Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Спонтанный апоптоз и чувствительность опухолевых клеток к химиопрепаратам in vitro при острых лейкозах у детей

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГИИ И ПЕРЕЛИВАНИЯ КРОВИ

УДК 616.155.392-053.2:[616-018-006:615.28]

ШМАН ТАТЬЯНА ВИКТОРОВНА

СПОНТАННЫЙ АПОПТОЗ И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК К ХИМИОПРЕПАРАТАМ IN VITRO ПРИ ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗАХ У ДЕТЕЙ

14.00.29 - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск, 2004

Работа выполнена в ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии и гематологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь и ГУ «НИИ гематологии и переливания крови» Министерства здравоохранения Республики Беларусь.

Научный руководитель: Доктор медицинских наук М.П. Потапнев,

заместитель директора по науке ГУ «РНПЦДОГ» МЗ РБ

Научный консультант: Доктор медицинских наук, профессор А.И. Свирновский,

заведующий лабораторией патофизиологии лейкозов ГУ «НИИ гематологии и переливания крови» МЗ РБ

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор,

член-корреспондент НАНБ Е.И. Слобожанина, заместитель директора по научной работе ГНУ «Институт фотобиологии НАНБ», заведующая лабораторией физико-химии биологических мембран

Кандидат биологических наук, доцент Д.Г. Цвирко, заведующий отделом клинической гематологии ГУ «НИИ гематологии и переливания крови» МЗ РБ»

Оппонирующая организация: ГУ «НИИ онкологии и медицинской радиологии

им. H.H. Александрова» МЗ РБ

Защита состоится " илСи^-С 2004 г. в на заседании Совета по защите диссертаций Д03.11.01 приГУ «НИИ гематологии и переливания крови» Министерства здавоохранения Республики Беларусь по адресу: 223059, Минск, Долгиновский тракт, 160. Телефон ученого секретаря (017) 289-89-09.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеках ГУ «РНПЦДОГ» и ГУ «НИИ гематологии и преливания крови» МЗ РБ. Автореферат разослан"

2004 г.

Ученый секретарь Совета по защите диссертаций, кандидат медицинских наук доцент

С.И. Кривенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Апоптоз, или запрограммированная клеточная гибель, - генетически детерминированный процесс, нарушения в котором лежат в основе развития многих патологических процессов [Carson D.A. et al., 1993; Hetts S.W., 1998]. Одним из важных достижений последнего времени было установление роли апоптоза в канцерогенезе [Wickremasinghe R.G. et al., 1999]. Блокировка программы апоптоза позволяет опухолевой клетке выживать вне зависимости от факторов роста и гормонов [Igney F.H. et al., 2002]. В то же время показано, что уничтожение опухолевых клеток посредством иммунотерапии, химиопрепаратов, радиотерапии происходит за счет запуска в них программы клеточной гибели [Hannun Y.А., 1997]. Очевидно, что с апоптозом связаны как образование опухоли, так и ее элиминация [Debatin К.-М. et al., 2003].

Необходимость изучения апоптоза при онкологических заболеваниях заключается в том, что способность опухолевой клетки запускать программу апоптоза отражает ее чувствительность к лекарственно-индуцируемому апоптозу как in vitro (по результатам тестов на химиочувствительность), так и in vivo (по результатам ответа на терапию). Полагают, что именно способность к запуску программы клеточной гибели связана с эффективностью химиолучевой терапии и прогнозом заболевания [Zhivotovsky В. et al., 2003].

Объективной характеристикой, отражающей способность клетки к апоптозу, является показатель так называемого «спонтанного» (culture-induced) апоптоза, который характеризует апоптоз опухолевых клеток in vitro при отсутствии специфических индукторов. Проведенные немногочисленные исследования показали наличие связи между уровнем спонтанного апоптоза и химиочувствительностью опухолевых клеток in vitro [Efferth T. et al., 1997] и in vivo [Smith B.D. et al., 1998]. Различные экспериментальные модели и методы определения апоптоза, используемые в настоящее время, приводят к противоречивым результатам [Tsuda H. et al., 1993; Huang R.W. et al., 1993; Banker D.E. et al., 1997; Wuchter С. et al., 2000, 2002; Svirnovski A.I. et al., 2000; Garrido S.M. et al., 2001].

