Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Регуляция пролиферации и апоптоза опухолевых клеток свободными радикалами

На правах рукописи

КОНДАКОВА Ирина Викторовна

РЕГУЛЯЦИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК СВОБОДНЫМИ РАДИКАЛАМИ

14.00.14 - онкология 14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

ТОМСК - 2005

Работа выполнена в ГУ НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН.

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН

доктор биологических наук, профессор

Чойнзонов Евгений Лхамацыренович Кушлинский Николай Евгеньевич

Новицкий Вячеслав Викторович

Дыгай Александр Михайлович Чердьтнцева Надежда Викторовна

Ведущая организация: ГУ НИИ онкологии им. проф. H.H. Петрова (МЗМП РФ), г. Санкт-Петербург.

Защита состоится _ апреля 2005 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д.001.032.01 при НИИ онколоти Томского научного центра СО РАМН (634009, Россия, г. Томск, пер. Кооперативный 5).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН.

Автореферат разослан__2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, _

д.м.н. CS^S — Евтушенко В. А.

Щпг АО<оЪЪЪЪ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Злокачественные новообразования являются одной из главных причин смертности в большинстве промышленно развитых стран. О глобальной величине проблемы онкологической заболеваемости и смертности можно судить на основе экспертных оценок, проводимых Международным агентством по изучению рака. Так, в 2000 г. в мире количество вновь заболевших раком оценивалось более чем в 10 млн. человек, а количество умерших - в 6,2 млн. [Напалков Н.П., 2004; Parkin D.M., 2001]. Прогнозируется увеличение заболеваемости злокачественными опухолями до 15 млн. к 2020 г., одновременно смертность возрастёт до 9 млн в год [Parkin D.M., 2001]. Важнейшим условием успеха противораковой борьбы является знание механизмов патогенеза злокачественного роста, необходимое для формирования адекватной терапевтической стратегии. Современное понимание этиологии и механизмов возникновения рака, достигнутое благодаря прогрессу в фундаментальной медицине и биологии, даёт представление о ряде принципиальных свойств, которыми обладают злокачественные опухоли. Ключевыми параметрами опухолевого роста являются повышенная способность к пролиферации, утрата способности к полной дифференцировке и апоптотической гибели, инвазивный рост и метастазирование [Лихтенштейн A.B. и соавт., 1998; Фильченков A.A. и соавт., 1999; Lundberg A.S., 1999; Лушников Е.Ф. и соавт., 2001; Копнин Б.П., 2002; Григорьев М.Ю. и соавт., 2003]. Благодаря этим свойствам опухолевые клетки имеют преимущество перед клетками нормальных тканей во время роста и выживания в одинаковых условиях. Однако несмотря на огромные усилия, прилагаемые во всём мире, и успехи, достигнутые в области изучения рака, проблема этиопатогенеза злокачественных опухолей остаётся в целом пока нерешённой.

Исследование клеточных и молекулярных механизмов регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток является одной из приоритетных направлений современной онкологии и патологической физиологии. В здоровых тканях устанавливается баланс между процессами пролиферации и гибели клеток [Фильченков A.A. и соавт., 1999; Lundberg A.S., е.а. 1999; Швембергер И.Н. и соавт., 2002]. В противоположность этому, злокачественный рост основан на автономной и неограниченной пролиферации клеток, составляющих ткань опухоли [Лихтенштейн A.B. и соавт., 1998; Григорьев, М.Ю. и соавт., 2003]. Вместе с тем, в трансформированных клетках возникает резистентность к индукции апоптоза, что также является одним из ключевых механизмов их выживания [Фильченков A.A. и соавт., 1999; Лушников Е.Ф. и соавт., 2001; Райхлин Т.Н. и соавт., 2002]. Клеточные механизмы запуска и активации апоптоза нарушаются в результате генетических мутаций, что приводит к снижению способности трансформированных клеток активировать программу клеточной смерти и определяет Щ)огрессироваш1е„.опухолевого процесса, а

также может являться одно

йрив причин MHcfiKefr венной лекарственной

БИЬ.НЮ"! Г I \ CrUiipuspr s

200 JP К__j

резистентности [Weinberg R.A. 1991; Лихтенштейн A.B. и соавт., 1998; Фильченков A.A. и соавт., 1999; Лушников Е.Ф. и соавт., 2001]. Изучение механизмов регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток важно не только с точки зрения понимания патогенетических особенностей развития и функционирования опухолей, оно также позволяет определить новые направления терапии злокачественных новообразований.

В последнее время достигнуты значительные успехи в исследовании роли молекул различных классов в регуляции роста клеток. Регуляторные молекулы, прежде всего гормоны и факторы роста, вступают во взаимодействие с клеточными структурами. Также к факторам, модулирующим рост, относят события, происходящие внутри клеток при передаче сигнала с участием медиаторных систем. В понимании механизмов, контролирующих размножение клеток, важную роль играет выяснение природы внутриклеточных сигналов, ответственных за переключение метаболизма на новый уровень при смене состояния пролиферации и покоя.

Активированные кислородные метаболиты (АКМ), такие как супероксидный анион-радикал, гидроксильный, алкоксильный и пероксидный радикалы, оксид азота (N0) и др. являются обязательными компонентами нормального функционирования клеток [Владимиров Ю.А. и соавт., 1991, Меньшикова Е.Б. и соавт., 1994; Реутов В.П. и соавт., 1998; Droge W., 2001]. Они играют важную роль в регуляции активности ферментов, поддержании стабильности мембран, транскрипции некоторых генов, являются необходимыми элементами функционирования ряда медиаторных систем и выступают в качестве посредников в формировании клеточного ответа [Murrell G.F.C. е.а., 1990; Ванин А.Ф., 2000; Allen R.G. е.а., 2000; Droge W., 2001; Pervin S. е.а., 2001; Nindl G. Т. е.а., 2004]. Это стимулирует большой интерес к изучению роли свободных радикалов в регуляции пролиферации опухолевых клеток [Burdon R.H., 1995; Саприн A.C. и соавт., 1999; Gotoh Y. е.а., 2002; Han M.J. е.а., 2003].

Накапливающиеся в литературе данные о молекулярных механизмах действия различных свободно-радикальных молекул свидетельствуют об их участии в регуляции роста и дифференцировки клеток [Burdon R., 1995; Burch I., 1997; Harris S.R. е.а. 2000]. Известно, что супероксидный радикал и перекись водорода в низких концентрациях стимулируют деление клеток [Вартанян Л.С. и соавт., 1992; Burch H.B. е.а., 1997]. Оксид азота также участвует в регуляции пролиферации различных клеток, в том числе и опухолевых [Ambs S. е.а., 1997; Gansauge S. е.а., 1997; Cahlin С. е.а., 2000].

Антиоксидантные ферменты (АОФ), контролируя концентрацию радикалов, могут выступать в качестве регуляторов пролиферации [Oberley T.D. е.а., 1995; Botwich D.G. е.а., 2000]. Подтверждением данного предположения является факт обратной корреляции между скоростью роста гепатомы и содержанием в ней Си, Zn - супероксиддисмутазы [Bartoli G.e.a., 1983]. Таким образом, высокая активность АОФ является не только фактором устойчивости опухолей к свободно-радикальным воздействиям, но и может тормозить неограниченное деление клеток неоплазмы.

В патогенезе онкологических заболеваний исключительно важное значение имеет нарушение программируемой клеточной гибели (апоптоза). Данные многих исследований свидетельствуют о том, что в силу своей высокой химической активности АКМ могут повреждать внутриклеточные структуры и быть индукторами и медиаторами апоптоза [Gorman А. е.а., 1997; Саприн A.C. и соавт., 1999;, Droge W., 2001; Pandey S. е.а., 2003; Li J. e.a. 2004]. Факторы химической и физической природы, которые при действии на клетки вызывают окислительный стресс, также индуцируют апоптоз. К таким факторам относятся ионизирующее излучение и некоторые противоопухолевые препараты (например, антрациклиновые антибиотики и цисплатин), которые, проникая в клетку, приводят к образованию свободных радикалов [Афанасьев И.Б. и соавт., 1986; Benchekroun M.N. е.а., 1993]. Предполагается, что характер действия АКМ на клетки связан с их внутри- и внеклеточным уровнем [King K.L. е.а., 1995; Саприн A.C. и соавт., 1999], однако при этом не выявлено определенных закономерностей, что делает актуальным изучение влияния кислородных радикалов и на пролиферацию и на апоптоз опухолевых клеток в зависимости от концентрации.

Оксид азота, являясь регулятором внутри- и межклеточных процессов, принимает непосредственное участие в реализации апоптотической программы [Реутов В.П. и соавт. 2000; Dodd F., е.а., 2000; Проскуряков С.Я. и соавт., 2001; Hofseth L., е.а., 2003]. Считается, что оксид азота может усиливать цитотоксичность свободных радикалов, причем NO-генерирующие соединения, вступая в реакцию свободно-радикального окисления, могут образовывать еще более токсическое соединение -пероксинитрит, который повреждает ДНК и вызывает ковалентные модификации белков в клетке, инициируя тем самым апоптоз [Radi R. е.а., 1991; Pietraforte D. е.а. 1997; Aust А.Е. е.а., 1999]. Однако, во многих исследованиях NO рассматривается, скорее, как антиоксидант, который тормозит развитие радикальных окислительных реакций [Kanner J. е.а., 1991; Padmaja S. е.а., 1993; Juckett M.B. е.а., 1996]. При этом нет однозначного ответа на вопрос, является NO активатором или ингибитором апоптоза [Singh S. е.а., 1997; Terwell D.S., е.а., 2000; Yang F. е.а., 2000].

Ряд принципиальных вопросов, важных для понимания закономерностей взаимодействия свободно-радикальных молекул с опухолевыми клетками и регуляторных механизмов пролиферации опухолевых клеток остаётся неизученным. К ним относится, в частности, выяснение того, какие события являются первоначальными и определяющими во взаимодействии опухолевых клеток с органическими гидропероксидами. В настоящее время только в единичных исследованиях учитывается возможность и важность модуляции активированными кислородными метаболитами различных этапов регуляции клеточного деления: лиганд-рецепторных взаимодействий, функционирования системы «вторичных посредников», активации и/или ингибирования эффекторных молекул клеток. Недостаточно исследованы механизмы влияния АКМ на ключевые компоненты внутриклеточной сигнальной системы опухолевых

клеток. Остается не изученным вопрос о совместном влиянии кислородных радикалов и NO на пролиферативный потенциал опухолевых клеток. Решение этих вопросов могло бы послужить основой для понимания патогенетических механизмов необластомогенеза, а это в свою очередь -разработать более эффективные подходы к комплексной патогенетической терапии злокачественных новообразований.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования явилось изучение роли свободных радикалов, оксида азота и антиоксидантных ферментов в механизмах регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние активированных кислородных метаболитов, органических пероксидов и доноров оксида азота на пролиферативную активность опухолевых клеток.

2. Исследовать влияние активированных кислородных метаболитов и оксида азота на индукцию апоптоза в опухолевых клетках.

3. Изучить кинетику взаимодействия экзогенных пероксидов с опухолевыми клетками и выяснить роль ферментативных и неферментативных антиоксидантов в этом процессе.

4. Изучить роль арахидоновой кислоты в механизмах регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток. Оценить эффект свободно-радикальных агентов на выход арахидоновой кислоты из фосфолипидов мембран опухолевых клеток и показать роль ферментов метаболизма фосфолипидов в этом процессе.

5. Исследовать зависимость активности антиоксидантных ферментов от скорости пролиферации и структурной организации опухолей в эксперименте.

6. Оценить связь активности антиоксидантных ферментов с пролиферацией клеток доброкачественных и злокачественных опухолей молочной железы.

7. Исследовать совместное влияние свободно-радикальных агентов и N0-генерирующих соединений на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток.

8. Исследовать влияние доноров оксида азота на опухолетоксическое действие доксорубицина in vitro.

9. Оценить возможность применения доноров оксида азота для повышения терапевтической эффективности антибиотиков антрациклинового ряда.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное исследование влияния веществ, генерирующих свободные радикалы, и доноров оксида азота в широком спектре концентраций на активность пролиферативных процессов в клетках экспериментальных опухолевых линий и индукцию в них апоптоза. Выявлено, что направленность действия исследованных соединений меняется в зависимости от концентрации, а именно, с уменьшением дозы снижается ингибиующее влияние на пролиферацию и индукцию апоптоза.

При достижении концентраций 10"* М и менее наблюдается стимуляция клеточного размножения.

Впервые исследована кинетика взаимодействия органических пероксидов с опухолевыми клетками и обнаружена экстраклеточная продукция глутатионпероксидазы и низкомолекулярных компонентов, обладающих антирадикальной активностью.

Впервые показана концентрационная зависимость влияния свободных радикалов на освобождение арахидоновой кислоты из фосфолипидов мембран и связь этого процесса с пролиферацией и апоптозом опухолевых клеток. Установлено, что под действием АКМ в высоких концентрациях, ингибирующих пролиферативные процессы и индуцирующих апоптоз, наблюдается значительный выход арахидоновой кислоты из фосфолипидов мембран и ингибирование ее включения в них. В противоположность этому, АКМ в низких дозах, стимулирующих пролиферацию, приводят к менее выраженному выходу жирной кислоты с сохранением репарации фосфолипидов. При этом показано, что выход арахидоновой кислоты из фосфолипидов мембран опосредован активацией фосфолипазы А. Влияние оксида азота на данные процессы носило ту же направленность, но выражено в меньшей степени.

Получены новые данные о зависимости активности антиоксидантных ферментов от выраженности пролиферативных процессов в клетках экспериментальной опухоли, доброкачественных и злокачественных опухолях молочной железы человека. Быстрорастущие опухоли характеризуются низкой активностью антиоксидантных ферментов, тогда как при уменьшении степени выраженности пролиферативных процессов происходит увеличение ферментативной активности.

Впервые показана способность доноров оксида азота (нитрит натрия, нитропруссид натрия и Ь-аргинин) защищать опухолевые клетки от токсического действия пероксирадикалов и доксорубицина. Экспериментально доказана возможность использования донора N0 -нитрозогуанидина для увеличения противоопухолевой эффективности доксорубицина.

Теорерическая и практическая значимость

Результаты исследования существенно расширяют фундаментальные представления о механизмах регуляции пролиферативной активности и апоптотической гибели опухолевых клеток. Показано, что вещества, генерирующие свободные радикалы, и доноры оксида азота в зависимости от концентрации могут активировать как пролиферативную активность, так и апоптоз опухолевых клеток, что подтверждает существование общей для этих процессов внутриклеточной регуляторной системы, частью которой являются радикалы кислорода и азота.

Полученные результаты формируют новые представления о биохимических закономерностях взаимодействия опухолевых клеток с активированными кислородными метаболитами, доказывая возможность

экстраклеточной регуляции уровня свободно-радикального окисления и взаимодействия пероксидов с внутриклеточной сигнальной системой.

Данные о взаимосвязи активности антиоксидантных ферментов с интенсивностью пролиферативных процессов могут послужить основой для выбора дополнительных информативных критериев при оценке биологических характеристик опухолей, в частности, их пролиферативной активности, которые в свою очередь, можно использовать в качестве факторов прогноза. Полученные результаты свидетельствуют о том, что доноры оксида азота могут защищать опухолевые клетки от свободно-радикального повреждения и выступать в качестве факторов развития лекарственной разистентности. Все это должно способствовать при назначении химиотерапии более тщательному отбору препаратов, которые могут стимулировать образование оксида азота и пероксидов в организме пациентов со злокачественными новообразованиями. Кроме того, в работе экспериментально обоснована возможность использования доноров оксида азота для увеличения противоопухолевой эффективности антибиотиков антрациклинового ряда.

Положения, выносимые на защиту

1. Супероксидный радикал, органические пероксиды и доноры оксида азота в зависимости от концентрации могут проявлять как цитотоксическую активность по отношению к опухолевым клеткам и индуцировать их апоптоз, так и стимулировать их пролиферацию.

2. Влияние пероксидов и доноров оксида азота на пролиферацию и апоптоз опосредуется взаимодействием с сигнал-передающей системой липидной природы, включающей арахидоновую кислоту.

3 Активность антиоксидантных ферментов снижена в фазу быстрого логарифмического роста экспериментальных опухолей по сравнению с фазой медленного стационарного роста и в злокачественных опухолях молочной железы с наивысшим митотическим индексом.

