно Ral-GDS является ключевым эффектором, опосредующим влияние Ras на метастатическую активность.

2.3.1.2 Супрессия метастатической активности клеток введением доминантно негативной мутантной формы RalA

Ral-GDS является фактором обмена нуклеотидов и, следовательно, положительным регулятором для малых ГТФаз Ral. Мы предположили, что именно RalA является следующим звеном в Ha-ras - Ral-GDS — зависимой цепи передачи сигналов, задействованным в регуляции метастазирования. Для

проверки этого предположения была сделана попытка компенсировать повышение метастазирования в линии HET-SR Ha-ras V12G37 введением RalAS28N, доминантно негативной формы RalA.

Полученная в результате лентивирусной инфекции клеточная линия -HET-SRHa-rasV12G37-RalAS28N была протестирована на уровень СМ А. Метастатическая активность после введения RalAS28N упала с уровня родительской линии (Д=111,8) практически до уровня контрольной линии HET-SR (Д=7). То есть блокирование Ral в Ha-Ras-Ral-DGS сигнальном пути привело к редукции метастазирования до уровня исходных клеток HET-SR. Таким образом, можно заключить, что Ral действительно является основным эффектором Ral-GDS, ассоциированым с метастазированием.

Далее мы предприняли попытку аналогичного подавления метастазирования введением доминантно негативного мутанта RalAS28N в клетки HET-SRHa-rasV12, экспрессирующие конститутивно активный мутант Ha-ras. Тестирование СМА полученной клеточной линии HET-SRHa-RasV12RalAS28N показало, что в этом случае метастатическая активность уменьшилась, с Д=110 до Д=61, но статистически значимых различий между группами не было выявлено. То есть, в отличие от полного подавления метастазирования при введении RalAS28N в клетки HET-SRHa-rasV12G37, в которых стимулирован Ha-Ras-Ral-GDS сигнальный путь, в случае аналогичного введения RalAS28N в клетки HET-SRHa-ras V12, значимой супрессии метастазирования не происходит.

Следовательно, повышение метастатического потенциала, обусловленное введением мутанта Ha-rasV12, может быть результатом действия не только RalA. Поскольку введение Ha-RasV12C40 и Ha-rasV12S35 по отдельности не стимулировало СМА линии HET-SR, можно предположить, что эффект стимуляции метастазирования экспрессией Ha-RasV12 может быть вызван также и суммарным кумулятивным эффектом Ha-RasV12C40 и Ha-

rasV12S35. Чтобы подтвердить эту гипотезу, мы провели трансфекцгоо На-RasV12C40 в линию HET-SRHa-ras V12S35.

Получившаяся линия HET-SRHa-rasV12S35-C40 обладала уровнем СМА Д=80, что, с одной стороны, достоверно не отличается от уровня СМА клеточной линии HET-SRHa-rasV12, с другой стороны, достоверно больше уровней линий HET-SR Ha-rasV12S35 и HET-SRHa-rasV12C40. .

Таким образом, одновременная стимуляция путей, ведущих от Ha-Ras к Rafl и Р13К, достоверно повышает метастатическую активность клеток HET-SR - с Д=1,7 до Л=80, причем сопоставимо с увеличением СМА (с Д=1,7 до Д=111,8), вызванным стимуляцией одного Ral-GDS пути. Следовательно, суммарный эффект стимулированных Rafl и PI3K- ассоциированных путей вносит ощутимый и сопоставимый с Ral-GDS вклад в положительную регуляцию метастазирования. Существенно отметить, что в данном случае в линии HET-SRHa-rasV12S35-C40 экспрессируется две копии экзогенных активированных мутантов Ha-ras. Возможно, увеличение метастатической активности вызвано в том числе и увеличением общего количества активного продукта Ras, что, предположительно, может увеличивать количество задействованных в метастазировании активных мишеней Ras.

Поскольку линия HET-SR обладает исходно высокими показателями ЭМА, мы проверили, возможна ли супрессия и этого показателя уровня метастазирования введением доминантно негативной формы RalA.

Для этого мы инфицировали клетки линии HET-SR лентивирусом, экспрессирующим RalAS28N. Полученная линия клеток HET-SRRalAS28N была проверена на ЭМА. Значение ЭМА полученной линии HET-SRRalAS28N резко и достоверно понизилась с Д=350 до Д=16 (р<0,01). Следовательно, подавление эндогенного RalA критически сказывается на ЭМА клеток.

Следующим этапом было исследование вовлеченности эндогенного RalA в процесс стимуляции метастазирования в ходе селекции клеток in vivo.

Для этого мы сравнили количество активной формы RalA в клетках родительской клеточной линии HET-SR и в высокометастазирующей линии HET-SR2SC, полученной путем селекции in vivo. В качестве потенциального контроля была использована высокометастазлрующая клеточная линия НЕТ-SRHa-rasV12G37, в которой стимулирован Ral-GDS сигнальный путь и, значит, можно ожидать повышения количества активной формы RalA (см. рис.

3).

RalA цеТ-SR

2- HET-SRHa-rasV12G37 «•——»-. i..........- „i,,,.!! RalA активная форма 3- HET-SR2SC

1 2 3

Рисунок 3. Анализ экспрессии белка RalA в исследуемых линиях. А) общий уровень RalA, Б) активная форма RalA

Анализ проводился методом "pull down assay" с использованием коммерческого набора реактивов фирмы "Upstate". Метод основан на иммунопреципитации активной формы RalA с его эффектором - белком RalBPl. Паралельно был проведен анализ тотального уровня белка RalA в исследуемых клеточных линиях методом Вестерн блот анализа с использованием антител к RalA.

В результате показано, что при равном уровне экспрессии тотального белка RalA, в культурах HET-SRHa-rasV12G37 и HET-SR2SС уровень продукции активного RalA выше, чем в линии HET-SR. Этот факт свидетельствует о том, что, во-первых, введение мутанта Ha-rasV12G37 действительно стимулирует активность RalA в клетках, и, во-вторых, в ходе селекции in vivo в линии HET-SR2SC, параллельно с увеличением метастатической активности, активировался эндогенный RalA.

Чтобы проверить, насколько метастатическая активность клеточной линии HET-SR2SC зависит от эндогенного RalA, мы инфицировали эти клетки

стоком лентивирусов, содержащих последовательность доминантно негативного мутанта RalA. Линия HET-SR2SCRalAS28N продемонстрировала существенное снижение обоих показателей ЭМА с Д=538 до Д=17,2 (р< 0,01), СМА с Д=144 до Д=4,4( р<0.001,) см. рис. 4.

Из этого можно заключить, что RalA играет принципиальную роль в возникновении высокометастатического фенотипа в ходе селекции in vivo.

roo 600 500 400 300 200 ICO

о

HET-SR 2SC HET-SR2SC HET-SR-2SC HET-SR 2SC

RalAS28N RalAS28N

CMA

Рисунок 4. Супрессия спонтанной и экспериментальной метастатической активности линии HET-SR2SC после введения доминантно негативного мутанта RalA.