Способность к апоптозу рассматривается в качестве одной из характеристик опухолевых клеток, поэтому важно оценить ее взаимосвязь с другими биологическими параметрами, а также прогностическими факторами при онкогематологических заболеваниях. Так, при Т-линейном остром лимфобластном лейкозе у детей выявлена зависимость чувствительности лейкемических клеток к дексаметазон-индуцированному апоптозу от стадии дифференцировки клеток [Wuchter С. et al., 2002]. При остром миелоидном лейкозе (ОМЛ) у взрослых показано значение цитогенетических перестроек для чувствительности опухолевых клеток к спонтанному апоптозу [Banker D.E. et al., 1997]. Было установлено, что прогрессия В-хронического лимфолейкоза

(XJ1JI) сопровождается снижением чувствительности к апоптозу [Oliveira G.B. et al., 2001].

В регуляции уровня спонтанного и лекарственно-индуцированного апоптоза лейкозных клеток участвуют многочисленные проаптотические и антиапоптотические молекулы. Так, при остром лимфобластном лейкозе (OJIJI) у детей экспрессия опухолевыми клетками антиапоптотического белка Вс1-2 имела обратную корреляцию с уровнем их спонтанного апоптоза, тогда как при B-XJIJI у взрослых были получены противоположные результаты [Bromidge T.J. et al., 1998; Haarman E.G. et al., 1999]. К настоящему времени не сформировано единого мнения о прогностическом значении показателей апоптоза. Показано, что снижение уровня спонтанного апоптоза сопровождается худшим ответом на цитостатическую терапию при OJIJI у детей [Malinovska I. et al., 2002; Осипова Е.Ю. и др., 2003]. Однако другие исследователи полагают, что уровень экспрессии проапоптотического CD95, антиапоптотического Вс1-2, а также уровень спонтанного апоптоза не имеют значения для прогнозирования раннего ответа на терапию и не связаны с развитием рецидивов при OJIJI у детей [Wuchter С. et al., 2000].

Таким образом, интерес к проблемам апоптоза опухолевых клеток объясняется как неоднозначностью имеющихся данных на современном этапе, так и возможностью практического использования полученных результатов для прогноза ответа на терапию острого лейкоза.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Исследования по теме диссертации проведены в рамках следующих НИР: «Разработать и внедрить классификацию признаков групп риска детей с острыми лейкозами на основе биологических свойств лейкозных клеток и их чувствительности к химиопрепаратам», выполняемой по заданию ОНТП «Охрана материнства и детства и медицинская генетика» (1999-2000 гг., номер госрегистрации 2000110 от 13.01.2000); «Зависимость лекарственной чувствительности от фенотипических и генетических свойств лейкозных клеток, полученных ex vivo», выполняемой по заданию Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований (БРФФИ) (2000-2002 гг., договор Jfo Б99М-066, номер госрегистрации 20003044); «Разработать компьютерную систему анализа прогностических факторов риска для выбора адекватной терапии острых лейкозов у детей», выполняемой по заданию МНТЦ (грант № В-522, 2001-2004 гг.); «Изучение спонтанного апоптоза in vitro лейкемических клеток человека», выполняемой по заданию БРФФИ (2002-2004 гг., договор № Б01-208, номер госрегистрации 20022583).

Цель исследования. Оценка способности лейкемических клеток к спонтанному апоптозу и анализ их чувствительности к химиопрепаратам in vitro в зависимости от линейного происхождения, степени дифференцировки и других биологических особенностей опухолевых клеток при острых лейкозах у детей.

Задачи исследования:

1. Сравнить эффективность использования различных методов определения апоптоза лейкемических клеток.