4. Доноры оксида азота (нитрит натрия, нитропруссид натрия и L-аргинин) снижают ингибирующий эффект пероксирадикалов на пролиферацию опухолевых клеток и тормозят индукцию апоптоза in vitro.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на Симпозиуме стран СНГ «Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации» (Москва, 28-29 сентября 1993 г.), на V Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 29-30 ноября 1993 г), на VI симпозиуме по биохимии липидов (Санкт-Петербург, 3-6 октября 1994 г), на Second International Conference on Clinical Chemiluminescence (Berlin, Germany, April 27-30, 1996), на Втором съезде биохимического общества РАН (Москва, 1932 мая 1997 г.), на International Conference "Regulation of biological processes by free radicals: role of antioxidants, free radical scavengers, and chelators" (Москва-Ярославль, 10-13 мая 1998 г.), на региональной научной конференции «Актуальные вопросы кардиологии» (Томск, 14-15 сентября

2000 г.), на 7th ESACP Congress (Caen, France, April 1-5 2001), на 7th International Conference "Eicosanoids & other bioactive lipids in cancer, inflammation and related diseases" (Nashville, USA, October 14-17, 2001), на VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 16-19 апреля 2002 г.), на 3 съезде онкологов и радиологов стран СНГ (Минск, 25-28 мая 2004 г.).

Публикации

Основные результаты диссертации опубликованы в 57 печатных работах, в том числе 13 в центральных отечественных и зарубежных реферируемых журналах. Получен патент РФ на изобретение № 2199749 от 27.02.2003.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 248 страницах и иллюстрирована 29 рисунками и 19 таблицами. Библиография включает 410 литературных источников, из которых 58 отечественных и 352 иностранных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Экспериментальные модели. Эксперименты выполнены на 460 инбредных половозрелых мышах-самцах линии DBA/2 и C-57B1/6J массой 18-22 г разводки питомника Научно-исследовательской лаборатории экспериментального биомоделирования Томского научного центра СО РАМН и питомника НИИ Фармакологии Томского научного центра СО РАМН. В работе использовали клеточную линию нормальных фибробластов мыши и линию FC3H3, полученную путем спонтанной трансформации in vitro эмбриональных фибробластов мьппей СЗН, а также штаммы асцитных опухолей аденокарциномы Эрлиха, лимфомы EL-4 и мастоцитомы Р815. Клеточные линии нормальных фибробластов и FC3H3 получены в Институте цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск), другие линии получены из банка опухолевых штаммов РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН (Москва).

2. Краткая характеристика обследованных больных. Исследовали образцы опухолей 45 больных раком молочной железы (РМЖ) после выполнения хирургического вмешательства в объеме радикальной мастэктомии и 25 больных с доброкачественными новообразованиями после секторальной резекции. Ткань опухоли очищали от участков некроза и кровоизлияний и помещали в жидкий азот. Все больные находились на лечении в отделении общей онкологии НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН. Возрастной интервал больных составил 35-76 лет. Распространенность опухолевого процесса оценивали по системе TNM.

Методы исследования. Определение уровня синтеза ДНК в опухолевых клетках при действии гидропероксидов и доноров оксида азота осуществляли по включению в клетки меченого радионуклидами предшественника синтеза нуклеиновых кислот [3Н]-тимидина ("Изотоп", Россия).

Митотическую активность клеток новообразований молочной железы изучали по методу И.А. Казанцевой (1981). Показателем митотической активности клеток является митотический индекс, который подсчитывался на 1000 клеток.

Индукцию апоптоза в опухолевых клетках регистрировали методом С.Н. Орлова (1993) по анализу степени фрагментации ДНК. Морфологическое исследование индукции апоптоза проводили по методу К. Min (2002). Для выявления апоптотических клеток использовали ДНК-тропный краситель бисбензимид (Hoechst 33342), который соединяется в местах A-G-nap поврежденной ДНК.

Кинетику разложения гидропероксида третичного бутила (ГПТБ) в суспензии опухолевых клеток исследовали хемилюминесцентным методом в реакции с пероксидазой и люминолом. Концентрацию ГПТБ определяли в суспензиях опухолевых клеток (106 клеток/мл) до и после 30, 60, 120, 300 и 600 с инкубации.

Антирадикальную активность супернатантов определяли люминометрически по снижению скорости радикалообразования при термическом разложении 2.2-азо-бис-изобутиронитрила (АИБН). Первоначально в течение 1 мин регистрировали сигнал, отражающий стационарную концентрацию радикалов в реакции декомпозиции АИБН. После введения образца интенсивность хемилюминесцентного сигнала снижалась, и на стационарном участке кинетической кривой регистрировали новый уровень свечения.

Обмен [1 -ыС]арахидоновой кислоты оценивали по ее включению в изолированные клетки и выходу в водную фазу из предварительно меченых клеток. Определение включения [Т-|4С]-арахидоновой кислоты в клеточные фосфолипиды проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием хроматографа «Ультрахром G Ti» («LKB», Швеция).

Количественное содержание индивидуальных фосфолипидов в опухолевых клетках определяли после экстрагирования хлороформ-метоналом по Фолчу. Разделение фосфолипидов на классы производили с помощью двумерной тонкослойной хроматографии по методу Васьковского В.Е. (1975) на силикагеле kiesegel 60 F 254 («Merck», Германия).

Определение активности ферментов метаболизма фосфолипидов -фосфолипазы А2, ацилСоА-лизофосфатидилхолин ацилтрансферазы, лизофосфолипазы и ацилСоА-синтетазы проводили радиометрическим методом [Bouroudian М. е.а., 1988;Nalbone G. е.а. 1990] с использованием меченых радионуклидами субстратов. Продукты реакции элюировали на микроколонке с силикагелем Biosil А («Bio-Rad», Франция) и помещали в сцинтилляционные флаконы для подсчёта радиоактивности на сцинтилляционном счётчике «Packard» (США).

Активность антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, глутатионпероксидазы (ГП), глутатионтрансферазы (ГТ) и глутатионредуктазы (ГР), а также фермента, в ходе реакции которого

образуется супероксидный радикал - ксантиноксидазы, определяли спектрофотометрическими методами [Beers R.F.A., е.а., 1952; Little С., е.а.., 1968; Ray L.E., е.а., 1975; Keen J. Н., е.а., 1976; Вартанян Л.С. и соавт., 1982].

Статистическую обработку результатов исследования проводили на персональном компьютере с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 5.0. После проверки характера распределения исследуемых выборок, значимость различий между группами определяли с помощью непараметрических критериев Вилкоксона-Манна Уитни и критерия хи-квадрат Пирсона. Для сравнения групп по количественному признаку использовали критерий множественного сравнения дисперсиошюго анализа - ANOVA. Для каждого анализируемого показателя вычисляли среднее (X), ошибку среднего (ш), среднеквадратичное отклонение. Статистически значимыми считали различия при р<0,05. Результаты экспериментов приведены в таблицах в виде Х±ш.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование влияния активированных кислородных метаболитов и оксида азота на пролиферативную активность и апоптоз опухолевых

клеток in vitro

В основе злокачественного роста лежит прогрессирующее и автономное увеличение генетически нестабильной клеточной массы, в которой постоянно происходит отбор клеток с наиболее агрессивным потенциалом. Нарушение регуляции количества клеток в опухолях является результатом дисбаланса процессов пролиферации и апоптоза [Weinberg R.A 1991; Фильченков A.A. и соавт., 1999; Lundberg A.S., е.а. 1999; Швембергер И.Н. и соавт., 2002, Григорьев, М.Ю. и соавт., 2003]. Важность изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе этих процессов, определяется взаимосвязью нарушений их регуляции с возникновением и развитием злокачественных опухолей, что необходимо для понимания патогенеза рака, а также поиска новых направлений терапии злокачественных новообразований.

Исследование влияния свободных радикалов и доноров оксида азота на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток проводилось на экспериментальных моделях мастоцитомы Р-815 и асцитной карциномы Эрлиха. В результате проведенных исследований было установлено, что действие различных кислородных радикалов и доноров оксида азота на пролиферативную активность опухолевых клеток мастоцитомы Р-815 и карциномы Эрлиха зависело от концентрации и химической структуры используемых соединений. Общая тенденция влияния их на опухолевые клетки заключалась в выраженном цитотоксическом эффекте высоких концентраций (10'3 - 10"5 М), что выражалось в снижении уровня синтеза ДНК и, соответственно, пролиферативной активности (рис.1).

Включение [311]-тимидина, % к контролю

О Н-1--1- т -,-т-,--,

0,0001 0,001 0,005 0,01 0,05 0,1 0,5 1

Концентрация, тМ

Рис. 1. Влияние свободных радикалов на включение [ Н]-тимидина в ДНК клеток карциномы Эрлиха. 1- контроль, 2 - 2,2'азо-бис(2-амидинопропан), 3 - гидропероксида третичного бутила, 4 - супероксидный радикал.

Включение [ Н]-тимвдина, % к контролю

180 165 150 -135 -120 -105 -90 -75 -60 -45 -30 15 -0

Концентрация, М

Рис. 2. Влияние Ж)-генерирующих соединений (1 - нитропруссид натрия, 2 - нитрит натрия, 3 - нитрозогуанидин) на включение [3Н]- тимидина в ДНК клеток карциномы Эрлиха.

При снижении концентрации (10"6 М и ниже) происходило уменьшение цитотоксического действия, непосредственно переходящее в стимуляцию пролиферации опухолевых клеток. Эта закономерность была выявлена в действии супероксидного радикала, 2,2'азо-бис(2-амидинопропана) (АБАП), продуцирующего пероксирадикалы, гидропероксида третичного бутила, пероксида линоленовой кислоты, и доноров оксида азота за исключением нитрозогуанидина, который не оказывал стимулирующего влияния на синтез ДНК в изученном спектре концентраций (рис.2). Слабое увеличение пролиферативной активности оказало добавление Ь-аргинина в суспензии обеих клеточных культур. Ингибирование ЫО-синтазной реакции метиловым эфиром нитроаргинина практически не изменяло скорость синтеза ДНК опухолевых клеток мастоцитомы Р-815, а в клетках карциномы Эрлиха приводило почти к 50% снижению этого процесса. Эти данные свидетельствуют о различном вкладе N0, образующегося в ЫО-синтазной реакции, в обеспечение рострегуляторных процессов в различных типах опухолевых клеток.

Подобная концентрационная зависимость была выявлена и при действии доксорубицина на синтез ДНК в опухолевых клетках. Были обнаружены концентрации антибиотика (10"7 М и ниже), стимулирующие пролиферативные процессы в опухолях. Следует отметить существование общего диапазона концентраций для всех соединений, генерирующих свободные радикалы, включая доксорубицин (10"7- 10"' М), в которых они проявляют ростстимулирующие свойства. Из всех исследованных АКМ наименее токсичным оказался супероксидный анион радикал. Он стимулировал пролиферацию клеток начиная с концентрации 6*10"* М.

Полученные в настоящей работе данные согласуются с результатами исследования ОсНоЬ У. и соавт. (2002), которые также выявили зависимость пролиферативной активности опухолевых клеток от концентрации АКМ. Установлено, что липидные гидроперекиси в концентрации 10"6 М и ниже стимулируют деление клеток рака толстой кишки. Авторы полагают, что возможным механизмом данного процесса является увеличение экспрессии циклина и циклинзависимой киназы 4, фосфорилирование

ретинобластомного белка, что способствует переходу клеток из фаз О0 и О] в фазу в, во время которой происходит синтез ДНК. Повышение концентрации липидных перекисей и времени воздействия приводило к окислительному повреждению ДНК и остановке митоза в фазе во Л3|, что способствовало прекращению роста клеточной популяции. Эти данные, также как и полученные в настоящей работе результаты, являются доказательством участия кислородных радикалов в регуляции пролиферативной активности опухолевых клеток.

Таким образом, можно заключить, что уровень интенсивности окислительного стресса определяет его конечный биологический эффект в диапазоне от разрушающего цитотоксического действия при высоких концентрациях окислительных агентов до регуляции функционального

состояния клеток при физиологических концентрациях. В ряду различных физиологических функций свободных радикалов важную роль занимает способность влиять на пролиферативную активность клеток.

Баланс между процессами пролиферации и апоптоза необходим для развития нормальных тканей [Райхлин Т.Н. и соавт., 2002; Швсмбергер И.Н. и соавт., 2002; Григорьев М.Ю. и соавт., 2003]. Следствием нарушения равновесия между ними является неограниченный злокачественный рост. Потгому изучение эффектов свободных радикалов на пролиферацию опухолевых клеток целесообразно в комплексе с оценкой их влияния на апоптоз. Исследование воздействия пероксидов на программируемую клеточную гибель клеток карциномы Эрлиха показало, что к наиболее выраженным результатам приводило использование гидропероксида третичного бутила, который индуцировал апоптоз в микромолярных концентрациях, тогда как для АБАП требовалось повышение действующих доз до 10"3 (рис.3). Снижение концентрации пероксирадикалов в среде инкубации приводило к ингибированию процесса апоптоза. Возможным механизмом индукции апоптоза прооксидантами, вероятно, является окисление SH-rpynn белков - медиаторов программируемой клеточной гибели, таких как факторы транскрипции c-Fos, c-Jun, АР-1 и др [Лушников Е.Ф. и соавт., 2001, Cross J.V., е.а., 2004; Tormos С., е.а., 2004; Xu Q., е.а., 2004].

В отличие от пероксирадикалов, действие доксорубицина на индукцию апоптоза, носило волнообразный характер, и с повышением концентрации не наблюдалось роста программируемой гибели опухолевых клеток Это дает основание предположить, что в высоких концентрациях основной формой реализации противоопухолевого эффекта антибиотика является индукция некроза клеток неоплазмы. Стоит отметить, что наряду с увеличением апотттотической гибели при действии доксорубицина в низких концентрациях увеличивалась и пролиферативная активность опухолевых клеток. Вероятно, это обусловлено существованием универсальных сигнальных путей, которые принимают участие в регуляции обоих процессов [King K.L.,e.a., 1995; Саприн A.C. и соавт., 1999; Gewirtz D.A., е.а., 1999].

Применение доноров оксида азота в концентрации приводило к

достоверной активации индукции апоптоза по сравнению с контрольным уровнем. Снижение концентрации исследуемых доноров до 10'5М вызывало ингибирование запуска апоптотической программы.

Таким образом, при анализе полученных нами данных была отмечена концентрационная зависимость действия веществ, генерирующих свободные радикалы, включая доноры оксида азота, на пролиферативную активность и индукцию апоптоза опухолевых клеток. Высокие концентрации этих соединений угнетали пролиферативную активность и индуцировали апоптоз опухолевых клеток. Снижение концентрации действующих агентов в среде инкубации приводило к увеличению пролиферации опухолевых клеток и снижению процесса запуска программируемой клеточной смерти. В целом,

редокс-потенциал может являться важным фактором влияния на кинетику опухолевого роста, которая определяется митотической и апоптотической активностью клеток.

0,01 0,5 1 5 10

Концентрация, мМ

0,001 0,0) 0,1 1 10 Концентрация, мкМ

Рис. 3. Влияние 2,2'азо-бис(2-амидинопропан)а (А) и гидропероксида третичного бутила (Б) на расщепление хроматина в клетках карциномы Эрлиха. 1 -контроль, 2- АБАП.

Феномены стимуляции и ингибирования пролиферации опухолевых клеток под действием соответственно низких и высоких концентраций пероксидных радикалов, доксорубицина и ЫО-генерирующих соединений являются небезынтересными с теоретической и практической точек зрения. С

теоретической точки зрения, полученные результаты хорошо согласуются с концепцией Г. Селье и существующими представлениями, основанными на многочисленных данных литературы о том, что малые дозы токсических веществ (слабый химический стресс) оказывают стимулирующее действие, а высокие их дозы оказывают, соответственно, повреждающее действие, вплоть до гибели клеток [Реутов В.П. и соавт. 2000]. Кроме того, полученные данные свидетельствуют о том, что нарушение в системе регуляции синтеза оксида азота и активных форм кислорода могут быть далеко не безразличны для пролиферативной активности опухолевых клеток. С практической точки зрения, полученные результаты представляют интерес в связи с тем, что реальные популяции опухолевых клеток в организме онкологических больных гетерогенны и изменчивы по многим фенотипическим признакам. В связи с этим нельзя исключить возможность существования клонов клеток в одном опухолевом узле с различным порогом чувствительности к химиотерапевтическим воздействиям. Вследствие этого, специфическая противоопухолевая терапия может, привести к гибели значительной массы опухолевых клеток, но в то же время оказать стимулирующее воздействие на пролиферацию отдельных высокорезистентных клеток, в результате чего может наступить генерализация опухолевого процесса.