Для выяснения универсальности влияния RalA на метастазирование в рамках данной модели мы провели аналогичные эксперименты на других высокометастазирующих клеточных линиях.

Так, изначально высокометастазирующая RSV-трансформированная клеточная линия HET-SR8 была инфицирована доминантно негативным мутантом RalA. В полученой линии HET-SR8RalAS28N по сравнению с родительской HET-SR8 принципиально снизились как СМА (с Д =130 до Д =5), так и ЭМА (с Д =300 до Д=5, 6) (см. табл. 1).

Аналогичный опыт был проведен и на спонтанно трансформированных фибробластах. Для этого использовались клетки, приобретшие высокометастатический фенотип в тестах СМА и ЭМА в результате селекции in vivo. STHE83/20 были получены из легочных метастазов, образовавшихся через 20 дней после внутриорбитального введения клеток STHE, a STHELNM8

538

17,2

ЭМА

- из метастаза в легком, образовавшегося через 50 дней после подкожной инъекции STHE, то есть линия STHELNM8 прошла более жесткую селекцию на животных. В производных клеточных линиях метастатическая активность снизилась по сравнению с родительскими линиями. Так, в линии STHE83/20RalAS28N по сравнению с родительской STHE83/20 снизилась и СМА (с Д=125 до Д =11,4), и ЭМА (с Д=100 до Д=13,8). В то же время, в линии STHELNM8RalAS2SN мы обнаружили менее выраженную тенденцию к снижению СМА (с Д=180 до Д=15) и ЭМА (с Д =200 до Д= 88) (см. табл. 1). Возможно, что частичное снижение метастатической активности в случае STHE-MLN8 после введения RalAS28N связано с тем, что эта линия прошла более глубокий отбор ш vivo по сравнению с STHE83/20.

Таблица 1

Клеточные линии А СМА Л ЭМА

HET-SR8 130 300

HET-SR8RalAS28N 5 5, 6

STHE83/20 125 100

STHE83/20 RalAS28N 11,4 13,8

STHELNM8 180 200

STHELNM8RalAS28N 15 88

Суммируя вышеизложенное, можно заключить, что Ha-Ras значительно увеличивает метастатический потенциал клеток. При этом основным Ha-Ras-ассоциированным сигнальным путем, вовлеченным в стимуляцию метастазирования, является Ral-GDS/RalA путь. Подавление активности RalA сказывается на способности к метастазированию всех исследованных линий. В ходе селекции клеток in vivo, приводящей к увеличению метастатической активности, активность эндогенного RalA увеличивается.

2.3.1.3 RalA зависимая индукция метастазирования Основываясь на результатах экспериментов по снижению метастатической активности с помощью доминантно негативной формы RalA, мы решили исследовать влияние активности RalA на метастатический

потенциал путем прямого эксперимента. Для этого мы использовали активированный (постоянно связанный с ГТФ) мутант - Яа1А023У.

Мы провели трансфекцию вектора рЬХ8Ы-Иа1А-С23У в клетки НЕТ-ЭК. Полученная клеточная линия НЕТ-8Ш1а1А023У была проверена на уровень СМА. Показано, что введение активной формы Яа1А достоверно повышает СМА линии НЕТ-БЙ. с А~7 до Д= 145. Аналогичный опыт по введению активированного мутанта Яа1А был проведен на низкометастазирующей как по СМА, так и по ЭМА линии спонтанно трансформированных фибробластов БТНЕ. Полученная линия БТНЕ Ка1Л-С23У была протестирована на ЭМА и СМА. Значение ЭМА существенно выросло (с Д=б,9 до Л > 500), показатель СМА также достоверно вырос с Д=3,8 до Д=14, 3 (см. табл. 2).

Таблица 2

Клеточные линии А СМА А ЭМА

STHE 3,8 6,9

STHE RalAG23V 14,3 >500

Таким образом, мы можем заключить, что RalA усиливает метастатический потенциал как RSV-трансформированных, так и спонтанно трансформированных фибробластов. Все полученные клеточные линии были проверены на туморогенность. Статистических изменений среди полученных производных линий по этому параметру не было зафиксировано (ANOVA, ' р<0,01).

В результате всех вышеописанных экспериментов изначальная панель клеток, содержащая Раус-трансформированные и спонтанно трансформированные фибробласты с разным уровнем СМА и ЭМА, была существенно расширена за счет Ha-Ras и RalA трансфектантов.

2.3.2.2 Характеристика полученных культур in vitro

2.3.2.2.1 Динамика роста клеток

Скорость пролиферации клеток является важной характеристикой для любой клеточной линии в экспериментальных моделях. Этот показатель может

непосредственно влиять на туморогенность и метастатическую активность клеток in vivo.

Анализ проводился путем подсчета клеток в камере Горяева через равные промежутки времени. Линии HET-SRHa-rasV12S35 и HET-SRHa-rasV12SC40 показали большую скорость пролиферации, чем родительская линия. Среди остальных линий достоверных отличий выявлено не было. Мы можем утверждать, что в данной модели метастатическая активность не зависит от скорости пролиферации, так как ни в одной линии, обладающей высоким потенциалом метастазирования, как исходным, так и индуцированным Ha-Ras и RalA, скорость пролиферации по сравнению с контрольными линиями не увеличилась.

2.3.2.2.2. Анализ способности клеток к образованию колоний

Способность к образованию колоний в условиях отсутствия межклеточных взаимодействий - важная характеристика культуры. Таким образом искусственно моделируется процесс некоторых стадий образования метастазов.

Полученная нами панель клеток была тестирована на способность образовывать колонии на чашках Петри (см. табл. 3).

Таблица 3.

Клеточные линии Количество колоний Размер колоний

HET-SRpLXSN 50 10 клеток

HET-SRHa-Ras V12 > 50 >10 клеток

HET-SRHa-ras V12S35 > 50 > 40 клеток

HET-SRHa-ras V12G37 >100 > 40 клеток

HET-SRHa-ras V12C40 >200 > 40 клеток

HET-SR RalAG23 V >50 >10 клеток

HET-SRRalAS28N > 100 >10 клеток

HET-SR -2SC 50 10 клеток

HET-SR -2SC RalAS28N >50 >10 клеток

Как видно из таблицы, наиболее значительно увеличила способность к образованию колоний линия На-газУ12С40. Стимуляция Ка1-ассоциированного сигнального пути в клетках НЕТ-БТШа-газ У12С37 также увеличивает способность к образованию колоний. Введение как активной, так и доминантно негативной формы 11а 1А приводит к незначительному увеличению этого показателя.

Стоит отметить, что отличалось не только количество колоний, но и их размер (см. рис. 5).