2. Изучить влияние линейной принадлежности и степени дифференцировки лейкемических клеток на их способность к спонтанному апоптозу и чувствительность к химиопрепаратам in vitro.

3. Проанализировать взаимосвязь спонтанного апоптоза с лекарственной чувствительностью лейкемических клеток in vitro.

4. Исследовать зависимость спонтанного апоптоза и лекарственной чувствительности лейкемических клеток in vitro от их пролиферативной активности.

5. Оценить влияние экспрессии CD95, CD95L, Вс1-2 и P-gp на уровень спонтанного апоптоза и лекарственной чувствительности лейкемических клеток in vitro.

6. Исследовать связь способности лейкемических клеток к спонтанному апоптозу и их чувствительности к химиопрепаратам in vitro с инициальным лейкоцитозом и ранним ответом на терапию при В-линейном ОЛЛ, а также выявить особенности спонтанного апоптоза и химиочувствительности опухолевых клеток при рецидивах острого лейкоза.

Объект исследования. Лейкемические клетки костного мозга детей с диагнозом острый лейкоз.

Предмет исследования. Способность лейкемических клеток подвергаться спонтанному апоптозу и цитотоксическому действию химиопрепаратов in vitro.

Гипотеза. Лейкемические клетки различной линейной принадлежности и степени дифференцировки отличаются по способности подвергаться спонтанному апоптозу и действию химиопрепаратов in vitro. Такие биологические особенности лейкемической популяции, как пролиферативная активность, плоидность, экспрессия про- и антиапоптотических молекул, белков лекарственной резистентности определяют способность опухолевых клеток подвергаться спонтанному апоптозу и действию цитостатических препаратов.

Методология и методы проведенного исследования. В работе использована методология клинико-биологического исследования: изучали биологические особенности апоптоза, пролиферации, чувствительности к химиопрепаратам лейкемических клеток при острых лейкозах у детей с целью получения значимых для клиники данных. Применяли следующие методы: выделение лейкемических клеток и их краткосрочное культивирование; флуоресцентно-микроскопический и цитофлуориметрические методы выявления апоптотических клеток; метил-тиазол-тетразолиумбромид метод (МТТ-тест) определения чувствительности лейкемических клеток к химиопрепаратам; цитофлуориметрический метод оценки распределения

опухолевых клеток по фазам клеточного цикла; иммунофенотипический и цитогенетический анализы; методы статистической обработки данных.

Научная новизна и значимость полученных результатов. Впервые показана зависимость уровня спонтанного апоптоза лейкемических клеток от их линейной принадлежности. Установлено, что лейкемические клетки при ОМЛ у детей характеризуются достоверно сниженной способностью к спонтанному апоптозу по сравнению с ОЛЛ.

Впервые оценена способность к спонтанному апоптозу опухолевых клеток при различных субтипах de novo ОМЛ и В-линейного ОЛЛ у детей. Установлено, что опухолевые клетки при М1-М2 субтипах проявляют достоверно большую способность к спонтанному апоптозу по сравнению с МЗ и М4 субтипами ОМЛ, а опухолевые клетки при пре-В субтипе более подвержены спонтанному апоптозу, чем при Common субтипе В-линейного ОЛЛ.

Впервые показано, что лекарственная резистентность лейкемических клеток in vitro при В-линейном ОЛЛ ассоциирована с высоким уровнем экспрессии CD34 (устойчивость к L-аспарагиназе, цитарабину и этопозиду), гиподиплоидным количеством хромосом (устойчивость к винкристину), низкой чувствительностью к спонтанному апоптозу (устойчивость к цитарабину и L-аспарагиназе).

Впервые установлено, что низкий уровень спонтанного апоптоза лейкемических клеток при В-линейном ОЛЛ является фактором развития раннего рецидива заболевания. Выявлено, что при рецидивах острых лейкозов у детей лейкемические клетки проявляют сниженную способность к спонтанному апоптозу по сравнению с de novo заболеванием как при ОЛЛ, так и при ОМЛ.