Регуляция пролиферации и апоптоза опухолевых клеток - сложный многостадийный процесс, включающий на начальном этапе взаимодействие регуляторной молекулы со специфическими рецепторами. Поскольку в настоящее время не охарактеризован рецепторный аппарат для свободно-радикальных молекул (за исключением оксида азота), то для выяснения механизма, с помощью которого эти вещества могут влиять на сложную регуляторную внутриклеточную систему, представлялось необходимым исследовать параметры взаимодействия пероксирадикалов с плазматической мембраной и их влияние на метаболизм основных липидных компонентов мембран - фосфолипидов.

Результатом взаимодействия гидроперекиси третичного бутила с плазматическими мембранами опухолевых клеток являлось ее разложение с образованием пероксидных радикалов, которые могут дать начало цепи окисления липидов, белков и ДНК [Владимиров Ю.А., 1991, 1998; Меныцикова Е.Б. и соавт., 1994]. Изучение кинетики разложения ГПТБ в суспензии клеток мастоцитомы Р-815, лимфомы EL-4 и карциномы Эрлиха показало, что этот процесс в опухолевых клетках протекает значительно медленнее по сравнению с нормальными. Кроме того, была выявлена экстрацеллюлярная продукция белков, обладающих глутатионпероксидазной активностью, и низкомолекулярных соединений с выраженной антирадикальной активностью (табл. 1). Это свидетельствует о существовании экстраклеточного уровня защиты опухолевых клеток от окислительного воздействия, что подтверждается данными Sandstrom P.A. и соавт. (1993), показавшими способность клеток лейкемии человека экстраклеточно продуцировать каталазу.

Таблица 1.

Антирадикальная и глутатионпероксидазная активность в супернатантах асцитных мышиных опухолевых клеток (М±т)

Асцитная опухоль Антирадикальная активность, Активность

усл. ед. х К)3 глутатионпероксидазы,

контроль Трихлоруксусная мкмоль НАДФН/мкг

кислота белка

Лимфома EL-4 1,7±0,08 0,83±0,04 10,85±0,89

Мастоцитома Р-815 2,1 ±0,09 2,1 ±0,06 2,08±0,14

Карцинома Эрлиха 1,9±0,1 1,6±0,05 8,67±0,37

Другим аспектом взаимодействия свободных радикалов с мембранами является влияние на метаболизм фосфолипидов, в состав которых входит арахидоновая кислота. Она является предшественником важного класса физиологически-активных соединений - эйкозаноидов, которые многими исследователями рассматриваются в качестве местных гормонов и влияют на внутриклеточные процессы, в том числе пролиферацию [Anderson, Eling], В настоящей работе показано, что при активации пролиферации трансформированных фибробластов наблюдается усиление метаболизма арахидоновой кислоты, которое выражается в увеличении ее включения в фосфолипиды, главным образом, в фосфатидилхолин и кардиолипин.

Изучение влияния свободных радикалов на выход и включение арахидоновой кислоты в мембраны опухолевых клеток показало, что гидропероксид третичного бутила в низких концентрациях, активирующих пролиферацию опухолевых клеток, усиливал в 3 раза высвобождение [1-14С| арахидоновой кислоты из фосфолипидов не влияя на процесс ее включение в них (рис.4). При действии токсических доз 1 IIIЬ было обнаружено, что пероксид значительно (в 7 раз) стимулировал выход жирной кислоты из клеточных фосфолипидов и ингибировал репаративные процессы, что может быть важным фактором в нарушении структурно-функциональого состояния мембран. Выход [1-14С]-арахидоновой кислоты был связан с активацией ФЛА, в то время как активности лизофосфолипид липазы, ацилСоА: лизофосфатидилхолин ацилтрансферазы и ацилСоА синтетазы не менялись под действием ГПТБ.

Аналогичным, но менее выраженным действием обладали доноры оксида азота. Инкубация опухолевых клеток мастоцитомы Р-815 в среде содержащей NaN03 в различных концентрациях приводила к увеличению выхода [1-,4С]-арахидоновой кислоты из мембран фосфолипидов на 36% по сравнению с контрольным уровнем. В то же время L-аргинин не оказывал

активирующего воздействия на выход арахидоновой кислоты из фосфолиттидов мембран опухолевых клеток. Исследование включения арахидоновой кислоты в фосфолипиды мембран опухолевых клеток показало, что добавление КаЖ)2 в высоких концентрациях (КГ'М) в среду инкубации опухолевых клеток мастоцитомы Р-815 приводило к ингибированию этого процесса.

О 30 60 90 120

min.

min

Рис. 4. Влияние гидроперекиси третичного бутила на выход (А) [1,4-С]-арахидоновой кислоты из клеток мастоцитомы Р-815 и ее включение (Б) в клетки. 1. Контроль, 2. ПТГБ - 5 мМ, 3. ГТТТБ - 5 мкМ.

Таким образом, действие ГГТГБ и доноров оксида азота в концентрациях, стимулирующих пролиферацию, выражается увеличении выхода жирной кислоты, которая в дальнейшем может использоваться как субстрат для синтеза биологически активных эйкозаноидов [Eling Е.Т., е.а., 1994]. Метаболиты арахидоновой кислоты участвуют в передаче пролиферативного сигнала [Eling Е.Т., е.а., 1994; Korystov Yu. N., е.а., 1998] и увеличение ее содержания под действием свободных радикалов может являться одной из причин приводящей к усиленной пролиферации опухолевых клеток. С другой стороны, чрезмерное повышение уровня свободной арахидоновой кислоты внутри клеток, которое наблюдалось при действии ГПТБ и донора оксида азота в высоких дозах, обладающих токсическим эффектом, приводит к апоптотической гибели клеток неоплазмы. Участие свободной арахидоновой кислоты в индукции апоптоза подтвердается исследованиями, в которых показана ее важная роль в активации каспаз [Brush A.R., 2001; Garrido R., е.а., 2001] и повышении проницаемости мембран митохондрий для цитохрома С и AIF [Rizzo М Т., е.а., 1999; Scorrano L., е.а., 2001].

Параллельно с увеличением концентрации свободной арахидоновой кислоты при действии токсических доз пероксида наблюдалось накопление продукта фосфолипазного гидролиза - лизофосфатидилхолина. Лизофосфатидилхолин также считается цитотоксичным продуктом, который является детергентом, разрушающим стабильность липидного бислоя [Sedlis S. Р., е.а., 1988] Индукция апоптоза опухолевых клеток может быть следствием увеличения содержания как свободной арахидоновой кислоты, так и лизофосфолипидов под действием высоких концентраций свободных радикалов.

Таким образом, нами установлено, что регуляция как пролиферативной активности опухолевых клеток, так и индукции апоптоза может осуществляться свободными радикалами путем их влияния на уровень свободной арахидоновой кислоты, которая, вероятно, является одним из компонентов универсального пути передачи внутриклеточного сигнала. Переключение и определение конкретного пути реализации сигнала зависит от концентрации действующего агента.

Для поддержания стационарного уровня свободных радикалов и блокирования цепных реакций в клетках экспрессируются антиоксидантные ферменты, которые могут оказывать существенное влияние на вес физиологические процессы, регулируемые этими высокоактивными молекулами. Так, в представленной работе обнаружена взаимосвязь между активностью ключевых ферментов метаболизма супероксидного радикала, органических пероксидов и выраженностью пролиферативных процессов в опухолевых клетках как в эксперименте на моделях асцигного и солидного роста карциномы Эрлиха, так и в опухолях человека. Наблюдалось существенное, в несколько раз, повышение активности супероксид дисмутазы при переходе клеток карциномы Эрлиха из логарифмической фазы, которая характеризуется более высокой скоростью роста, в стационарную фазу (табл.

2). Исследование ксантиноксидазы - фермента, катализирующего образование супероксидного радикала, показало его максимальную активность в логарифмическую фазу роста опухоли, тогда как в стационарную фазу происходило достоверное снижение активности этого фермента.

Таким образом, повышение активности ксантиноксидазы в логарифмическую фазу роста с одной стороны и снижение активности СОД с другой дают основание считать, что процесс наработки супероксидного радикала активно протекает при высокой скорости опухолевого роста, тогда как его элиминация ингибирована. Представленные в данной работе результаты указывают на тесную взаимосвязь между ключевыми ферментами метаболизма супероксидного радикала и активностью пролиферативных процессов в опухолевых клетках. Торможение скорости пролиферации в стационарной фазе роста опухолей может быть связано, по нашему мнению, со значительным ростом супероксиддисмутазной активности в этой фазе. Можно заключить, что СОД, контролируя концентрацию Ог", по-видимому, является одним из регуляторов пролиферативной активности. Существенная разница в активности ферментов в асцитной и солидной формах объясняется тем, что асцитная опухоль характеризуется высокой скоростью клеточной пролиферации.

Таблица 2.

Зависимость активности антиоксидантных ферментов от фазы и формы роста карциномы Эрлиха

Фазы роста

логарифмическая стационарная

Ферменты асцит солид асцит солид

СОД 8,91±2,3 23,6±4,1* 16,78±3,9 106,88±17,1*

каталаза 1,68±0,6 12,97±3,7* 1,44±0,5 6,31±0,9

КО 12,78±3,8 7,9±3,2 2,39±0,б 5,63±1,6*

гп 29,69±4,3 44,9±8,6* 35,4±4,3 48,91 ±5,1 51,86±4,9

ГР 29,32±4,1 26,7±4,3 26,03±3,7

ГТ 88,03±18,7 102,55±23,9 142,85±19,8 138,35±20,5

Примечание- значимость различий между солидной и асцитной формами роста р<0,01. СОД супероксиддисмутаза, КО - ксантиноксидаза, ПТ - глутутионпероксидаза, ГР -глутатионредуктаза, ГТ - глутатионтрансфераза.

Также продемонстрирована тесная взаимосвязь активности глютатионзависимых ферментов с фазой и формой роста карциномы Эрлиха (табл.2). Активность глутатионзависимых ферментов глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы в клетках асцитной опухоли в логарифмической фазе роста была значительно ниже по сравнению с другими фазами роста и активностью ферментов в солидной опухоли. В стационарной фазе роста наблюдалось достоверное увеличение активности обоих ферментов, как в солидной, так и в асцитной формах. Поскольку эти ферменты регулируют внутриклеточный пул органических пероксидов, то участие последних в процессах, ре1улирующих пролиферацию опухолевых клеток, является вполне вероятным.

На примерах злокачественных и доброкачественных опухолей молочной железы человека была проведена сравнительная оценка активности антиоксидантных ферментов в зависимости от митотического индекса исследуемых опухолей. В данных исследованиях выявлены те же тенденции к снижению активности АОФ при увеличении числа делящихся клеток, что было продемонстрировано на экспериментальных моделях.

Установлено, что зависимость ферментативной активности от выраженности пролиферативных процессов в доброкачественных и злокачественных опухолях имеют принципиальные отличия.Так, нами было показано, что в фиброаденомах молочной железы с увеличением митотического индекса (до 7— 120/оо) наблюдалось повышение активности практически всех исследуемых ферментов, причем наиболее выраженный рост был зарегистрирован для каталазы и глутатионтрансферазы. Изменение активности глутатионпероксидазы было наименее значимо. Низкие значения активности ксантиноксидазы, продуцирующей супероксидный радикал, наблюдались в тканях доброкачественных опухолей с невысокой скоростью пролиферации. Такие результаты, вероятно, свидетельствуют о физиологическом повышении активности АОФ в ответ на увеличение продукции активированных кислородных метаболитов при клеточном делении, их своевременной детоксикации и поддержании окислительно-восстановительного равновесия в клетках доброкачественных опухолей.

В противоположность этому, в тканях РМЖ форма зависимости активности АОФ от митотического индекса имеет другой характер. В опухолях с наивысшим митотическим индексом (>35°/оо) была зарегистрирована наиболее низкая активность СОД, ГТ, ГП и ГР. Исключение составила только высокая активность каталазы. Снижение активностей ГП и ГР по мере возрастания числа митозов в опухолях носило линейный характер, тогда как изменения СОД и ГТ были выражены более сложной зависимостью. Представленные результаты свидетельствуют о том, что в опухолевых клетках не происходит элиминации АКМ в должной степени. Возрастание митотической активности злокачественных опухолей, возможно, сопровождается увеличением продукции супероксидного радикала. Подтверждением этого предположения является показанное в

наших экспериментах увеличение активности ксантиноксидазы, катализирующей образования эндогенного супероксидного радикала во многих активно пролиферирующих опухолях. Существующие экспериментальные данные подтверждают предположение о повышении его концентрации в физиологических пределах в активно пролиферирующих клетках [Аскарова Э.Л. и соавт., 1987; Вартанян Л.С. и соавт., 1992]. В ряде работ также показан высокий конститутивный уровень перекиси водорода в опухолевых клетках [Oberley L.W. е.а. 1988; Burdon R.H 1995]. Вероятно, что в дальнейшем эти радикалы участвуют в окислительной модификации ДНК, вызывают генотоксический эффект и способствуют прогрессии опухоли, поддерживая ее малипгазированное состояние, инвазивность и метастатический потенциал.

Несмотря на то, что требуются дополнительные исследования для окончательных выводов о роли АОФ в регуляции пролиферации опухолевых клеток, в настоящее время проведены первые исследования по использованию этих ферментов в терапии опухолей. Данные о способности СОД ингибировать пролиферацию клеток при повышении экспрессии фермента послужили основой для первых опытов применения СОД и миметиков СОД в качестве противоопухолевых средств. В эксперименте была показана регрессия опухолевых культур при трансфекции в них кДНК фермента Mn-СОД [Li N., е.а., 1998]. Таким образом, возможность ингибирования пролиферации опухолевых клеток антиоксидантными ферментами открывает перспективу их использования в качестве противоопухолевых средств.

Данные представленные в настоящей работе доказывают возможность регуляции свободными радикалами таких важных функциональных состояний, как пролиферация и апоптоз опухолевых клеток. В механизме данных процессов большую роль играет взаимодействие радикалов кислорода и азота с системами внутриклеточной передачи сигнала, и их конечный эффект зависит от концентрации. Однако, внутри клетки возможно сразу образование нескольких типов свободно-радикальных молекул, которые могут взаимодействовать друг с другом. Влияние такого взаимодействия на пролиферацию опухолевых клеток и индукцию в них апоптоза до сих пор исследовано недостаточно. Поэтому представлялось важным изучить влияние комбинации веществ, генерирующих пероксирадикалы и доноров оксида азота на пролиферативную активность и апоптоз опухолевых клеток. Исследования такого плана могут представлять интерес и в связи с тем, что в основе многих классических методов лечения онкологических заболеваний, применяемые в клинической практике (химио-, лучевая и фотодинамическая терапия), лежит свободно-радикальный механизм Поэтому важно оценить возможность использования доноров оксида азота в фармакологических целях в комплексной терапии опухолей.

Следующая серия экспериментов была посвящена изучению сочетанного воздействия свободных радикалов и N0 на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток в модельной системе in vitro.

Предварительные исследования показали концентрационную зависимость влияния пероксидов на пролиферативную активность клеток карциномы Эрлиха, что выражалось в ингибировании синтеза ДНК высокими концентрациями и стимуляцией этого процесса выше контрольных значений низкими дозами используемых соединений.

При исследовании сочетанного действия оксида азота и свободно-радикальных агентов на пролиферацию опухолевых клеток было показано, что доноры NO в нетоксичной концентрации в комбинации с субтоксичными концентрациями пероксидов увеливали включение [3Н]-тимидина в ДНК по сравнению с контрольной популяцией опухолевых клеток, инкубированных только с источниками пероксидных радикалов, либо не влияли на нее. Комбинация NO-доноров в тех же концентрациях с цитотоксичными дозами ГПТБ и АБАП, угнетающих синтез ДНК более чем на 80%, приводила к снижению антинролиферативного действия свободных радикалов (табл. 3). Анализируя полученные данные можно заключить, что оксид азота снижает токсический эффект пероксирадикалов на опухолевые клетки и усиливает их ростстимулирующее действие при использовании в нетоксичных концентрациях, что в целом позволяет предположить защитные свойства NO в культурах злокачественных клеток.

Таблица 3.