1 2

Рисунок 5. Колонии, образованные клеточными линииями НЕТ-SRpLXSN (1), HET-SRHa-ras V12S35 (2).

Так, все мутанты Ha-Ras в той или иной степени вызвали увеличение размера колоний. Линии, трансфицированные мутантами Ha-rasV12C40 и На-rasV12C S35, значительно увеличили размер колоний, что возможно связано с повышенной пролиферативной активностью этих клеток. Введение активной формы RalA также приводит к увеличению размера колоний по сравнению с родительской линией. Высокометастазирующие линии HET-SRHa-rasV12G37 и HET-SRRalAG23V, по-видимому, увеличили размер колоний независимо от скорости деления, так как их пролиферативная активность не отличалась от родительской линии HET-SR.

2.3.2.2.3. Анализ подвижности клеток

Скорость миграции клеток в «рану» - важный параметр, позволяющий оценить подвижность клеток и их способность к миграции in vitro. Подвижность клеток определялась скоростью миграции клеток в «рану» в монослое. Эксперимент проводился с добавлением в среду антибиотика

митомицина С, который позволяет нивелировать влияние различия в скорости деления клеток на скорость зарастания раны путем блокировки деления клеток.

Среди Ha-Ras трансфектантов линии HET-SR клетки линий HET-SRHa-rasV12S35 и HET-SRHa-rasV 12С40 наиболее значительно увеличили скорость зарастания по сравнению с родительской линией, (см. рис. 6). Введение доминантно негативной формы RalA в линию HET-SR существенно усиливало миграцию, в то время как введение конститутивно-активной формы RalA принципиально не влияет на миграцию. Высокометастатическая линия НЕТ-SR2SC не изменила скорость зарастания «раны», будучи трансфицированна доминантно негативной формой RalA.

Таким образом, введение доминантно негативной формы RalA подавляет метастазирование, однако по разному влияет на скорость зарастания раны линий HET-SR и HET-SR2SC, тогда как конститутивно-активная форма этого белка усиливает метастатическую активность, но не влияет на зарастание «раны».

Рисунок 6. Динамика зарастания раны. Контуром обозначена первоначальная граница раны. 1- HET-SRpLXSN, 2- HET-SRHa-ras \n2S35

В исследуемой модели не выявлено прямой связи между метастатической активностью и скоростью миграции клеток в «рану». Предположительно, в данной модели миграция не является сопряженной с метастазированием характеристикой.

2.3.2.2.4. Анализ секреции матриксных металлопротеиназ В нашей работе был проведен анализ продукции секретируемых металлопротеиназ, способных расщеплять желатин - металлопротеиназ 1, 2 и 9 типов. В первую очередь были протестированы Ha-Ras производные линии HET-SR. Результаты желатиназной зимографии представлены на рис. 7.

1 2 3 4 5

1- HET-SR

2- HET-SRHaRas V12C40

3-HET-SRHaRas V12S35

4- HET-SRHaRas VI2

5- HET-SRHaRas V12G37

Рисунок 7. Анализ активности секретируемых металлопротеиназ в HaRas производных линии HET-SR.

Как показал эксперимент, активность ММР2 практически не меняется в исследованной панели линий за исключением низкометастазирующих линий HET-SR Ha-rasV12S35 и HET-SR Ha-rasV12C40, в которых ее активность несколько повышена. При этом ММР2 является самой активной из трех выявленных металлопротеиназ. Фактически, ее активность никак не коррелирует с данными по метастазированию. Более интересна ситуация с ММР9. Ее экспрессия не отмечена в низкометастазирующей линии HET-SR, но при этом она появляется во всех Ha-Ras трансфектантах этой линии. Последняя металлопротеиназа, выявленная нами при анализе желатиназной активности, ММР1, практически не меняет уровень экспрессии в Ha-Ras трансфектантах HET-SR. Таким образом, можно проследить корреляцию между активностью ММР9 и введением Ha-Ras в линию HET-SR. Аналогичный опыт был поставлен на RalA трансфектантах, при этом были проанализированы линии HET-SR2SC и HET-SR2SC Ra!AS28N, HET-SR,

НЕТ-8Ш1а1А-С23У и НЕТ-5КЛа]А528Ы, а так же линии 5ТНЕ83/20 и STHE83/20RalAS28N. Результаты представлены на рис. 8.

1 2 3 4 5 6 7

- Рго-ММР-2

ММР-2 Рго-ММР-1

ММР-1

ММР-9

т. hf.t-.sr

2- IIET-SRRalAS28N

3- НЕТ-51г1га1АУ23С

4- 8тне83/20

5- STHF.RV2nRяIДS28N

6- ПЕТ-вШвС

7- НР.Т-«П

Рисунок 8. Анализ активности секретируемых металлопротеиназ у Яа1А трансфектантов.

Согласно полученным данным, введение активной формы Иа1А в линию НЕТ-ЭИ. вызывает редукцию экспрессии всех форм анализируемых ММР, а продукция ММР1 и вовсе прекращается. В 11а1А828Ьт-производной линии НЕТ-511 уровень продукции всех ММР, напротив, увеличивается. При введении RalAS2SN в линию 5ТНЕ83/20, в которой отмечается изначальная слабая экспрессии ММР1, уровень продукции ММР не претерпевает существенных изменений. В то же время после введения доминантно негативной формы Яа1А в высокометастазирующую линию НЕТ-БКЗБС изначально высокий уровень продукции всех ММР2 существенно снижается, а продукция ММР1 и 9 полностью подавляется. Эти данные позволяют заключить, что введение активного Яа1А понижает уровень экспресии ММР2 и угнетает экспрессию ММР1 и 9. Присутствие доминантно негативного мутанта Иа!А оказывает различный эффект на продукцию ММР. По-видимому, повышение продукции ММР не вовлечено в Яа1А индуцированное метастазирование, о чем говорит

неизменный уровень продукции в HET-SR Ha-rasV12G37, в то время как в случае RalAV23G производной уровень секреции ММР понижен.

Кроме того, трансфекция доминантно негативной формы RalA оказывает разное влияние на количество секретируемых ММР в отобранных in vivo различными способами вирус-трансформированной линии HET-SR2SC и спонтанно трансформированной линии STHE83/20. Возможно, метастатическая активность линии HET-SR2SC определяется в том числе и усиленной экспрессией металлопротсиназ, и ингибирование их экспрессии коррелирует со снижением метастатической активности у НЕТ-SR2SCRalAS28N.

Суммируя полученные результаты, мы можем утверждать, что среди исследованных нами характеристик лишь некоторые однозначно ассоциированны с метастазированием. Другие характеристики можно сгруппировать в кластеры, составленные из коррелирующих между собой признаков. Например, увеличение подвижности, скорости пролиферации, колониеобразования, наряду с повышением активности ММР, свойственны таким низкометастатическим линиям, как HET-SRHa-RasV12S35, HET-SRHa-ras V12C40, что согласуются с литературными данными о том, что активация Rafl-и Р13К-ассоциированных сигнальных путей индуцирует G(0)—>G(1)—>S этапы клеточного цикла {Mirza A.M. et al, 2004).