Практическая (экономическая, социальная) значимость полученных результатов. Метод определения in vitro лекарственной чувствительности лейкемических клеток к цитотоксическому действию химиопрепаратов включен в перечень тестов комплексной диагностики лейкозов (Инструкция МЗ РБ № 111-1102 от 13.02.2003 г. «Применение МТТ-теста для оценки чувствительности лейкозных клеток к цитостатическим препаратам in vitro и прогнозирования ответа на химиотерапию при лейкозах»). Показатели спонтанного апоптоза и чувствительности опухолевых клеток к химиопрепаратам in vitro рекомендованы и используются для стратификации групп риска с целью проведения дифференцированной химиотерапии при острых лейкозах у детей (Методические рекомендации «Стратификация групп риска у детей с острым лимфобластным лейкозом», утвержденные МЗ РБ от 4 декабря 2000 г., регистрационный номер 14-1.001-1).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту: 1. Для выявления апоптотических лейкемических клеток наиболее чувствительными являются методы, детектирующие ранние и промежуточные, но не поздние стадии апоптоза.

2. Лейкемические клетки миелоидиого происхождения по сравнению с лимфоидными характеризуются сниженной способностью к спонтанному апоптозу и менее чувствительны к действию химиопрепаратов in vitro.

3. Лекарственная резистентность лейкемических клеток при de novo 13-линейном ОЛЛ ассоциирована с высоким уровнем экспрессии CD34, гиподиплоидным количеством хромосом, сниженным количеством пролиферирующих клеток, экспрессией белка P-gp, низкой чувствительностью к спонтанному апоптозу.

4. Рецидив острого лейкоза по сравнению с первично диагностированным заболеванием характеризуется снижением способности лейкемических клеток к спонтанному апоптозу и чувствительности к химиопрепаратам in vitro. Сниженная способность лейкемических клеток к спонтанному апоптозу является фактором, указывающим на возможность развития раннего рецидива острого лейкоза.

Личный вклад соискателя. Выделение, культивирование, фиксация лейкемических клеток, частично их окраска для определения уровня спонтанного апоптоза методом проточной цитофлуориметрии, а также определение апоптоза методом флуоресцентной микроскопии, МТТ-тест и анализ результатов выполнены автором самостоятельно. Все цитофлуоримет-рические исследования проводились совместно с н.с. Савицким В.П. В диссертации не использованы результаты исследований соавторов публикаций.

Апробация результатов диссертации. Результаты исследований, включенные в диссертацию, докладывались: на II съезде детских онкологов и гематологов России (Ростов-на-Дону, 4-6 июня 2001 г.); VIII и IX международном симпозиумах «Актуальные вопросы детской онкологии и гематологии» (Минск, 27-29 апреля 2000 г., 25-27 апреля 2002 г.); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии» (Минск, 25-27 октября 2000 г.); VI Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (20-23 мая 2002 г.); 31-ом ежегодном конгрессе международного общества экспериментальной гематологии (Монреаль, 5-9 июля 2002 г.); III международном симпозиуме "Биологические основы терапии онкогематологи-ческих заболеваний" (г. Москва, 6-7 февраля 2003 г.).

Опубликованность результатов. По теме диссертации имеется 17 научных публикаций. Из них статей в научных журналах - 6, статей в рецензируемых сборниках научных материалов - 2, тезисов докладов в материалах научных конференций и съездов научных обществ - 9. Общий объем опубликованного материала - 52 страницы.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 100 страницах машинописного текста и содержит 10 иллюстраций, 20 таблиц. Список использованных литературных источников включает 186 ссылок (в том числе 23 - на русском и 163 - на английском языках). Диссертация включает