Влияние доноров оксида азота на токсический эффект пероксидных радикалов в клетках карциномы Эрлиха_г——,_ _

Контроль АВАП(2х10"2М) ГПТБ(10"5М)

Контроль 100 25,1+2,3* 7,3±1,7*

SNP 10'3М 52,4±8,5* 36,8±8,9 1,8±0,6**

Ю^М 98,0±13,7* 76,9±18,3** 11,6±2,6

10"5М 132,1±25,9* 118,2±35,3** 8,7±1,1**

NaNO2 10'3М 79,6±19,3* 57,4±10,9** 20,6+5,3**

Ю^М 98,2±20,7* 102,9±19,0** 8,3±1,8

10"3М 148,3±24,8* 73,5±15,7** 4,6±2,6**

Ь-аргинин,5 х 10 3М 185,6±23,8* 69,3±14,6** 3,4±1,5**

Примечание- * р<0,05 - значимость различий по сравнению с контролем; ** р<0,05 - значимость различий по сравнению с действием АБАП и ГПТБ, соответственно Результаты выражены я % по отношению к контролю.

Такое влияние может быть обусловлено антиоксидантными свойствами оксида азота что, вероятно, и обуславливает его цитопротекторное действие. Способность NO связывать органические пероксиды с образованием пероксинитритов, которые превращаются в нитраты подтверждает это предположение [Padmaja S., е.а., 1993; Gorbunov N.V., 1997]. Кроме того, известно, что NO связывает мембранные и внутриклеточные комплексы железа, что препятствует распаду пероксидов с образованием радикалов и развитию цепных реакций свободно-радикального окисления [Kanner J., е.а., 1991; JuckettM.B, е.а., 1996].

Изучение сочетанного действия оксида азота и свободных радикалов на индукцию апоптоза опухолевых клеток карциномы Эрлиха показало активацию этого процесса при комбинированном применении нитрита натрия (10'5 М) и АБАП (0,1 мМ), L-аргинина (5x10"3 М) и АБАП (0,1 мМ), L-аргинина и I II I b (0,1 мМ). В других случаях наблюдалось снижение апоптотической гибели клеток. Основываясь на полученных результатах можно предположить, что сочетанное применение доноров оксида азота и свободно-радикальных агентов в низких концентрациях может приводить к усиленной пролиферации с одновременной индукцией апоптоза.

Одним из частных случаев свободно-радикального воздействия на опухолевые клетки является химиотерапия лекарственными препаратами, в частности антрациклиновыми антибиотиками [Афанасьев И.Б., 1986; Benchekroun M.N., е.а., 1993]. Использование комбинации доксорубицина с донорами оксида азота приводило к достоверному увеличению процессов синтеза ДНК в опухолевых клетках карциномы Эрлиха, за исключением усиления опухолетоксического действия доксорубицина (10~7 М), которое наблюдалось при добавлении доноров оксида азота нитрита натрия и нитропруссида натрия (SNP) в концентрациях 10'3 М. L-аргинин в сочетании с доксорубицином оказывал выраженное цитопротекторное действие. В то же время было обнаружено соединение, которое значительно усиливало цитотоксическое действие доксорубицина. Так, метил-N- нитро-нитрозогуанидин (MNNG) в концентрации 10"4 М в 3 раза усиливал ингибирующее действие доксорубицина на синтез ДНК (рис. 5).

Таким образом, полученные результаты показывают, что применение доксорубицина в сочетании с донорами оксида азота in vitro выявило наличие сложной закономерности в воздействии различных комбинаций доз антибиотика и доноров оксида азота на пролиферативную активность опухолевых клеток. Доноры оксида азота имеют неоднозначное действие на опухолетоксический эффект доксорубицина, что зависит от химического строения и концентрации используемых соединений. Выявленное снижение антипролиферативного эффекта доксорубицина и индукции апоптоза опухолевых клеток донорами N0 дает основание предположить, что оксид азота может являться одним из факторов, способствующим появлению клонов опухолевых клеток, устойчивых к доксорубицину и обладающих повышенной пролиферативной активностью.

Включение [5Н1-тимидина, % к контролю

Рис. 5. Комбинированное действие метил-Н-ншро-нитрозогуанидина (MNNG) и доксорубидина на пролиферацию опухолевых клеток карциномы Эрлиха in vitro: 1 - контроль; 2 - доксорубицин (10"3М); 3 - MNNG (10"3М); 5 - MNNG (10"4М); 7 - MNNG (10"5М); 4 - доксорубицин + MNNG (10"3М); 6 -доксорубицин + MNNG (10^*М); 8 - доксорубицин + MNNG (1 (Г5М).

Оценивая полученные в настоящей работе данные, можно заключить, что NO, вероятно, является фактором, защищающим ДНК опухолевых клеток от повреждающего действия доксорубицина и вносит свой вклад в развитие резистентности опухолей к антрациклиновым антибиотикам. Однако стоит отметить, что в некоторых ситуациях наблюдалось потенцирование повреждающего действия доксорубицина. В итоге конечный результат комбинированного действия оксида азота и свободных радикалов зависит от многих факторов: от концентрации действующих агентов, от типа клеток, от условий постановки экспериментов. Учитывая способность некоторых противоопухолевых препаратов усиливать генерацию NO, необходимо, по нашему мнению, дополнительно исследовать противоопухолевую активность комбинации препаратов, используемых в химиотерапии.

На наш взгляд, наиболее перспективным для клинического использования из всех исследованных доноров оксида азота являются нитрозосоединения, что подтверждаеся существованием противоопухолевых препаратов класса нитрозомочевины, нашедшей терапевтическое применение [Авдеева О.С., 1980; Левина В.И. и соавт., 2001]. Для более полной оценки способности нитрозогуанидина модулировать противоопухолевое действие доксорубицина было проведено исследование т vivo. Показано, что MNNG может усиливать терапевтический эффект

доксорубицина что выражалось в значительном уменьшении размера опухоли, а также усилении индуктщи апоптоза и некроза клеток карциномы Эрлиха по сравнению с действием одного химиопрепарата (табл.4).

Таблица 4.

Противоопухолевое действие доксорубицина и доноров оксида азота на карциному Эрлиха in vivo.

Объем опухоли, мл Число клеток асцита, млн. Некроз, % Апоптоз, %

Контроль 0,44±0,04 68,5±10 2,99±0,3 7±0,5

Доксорубицин, 10 мг/кг 0,048±0,005* 13,4±2,5 * 9,8±2,6* 3,59±0,2*

MNNG 2,5 мг/кг 0,342±0,06* 12,7±2,1* 18,2±3,2* 6,9±0,54*

MNNG+Докс. 0,013±0,002** 6,8±1,3 ** 15,8±3,1** 19,6±3,7**

Примечание: *- р<0,05 - значимость различий по сравнению с контролем. **- р<0,05 -значимость различий по сравнению с колонкой "Доксорубицин".

Известно, что противоопухолевая эффективность циклофосфана повышалась при его комбинации с донором N0 по отношению к клеткам лейкемии Р-388 [Коновалова Н.П. и соавт., 2003]. Сопоставляя эти факты и данные, представленные в настоящей работе, можно сделать вывод о целесообразности применения доноров оксида азота для повышения эффективности используемых в клинике химиотерапевтических агентов. Однако для окончательного заключения по использованию доноров N0 в химиотерапии опухолей необходимы дополнительные исследования зависимости противоопухолевого эффекта от дозы, химической структуры соединений и стадии опухолевого процесса.

Заключение. Обобщая представленные результаты, можно сказать, что в клетках млекопитающих развились не только механизмы, позволяющие адаптироваться к сосуществованию с агрессивными свободными радикалами, но и пути использования этих высокоактивных молекул для регуляции жизненно-важных функций. Свободные радикалы играют важную физиологическую роль в жизнедеятельности организма, и к числу их биологических эффектов относится регуляция пролиферации и апоптотической гибели клеток. При злокачественной трансформации происходит приспособление данных механизмов для обеспечения максимальной способности к выживанию и росту опухолевых клеток. Если в

нормальных клетках срабатывает программа ограниченного числа делений и входа в дифференцировку и затем апоптоз, то в опухолевых клетках свободные радикалы являются одним из инструментов обеспечения их неконтролируемого роста, мутагенеза и опухолевой прогрессии.

В дополнение к имеющимся общепринятым молекулярно-биохимическим характеристикам опухолевых клеток, которые включают наличие мутаций в генах, продукты которых контролируют пролиферацию и апоптоз, аутокринный тип регуляции клеточной численности популяции злокачественного узла, активацию внутриклеточных сигнальных путей, мы обнаружили новые атрибуты опухолевого роста На основании полученных нами данных, следует отметить, что злокачественные клетки отличают от нормальных такие характеристики, как

• внеклеточная продукция ферментативных и неферментативных антиоксидантов

• замедленный распад экзогенных пероксидов

• быстрая активация и высокая индуцибельность ферментов, участвующих в образовании сигнальных молекул липидной природы

• нарушение регуляции окислительно-восстановительного гомеостаза в опухолевых клетках, ингибирование активности антиоксидантных ферментов в быстрорастущих опухолях

• использование оксида азота в качестве фактора защиты опухолевых клеток от окислительного стресса.

По результатам настоящего исследования и литературным данным возможно выделить несколько основных механизмов влияния свободных радикалов на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток. Необходимо подчеркнуть существование концентрационной зависимости влияния свободных радикалов на клеточные физиологические эффекты и метаболические процессы. В высоких концентрациях они оказывают повреждающее действие на опухолевые клетки, что выражается в ингибировании синтеза ДНК, нарушении процессов репарации клеточных мембран. Итогом такого воздействия являются угнетение пролиферации опухолевых клеток и индукция в них апоптоза. В противоположность этому, свободные радикалы в низких концентрациях усиливает передачу ростстимулирующих сигналов, в том числе, за счет освобождения арахидоновой кислоты, стимулируют синтез ДНК, что ведет к активации пролиферативных процессов в опухолевых клетках.

Доноры N0 могут также оказывать неоднозначное действие на процессы пролиферации и апоптоза опухолевых клеток. На данном этапе сложно найти азаимосвязь между действием всех факторов, определяющих терапевтический эффект доноров оксида азота, однако можно констатировать, что решающее значение в их физиологических ответах имеет концентрация и химическая структура МО-генерирующих соединений. В данной работе получены результаты, показывающие принципиальную

возможность развития направления по использованию доноров оксид азота для усиления терапевтической эффективности доксорубицина.

Наиболее перспективным для развития направления по применению доноров оксида азота в онкологии представляется проведение комплексных исследований, совмещающих изучение их антиканцерогенной, противоопухолевой, антиметастатической и иммуномодулирующей активности, что в итоге может привести к их широкому клиническому использованию.

В заключение необходимо отметить, что нарушение окислительно-восстановительного гомеостаза играет важную роль в поддержании роста опухолей, поэтому определение возможности регуляторного влияния на свободно-радикальные процессы в злокачественных клетках может являться плодотворной предпосылкой на пути создания противоопухолевых средств нового типа.

ВЫВОДЫ

1. Влияние свободных радикалов на пролиферацию опухолевых клеток носит дозозависимый характер. Радикалы кислорода (супероксидный радикал, органические пероксиды) и доноры оксида азота в высоких концентрациях (10"3-10"5М) ингибируют пролиферацию, а в низких (10" б-10'9 М) проявляют ростстимулирующую активность по отношению к асцитным опухолевым клеткам. Исключение составляет нитрозогуанидин, который в спектре исследованных концентраций не активирует пролиферативные процессы в опухолевых клетках.

2. Степень индукции апоптоза опухолевых клеток органическими пероксидами и донорами оксида азота более выражена при увеличении концентрации используемых соединений. Усиление программируемой гибели клеток сопровождается ингибированием их пролиферативной активности.

3. Кинетика взаимодействия экзогенных пероксидов с асцитными опухолевыми клетками характеризуется более медленным распадом по сравнению с нормальными клетками (лимфоцитами и эритроцитами).

4 Опухолевые клетки секретируют экстраклеточно

глутатионпероксидазу и низкомолекулярные соединения небелковой природы, обладающие антирадикальной активностью.

5. Состояние пролиферативной активности трансформированных клеток характеризуется усилением метаболизма фосфолипидов, которое выражается в увеличении включения арахидоновой кислоты в фосфолиттиды мембран, главным образом в фосфатидилхолин и кардиолипин по сравнению с покоящимися клетками.

6. При действии свободных радикалов, в концентрациях, стимулирующих пролиферацию, наблюдается трехкратное увеличение

выхода арахидоновой кислоты из фосфолиттидов опухолевых клеток при сохранении репаративных процессов в мембранах, а при действии токсических доз - семикратное увеличение, которое сопровождается полным ингибированием процессов репарации мембран. Эффект доноров оксида азота носит ту же направленность, но выражен в меньшей степени. Главную роль в выходе арахидоновой кислоты из мембранных фосфолипидов играет фосфолипаза А2.

7. В асцитных и солидных опухолях карциномы Эрлиха в фазу быстрого логарифмического роста наблюдается снижение активности антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы) по сравнению с фазой медленного стационарного роста.

8. В фиброаденомах молочной железы активность антиоксидантных ферментов возрастает при увеличении митотического индекса опухоли. В противоположность этому, в тканях рака молочной железы наблюдается снижение активности антиоксидантных ферментов при наиболее высоких значениях митотического индекса.

9. Доноры оксида азота (нитропруссид натрия, нитрит натрия, Ь-аргинин) уменьшают степень ингибирования пролиферации опухолевых клеток, вызванную веществами, генерирующими пероксирадикалы, и ингибируют апоптоз, индуцированный свободными радикалами

10. Комбинация доноров оксида азота (нитропруссид натрия, нитрит натрия, Ь-аргинин) в концентрации 10"4-10" М и доксорубицина приводит к снижению опухолетоксичности антибиотика (10"' - 10~7 М). Нитропруссид натрия, нитрит натрия в концентрации 10° М и нитрозогуанидин в концентрации Ю^М усиливают опухолетоксичное действие доксорубицина.

11. Нитрозогуанидин повышает терапевтическую эффективность доксорубицина в эксперименте, уменьшая размер карциномы Эрлиха в 3 раза и увеличивая уровень индукции апоптоза и некроза опухолевых клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Включение [1-14С] арахидоновой кислоты в фосфолипиды при переходе клеток от состояния пролиферации в состояние покоя // Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации. Материалы симпозиума. - Москва. - 1993. - С 39-40 ( в соавт. с Боруновым Е.В., Антиповой Е.В.).

2 Активность мембраносвязанной фосфолипазы А2 при свободно- «

радикальном воздействии на опухолевые клетки // Материалы 5-й Всероссийской конференции по патологии клетки. - Москва. - 1993. - С. 33. (в соавт. с. Nalbone G.). ш

3. Роль антиоксидантных ферментов и фосфолипазного гидролиза в окислительном повреждении опухолевых клеток // Биоантиоксидант Материалы 4-й конференции. - Москва. - 1993. - С. 133-134 (в соавт. со Смирновой Л.П., Щепёткиным И. А.).

4. Оценка роли экстацеллюлярного микроокружения в формировании резистентности опухолевых клеток к свободно-радикальному повреждению II Проблемы современной онкологии. Материалы российской конференции. Т.1. - Ростов на Дону. - 1995. С. 197-198 (в соавт с Ситожевским А.В., Хавалкиным, И.В., Ивановым В.В., Полушиной О.А.).

5. Метаболизм арахидонат содержащих фосфолипидов в процессе пролиферации спонтанно трансформированных клеток // Материалы 6-го симпозиума по биохимии липидов. Москва. - 1995. - С. 49-50 (в соавт. с Антиповой Е.В., Боруновым Е.В., Лавровским В.А.).

6. Phospholipase A stimulation in tumor cells by subtoxic concentration of tert-butyl hydroperoxide // Biochim. Biophys. Acta. - 1995. - V. 1258. - P. 297-302 (with Peiretti F., Nalbone G., Lafont R).

7. Extracellular production of organic hydroperoxide scavenging proteins by mouse leukemic cells II Int. Conference "Tumor microenvironment, progression, therapy and prevention". -Israel. - 1995. - P. 39 (with Havalkin, A.V. Sitozhevsky, V.V. Ivanov, O. Polushina.)

8. Modulation of extracellular arachidonic acid release by nitric oxide generating „ compounds from tumor cells // Int. Conference "Tumor microenvironment, progression, therapy and prevention. Israel. - 1995. - P. 40 (with Tcheredova

V.V., Reutov V.P.).

9. Регуляция активности фосфолипазы A2 продуцентами окиси азота в опухолевых клетках // Материалы Первого Российского конгресса по патофизиологии. Москва. - 1996. - С. 185. - (в соавт. с Чередовой В.В., Реутовым В.П.).

10. Модуляция высвобождения арахидоновой кислоты из опухолевых клеток NO-генерирующими соединениями // Материалы Первого Российского конгресса по патофизиологии. - Москва. - 1996. - С. 185 (в соавт. с Чередовой В.В., Реутовым В.П.).