Многофакторность процесса метастазирования и определяет большое число сочетаний признаков, которые могут оказаться эффективными в продвижении клетки к обретению высокометастатического фенотипа.

3. выводы

1. Онкоген Ha-ras существенно увеличивает метастатическую активность RSV-трансформированных фибробластов сирийского хомяка. Основной вклад в На-гаБ-зависимую стимуляцию метастазирования вносит Ral-GDS/Ral-ассоциированный сигнальный путь.

2. Экспрессия конститутивно активной формы RalA увеличивает спонтанную метастатическую активность пизкометастазирующей RSV-трансформированной линии HET-SR, а также спонтанную и экспериментальную метастатическую активность спонтанно трансформированной линии STHE. Экспрессия доминантно негативной формы RalA приводит к подавлению как спонтанной, так и экспериментальной метастатической активности клеток.

3. Приобретение высокометастатического фенотипа в ходе селекции RSV-трансформированных клеток in vivo ассоциировано с увеличением продукции активной формы RalA. Введение доминантно негативной формы RalA как в RSV- трансформированные, так и в спонтанно трансформированные клетки, прошедшие селекцию на животных, приводит к супрессии их метастатической активности.

4. Отсутствует зависимость между метастатической активностью клеток, экспрессирующих различные последовательности мутантных белков Ha-ras и RalA, со скоростью их пролиферации и подвижностью. Показано, что среди эффекторов Ha-ras наибольший вклад в скорость пролиферации и подвижность клеток вносят киназы Rafl и PI3K.

5. Отсутствует связь между метастатическим потенциалом исследуемых клеток и уровнем активности матриксных металлопротеиназ 1, 2 и 9 типов. Показано, что экспрессия экзогенного RalA приводит к снижению активности исследуемых металлопротеиназ.

6. Метастатическая активность клеток ассоциирована с уровенем метаболизации перекиси водорода in vitro и с устойчивостью клеток к перекиси водорода.

7. Стимуляция RalA сигнального пути ассоциирована со снижением уровня экспрессии S100A4 в RSV-трансформированных клетках. Экспрессия доминантно негативной формы RalA приводит к увеличению уровня фосфорилированной формы паксиллина. Уровень фосфорилирования Erkl/Erk2 не коррелирует с уровнем метастатического потенциала. Уровень экспрессии циклина D1 повышается при стимуляции Rafln Р13К-зависимых сигнальных путей и понижается при стимуляции RalA-ассоциированного сигнального пути.

8. Получена модель обратимого регулирования метастазирования с помощью стимуляции или супрессии малой ГТФазы RalA.

4. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Tchevkina Е., Rodina A., Musatkina Е., Martinuk A., Tatosyan А. Modulation of signal transduction protein expression in v-src-transformed cells with different level of metastatic potencial Revista de Oncologia 2002. v. 4/1,p 48-49 , 17lh Meet of Oncology, Granada, Spain

2. Tchevkina E., Martinuk A., Komelkov A., Tatosyan A. Ha-ras oncogene induces the metastatic ability of transformed cells in vivo through RalGDS downstream signalling pathway .European Journal of Cancer 2003, v.l, Suppl.5, p 180

3. Tchevkina E., Agapova L., Dyakova N., Martinjuk A., Komelkov A., Tatosyan A. The small G-protein RalA stimulates the metastasis of transformed cells. Oncogene, 2005 Jan 13; -24(3):329-35.

Принято к исполнению 29/06/2006 Исполнено 30/06/2006

Заказ № 500 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495)975-78-56 (495) 747-64-70 www.autoreferat.ru

Метастазирование - одно из опаснейших свойств злокачественных опухолей, являющееся основной причиной смертности от онкологических заболеваний.

Способность клетки к метастазированию - это результат отбора в популяции опухолевых клеток в процессе опухолевой прогрессии. Клетки должны приобрести способность выжить в условиях гипоксии, прорасти опухолевую массу, кровеносные и/или лимфатические сосуды, выйти в кровеносное русло, избежать гибели от иммунного ответа, прикрепиться к ткани во вторичном очаге и сформировать вторичный опухолевый узел.

На сегодняшний день имеется огромное количество данных о молекулярных механизмах отдельных составляющих этого процесса, однако они в значительной степени противоречивы. В этой связи особенно актуальным представляется использование биологических моделей, позволяющих изучать метастазирование как комплексный физиологический феномен in vivo.

Эти модели должны обладать свойством, позволящим при экспериментальном изменении какого-либо параметра опухолевой клетки (обработка различными химическими ингибиторами или стимуляторами, введение определенных генетических конструкций) оценить суммарное влияние на метастатический фенотип in vivo. Таким образом, на таких моделях возможно изучение как отдельных составляющих процесса метастазирования с помощью соответствующих тестов, так и целостного процесса. Одним из способов моделирования метастатического процесса является введение дополнительных генетических агентов. Такие агенты изменяют передачу внутриклеточных сигналов и влияют на функциональное состояние клетки. Сравнение молекулярно-биологических различий таких линий является одним из способов идентификации новых генетических маркеров метастазирования.

Одной из таких экспериментальных моделей является система линий трансформированных эмбриональных фибробластов сирийского хомяка. Эта модель уникальна тем, что включает в себя клеточные линии одинакового происхождения, но отличающиеся по метастатической активности in vivo. Она была получена в лаборатории противоопухолевого иммунитета ГУ РОНЦ им. Н.Н Блохина РАМН. Данная экспериментальная модель состоит из линий эмбриональных фибробластов сирийского хомяка, независимо трансформированных in vitro вирусом саркомы Рауса (RSV). Клетки этих линий обладают типично трансформированным фенотипом и различаются по ряду биологических характеристик, в том числе и по уровню метастатической активности. Все полученные линии имели типично трансформированный фенотип и были высокотуморогенны для сингенных животных. При внутривенном введении взрослым хомякам клетки всех линий демонстировали высокую экспериментальную метастатическую активность (ЭМА). Значительные отличия были обнаружены при исследовании спонтанной метастатической активности полученных линий (СМА). Следует отметить, что тест ЭМА представляет собой анализ способности трансформированных клеток, введенных в кровеносную систему, образовывать метастатические узелки в легких. При помощи же теста СМА оценивают метастазирование клеток опухолевой массы, сформировавшейся после введения анализируемых клеток животному подкожно. Таким образом, тест ЭМА отражает уровень выживаемости клеток в условиях противоопухолевой активности организма, тогда как тест СМА - это анализ способности клеток первичной опухоли инвазировать через стенки сосудов организма и образовывать очаги вторичного опухолевого роста. СМА - чрезвычайно важный показатель, так как условия теста наиболее близки к условиям естественного образования метсатазов и в большей степени отражают процесс истинного метастазирования опухолевых клеток. Таким образом, имеющаяся в нашем распоряжении модель дает возможность изучать характер влияния на метастазирование различных генетических агентов.