введение, общую характеристику работы, обзор литературы, описание материалов и методов, пять глав собственных данных, главу обсуждения результатов, заключение, список использованных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В исследование включены 206 пациентов в возрасте от 6 месяцев до 17 лет, поступавшие для лечении в ГУ РНПЦЦОГ МЗ РБ с 1999 по 2002 гг. Из них у 128 детей диагностирован острый лимфобластный лейкоз (OJIJI), у 37 детей -острый миелоидный лейкоз (OMJI), у 32 - рецидив OJIJI, у 9 - рецидив OMJ1. Общеклиническое, иммунофенотипическое и цитогенетическое обследование больных проводили по общепринятым методикам в клинико-диагностической лаборатории РНПЦЦОГ. Для решения задач исследования у всех больных до начала интенсивной полихимиотерапии получали лейкемические клетки костного мозга, которые выделяли на градиенте плотности Histopaque-1077 (Sigma, США). Клетки дважды отмывали в среде RPMI-1640 (Sigma, США) с добавлением 1% эмбриональной сыворотки телят (ЭТС, Sigma, США).

Определение спонтанного апоптоза проводили после культивирования лейкемических клеток в среде RPMI-1640 с добавлением 15 % ЭТС, 2 mM L-глутамина (Sigma, США) и антибиотиков (смеси пенициллина, стрептомицина, амфотерицинаВ, Sigma, США) при 37°С во влажной атмосфере 5% СОг в течение 20 часов. По окончании культивирования часть клеток немедленно окрашивали (JC-1 или AnnexinV-kit), другую часть клеток фиксировали 1 % параформальдегидом при +4°С, отмывали фосфатно-солевым буферным раствором (ФБР) и сохраняли в 70 % охлажденном этиловом спирте для последующей окраски PI и APO-BRDU Kit.

Морфологический метод определения апоптоза включал окраску предварительно фиксированных параформальдегидом клеток акридиновым оранжевым (АО, 4 мкг/мл) в присутствии этидиум бромида (4 мкг/мл) [Dai J. et al., 1999]. Учет результатов проводили на флуоресцентном микроскопе ЛЮМАМ РПО-11 (JIOMO, Россия) при увеличении х1500 раз. Апоптотические клетки различали по морфологии ядра (конденсированный и/или фрагментированный хроматин). Процент апоптотических клеток рассчитывали из не менее чем 300 живых клеток.

Апоптотические клетки с измененным митохондриальным мембранным потенциалом выявляли с использованием липофильного катионного зонда 5,5',6,6'-тетрахлоро-1,1 ',3,3 '-теграэтилбензимидазолкарбоцианина иодид (JC-1, Molecular Probes, США) [Salvioli S. et al., 1997]. Для этого нефиксированные клетки инкубировали в ФБР с JC-1 (1 мкМ) в темноте при комнатной

температуре. Затем клетки отмывали и анализировали на проточном цитофлуориметре FACScan (Becton Dickinson, далее BD, США).

Апоптотические клетки с экспрессией фосфатидилсерина на внешней поверхности оценивали с использованием AnnexinV-kit (BD, США) согласно рекомендациям производителя.

Для определения апоптотических клеток с гиподиплоидым содержанием ДНК фиксированные лейкемические клетки обрабатывали РНК-азой (150 Ед/мл) в течение 30 минут при +4°С. Затем клетки отмывали и окрашивали пропидиум иодидом (PI, 50 мкг/мл) в течение 30 минут при комнатной температуре и анализировали на проточном цитофлуориметре FACScan [Darzynkiewicz Z. etal., 1997].

Выявление апоптотических клеток с разрывами ДНК проводили с использованием APO-BRDU Kit (PharMingen, США) согласно рекомендациям фирмы-производителя. Результаты учитывали на проточном цитофлуориметре.