11. Кинетика распада органической гидроперекиси в суспензии опухолевых клеток // Материалы Первого Российского конгресса по патофизиологии. - Москва. - 1996. - С.198 (в соавт. с Ситожевским А.В., Хавапкиным И.В., Ивановым В.В., Полушиной О.А.).

12.Механизм формирования резистентности опухолевых клеток к свободно-радикальному повреждению // Материалы Первого съезда онкологов стран СНГ. - Москва. - 1996. - Часть 1. - С. 93. (в соавт с Боруновым Е.В., Смирновой Л.П., Щепёткиным И.А., Ситожевским А.В., Хавалкиным И.В., Ивановым В.В.).

13.Регуляция активности фосфолипазы А2 продуцентами окиси азота в опухолевых клетках // Магнитный резонанс в химии и биологии. Материалы Одиннадцатой конференции - Москва. - 1996 - С. 64. - (в соавт. с Чередовой, В.В., Реутовым В.П.).

14.Production of extracellular anti-radical agents by tumor cells as a factor of their resistance to oxidative stress // Abstracts 6-th International congress on anticancer treatment. - France, Paris. - 1996. - P. 645 (with I.V. Havalkin, A.V. Sitozhevsky, V.V. Ivanov, O. Polushina.).

15. Nitric oxide generation by hypoxic radiosensitizer AK-2123. // Abstracts 6-th International congress on anti-cancer treatment - France, Paris. - 1996. - P. 656 (with Tcheredova V.V.).

16. Активация фосфолипазы A2 субтоксическими концентрациями органического гидропероксида в опухолевых клетках // Материалы Второго съезда биохимического общества Российской Академии наук. -Москва. - 1997. - 4.1. - С.267-268 (в соавт. с G.Nalbone).

17.Влияние NO-генерирующих соединений на гидролиз фосфолипидов и перекисное окисление липидов опухолевых клеток // Материалы Второго съезда биохимического общества Российской Академии наук. - Москва. -1997.-Ч.2. - С.324-325 (в соавт. с Чередовой В.В., Реутовым В.П.).

18.Effect of doxorubicin on arachidonate incorporation into phospholipids of tumor cells // б"1 International symposium on Molccular Aspects of Chemotherapy. - Gdansk, Poland. - 1997. - P.57.

19.Кинетика распада трет-бутилгидропероксида в суспензии эритроцитов // Биологические мембраны. - 1997. - Т. 14. - № 4,- С. 394-401 (в соавт. с Ситожевским А.В., Хавлкиным И.В., Ивановым В.В.).

20.Mechanism of tumor cell resistence to free-radical damage // Abstracts 7th International congress on Anti-cancer Treatments. - Paris, France, February 36.- 1997,- P. 551.

21 Different activities of antioxidant enzymes in the cells of ascitic and solid tumors // Abstracts of 3rd International Symposium of Bulgarian Lipid League "Free Radicals in Biology and Medicine". - Sofia, Bulgaria. - 1997. - P.83-84 (with Smirnova L. P.).

22.Chemiluminescent analysis of organic hidroperoxide decomposition in cellular suspension // Therd International Symposium of Bulgarian Lipid League "Free Radicals in Biology and Medicine". - Sofia, Bulgaria. - 1997. - P.40-41 (with Sitozhevsky A. V.).

23. Кинетика разложения трет-бутилгидроперокеида асцитными опухолевыми клетками // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. Приложение 1. - 1999. -Т. 127.- С.38-40 (в соавт. с Ситожевским А.В., Хавалкиным И.В., Ивановым В.В.).

24 Активность антиоксидантных ферментов при окислительном воздействии на опухолевые клетки // Биоантиоксидант Материалы 5 международной конференции. - 18-20 ноября 1998, Москва. - С.171 (в соавт. со Смирновой Л.П., Щепеткиным И. А.).

25.Extracellular antioxidants in gastric precancerous conditions and gastric cancer // Journal of Buon. - 1998. - N 1. - P. 61-66. (with Bochkareva N.V, Sitozhevsky A.V., Kolomiets L.A.).

26.Antiradical capacity of biological fluids in stomach precancer and cancer // Abstracts International Conference "Regulation of biological processes by free radicals' role of antioxidants, free radical scavengers and chelators". - Moscow-Yaroslav!, , May 10-13, 1998. - P. 6 (with Bochkareva N., Sitozhevsky A., Kolomiets L.A.).

27.1nitial mechanism of tumor cell resistance to peroxidative stress // Abstracts International Conference "Regulation of biological processes by free radicals: role of antioxidants, free radical scavengers and chelators". - Moscow-Yaroslavl, , May 10-13, 1998. - P. 33 (with Sitozhevsky A., Havalkin I.).

28.Antioxidant enzymes in tumor cells with different rate of proliferation // Abstracts International Conference "Regulation of biological processes by free radicals: role of antioxidants, free radical scavengers and chelators". - Moscow-Yaroslavl, , May 10-13,1998 - P. 7 (with Smirnova L.).

29.Hydroperoxide involvement in the activation of phospholipase A activation and arachidonic acid mobilisation from tumor cells // Abstracts International Conference "Regulation of biological processes by free radicals: role of antioxidants, free radical scavengers and chelators". - Moscow-Yaroslavl, , May 10-13,1998.-P. 18.

30.Участие активных форм кислорода и антиоксидантных ферментов в регуляции пролиферации опухолевых клеток // Высокие технологии в онкологии Материалы 5 Всероссийского съезда онкологов. - Казань, 4-7 октября 2000. - T.I- С.217 (в соавт. со Смирновой Л.П., Загребельной Г.В.).

31 .Модуляция опухолетоксического действия свободно-радикальных агентов NO-генерирующими соединениями // Высокие технологии в онкологии. Материалы 5 Всероссийского съезда онкологов .- Казань, 4-7 октября, 2000. - Т.1- С.155-156 (в соавт. с Загребельной Г.В.).

32.Регуляция пролиферации опухолевых клеток свободными радикалами // Актуальные вопросы кардиологии Материалы региональной конференции - Томск, 14-15 сентября, 2000,- С.253-254 (в соавт. с Загребельной Г.В., Смирновой Л.П., Реутовым В.П.).

33.Роль NO-генерирующих соединений в модуляции опухолетоксического действия свободно-радикальных агентов // Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы. Материалы Второго Российского конгресса по патофизиологии - Москва. - 2000г. - С. 187 (в соавт. с Загребельной Г.В., Реутовым В.П.).

34.1nteraktive effects of peroxyl radicals and nitric oxide on tumor cell proliferation // Материалы П съезда онкологов стран СНГ- Киев, 23-26 мая, 2000. - Экспериментальная онкология. - V 22. - Р. 259 (в соавт. с Загребельной Г.В.).

35.Сочетанное действие оксида азота и свободно-радикальных агентов на опухолевые клетки // Актуальные вопросы клинической онкологии и преканцерогенеза. Материалы межрегиональной конференции - Якутск, 2000.- С. 174-175 (в соавт с Загребельной Г.В.).

36.Сочетанное действие оксида азота и пероксидных радикалов на пролиферативную активность опухолевых клеток // Бюллетень СО РАМН - 2000. №2 (96) - С.59-63 (в соавт. с Г.В. Загребельной).

37.Роль свободных радикалов в регуляции пролиферации опухолевых клеток // Материалы IV ежегодной Российской онкологической конференции -Москва, 21-23 ноября, 2000 -Ч.2.- С.87-88 (в соавт. со Смирновой Л.П., Загребельной Г.В.).

38 Антиоксидантная система и перекисное окисление липидов у больных с предопухолевыми заболеваниями и раком молочной железы // Российский онкологический журнал.- 2001.- №1,- С.20-22 (в соавт с Савиной Е.В., Слонимской Е.М.).

39.Nitric oxide abates free-radical inhibition of tumor cells proliferation // Analytical cellular pathology. Abstracts 7,b ESACP Congress, Caen, France, April 1-5,2001.-V.22.-N 1,2.- P.31 (withMalahovaE.,ZagrebelnajaG).

40. Involvement of antioxidant enzymes in regulation of tumor cells proliferation // Analytical cellular pathology. Abstracts 7th ESACP Congress, 2001. Caen, France, April 1-5,2001. -V. 22. -N 1,2. - P. 31 (with SmirnovaL.).

41.Detection of antiradical activity in biological fluids: comparative study of two metods // Analytical cellular pathology. Abstracts 7th ESACP Congress, Caen, France, April 1-5, 2001. - V. 22. - N 1,2. - P. 25 (with Bochkaiyeva N., Kolomijets L.).

42.Зависимость активности антиоксидантных ферментов от скорости пролиферации и структурной организации опухолей // Сибирский онкологический журнал - 2002. - №1. - С. 65-69 ( в соавт. со Смирновой Л.П.).

43.Зависимость активности антиоксидантных ферментов от митотического индекса опухолей молочной железы // Сибирский онкологический

журнал - 2002. - №2. - С. 47-51 (в соавт. со Смирновой Л.П., Слонимской Е.М., Глущенко С.А., Яловой М.Ф.).

44. Зависимость активности антиоксидантных ферментов от выраженности процессов пролиферации доброкачественных и злокачественных опухолей молочной железы И Биоантиоксидант. материалы VI Международной конференции. - 16-19 апреля 2002, Москва. - С. 536-537 (в соавт. со Смирновой Л,П, Слонимской Е.М., Глущенко С.А., Яловой М.).

45.Оксид азота как фактор защиты опухолевых клеток от свободно-радикального повреждения // Биоантиоксидант. Материалы VI Международной конференции. - 16-19 апреля, 2002, Москва. - С. 286-287 (в соавт. с Загребельной, Реутовым В.П.).

46.Прогностическая значимость определения активности антиоксидантных ферментов в доброкачественных и злокачественных опухолях молочной железы // Гормонозависимые опухоли Материалы IX Всероссийской конференции онкологов. - Санкт-Петербург 2002. - С.176-179 (в соавт. со Смирновой Л.П., Слонимской Е. М., Малаховой Е. В.).

47 Активность антиоксидантных ферментов в тканях опухолей молочной железы с различной выраженностью процессов пролиферации // Рак репродуктивных органов. Профилактика, диагностика, лечение. Материалы региональной научно-практической конференции. - Томск, 2002. - С. 122-123 (в соавт. со Смирновой Л.П., Слонимской Е.М., Глущенко С.А., Яловой М.Ф.).

48 Модулирующее действие оксида азота на противоопухолевую активность свободных радикалов // Современные аспекты онкологии и радиологии Материалы конференции. - Алматы, 2002. - С. 90-93 (в соавт. с Загребельной Г.В.).

49.Взаимосвязь ферментативных антиоксидантов и митотического индекса доброкачественных и злокачественных новообразований молочной железы // Современные аспекты онкологии и радиологии. Материалы конференции. - Алматы, 2002,- С. 93-95 (в соавт. со Смирновой Л.П., Слонимской Е.М., Глущенко С.А., Яловой М.Ф.).

50. Antioxidant enzyme activities in the cells of solid and ascitic Ehrlich carcinoma // Experimental Oncology - 2003. V. 25. - P.60-63 (with Smimova L.P., Rogozin E.A.).

51.Влияние пероксидных радикалов и оксида азота на пролиферативную активность опухолевых клеток // News of biomedical sciences. Вести национальной академии наук Белоруссии. - 2003. - №1. - С.77-82 (в соавт. с Загребельной Г.В., Реутовым В.П.).

52 Влияние NO-генерирующих соединений на опухолетоксическое действие доксорубицина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины -2004 - № 6. - С.664-666 (в соавт с Загребельной Г.В., Чойнзоновым. Е.Л.).

53.Влияние комбинации пероксидных радикалов с оксидом азота на синтез ДНК в опухолевых клетках // Биомедицинская химия - 2004. - Т.50 - №6. - С. 576-581 (в соавт. с Какуриной. Г.В.).

54.Зависимость активности антиоксидантных ферментов от выраженности процессов пролиферации и типа тканевой организации карциномы Эрлиха // Биомедицинская химия - 2004. - Т. 50. - № 6. - С.566-575 (в соавт. со Смирновой Л.П.).

55 Изменение активности антиоксидантных ферментов в зависимости от пролиферативной активности новообразований молочной железы // Материалы III съезда онкологов и радиологов СНГ. Минск, 25-28 мая, 2004. - Часть II. - С. 74-75 (в соавт. со Смирновой Л.П., Слонимской Е.М., Середой Е.Е., Глущенко С.А.),

56.Эффект доноров оксида азота на противоопухолевую эффективность доксорубицина // Материалы Ш съезда онкологов и радиологов СНГ. -Минск, 25-28 мая, 2004. - С. 336 (в соавт. с Загребельной Г.В.).

Изобретение

1 .Способ определения антирадикальной активности биологических жидкостей: Патент РФ № 2199749 от 27.02.2003 (в соавт. с Ситожевским A.B., Хавалкиным И.В., Ивановым В.В., Лустой И.В., Груздевой О.В., Сусловой Т.Е., Фёдоровой Т.С., Бочкарёвой Н.В.).

Список сокращений

АБАП - 2,2'азо-бис(2-амидинопропан)

АКМ - активированные кислородные метаболиты

АИБН - 2.2-азо-бис-изобутиронитрил

АОФ - антиоксидантные ферменты

ГП - глутатионпероксидаза

ГР - глутатионредуктазы

ГТ - глутатионтрансфераза

1 111 Ь - гидропероксид третичного бутила

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

супероксиддисмутазы (СОД),

РМЖ - рак молочной железы

MNNG - метил-М-нитро-нитрозогуанидин

N0 - оксид азота

SNP - нитропруссид натрия

Автор выражает глубокую признательность ведущему научному сотруднику Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (г. Москва), доктору биологических наук, Реутову Валентину Палладиевичу; научному сотруднику ГУ НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН, кандидату медицинских наук, Ситожевскому Алексею Викториновичу; доценту кафедры биохимии СибГМУ, кандидату медицинских наук, Иванову Владимиру Владимировичу; Dr. Gilles Nalbone, Ph.D. Institut National de la Santé et de la recherche Medicale INSERM, Unite de Recherces sur le Transport des Lipides, Marselle, France за ценные теоретические рекомендации и большую практическую помощь.

f I

л

î

i

f \

í

! /

i i Í

I

РНБ Русский фонд

2005-4 47784

Тираж 100. Заказ 187. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники пр. Ленина, 40

22>,:;'И5; I

1812

Злокачественные новообразования являются одной из главных причин смертности в большинстве промышленно развитых стран. О глобальной величине проблемы онкологической заболеваемости и смертности можно судить на основе экспертных оценок, проводимых Международным агентством по изучению рака. Так, в 2000 г. в мире количество вновь заболевших раком оценивалось более чем в 10 млн. человек, а количество умерших — в 6,2 млн. [39, 314]. Прогнозируется увеличение заболеваемости злокачественными опухолями до 15 млн. к 2020 г., одновременно смертность возрастёт до 9 млн. в год [314]. Важнейшим условием успеха противораковой борьбы является знание механизмов патогенеза злокачественного роста, необходимое для формирования адекватной терапевтической стратегии. Современное понимание этиологии и механизмов возникновения рака, достигнутое благодаря прогрессу в фундаментальной медицине и биологии, даёт представление о ряде принципиальных свойств, которыми обладают злокачественные опухоли. Ключевыми параметрами опухолевого роста являются повышенная способность к пролиферации, утрата способности к полной дифференцировке и апоптотической гибели, инвазивный рост и метастазирование [17, 25, 31, 34, 53, 257]. Благодаря этим свойствам опухолевые клетки имеют преимущество перед клетками нормальных тканей во время роста и выживания в одинаковых условиях. Однако несмотря на огромные усилия, прилагаемые во всём мире, и успехи, достигнутые в области изучения рака, проблема этиопатогенеза злокачественных опухолей остаётся в целом пока нерешённой.