Онкогены семейства Ras, имея возможность широкого воздействия на передачу самых разнообразных клеточных сигналов, могут модулировать процессы, связанные с опухолевой прогрессией и метастазированием {Chambers A.F. ТискА.В. 1993).

Гены, кодирующие белки Ras, мутируют в 15% всех типов человеческих опухолей, при этом в большинстве опухолей обнаружены мутации только в одном из генов семейства ras (Almoguera С. et at, 1988).

В настоящее время накопилось большое число работ, посвященных роли Ha-Ras в злокачественной трансформации клеток. Однако механизм его влияния на метастазирование до сих пор не ясен.

Более того, конкретные механизмы и роль отдельных эффекторов HaRas в метастазировании варьируют в зависимости от используемых моделей. Получение разных результатов в разных моделях может зависеть от тканеспецифичности, видоспецифичности используемых моделей, а также от того, какой именно ген Ras использовался для модуляции метастазирования.

Ранее на использованной нами модели было показано, что введение активированного онкогена N-Ras не оказывает принципиального влияния на метастатический потенциал трансформированных фибробластов хомяка (:TopolL.Z; etal., 1993).

Вместе с тем, согласно литературным данным, среди представителей семейства Ras на метастазирование в наибольшей мере влияет Ha-Ras (Maruyama С. et at, 2001; Moon A. et al., 2000; Schlatter B. et at, 1992).

Поэтому в данной работе мы решили воспользоваться именно этим онкогеном для модуляции метастатического потенциала.

Целью данной работы является анализ влияния Ha-ras на метастатическую активность трансформированных фибробластов сирийского хомяка и идентификация сигнальных путей, осуществляющих это влияние.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Трансфекция низкометастазирующих RSV-трансформированных фибробластов сирийского хомяка мутантными вариантами активированного Ha-ras: (.Ha-rasV12, Ha-rasVl2G37, Haras VI2S35, Ha-rasV12C40) и сравнительный анализ метастатической активности полученных трансфектантов.

2. Трансфекция активной формы RalA в спонтанно трансформированные и RSV-трансформированные линии фибробластов хомяка. Трансфекция доминантно негативной формы RalA в высокометастазирующие спонтанно трансформированные и RSV-трансформированные линии фибробластов хомяка. Сравнительный анализ метастатической активности полученных линий.

4. Сравнительный анализ молекулярно-биологических характеристик полученных линий: подвижности клеток, скорости пролиферации, способности к инвазии in vitro и колониеобразования.

5. Определение в полученой панели клеточных линий экспрессии белков S100A4, фосфо-паксилина, Erkl/Erk2, ЦиклинаБ1.

6. Определение уровеня секреции металлопротеаз в исследуемых клеточных линиях.

7. Определение устойчивости к перекиси водорода и способности катаболизировать перекись водорода исследуемых клеточных линий.

В результате исследований впервые показано, что активация онкогена Ha-ras существенно увеличивает метастатическую активность RSV-трансформированных фибробластов сирийского хомяка, при этом основной вклад вносит Ha-ras/Ral-GDS/Ral-ассоциированный сигнальный путь.

Показано, что в клетках сирийского хомяка, активация Raf киназы не приводит к увеличению метастатической активности.

Было показано, что экспрессия конститутивно активной формы RalA достоверно увеличивает метастатическую активность как RSV-трансформированных, так и спонтанно трансформированных линий эмбриональных фибробластов хомяка.

Впервые показано, что приобретение высокометастатического фенотипа в ходе селекции RSV-трансформированных клеток in vivo ассоциировано с увеличением количества активной формы RalA.

Показано отсутствие зависимости между метастатическим потенциалом исследуемых клеток и уровнем активности матриксных металлопротиеназ 1, 2 и 9 типов. Показано, что экспрессия экзогенной активной формы RalA приводит к снижению уровня экспрессии исследуемых металлопротиеназ.

Показано, что метастатическая активность клеток коррелирует с устойчивостью клеток к перикиси водорода.

Таким образом, получена уникальная модельная система клеточных культур, несущих различные экзогенные последовательности и отличающиеся метастатическим фенотипом. Дальнейшие эксперименты с полученными линиями позволят пролить свет на механизм реализации На-Ras- и RalA- опосредованной модуляции метастазирования в клетках RSV-трансформированных и спонтанно трансформированных фибробластов сирийского хомяка.

II Обзор литературы

Ras зависимые пути передачи сигнала

В данном обзоре литературы представлены современные данные о Ras-зависимых путях передачи сигнала в клетках и их участия в злокачественной трансформации. Особо рассмотрен Ral - ассоциированный путь, как имеющий непосредственное отношение к практической части наших исследований.

II. 1.1 Белки семейства Ras. Общие сведения.

Множество рецепторов различных типов, локализованных на поверхности клетки, обеспечивают широкий спектр ответов на различные сигналы, поступающие извне. Активация этих рецепторов ведет к потрясающему разнообразию биохимических реакций, в которых значительную роль играют малые ГТФазы (Bos L.J. 1998).

ГТФазы представляют собой обширный класс белков, гидролизующих ГТФ. Известно по крайней мере 140 ГТФаз, кодируемых человеческим геномом. Они разделяются на подклассы, в том числе Ras, Rho, Arf, Rab, Kir/Rem/Rad, Rab и Ran подсемейства. Их биологические функции широки и разнообразны, они влияют на пролиферацию, организацию цитоскелета, дифференцировку, нуклеоплазменный транспорт, везикулярный транспорт и экспрессию генов (Takai Y. et al., 2001).

Ras-семейство ГТФаз включает в себя Ras, Rap, R-ras, ТС21, Ral, Rheb (Bos L.J. 1997) и M-ras (R-ras3) (MatsumotoK. et al., 1997). Белки были классифицированы по сходству в эффекторном домене, который определяет взаимодействие с эффекторами.

Белки Ras в геноме позвоночных представлены в трех вариантах: На-Ras, Ki-Ras и N-Ras. У млекопитающих существуют три ras гена, кодирующих почти идентичные белки с молекулярной массой 21 кДа: ген N-ras , ген Ha-ras и ген Ki-ras. Названия двух последних происходят от штаммов вируса, в которых найдены гомологичные вирусные онкогены: Harwey и Kirsten. Гомолог третьего в вирусах не найден. Структуры, и функции этих белков высококонсервативны: белки млекопитающих гомологичны белкам Ras в дрожжах S. cerevisiae (Gibbs J. Marshall S. 1989). Сравнение этих генов на уровне нуклеиновых кислот показало, что их гомология выражена слабо (около 30%), однако их аминокислотные последовательности свидетельствуют о близком родстве этих генов (до 100% в консервативной области белка) (Wigler М. et al., 1984). Протоонкобелки На-Ras, N-Ras и Ki-Ras, имеют 58% гомологию с белками Ral, меньшую гомологию они сохраняют с Rap, (1 и 2), ТС21, M-Ras, R-Ras и Rheb (Bos J. L. 1998).

И Ras, и Ral принадлежат к Ras подобным малым ГТФ-азам, т.е. представляют собой белки, активность которых связана со способностью расщеплять молекулу ГТФ. Расщепив ГТФ и оставшись в ГДФ-связанном виде, они становятся неактивными. Белки, позволяющие малым ГТФ-азам освободиться от связанной молекулы ГДФ и помогающие связаться с активирующей молекулой ГТФ, названы GEF (guanine nucleotide exchange factors) факторами. Белки же, индуцирующие гидролиз связанной молекулы ГТФ до ГДФ, названы GAP (GTPase-activating protein) факторами. Таким образом, белки GEF активируют свои мишени-ГТФ-азы, GAP же -дезактивируют их (см. рис 1).

Нелсгишх* сктояши fl\

Гидрата ГТФ CAt' [ GEJ ] ^"Гстнд.

A ximpot cocrcmrif

Рисунок 1. Схема активации и дезактивации ГТФаз.

Специфический набор факторов GEF и GAP позволяет Ras белкам, активируясь, реагировать на уникальный спектр сигналов и играть важную роль в функционировании клетки,

11.1.2 Строение белков семейства Ras

Белки Ras (р21) являются сравнительно небольшими по размеру и содержат около 190 аминокислотных остатков (Mr=21kDa). Сравнение аминокислотных последовательностей белков RAS у человека выявило четыре области, отличающиеся по степени своей консервативности.

N-концевая область, составляющая примерно одну треть белка, является наиболее консервативной. Вторая область, расположенная в середине белка, составляющая сайты связывания нуклеотидов и эффекторный домен, демонстрируют несколько большую дивергенцию, но все еще сохраняют 85% гомологии, в то время как третья часть, С-конпевая последовательность белков Ras, отличается высокой степенью вариабельности. И, наконец, четвертая часть, С - концевой пептид, связанный с посттрансляционной модификацией, консервативен в пределах Ras-семейства (Taparowsky Е. et al, 1983).

П.1.3 Мутации генов ras

Гены, кодирующие белки Ras, мутируют в 15% всех типов человеческих опухолей (Bos J.L. 1989). При этом для новообразований разной локализации/гистогенеза характерна разная частота мутаций ras.

Как правило, наблюдаются аминокислотные замены в кодонах 12, 13 и 61, 65. Такие активирующие мутации приводят, в зависимости от положения, к двум основным биохимическим изменениям белковой молекулы: уменьшению ее ГТФ-азной активности и облегчению обмена ГДФ на ГТФ. Мутации Ras в кодонах 12, 13 и 61 делают белок постоянно активным в ГТФ связанной форме (Bos J. L. 1995). Эти мутации обуславливают онкогенный эффект белка Ras в 30 % случаев человеческих злокачественных новообразований.

Замены аминокислот в положениях 16, 17, 116, 117, 119, 144 и 146 ускоряют скорость обмена гуанинового нуклиотида и также приводят к повышению активности Ras.

Как правило, мутации ras обнаруживаются в эпителиальных опухолях и при миелолейкозах, тогда как в опухолях нейроэктодермального происхождения и различных лимфоидных новообразованиях они почти никогда не встречаются (Bos J.L. 1989). К опухолям, в клетках которых ras мутирует с наибольшей частотой, относятся аденокарциномы поджелудочной железы (90-95% всех случаев), множественные миеломы (5580%), аденомы и аденокарциномы толстого кишечника, при этом мутации разных генов ras неравномерно распределены в клетках опухолей различных локализаций. Так, в опухолях простаты и мочевого пузыря найдены мутации только в гене Ha-ras, в карциномах поджелудочной железы -преимущественно в гене Ki-ras, а в гемопоэтических новообразованиях - в reHeiV- ras (Almoguera С. etal., 1988; BreivikJ. etal., 1994).

11.1.4 Функциональные области белков Ras

Выделяют несколько функциональных областей белков Ras (см. рис. 2). Аминокислотные остатки с 10-ого по 16-ый и с 56-ого по 59-ый связываются с а и р фосфатными группами ГТФ. Аминокислотные остатки 116-119 и 152165 взаимодействуют непосредственно с гуанином. Аминокислотные остатки с 32-го по 40-ой участвует в связывании эффекторов белка Ras и GAP, Аминокислотные остатки с 60-го по 76-ой связывают у-фосфат ГТФ и также принимают участие во взаимодействии с различными эффекторами. Аминокислотные остатки с 32-го по 40-ой, которые входят в эффекторный домен, консервативны в семействе Ras белков, за исключением белка Ral. Различия в эффекторном домене определяют способность связываться с эффекторами и разницу в конформациях ГТФ и ГДФ- связанных форм белка.

Таким образом, область с первой по 165-ую аминокислоту является наиболее консервативной (85%), в то время как С - концевая область с 165ой по 185ую является гетерогенной в пределах семейства. С- концевой СААХ мотив задействован в пост трансляционной модификации белка и необходим для заякоривания на мембране, что является обязательным условием его нормального функционирования.

Коисерплтшшя область Гоымопш (85%> Гекрокшш

I 21 41 61 81 101 121 Ml 161 Ш вз]з n I f [ [J J JJ iDirtf Him и ]/ЙШ1Ш1 и JJ I ii nialt L^T PTIJID JT fujr Ш unjjf?flf I a MI mmff ш i i uui EftymiHii пштиг пп ]i ши nnn fl s r ir ■ E ^

Рисунок 2. Функциональные области белков Ras.

П.1.5 Ras и его мембранные транслокации

Основная локализация белков семейства Ras - плазматическая мембрана. Они синтезируются в цитозоле, а затем, пройдя ряд посттрансляционных модификаций, прикрепляются к плазматической мембране. Заякоривание белков Ras на мембране необходимо для его правильного функционирования.