Исследование клеточных и молекулярных механизмов регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток является одной из приоритетных направлений современной онкологии и патологической физиологии. В здоровых тканях устанавливается баланс между процессами пролиферации и гибели клеток [54, 56, 257]. В противоположность этому, злокачественный рост основан на автономной и неограниченной пролиферации клеток, составляющих ткань опухоли [17, 31]. Вместе с тем, в трансформированных клетках возникает резистентность к индукции апоптоза, что также является одним из ключевых механизмов их выживания [34, 45, 54]. Клеточные механизмы запуска и активации апоптоза нарушаются в результате генетических мутаций, что приводит к снижению способности трансформированных клеток активировать программу клеточной смерти и определяет прогрессирование опухолевого процесса, а также может являться одной из причин множественной лекарственной резистентности [31, 34, 42, 54]. Изучение механизмов регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток важно не только с точки зрения понимания патогенетических особенностей развития и функционирования опухолей, оно также позволяет определить новые направления терапии злокачественных новообразований. /

В последнее время достигнуты значительные успехи в исследовании роли молекул различных классов в регуляции роста клеток. Регуляторные молекулы, прежде всего гормоны и факторы роста, вступают во взаимодействие с клеточными структурами, также к ростмодулирующим факторам относят и события, происходящие внутри клеток при передаче сигнала с участием медиаторных систем. В понимании механизмов, контролирующих размножение клеток, важную роль играет выяснение природы внутриклеточных сигналов ответственных за переключение метаболизма на новый уровень при смене состояния пролиферации и покоя.

Активированные кислородные метаболиты (АКМ), такие как супероксидный анион-радикал, гидроксильный, алкоксильный и пероксидный радикалы, оксид азота (N0) и др. являются обязательными компонентами нормального функционирования клеток [13, 37, 47, 134]. Они играют важную роль в регуляции активности ферментов, поддержании стабильности мембран, транскрипции некоторых генов, являются необходимыми элементами функционирования ряда медиаторных систем и выступают в качестве посредников в формировании клеточного ответа. Это стимулирует большой интерес к изучению роли свободных радикалов в регуляции пролиферации опухолевых клеток [49, 101, 172, 186].

Накапливающиеся в литературе данные о молекулярных механизмах действия различных свободно-радикальных молекул свидетельствуют об их участии в регуляции роста и дифференцировки клеток [96, 101]. Известно, что супероксидный радикал и перекись водорода в низких концентрациях стимулируют деление клеток [11, 96]. Оксид азота также участвует в регуляции пролиферации различных клеток, в том числе и опухолевых [63, 158].

Антиоксидантные ферменты (АОФ), контролируя концентрацию радикалов, могут выступать в качестве регуляторов пролиферации [304]. Подтверждением данного предположения является факт обратной корреляции между скоростью роста гепатомы и содержанием в ней Си, Ъа - супероксиддисмутазы [80]. Таким образом, высокая активность АОФ является не только фактором устойчивости опухолей к свободно-радикальным воздействиям, но и может тормозить неограниченное деление клеток неоплазмы.

В патогенезе онкологических заболеваний исключительно важное значение имеет нарушение программируемой клеточной гибели (апоптоза). Данные многих исследований свидетельствуют о том, что, в силу своей высокой химической активности, АКМ могут повреждать внутриклеточные структуры и быть индукторами и медиаторами апоптоза [49, 134, 157,171, 242]. Факторы химической и физической природы, которые при действии на клетки вызывают окислительный стресс, также индуцируют апоптоз. К таким факторам относятся ионизирующее излучение и некоторые противоопухолевые препараты (например, антрациклиновые антибиотики и цисплатин), которые, проникая в клетку, приводят к образованию свободных радикалов [6, 82]. Предполагается, что характер действия АКМ на клетки связан с их внутри- и внеклеточным уровнем [222], однако при этом не выявлено определенных закономерностей, что делает актуальным изучение влияния кислородных радикалов на пролиферацию и на апоптоз опухолевых клеток в зависимости от концентрации.

Оксид азота, являясь регулятором внутри- и межклеточных процессов, принимает непосредственное участие в реализации апоптотической программы. Считается, что оксид азота может усиливать цитотоксичность свободных радикалов, причем ЫО-генерирующие соединения, вступая в реакцию свободно-радикального окисления, могут образовывать еще более токсическое соединение - пероксинитрит, который повреждает ДНК и вызывает ковалентные модификации белков в клетке, инициируя тем самым апоптоз [71, 318, 324]. Однако во многих исследованиях N0 рассматривается, скорее, как антиоксидант, который тормозит развитие радикальных окислительных реакций [205, 212, 308]. При этом нет однозначного ответа на вопрос, является N0 активатором или ингибитором апоптоза.

Ряд принципиальных вопросов, важных для понимания закономерностей взаимодействия свободно-радикальных молекул с опухолевыми клетками и регуляторных механизмов пролиферации опухолевых клеток остаётся неизученным. К ним относится, в частности, выяснение того, какие события являются первоначальными и определяющими во взаимодействии опухолевых клеток с органическими гидропероксидами. В настоящее время только в единичных исследованиях учитывается возможность и важность модуляции активированными кислородными метаболитами различных этапов регуляции клеточного деления: лиганд-рецепторных взаимодействий, функционирования системы «вторичных посредников», активации и/или ингибирования эффекторных молекул клеток. Недостаточно исследованы механизмы влияния АКМ на ключевые компоненты внутриклеточной сигнальной системы опухолевых клеток. Остается не изученным вопрос о совместном влиянии кислородных радикалов и N0 на пролиферативный потенциал опухолевых клеток. Решение этих вопросов могло бы послужить основой для понимания патогенетических механизмов необластомогенеза, а это в свою очередь -разработать более эффективные подходы к комплексной патогенетической терапии злокачественных новообразований.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования явилось изучение роли свободных радикалов, оксида азота и антиоксидантных ферментов в механизмах регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние активированных кислородных метаболитов, органических пероксидов и доноров оксида азота на пролиферативную активность опухолевых клеток.

2. Исследовать влияние активированных кислородных метаболитов и оксида азота на индукцию апоптоза в опухолевых клетках.

3. Изучить кинетику взаимодействия экзогенных пероксидов с опухолевыми клетками и выяснить роль ферментативных и неферментативных антиоксидантов в этом процессе.

4. Изучить роль арахидоновой кислоты в механизмах регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток. Оценить эффект свободно-радикальных агентов на выход арахидоновой кислоты из фосфолипидов мембран опухолевых клеток и показать роль ферментов метаболизма фосфолипидов в этом процессе.

5. Исследовать зависимость активности антиоксидантных ферментов от скорости пролиферации и структурной организации опухолей в эксперименте.

6. Оценить связь активности антиоксидантных ферментов с пролиферацией клеток доброкачественных и злокачественных опухолей молочной железы.

7. Исследовать совместное влияние свободно-радикальных агентов и NO-генерирующих соединений на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток.

8. Исследовать влияние доноров оксида азота на опухолетоксическое действие доксорубицина in vitro.

9. Оценить возможность применения доноров оксида азота для повышения терапевтической эффективности антибиотиков антрациклинового ряда.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное исследование влияния веществ, генерирующих свободные радикалы, и доноров оксида азота в широком спектре концентраций на активность пролиферативных процессов в клетках экспериментальных опухолевых линий и индукцию в них апоптоза. Выявлено, что направленность действия исследованных соединений меняется в зависимости от концентрации, а именно, с уменьшением дозы снижается ингибиующее влияние на пролиферацию и индукцию апоптоза и при достижении концентрации 10"6 М и менее наблюдается стимуляция клеточного размножения.

Впервые исследована кинетика взаимодействия органических пероксидов с опухолевыми клетками и обнаружена экстраклеточная продукция глутатионпероксидазы и низкомолекулярных компонентов, обладающих антирадикальной активностью.

Впервые показана концентрационная зависимость влияния свободных радикалов на освобождение арахидоновой кислоты из фосфолипидов мембран и связь этого процесса с пролиферацией и апоптозом опухолевых клеток. Установлено, что под действием АКМ в высоких концентрациях, ингибирующих пролиферативные процессы и индуцирующих апоптоз, наблюдается значительный выход арахидоновой кислоты из фосфолипидов мембран и ингибирование ее включения в них. В противоположность этому, АКМ в низких дозах, стимулирующих пролиферацию, приводят к менее выраженному выходу жирной кислоты с сохранением репарации фосфолипидов. При этом показано, что выход арахидоновой кислоты из фосфолипидов мембран опосредован активацией фосфолипазы А.Влияние оксида азота на данные процессы носило ту же направленность, но выражено в меньшей степени.

Получены новые данные о зависимости активности антиоксидантных ферментов от выраженности пролиферативных процессов в клетках экспериментальной опухоли, доброкачественных и злокачественных опухолях молочной железы человека. Быстрорастущие опухоли характеризуются низкой активностью антиоксидантных ферментов, тогда как при уменьшении степени выраженности пролиферативных процессов происходит увеличение активности антиоксидантных ферментов.

Впервые показана способность доноров оксида азота (нитрит натрия, нитропруссид натрия и Ь-аргинин) защищать опухолевые клетки от токсического действия пероксирадикалов и доксорубицина. Экспериментально доказана возможность использования донора N0 -нитрозогуанидина для увеличения противоопухолевой эффективности доксорубицина.

Теорерическая и практическая значимость

Результаты исследования существенно расширяют фундаментальные представления о механизмах регуляции пролиферативной активности и апоптотической гибели опухолевых клеток. Показано, что вещества, генерирующие свободные радикалы, и доноры оксида азота в зависимости от концентрации могут активировать как пролиферативную активность, так и апоптоз опухолевых клеток, что подтверждает существование общей для этих процессов внутриклеточной регуляторной системы, частью которой являются радикалы кислорода и азота.

Полученные результаты формируют новые представления о биохимических закономерностях взаимодействия опухолевых клеток с активированными кислородными метаболитами, доказывая возможность экстраклеточной регуляции уровня свободно-радикального окисления и взаимодействия пероксидов с внутриклеточной сигнальной системой.

Данные о взаимосвязи активности антиоксидантных ферментов с интенсивностью пролиферативных процессов могут послужить основой для выбора дополнительных информативных критериев при оценке биологических характеристик опухолей, в частности, их пролиферативной активности, которые, в свою очередь, можно использовать в качестве факторов прогноза. Полученные данные свидетельствуют о том, что доноры оксида азота могут защищать опухолевые клетки от свободно-радикального повреждения и выступать в качестве факторов развития лекарственной разистентности. Все это должно способствовать при назначении химиотерапии более тщательному отбору препаратов, которые могут стимулировать образование оксида азота и пероксидов в организме пациентов со злокачественными заболеваниями. Кроме того, в работе экспериментально обоснована возможность использования доноров оксида азота для увеличения противоопухолевой эффективности антибиотиков антрациклинового ряда.

Положения, выносимые на защиту 1. Супероксидный радикал, органические пероксиды и доноры оксида азота в зависимости от концентрации могут проявлять как цитотоксическую активность по отношению к опухолевым клеткам и индуцировать их апоптоз, так и стимулировать их пролиферацию.

2. Влияние пероксидов и доноров оксида азота на пролиферацию и апоптоз опосредуется взаимодействием с сигнал-передающей системой липидной природы, включающей арахидоновую кислоту.

3. Активность антиоксидантных ферментов снижена в фазу быстрого логарифмического роста экспериментальных опухолей по сравнению с фазой медленного стационарного роста и в злокачественных опухолях молочной железы с наивысшим митотическим индексом.

4. Доноры оксида азота (нитрит натрия, нитропруссид натрия и L-аргинин) снижают ингибирующий эффект пероксирадикалов на пролиферацию опухолевых клеток и тормозят индукцию апоптоза in vitro.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на Симпозиуме стран СНГ «Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации» (Москва, 28-29 сентября 1993 г.), на V Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 29-30 ноября 1993 г.), на VI симпозиуме по биохимии липидов (Санкт-Петербург, 3-6 октября 1994 г.), на Second International Conference on Clinical Chemiluminescence (Berlin, Germany, April 27-30, 1996), на Втором съезде биохимического общества РАН (Москва, 19-32 мая 1997 г.), на International Conference "Regulation of biological processes by free radicals: role of antioxidants, free radical scavengers, and chelators" (Москва-Ярославль, 10-13 мая 1998 г.), на региональной научной конференции «Актуальные вопросы кардиологии» (Томск, 14-15 сентября 2000 г.), на 7th ESACP Congress (Caen, France, April 1-5 2001), на 7th International Conference "Eicosanoids & other bioactive lipids in cancer, inflammation and related diseases" (Nashville, USA, October 14-17, 2001), на VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 16-19 апреля 2002 г.), на 3 съезде онкологов и радиологов стран СНГ (Минск, 25-28 мая 2004 г.).

Публикации

Основные результаты диссертации опубликованы в 57 печатных работах, в том числе 13 в центральных отечественных и зарубежных реферируемых журналах. Получен патент РФ на изобретение № 2199749 от 27.02.2003.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 248 страницах и иллюстрирована 29 рисунками и 19 таблицами. Библиография включает 410 литературных источников, из которых 58 отечественных и 352 иностранных.

ВЫВОДЫ

1. Влияние свободных радикалов на пролиферацию опухолевых клеток носит дозозависимый характер. Радикалы кислорода (супероксидный радикал, органические пероксиды) и доноры оксида азота в высоких

3 5 концентрациях (10' -10" М) ингибируют пролиферацию, а в низких (10"б-10"9 М) проявляют ростстимулирующую активность по отношению к асцитным опухолевым клеткам. Исключение составляет нитрозогуанидин, который в спектре исследованных концентраций не активирует пролиферативные процессы в опухолевых клетках.

2. Степень индукции апоптоза опухолевых клеток органическими пероксидами и донорами оксида азота более выражена при увеличении концентрации используемых соединений. Усиление программируемой гибели клеток сопровождается ингибированием их пролиферативной активности.

3. Кинетика взаимодействия экзогенных пероксидов с асцитными опухолевыми клетками характеризуется более медленным распадом по сравнению с нормальными клетками (лимфоцитами и эритроцитами).

4. Опухолевые клетки секретируют экстраклеточно глутатионпероксидазу и низкомолекулярные соединения небелковой природы, обладающие антирадикальной активностью.

5. Состояние пролиферативной активности трансформированных клеток характеризуется усилением метаболизма фосфолипидов, которое выражается в увеличении включения арахидоновой кислоты в фосфолипиды мембран, главным образом в фосфатидилхолин и кардиолипин, по сравнению с покоящимися клетками.

6. При действии свободных радикалов в концентрациях, стимулирующих пролиферацию, наблюдается трехкратное увеличение выхода арахидоновой кислоты из фосфолипидов опухолевых клеток при сохранении репаративных процессов в мембранах, а при действии токсических доз — семикратное увеличение, которое сопровождается полным ингибированием процессов репарации мембран. Эффект доноров оксида азота носит ту же направленность, но выражен в меньшей степени. Главную роль в выходе арахидоновой кислоты из мембранных фосфолипидов играет фосфолипаза А2.

7. В асцитных и солидных опухолях карциномы Эрлиха в фазу быстрого логарифмического роста наблюдается снижение активности антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы) по сравнению с фазой медленного стационарного роста.

8. В фиброаденомах молочной железы активность антиоксидантных ферментов возрастает при увеличении митотического индекса опухоли. В противоположность этому, в тканях рака молочной железы наблюдается снижение активности антиоксидантных ферментов при наиболее высоких значениях митотического индекса.

9. Доноры оксида азота (нитропруссид натрия, нитрит натрия, Ь-аргинин) уменьшают степень ингибирования пролиферации опухолевых клеток, вызванную веществами, генерирующими пероксирадикалы, и ингибируют апоптоз, индуцированный свободными радикалами.

10. Комбинация доноров оксида азота (нитропруссид натрия, нитрит натрия, Ь-аргинин) в концентрации 10-4-10"5 м и доксорубицина

5 7 приводит к снижению опухолетоксичности антибиотика (10" - 10" М). Нитропруссид натрия, нитрит натрия в концентрации 10~3 М и нитрозогуанидин в концентрации 10"4 М усиливают опухолетоксичное действие доксорубицина.

11. Нитрозогуанидин повышает терапевтическую эффективность доксорубицина в эксперименте, уменьшая размер карциномы Эрлиха в 3 раза и увеличивая уровень индукции апоптоза и некроза опухолевых клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В основе злокачественного роста лежит прогрессирующее и автономное увеличение генетически нестабильной клеточной массы, в которой постоянно происходит отбор клеток с наиболее агрессивным потенциалом. Нарушение регуляции количества клеток в опухолях является результатом дисбаланса процессов пролиферации и апоптоза [17, 53, 54, 56, 257, 393]. Изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе этих процессов, стало в последние годы одной из самых актуальных проблем современной онкологии и патологической физиологии. Важность решения этой задачи определяется взаимосвязью нарушений регуляции процессов размножения и гибели клеток с возникновением и развитием злокачественных опухолей, что необходимо для понимания патогенеза рака, а также поиска новых направлений терапии злокачественных новообразований.

В настоящее время механизмы регуляции пролиферативной активности и апоптоза опухолевых клеток свободными радикалами изучены недостаточно. Важной задачей является выявление ведущих механизмов, ответственных за конечные биологические эффекты данного класса молекул. По литературным данным, регуляция свободными радикалами пролиферативной активности и апоптоза - мультифакторный процесс, который осуществляется через их взаимодействие со специфическими сигнал-передающими системами [59, 136, 186, 233]. Важная роль в регуляции роста опухолевых клеток и их гибели принадлежит свободному радикалу N0', который является важнейшим биологическим эффектором [44, 130, 166, 191, 407]. Однако лишь в единичных исследованиях учитывается возможность и важность модуляции свободными радикалами различных этапов регуляции жизнедеятельности клеток, включающих изменение активности ферментов, экспрессию генов и др [124, 136]. До настоящего времени антиоксидантные ферменты практически не рассматривались с позиции их возможной роли в регуляции пролиферативных процессов посредством изменения уровня окислительного метаболизма в клетках.

Вопрос о влиянии низких доз свободных радикалов на мембранные компоненты — фосфолипиды и ферменты их метаболизма остается одним из наименее изученных. Недостаточно раскрыта роль оксида азота и его комбинации с другими свободно-радикальными молекулами в реализации пролиферативных или апоптотических механизмов. Очевидно, существенное, хотя пока недостаточно выясненное влияние имеет N0 на противоопухолевую терапию. Не исследована возможность использования соединений, генерирующих оксид азота, для усиления эффективности тех видов противоопухолевой терапии, механизм действия которых основан на свободно-радикальном повреждении злокачественной ткани, к которым относится химиотерапия антрациклиновыми антибиотиками.

Эти обстоятельства послужили отправным пунктом при постановке цели, которая заключалась в исследовании роли свободных радикалов, оксида азота и антиоксидантных ферментов в регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток. При этом предполагалось:

1. Изучить влияние активированных кислородных метаболитов, органических пероксидов и доноров оксида азота на пролиферативную активность опухолевых клеток.

2. Исследовать влияние активированных кислородных метаболитов и оксида азота на индукцию апоптоза в опухолевых клетках.

3. Изучить кинетику взаимодействия экзогенных пероксидов с опухолевыми клетками и выяснить роль ферментативных и неферментативных антиоксидантов в этом процессе.

4. Изучить роль арахидоновой кислоты в механизмах регуляции пролиферации и апоптоза опухолевых клеток. Оценить эффект свободно-радикальных агентов на выход арахидоновой кислоты из фосфолипидов мембран опухолевых клеток и показать ферментов метаболизма фосфолипидов в этом процессе.

5. Исследовать зависимость активности антиоксидантных ферментов от скорости пролиферации и структурной организации опухолей в эксперименте.

6. Оценить связь активности антиоксидантных ферментов с пролиферацией клеток доброкачественных и злокачественных опухолей молочной железы.

7. Исследовать совместное влияние свободно-радикальных агентов и NO-генерирующих соединений на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток.

8. Исследовать влияние доноров оксида азота на опухолетоксическое действие доксорубицина in vitro.

9. Оценить возможность применения доноров оксида азота для повышения терапевтической эффективности антибиотиков антрациклинового ряда.

Исследование влияния свободных радикалов и доноров оксида азота на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток проводилось на экспериментальных моделях мастоцитомы Р-815 и асцитной карциномы Эрлиха.

В результате проведенных исследований было установлено, что действие различных кислородных радикалов и доноров оксида азота на пролиферативную активность опухолевых клеток мастоцитомы Р-815 и карциномы Эрлиха зависело от концентрации и химической структуры используемых соединений. Общая тенденция влияния их на опухолевые клетки заключалась в выраженном цитотоксическом эффекте высоких т с концентраций (10" — 10" М), что выражалось в снижении уровня синтеза ДНК и, соответственно, пролиферативной активности. При снижении концентрации (1(У6 М и ниже) происходило уменьшение цитотоксического действия, непосредственно переходящее в стимуляцию пролиферации опухолевых клеток. Эта закономерность была выявлена в действии супероксидного радикала, 2,2'азо-бис(2-амидинопропана) (АБАП), продуцирующего пероксирадикалы, гидропероксида третичного бутила, пероксида линоленовой кислоты, и доноров оксида азота за исключением нитрозогуанидина, который не оказывал стимулирующего влияния на синтез ДНК в изученном спектре концентраций. Слабое увеличение пролиферативной активности оказало добавление Ь-аргинина в суспензии обеих клеточных культур. Ингибирование ЪЮ-синтазной реакции метиловым эфиром нитроаргинина практически не изменяло скорость синтеза ДНК опухолевых клеток мастоцитомы Р-815, а в клетках карциномы Эрлиха приводило почти к 50% снижению этого процесса. Эти данные свидетельствуют о различном вкладе N0, образующегося в N0-синтазной реакции, в обеспечение рострегуляторных процессов в различных типах опухолевых клеток. Подобная концентрационная зависимость была выявлена и при действии доксорубицина на синтез ДНК п в опухолевых клетках. Были обнаружены концентрации антибиотика (10" М и ниже), стимулирующие пролиферативные процессы в опухолях. Следует отметить существование общего диапазона концентраций для всех соединений, генерирующих свободные радикалы, включая доксорубицин

7 о

10" - 10" М), в которых они проявляют ростстимулирующие свойства. Из всех исследованных АКМ наименее токсичным оказался супероксидный анионрадикал, который стимулировал пролиферацию клеток начиная с концентрации 6><10"6 М.

Полученные в настоящей работе данные согласуются с результатами исследования Оо1оЬ У. и соавт. [172], которые также выявили зависимость пролиферативной активности опухолевых клеток от концентрации АКМ.

Установлено, что липидные гидроперекиси в концентрации 1(Г6 М и ниже стимулируют деление клеток рака толстой кишки. Авторы полагают, что возможным механизмом данного процесса является увеличение экспрессии циклина и циклинзависимой киназы 4, фосфорилирование ретинобластомного белка, что способствует переходу клеток из фаз О0 и От в фазу 8, во время которой происходит синтез ДНК. Повышение концентрации липидных перекисей и времени воздействия приводило к окислительному повреждению ДНК и остановке митоза в фазе О0 /Оь что способствовало прекращению роста клеточной популяции. Эти данные, также как и полученные в настоящей работе результаты, являютя доказательством участия кислородных радикалов в регуляции пролиферативной активности опухолевых клеток.

В настоящее время трудно что-либо сказать о времени, требуемом для индукции деления опухолевых клеток под действием свободных радикалов. Эксперименты по определению времени индукции пролиферации бактериальных штаммов и гепатоцитов [5, 11] показали, что супероксидный радикал начинает индуцировать пролиферативный ответ через 20 минут от начала инкубации. Требуются дополнительные исследования для определения этого параметра в культурах опухолевых клеток и тканей.

Таким образом, можно заключить, что уровень интенсивности окислительного стресса определяет его конечный биологический эффект в диапазоне от разрушающего цитотоксического действия при высоких концентрациях окислительных агентов до регуляции функционального состояния клеток при физиологических концентрациях. В ряду различных физиологических функций свободных радикалов важную роль занимает способность влиять на пролиферативную активность клеток.

Баланс между процессами пролиферации и апоптоза необходим для развития нормальных тканей [17, 42, 45, 56]. Следствием нарушения равновесия между ними является неограниченный злокачественный рост. Поэтому изучение эффектов свободных радикалов на пролиферацию опухолевых клеток целесообразно в комплексе с оценкой их влияния на апоптоз. Исследование воздействия пероксидов на программируемую клеточную гибель клеток карциномы Эрлиха показало, что к наиболее выраженным результатам приводило использование гидропероксида третичного бутила, который индуцировал апоптоз в микромолярных концентрациях, тогда как для АБАП требовалось повышение действующих доз до 10" . Снижение концентрации пероксирадикалов в среде инкубации приводило к ингибированию процесса апоптоза. Возможным механизмом индукции апоптоза прооксидантами, вероятно, является окисление или восстановление 8Н-групп белков - медиаторов программируемой клеточной гибели, таких как факторы транскрипции с-Боб, с-Дт, АР-1 и др. [34, 120, 379, 400].

В отличие от пероксирадикалов, действие доксорубицина на индукцию апоптоза, носило волнообразный характер и с повышением концентрации не наблюдалось роста программируемой гибели опухолевых клеток. Это дает основание предположить, что в высоких концентрациях основной формой реализации противоопухолевого эффекта антибиотика является индукция некроза опухолевых клеток. Стоит отметить, что наряду с увеличением апоптотической гибели при действии доксорубицина в низких концентрациях увеличивалась и пролиферативная активность опухолевых клеток. Вероятно, это обусловлено существованием универсальных сигнальных путей, которые принимают участие в регуляции обоих процессов [49, 163, 222]. о

Применение доноров оксида азота в концентрации приводило к достоверной активации индукции апоптоза по сравнению с контрольным уровнем. Снижение концентрации исследуемых доноров до 10"5М вызывало ингибирование запуска апоптотической программы. Увеличение числа апоптотически погибших клеток в 1,5 раза выше контрольного наблюдалось под действием Ь-аргинина.

Таким образом, при анализе полученных нами данных была отмечена концентрационная зависимость действия веществ, генерирующих свободные радикалы, включая доноры оксида азота, на пролиферативную активность и индукцию апоптоза опухолевых клеток. Высокие концентрации этих соединений угнетали пролиферативную активность и индуцировали апоптоз опухолевых клеток. Снижение концентрации действующих агентов в среде инкубации приводило к увеличению пролиферации опухолевых клеток и снижению процесса запуска программируемой клеточной смерти. В целом, редокс-потенциал может являться важным фактором влияния на кинетику опухолевого роста, которая определяется митотической и апоптотической активностью клеток.

Феномены стимуляции и ингибирования пролиферации опухолевых клеток под действием соответственно низких и высоких концентраций пероксидных радикалов, доксорубицина и МЭ-генерирующих соединений являются небезинтересными с теоретической и практической точек зрения. С теоретической точки зрения, полученные результаты хорошо согласуются с концепцией Г. Селье и существующими представлениями, основанными на многочисленных данных литературы о том, что малые дозы токсических веществ (слабый химический стресс) оказывают стимулирующее действие, а высокие их дозы оказывают соответственно повреждающее действие, вплоть до гибели клеток [47]. Кроме того, полученные данные свидетельствуют о том, что нарушение в системе регуляции синтеза оксида азота и активных форм кислорода могут быть далеко небезразличны для пролиферативной активности опухолевых клеток. С практической точки зрения, полученные результаты представляют интерес в связи с тем, что реальные популяции опухолевых клеток в организме онкологических больных гетерогенны и изменчивы по многим фенотипическим признакам. В связи с этим нельзя исключить возможность существования клонов клеток в одном опухолевом узле с различным порогом чувствительности к лучевым и химиотерапевтическим воздействиям. Вследствие этого, специфическая противоопухолевая терапия может, привести к гибели значительной массы опухолевых клеток, но в то же время оказать стимулирующее воздействие на пролиферацию отдельных высокорезистентных клеток, в результате чего может наступить генерализация опухолевого процесса.

Регуляция пролиферации и апоптоза опухолевых клеток — сложный •многостадийный процесс, включающий на начальном этапе взаимодействие регуляторной молекулы со специфическими рецепторами. Поскольку в настоящее время не охарактеризован рецепторный аппарат для свободно-радикальных молекул (за исключением оксида азота), то для выяснения механизма, с помощью которого эти вещества могут влиять на сложную регуляторную внутриклеточную систему, представлялось необходимым исследовать параметры взаимодействия пероксирадикалов с плазматической мембраной и их влияние на метаболизм основных липидных компонентов мембран - фосфолипидов.

Результатом взаимодействия гидроперекиси третичного бутила с плазматическими мембранами опухолевых клеток являлось ее разложение с образованием пероксидных радикалов, которые могут дать начало цепи окисления липидов, белков и ДНК [13, 14, 37]. Изучение кинетики разложения ГПТБ в суспензии клеток мастоцитомы Р-815, лимфомы ЕЬ-4 и карциномы Эрлиха показало, что этот процесс в опухолевых клетках протекает значительно медленнее по сравнению с нормальными. Кроме того, была выявлена экстрацеллюлярная продукция белков, обладающих глутатионпероксидазной активностью, и низкомолекулярных соединений с выраженной антирадикальной активностью. Это свидетельствует о существовании экстраклеточного уровня защиты опухолевых клеток от окислительного воздействия, что подтверждается данными ЗапсМгот [343], показавшими способность клеток лейкемии человека экстраклеточно продуцировать каталазу.

Другим аспектом взаимодействия свободных радикалов с мембранами является влияние на метаболизм фосфолипидов, в состав которых входит арахидоновая кислота. Она является предшественником важного класса физиологически-активных соединений — эйкозаноидов, которые многими исследователями рассматриваются в качестве местных гормонов и влияют на внутриклеточные процессы, в том числе пролиферацию [66, 138]. В настоящей работе показано, что при активации пролиферации трансформированных фибробластов наблюдается усиление метаболизма арахидоновой кислоты, которое выражается в увеличении ее включения в фосфолипиды, главным образом, в фосфатидилхолин и кардиолипин.

Изучение влияния свободных радикалов на выход и включение арахидоновой кислоты в мембраны опухолевых клеток показало, что гидропероксид третичного бутила в низких концентрациях, активирующих пролиферацию опухолевых клеток, усиливал в 3 раза высвобождение [1-14С] арахидоновой кислоты из фосфолипидов не влияя на процесс ее включение в них. При действии токсических доз ГПТБ было обнаружено, что пероксид значительно (в 7 раз) стимулировал выход жирной кислоты из клеточных фосфолипидов и ингибировал репаративные процессы, что может быть важным фактором в нарушении структурно-функциональого состояния мембран. Выход [1-14С]-арахидоновой кислоты был связан с активацией ФЛА, в то время как активности лизофосфолипид липазы, ацилСоА: лизофосфатидилхолин ацилтрансферазы и ацилСоА синтетазы не менялись под действием ГПТБ.

Аналогичным, но менее выраженным действием обладали доноры оксида азота. Инкубация опухолевых клеток мастоцитомы Р-815 в среде содержащей МаЫСЬ в различных концентрациях приводила к увеличению выхода [1-14С]-арахидоновой кислоты из мембран фосфолипидов на 36% по сравнению с контрольным уровнем. В то же время Ь-аргинин не оказывал активирующего воздействия на выход арахидоновой кислоты из фосфолипидов мембран опухолевых клеток. Исследование включения арахидоновой кислоты в фосфолипиды мембран опухолевых клеток о показало, что добавление №N02 в высоких концентрациях (10" М) в среду инкубации опухолевых клеток мастоцитомы Р-815 приводило к ингибированию этого процесса.

Таким образом, действие ГПТБ и доноров оксида азота в концентрациях, стимулирующих пролиферацию, выражается увеличении выхода жирной кислоты, которая в дальнейшем может использоваться как субстрат для синтеза биологически активных эйкозаноидов [138]. Метаболиты арахидоновой кислоты участвуют в передаче пролиферативного сигнала [138, 228] и увеличение ее • содержания под действием свободных радикалов может являться одной из причин приводящей к усиленной пролиферации опухолевых клеток. С другой стороны, чрезмерное повышение уровня свободной арахидоновой кислоты внутри клеток, которое наблюдалось при действии ГПТБ и донора оксида азота в высоких дозах, обладающих токсическим эффектом, приводит к апоптотической гибели клеток неоплазмы. Участие свободной арахидоновой кислоты в индукции апоптоза подтвердается исследованиями, в которых показана ее важная роль в активации каспаз

96, 160] и повышении проницаемости мембран митохондрий для цитохрома С и АП7 [333, 348].

Параллельно с увеличением концентрации свободной арахидоновой кислоты при действии токсических доз пероксида наблюдалось накопление продукта фосфолипазного гидролиза - лизофосфатидилхолина. Лизофосфатидилхолин также считается цитотоксичным продуктом, который является детергентом, разрушающим стабильность липидного б и слоя [350]. Индукция апоптоза опухолевых клеток может быть следствием увеличения содержания как свободной арахидоновой кислоты, так и лизофосфолипидов под действием высоких концентраций свободных радикалов.

Таким образом, нами установлено, что регуляция как пролиферативной активности опухолевых клеток, так и индукции апоптоза может осуществляться свободными радикалами через влияние на уровень свободной арахидоновой кислоты, которая, вероятно, является одним из компонентов универсального пути передачи внутриклеточного сигнала. Переключение и определение конкретного пути реализации сигнала зависит от концентрации действующего агента.