Локализация Ras на плазматической мембране клетки осуществляется в несколько стадий. Ras синтезируется в цитозоле в виде предшественника, прикрепление которого к клеточной мембране обеспечивается специальной посттрансляционной модификацией, характерной для всех G-белков. СААХ мотив - триплет, кодирующий цистеин и две алифатические аминокислоты, является триплетом инициации модофикации, он консервативен для всех Ras белков (Willumsen В.М. et al., 1984). В начале фарензил-трансфераза, цитозольный белок, присоединяет фарнезил к цистеиновому остатку в СААХ мотиве. (.Reiss Y. et al., 1990). Затем фарнезилированный СААХ локализует Ras белок на цитозольной стороне эндоплазматического ретикулума, где эндопептидаза Reel удаляет ААХ трипептид (Kim Е. et al., 1999). И, наконец, альфа карбокси группа на фарнезилцистеине метилируется изопренилцистеин-карбоксил метилтрансферазой. (Dai Z. et al., 1998). Ki-Ras по неясным причинам метилируется с большей эффективностью, чем Ha-Ras и N-Ras (Choy Е. et al., 1999). После метилирования Ras занимает одну из двух позиций на клеточной мембране, которые определяются пептидным сигналом, локализованным на амино-конце фарнезилированного по цистеину белка (.Hancock J.F, Paterson Д Marshall C.J., 1990). Ha-Ras и N-Ras к тому же подвергаются пальмитилированию по цистеину в аппарате Гольджи и входят в экзоцитозный путь, проходя через него на мембрану. {Choy Е. et al.,1999). Ki-Ras, который имеет, наряду с цистеиновым остатком, полилизиновую последовательность, минует Гольджи и достигает мембраны, используя неясный пока механизм.

Будучи трансфицированным в клетки, Ha-Ras и N-Ras локализуются не только на эндоплазматической мембране, но и на мембранах аппарата Гольджи, на эндоплазматическом ретикулуме и даже в эндосомах {Howe C.L. et al., 2001). До сих пор остается открытым вопрос, участвует ли пул не связанных с цитоплазматической мембраной белков в передаче сигнала. В нескольких работах предложены варианты ответа на этот вопрос. Матсуда и коллеги показали, что Ras, активируемый EGF в трансформированных клетках зеленой мартышки Cos, локализуется на плазматической мембране и, в меньшей степени, в области складок клеточной мембраны, так называемых мембранных раффлов {Mochizuki et al., 2001; Ohba Y, Kurokawa K, Matsuda M., 2003). С другой стороны, другой белок Ras-семейства, Rap, активируется в ответ на EGF преимущественно в цитозоле {Mochizuki N. et al, 2001).

И. 1.6 Регуляция активности Ras

Как уже упоминалось выше, существует 2 группы факторов, взаимодействующих с ГТФазами: GEF и GAP. Известно множество GEF и несколько GAP, являющиеся, соответственно, положительными и отрицательными регуляторами активности Ras {Ehrhardt A. et al., 2002). При этом для каждого белка Ras семейства существует свой набор таких факторов, связывающихся с ним с разной степенью афинности. Эти различия в специфичности взаимодействия позволяют наборам GEF и GAP разных белков перекрываться между собой.

П.1.6.1 GAP - негативные регуляторы Ras белков

Факторы GAP - (GTPase-activating protein), катализируют гидролиз связанной G-белками молекулы ГТФ. При этом G белки переходят из активной формы в неактивную.

Для Ras белков известны следующие GAP: р120, NF1, RASAL, CAPRI, а также AIP1.

Все эти белки имеют сходное строение и состоят из N - концевого домена, соединяющего GAP с эффекторами, SH2 (Src homology 2) домена, соединяющегося с SH3 (Src homology 3) доменом, центрального Cal-В и РН (pleckstrin homology) домена, отвечающего за ассоциацию белка с мембраной и С-концевого каталитического GAP домена, инициирующего конверсию Ras - ГТФ на Ras - ГДФ (Gawle D. J. et al, 1995; Moran M.F. et al., 1990). pl20 - один из наиболее многофункциональных GAP для Ras. Он имеет вес 120kDa, его экспрессия в опухолях человека гетерогенна (McGlade J. et al., 1993).

В экспериментах по исследованию скорости зарастания «раны» р120 дефицитные клетки не были способны к установлению полярности и продвижению в «рану». Однако дальнейшие исследования показали, что для клеточной подвижности необходим не только Ras-GAP. Он важен для клеточной поляризации как регулятор актиновых стресс - фибрилл и реориентации фокальной адгезии, для чего необходим комплекс с другим GAP - р190 Rho-GAP (.Kulkarni S.V. et al, 2000). Есть сведения, что у р120 есть добавочная функция - предотвращение взаимодействия Ras и Ras-GEF (Giglione С. S. et al, 1997).

Кроме того, р120 - мембрано- ассоциированный субстрат Src киназы (Reynolds, А.В. et al., 1994). В клетках, трансформированных v-src, он фосфорилируется src киназой в ответ на сигналы ростовых факторов (Daniel, J.M. Reynolds, А.В. 1995). В клетке рр120 ассоциирован с комплексом Е-катгерина и р-катенина и способствует их взаимодействию с другими формами кадгеринов (Shimazui Т. et al., 1996). Связь р120 с цитоскелетом подтверждает и тот факт, что в клетках злокачественной астроцитомы р120 принимает участие в FAK- зависимой активации Ras (Fokal Adhesion Kinase) (HeckerT.P. etal., 2004).

Мутации ras в кодонах 12, 13, 59, 61 и 63 уменьшают ГТФ-азную активность и делают белок Ras нечувствительным к действию pl20GAP и NF1 СBarbacidM. 1990).

NF1 - нейрофибромин, член семейства Ras - подобных ГТФаз, является продуктом гена опухолевой супрессии nfl. Мутации этого гена вызывают нейрофиброматоз первого типа, распространенное заболевание, характеризующееся повышением риска образования злокачественных опухолей нервных тканей. Таким образом, NF1 обладает свойствами опухолевого супрессора.

Сходство каталитических доменов NF1 и р120 GAP заставило задуматься о том, что эти белки могут обладать сходными функциями. Действительно, NF1 связывает Ras с большой афинностью и вызывает гидролиз связанной с белком ГТФ (Hiatt К.К. et al, 2001).

Взаимодействие GAP домена NF1 и Ras было показано в экспериментах in vitro (Martin G.A. etal., 1990).

AIP1- недавно открытый белок, содержащий Ras-GAP домен, в результате чего его охарактеризовали как RasGAP. Он локализован на плазматической мембране в комплексе с TNFR1, осуществляющем передачу TNF-индуцированного сигнала по ASK1-JNK сигнальному пути. ASK1 (apoptosis signal regulating kinase-1) относится к семейству МАРЗ-киназ, ведущий МАРК каскад к активации jnk, но не NFkB (Zhang H.Z. et al., 2004).

CAPRI и RASAL недавно открытые Ras-GAP, функционирование которых зависит от концентрации кальция. RASAL активируется кальций-зависимо, будучи связанными с плазматической мембраной. CAPRI реагирует на концентрацию кальция слабее (Liu Q., et al., 2005). Они были открыты в экспериментах по скринированию библиотек по гомологии с фрагментом GAP домена (Allen М. et al., 1998).

Показано, что CAPRI блокирует передачу сигнала на Raf-MAPK путь, при активации внеклеточным введением кальция (Lockyer P.J. et al., 2001).