Для поддержания стационарного уровня свободных радикалов и блокирования цепных реакций в клетках экспрессируются антиоксидантные ферменты, которые могут оказывать существенное влияние на все физиологические процессы, регулируемые этими высокоактивными молекулами [13, 14, 408]. Так, в представленной работе обнаружена взаимосвязь между активностью ключевых ферментов метаболизма супероксидного радикала, органических пероксидов и выраженностью пролиферативных процессов в опухолевых клетках как в эксперименте на моделях асцитного и солидного роста карциномы Эрлиха, так и в опухолях человека. Наблюдалось существенное, в несколько раз, повышение активности СОД при переходе клеток карциномы Эрлиха из логарифмической фазы, которая характеризуется более высокой скоростью роста, в стационарную фазу. Исследование ксантиноксидазы — фермента, катализирующего образование супероксидного радикала, показало его максимальную активность в логарифмическую фазу роста опухоли, тогда как в стационарную фазу происходило достоверное снижение активности этого фермента.

Таким образом, повышение активности ксантиноксидазы в логарифмическую фазу роста с одной стороны и снижение активности СОД с другой дают основание считать, что процесс наработки супероксидного радикала активно протекает при высокой скорости опухолевого роста, тогда как его элиминация ингибирована. Представленные в данной работе результаты указывают на тесную взаимосвязь между ключевыми ферментами метаболизма супер оксидного радикала и активностью пролиферативных процессов в опухолевых клетках. Торможение скорости пролиферации в стационарной фазе роста опухолей может быть связано, по нашему мнению, со значительным ростом супероксиддисмутазной активности в этой фазе. Можно заключить, что СОД, контролируя концентрацию 0г\ по-видимому, является одним из регуляторов пролиферативной активности. Существенная разница в активности ферментов в асцитной и солидной формах объясняется тем, что асцитная опухоль характеризуется высокой скоростью клеточной пролиферации.

Также продемонстрирована тесная взаимосвязь активности глютатионзависимых ферментов с фазой и формой роста карциномы Эрлиха. Активность глутатионзависимых ферментов - ГП и ГТ в клетках асцитной опухоли в логарифмической фазе роста была значительно ниже по сравнению с другими фазами роста и активностью ферментов в солидной опухоли. В стационарной фазе роста наблюдалось достоверное увеличение активности обоих ферментов, как в солидной, так и в асцитной формах. Поскольку эти ферменты регулируют внутриклеточный пул органических пероксидов, то участие последних в процессах, регулирующих пролиферацию опухолевых клеток, является вполне вероятным.

На примерах злокачественных и доброкачественных опухолей молочной железы человека была проведена сравнительная оценка активности антиоксидантных ферментов в зависимости от митотического индекса исследуемых опухолей. В данных исследованиях выявлены те же тенденции к снижению активности АОФ при увеличении числа делящихся клеток, что было продемонстрировано на экспериментальных моделях.

Установлено, что зависимость ферментативной активности от выраженности пролиферативных процессов в доброкачественных и злокачественных опухолях имеют принципиальные отличия.

Так, нами было показано, что в фиброаденомах молочной железы с увеличением митотического индекса (до 7—12°/00) наблюдалось повышение активности практически всех исследуемых ферментов, причем наиболее выраженный рост был зарегистрирован для каталазы и глутатионтрансферазы. Изменение активности глутатионпероксидазы было наименее значимо. Низкие значения активности ксантиноксидазы, продуцирующей супероксидный радикал, наблюдались в тканях доброкачественных опухолей с невысокой скоростью пролиферации. Такие результаты, вероятно, свидетельствуют о физиологическом повышении активности АОФ в ответ на увеличение продукции активированных кислородных метаболитов при клеточном делении, их своевременной детоксикации и поддержании окислительно-восстановительного равновесия в клетках доброкачественных опухолей.

В противоположность этому, в тканях РМЖ форма зависимости активности АОФ от митотического индекса имеет другой характер. В опухолях с наивысшим митотическим индексом (>35°/оо) была зарегистрирована наиболее низкая активность СОД, ГТ, ГП, ГТ. Исключение составила только высокая активность каталазы. Снижение активностей ГП и ГР по мере возрастания числа митозов в опухолях носило линейный характер, тогда как изменения СОД и ГТ были выражены более сложной зависимостью. Представленные результаты свидетельствуют о том, что в опухолевых клетках не происходит элиминации АКМ в должной степени. Возрастание митотической активности злокачественных опухолей, возможно, сопровождается увеличением продукции супероксидного радикала. Подтверждением этого предположения является показанное в наших экспериментах увеличение активности ксантиноксидазы, катализирующей образования эндогенного супероксидного радикала во многих активно пролиферирующих опухолях. Существующие экспериментальные данные подтверждают предположение о повышении его концентрации в физиологических пределах в активно пролиферирующих клетках [5, 11]. В ряде работ показан высокий конститутивный уровень перекиси водорода в опухолевых клетках [101, 302]. Вероятно, что в дальнейшем эти радикалы участвуют в окислительной модификации ДНК, вызывают генотоксический эффект и способствуют прогрессии опухоли, поддерживая ее малигнизированное состояние, инвазивность и метастатический потенциал.

Несмотря на то, что требуются дополнительные исследования для окончательных выводов о роли АОФ в регуляции пролиферации опухолевых клеток, в настоящее время проведены первые исследования по использованию этих ферментов в терапии опухолей. Данные о способности СОД ингибировать пролиферацию клеток при повышении экспрессии фермента послужили основой для первых опытов применения СОД и миметиков СОД в качестве противоопухолевых средств. В эксперименте была показана регрессия опухолевых культур при трансфекции в них кДНК фермента Мп-СОД [243, 305]. Таким образом, возможность ингибирования пролиферации опухолевых клеток антиоксидантными ферментами открывает перспективу их использования в качестве противоопухолевых средств.

Данные представленные в настоящей работе доказывают возможность регуляции свободными радикалами таких важных функциональных состояний, как пролиферация и апоптоз опухолевых клеток. В механизме данных процессов большую роль играет взаимодействие радикалов кислорода и азота с системами внутриклеточной передачи сигнала, и их конечный эффект зависит от концентрации. Однако, внутри клетки возможно сразу образование нескольких типов свободно-радикальных молекул, которые могут взаимодействовать друг с другом. Влияние такого взаимодействия на пролиферацию опухолевых клеток и индукцию в них апоптоза до сих пор исследовано недостаточно. Поэтому представлялось важным изучить влияние комбинации веществ, генерирующих пероксирадикалы и доноров оксида азота на пролиферативную активность и апоптоз опухолевых клеток. Исследования такого плана могут представлять интерес и в связи с тем, что в основе многих классических методов лечения онкологических заболеваний, применяемые в клинической практике (химио-, лучевая и фотодинамическая терапия), лежит свободно-радикальный механизм. Поэтому важно оценить возможность использования доноров оксида азота в фармакологических целях в комплексной терапии опухолей.

Следующая серия экспериментов была посвящена изучению сочетанного воздействия свободных радикалов и NO на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток в модельной системе in vitro.

Предварительные исследования показали концентрационную зависимость влияния пероксидов на пролиферативную активность клеток карциномы Эрлиха, что выражалось в ингибировании синтеза ДНК высокими концентрациями и стимуляцией этого процесса выше контрольных значений низкими дозами используемых соединений.

При исследовании сочетанного действия оксида азота и свободно-радикальных агентов на пролиферацию опухолевых клеток было показано, что доноры N0 в нетоксичной концентрации в комбинации с субтоксичными концентрациями пероксидов увеливали включение [3Н]-тимидина в ДНК по сравнению с контрольной популяцией опухолевых клеток, инкубированных только с источниками пероксидных радикалов, либо не влияли на нее. Комбинация Ж)-доноров в тех же концентрациях с цитотоксичными дозами ГПТБ и АБАП, угнетающих синтез ДНК более чем на 80%, приводила к снижению антипролиферативного действия свободных радикалов. Анализируя полученные данные можно заключить, что оксид азота снижает токсический эффект пероксирадикалов на опухолевые клетки и усиливает их ростстимулирующее действие при использовании в нетоксичных концентрациях, что в целом позволяет предположить защитные свойства N0 в культурах злокачественных клеток. Такое влияние может быть обусловлено антиоксидантными свойствами оксида азота что, вероятно, и обуславливает его цитопротекторное действие. Способность N0 связывать органические пероксиды с образованием пероксинитритов, которые превращаются в нитраты подтверждает его антиоксидантные качества [179, 308]. Кроме того, известно, что N0 связывает мембранные и внутриклеточные комплексы железа, что препятствует распаду пероксидов с образованием радикалов и развитию цепных реакций свободно-радикального окисления [205, 212].

Изучение сочетанного действия оксида азота и свободных радикалов на индукцию апоптоза опухолевых клеток карциномы Эрлиха показало активацию этого процесса при комбинированном применении NaNCb (10"5 М) и АБАП (ОД мМ), L-аргинина (5x10'3 М) и АБАП (0,1 мМ), L-аргинина и ГПТБ (0,1 мМ). В других случаях наблюдалось снижение апоптотической гибели клеток. Основываясь на полученных результатах можно предположить, что сочетанное применение доноров оксида азота и свободно-радикальных агентов в низких концентрациях может приводить к усиленной пролиферации с одновременной индукцией апоптоза.

Одним из частных случаев свободно-радикального воздействия на опухолевые клетки является химиотерапия лекарственными препаратами, в частности антрациклиновыми антибиотиками [6, 82]. Использование комбинации доксорубицина с донорами оксида азота приводило к достоверному увеличению процессов синтеза ДНК в опухолевых клетках карциномы Эрлиха, за исключением усиления опухолетоксического щ действия доксорубицина (10" М), которое наблюдалось при добавлении доноров оксида азота NaN02 и SNP в концентрациях 10" М. L-аргинин в сочетании с доксорубицином оказывал выраженное цитопротекторное действие. В то же время было обнаружено соединение, которое значительно усиливало цитотоксическое действие доксорубицина. Так нитрозогуанидин в концентрации

10"4М в 3 раза усиливал ингибирующее действие доксорубицина на синтез ДНК.

Таким образом, полученные результаты показывают, что применение доксорубицина в сочетании с донорами оксида азота in vitro выявило наличие сложной закономерности в воздействии различных комбинаций доз антибиотика и доноров оксида азота на пролиферативную активность опухолевых клеток. Доноры оксида азота имеют неоднозначное действие на опухолетоксический эффект доксорубицина, что зависит от химического строения и концентрации используемых соединений. Выявленное снижение антипролиферативного эффекта доксорубицина и индукции апоптоза опухолевых клеток донорами NO дает основание предположить, что оксид азота может являться одним из факторов, способствующим появлению клонов опухолевых клеток, устойчивых к доксорубицину и обладающих повышенной пролиферативной активностью.

Оценивая полученные в настоящей работе данные, можно заключить, что NO, вероятно, является фактором, защищающим ДНК опухолевых клеток от повреждающего действия доксорубицина и вносит свой вклад в развитие резистентности опухолей к антрациклиновым антибиотикам. Однако стоит отметить, что в некоторых ситуациях наблюдалось потенцирование повреждающего действия доксорубицина. В итоге конечный результат комбинированного действия оксида азота и свободных радикалов зависит от многих факторов: от концентрации действующих агентов, от типа клеток, от условий постановки экспериментов. Учитывая способность некоторых противоопухолевых препаратов усиливать генерацию N0, необходимо, по нашему мнению, дополнительно исследовать противоопухолевую активность комбинации препаратов, используемых в химиотерапии.

На наш взгляд, наиболее перспективным для клинического использования из всех исследованных доноров оксида азота являются нитрозосоединения, что подтверждаеся существованием противоопухолевых препаратов класса нитрозомочевины, нашедшей терапевтическое применение [2, 30]. Для более полной оценки способности нитрозогуанидина модулировать противоопухолевое действие доксорубицина было проведено исследование in vivo. Показано, что MNNG может усиливать терапевтический эффект доксорубицина что выражалось в значительном уменьшении размера опухоли, а также усилении индукции апоптоза и некроза клеток карциномы Эрлиха по сравнению с действием одного химиопрепарата. Ранее показано, что противоопухолевая эффективность циклофосфана повышалась при его комбинации с донором N0 по отношению к клеткам лейкемии Р-388 [23, 24]. Сопоставляя эти факты можно сделать вывод о целесообразности применения доноров оксида азота для повышения эффективности используемых в клинике химиотерапевтических агентов. Однако для окончательного заключения по использованию доноров N0 в химиотерапии опухолей необходимы дополнительные исследования зависимости противоопухолевого эффекта от дозы, химической структуры соединений и стадии опухолевого процесса.

Обобщая представленные результаты, можно сказать, что в клетках млекопитающих развились не только механизмы, позволяющие адаптироваться к сосуществованию с агрессивными свободными радикалами, но и пути использования этих высокоактивных молекул для регуляции жизненно-важных функций. Свободные радикалы играют важную физиологическую роль в жизнедеятельности организма, и к числу их биологических эффектов относится регуляция пролиферации и апоптотической гибели клеток. При злокачественной трансформации происходит приспособление данных механизмов для обеспечения максимальной способности к выживанию и росту опухолевых клеток. Если в нормальных клетках срабатывает программа ограниченного числа делений и входа в дифференцировку и затем апоптоз, то в опухолевых клетках свободные радикалы являются одним из инструментов обеспечения их неконтролируемого роста, мутагенеза и опухолевой прогрессии.

В дополнение к имеющимся общепринятым молекулярно-биохимическим характеристикам опухолевых клеток, которые включают наличие мутаций в генах, продукты которых контролируют пролиферацию и апоптоз, аутокринный тип регуляции роста, активацию внутриклеточных сигнальных путей, мы обнаружили новые атрибуты опухолевого роста. На основании полученных нами данных, следует отметить, что злокачественные клетки отличают от нормальных такие характеристики, как

• внеклеточная продукция ферментативных и неферментативных антиоксидантов

• замедленный распад экзогенных пероксидов

• быстрая активация и высокая индуцибельность ферментов, участвующих в образовании сигнальных молекул липидной природы

• нарушение регуляции окислительно-восстановительного гомеостаза в опухолевых клетках, ингибирование активности антиоксидантных ферментов в быстрорастущих опухолях

• использование оксида азота в качестве фактора защиты опухолевых клеток от окислительного стресса.

По результатам настоящего исследования и литературным данным возможно выделить несколько основных механизмов влияния свободных радикалов на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток (рис. 29). Необходимо подчеркнуть существование концентрационной зависимости влияния свободных радикалов на клеточные физиологические эффекты и метаболические процессы. В высоких концентрациях они оказывают повреждающее действие на опухолевые клетки, что выражается в ингибировании синтеза ДНК, нарушении процессов репарации клеточных мембран. Итогом такого воздействия являются угнетение пролиферации опухолевых клеток и индукция в них апоптоза.

Рис. 29. Возможные механизмы регуляции свободными радикалами пролиферации и апоптоза опухолевых клеток.

В противоположность этому, свободные радикалы в низких концентрациях усиливает передачу ростстимулирующих сигналов, в том числе, за счет освобождения арахидоновой кислоты, активируют синтез ДНК, что ведет к активации пролиферативных процессов в опухолевых клетках.

Доноры N0 могут также оказывать неоднозначное действие на процессы пролиферации и апоптоза опухолевых клеток. Оксид азота, вследствие своих мультипотентных свойств, определяемых как цитотксичностью радикала, так и его коммуникативной активностью участвует в поддержании роста опухолей.

На данном этапе сложно найти взаимосвязь между действием всех факторов, определяющих терапевтический эффект доноров оксида азота, однако можно констатировать, что решающее значение в их физиологических ответах имеет концентрация и химическая структура N0-генерирующих соединений. В данной работе получены результаты, показывающие принципиальную возможность развития направления по использованию доноров оксид азота для усиления терапевтической эффективности доксорубицина. Наиболее перспективным для развития направления по использованию доноров оксида азота в онкологии представляется проведение комплексных исследований, совмещающих изучение их антиканцерогенной, противоопухолевой, антиметастатической и иммуномодулирующей активности, что в итоге может привести к их широкому клиническому применению.

В заключение необходимо отметить, что нарушение окислительно-восстановительного гомеостаза играет важную роль в биологии рака, которое заключается не только в запуске канцерогенеза, но и поддержании роста опухолей, поэтому определение возможности регуляторного влияния на свободно-радикальные процессы в злокачественных клетках может являться плодотворной предпосылкой на пути создания противоопухолевых средств нового типа. Управление интенсивностью свободно-радикальных реакций может иметь существенное значение для повышения эффективности профилактических мероприятий и противоопухолевой терапии.