Аврора киназа (Aurora kinase)- член семейства серин-треониновых Аврора-киназ, играющих ключевую роль в митотической сегрегации хромосом. В экспериментах по поиску белков, связывающихся с Ras, с помощью дигибридной системы был найден GAP домен Аврора киназы (Gigoux V. et al, 2002).

Регуляция GAP осуществляется множеством способов, включая белок-белковые взаимодействия, фосфолипидные взаимодействия, фосфорилирование, внутриклеточные перемещения и протеолитическую деградацию (Bernards A. Settleman J. 2004).

Одним из механизмов регуляции таких важнейших дезактиваторов Ras, как NF1 и pl20Ras-GAP является липид-зависимый. Некоторые фосфолипиды (фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин и др.) и жирные кислоты (например, арахидоновая, линолиевая и миристиловая) оказывают мощное ингибирующее воздействие на каталитический домен этих белков (Tsai, М.Н. et al, 1989; Serth, J. et al, 1991). Однако эти эксперименты, проведенные исследователями in vitro, не дают основания полагать, что в физиологических условиях дело обстоит точно так же.

Для pl20Ras-GAP существует и положительная регуляция. После фосфорилирования, вызваного стимуляцией v-Src или EGF, pl90Rho-GAP связывается с SH2-доменом pl20Ras-GAP. Вследствие этого, Ras и Rho обнаруживают ГТФазную активность, тем самым способствуя диссоциации актиновых филаментов, так как переходят в неактивную ГДФ-связанную конформацию (Fincham V.J. etal., 1999).

11.1.6.2 GEF- положительные регуляторы Ras белков.

GEF (guanine nucleotide exchange factors) факторы, катализируют высвобождение молекулы ГДФ из связанного с G белком состояния. В результате G белок имеет возможность связать молекулу ГТФ и прийти в активное состояние. Как и GAP, GEF имеют общие мотивы в строении.

Классификация GEF основана на гомологии генов, кодирующих эти белки, с дрожжевыми генами, взаимодействующими с белками Ras (Camonis J. et al, 1986; Broek D. et al., 1987). К обширной группе GEF для Ras -подобных ГТФаз относятся такие белки, как CDC25 (ChantJ. et al, 1991), Ras-GRF (Shou С. et al, 1992), mSos-J и mSos-2 (Bowtell D. et al, 1992), а так же продукты генов млекопитающих: dbl (Eva A. et al., 1988; Adams J.M. et al, 1992), bcr (Hariharan I.K. Adams J.M. 1987), Ras-GRF (Shou C. et al, 1992), smgGDS, Sos (Bonfini L. et al, 1992)и дрожжевого гена cdc24 (Miyamoto S. et al, 1987). Белки, кодируемые этими генами, взаимодействуют с Ras белками, активируя их. Белок dbl проявляет GEF активность для CDC42-Hs ГТФазы (Hart M.J. et al, 1991); smgGDS имеет GEF активность для rhoA, K-ras4b, rapla, raplb и racl ГТФаз (KaibuchiK. et al, 1991; Mizuno T. et al.,1991; Hiraoka K. et al, 1992).

Факторы активации для, собственно, белка Ras - достаточно многочисленная группа белков: Sosl и 2, GRF1 и 2, Ost, VAV и др. (Quilliam L. A. et al., 2002).

GEF находятся в цитозоле, пока активация с помощью, например, ростовых факторов не заставляет их локализоваться на мембранах аппарата Гольджи и плазматической, где они взаимодействуют с Ras, активируя его. Причем некоторые GEF активируют разные изоформы Ras с разной эффективностью (Ehrhardt A. etal., 2002).

Активный Ras связывается с белками-мишенями, иначе называемыми эффекторами.

Наиболее изученые эффекторы в клетках млекопитающих - Raf киназа, PI3-K (фосфотидил-инозитол-3-киназа) и группа Ral-GEF белков. Другими эффекторами являются AF6, RASSAL, PLC, Tiaml и MTS-1 (Ehrhardt A. et al., 2002), МЕК1, Rinl, AF6/Rsbl (Lee C.H. et al, 1996). Более подробно эффекторы будут рассмотрении в части "Ras - зависимые пути передачи сигнала".

Таким образом, можно выделить три группы белков, взаимодействующих с Ras: активаторы GEF, дезактиваторы GAP и эффекторы (см. рис. 3).

Рисунок 3. Белки, взаимодействующие с Ras.

ВЫВОДЫ

1. Онкоген Ha-ras принципиально увеличивает метастатическую активность RSV-трансформированных фибробластов сирийского хомяка. Основной вклад в На-гаэ-зависимую стимуляцию метастазирования вносит Ral-GDS/Ral-ассоциированный сигнальный путь.

2. Экспрессия конститутивно активной формы RalA увеличивает спонтанную метастатическую активность низкометастазирующей RSV-трансформированной линии HET-SR, а так же спонтанную и экспериментальную метастатическую активность спонтанно трансформированной линии STHE. Экспрессия доминантно негативной формы RalA приводит к подавлению как спонтанной, так и экспериментальной метастатической активности клеток.

3. Приобретение высокометастатического фенотипа в ходе селекции RSV-трансформированных клеток in vivo ассоциировано с увеличением продукции активной формы RalA. Введение доминантно негативной формы RalA как в RSV- трансформированные, так и в спонтанно трансформированные клетки, прошедшие селекцию на животных, приводит к супрессии их метастатической активности.

4. Отсутствует зависимость между метастатической активностью клеток, экспрессирующих различные последовательности мутантных белков Ha-ras и RalA, со скоростью их пролиферации и подвижностью. Показано, что среди эффекторов Ha-ras наибольший вклад в скорость пролиферации и подвижность клеток вносят киназы Rafl и PI3-К.

5. Отсутствует связь между метастатическим потенциалом исследуемых клеток и уровнем активности матриксных металлопротеиназ 1, 2 и 9 типов. Показано, что экспрессия экзогенного RalA приводит к снижению активности исследуемых металлопротеиназ.

6. Метастатическая активность клеток ассоциированна с уровенем метаболизации перекиси водорода in vitro и с устойчивостью клеток к перекиси водорода.

7. Стимуляция RalA сигнального пути ассоциированна со снижением уровня экспрессии S100A4 в RSY-трансформированных клетках. Экспрессия доминантно негативной формы RalA приводит к увеличениею уровня фосфорилированной формы паксиллина. Уровень фосфорилирования Erkl/Erk2 не коррелирует с уровнем метастатического потенциала. Уровень экспрессии Циклина D1 повышается при стимуляции Rafl и Р13-К~зависимых сигнальных путей и понижается при стимуляции RalA-ассоциированного сигнального пути.

8. Получена модель обратимого регулирования метастазирования с помощью стимуляции или супрессии малой ГТФазы RalA.