Лекарственную чувствительность лейкемических клеток к цитотоксическому действию химиопрепаратов определяли с помощью 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид (МТТ) теста [Pieters R е. а., 1990]. Для этого свежевыделенные лейкемические клетки помещали в ту же среду, что и для определения спонтанного апоптоза. В случае OJIJI в среду дополнительно добавляли смесь ITS (инсулин, трансферрин, селенит натрия) (Sigma, США). Клетки культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах, содержащих цитостатические химиопрепараты, в атмосфере 5% СО2 при +37°С 96 часов. Исследовали следующие химиопрепараты: дексаметазон - в конечных концентрациях 0,0002 - 6,0 мкг/ мл; преднизолон -0,008 - 250,0 мкг/мл; винкристин - 0,05-50,0 мкг/мл; L-аспарагиназа - 0,003 -10,0 ЕД/мл; рубомицин - 0,008 - 8,0 мкг/мл; доксорубицин - 0,008 - 8 мкг/мл; цитарабин - 0,01 - 10,0 мкг/мл; этопозид - 0,05 - 50,0 мкг/мл. Далее в каждую лунку добавляли по 10 мкл МТТ (5 мкг/мл) и продолжали инкубирование 6 часов, после чего образовавшиеся гранулы формазана растворяли кислым изопропанолом. Результаты окрашивания определяли при 540 нм на спектрофотометре Sanofi Diagnostic Pasteur PR 2100 (Франция).

Выживаемость клеток (ВК) рассчитывали по формуле: ВК (%) = (ОПл-ОПс)/(ОПк-ОПс)*ЮО%, где ОПл - это оптическая плотность опытных лунок, ОПк - оптическая плотность лунок контроля клеток без препаратов, ОПс -оптическая плотность лунок контроля среды без клеток. Результаты считали адекватными, если ОПк-ОПс>0,05. Величину полулетальной концентрации препарата LC50 (концентрация, при которой гибнет 50 % клеток) рассчитывали на основании построения кривой выживаемости клеток с каждым из шести разведений препарата.

Для определения параметров клеточного цикла фиксированные лейкемические клетки отмывали в ФБР, обрабатывали РНК-азой (150 Ед/мл) и окрашивали раствором пропидиума иодида (PI, 50 мкг/мл) в течение 30 минут

при комнатной температуре [Ormerod M.G., 1994]. Учет результатов проводили на проточном цитофлуориметре FACScan в прикладной программе CellFit. Полученные данные выражали как процент клеток, находящихся в G0/G1, S, G2+M фазах клеточного цикла.

Экспрессию молекул CD95, CD95L, P-gp и Вс1-2 выявляли с помощью моноклональных антител DX2, NOK1, 17F9 и bcl-2/ЮО (BD, США) соответственно. Пробы анализировали на проточном цитофлуориметре FACScan. Полученные данные выражали в значении коэффициента D, рассчитанном с помощью теста Колмогорова-Смирнова в программе LYSIS II [Taylor В J. et al., 2000].

Функциональную активность P-gp оценивали по накоплению клетками липофильного флуоресцентного зонда JC-1 с использованием специфического модулятора активности P-gp - циклоспорина А (CsA) [Legrand О. et al., 2001]. Полученные данные выражали в значении коэффициента D.

Математическую обработку и статистический анализ данных проводили в программе Statistica 6.О., где использовали непараметрические методы статистики. Результаты представлены в виде значений медианы и диапазона распределения данных (25 - 75 персентили). Оценку достоверности различий между независимыми группами проводили с помощью U-теста Манна-Уитни. В отмеченных случаях использовали парный тест Вилкоксона и -/2-тсст. Корреляционные зависимости оценивали по тесту Спирмана. Результаты считали достоверными при р<0,05.

Результаты и их обсуждение

Анализ спонтанного апоптоза лейкемических клеток с использованием различных методов. Известно, что использование нескольких методов позволяет выявлять клетки на различных стадиях апоптотического процесса [Ormerod M.G., 1998]. Поэтому для исследования мы выбрали пять наиболее распространенных методов детекции апоптоза (рис.1). Для выявления «вязи между количеством апоптотических клеток, выявляемых с помощью различных методов, нами был использован корреляционный анализ на примере de novo В-линейного OJLJL Наиболее высокие значения коэффициента корреляции установлены между количеством апоптотических клеток в следующих популяциях: АО конд и JC-1 (R=0,7 при р<0,0005), АО конд и An+PI+ (R=0,73 при р<0,0005), JC-1 и An+PI+ (R=0,74 при р<0,0005). Не наблюдали корреляций между количеством апоптотических клеток, выявляемых в популяциях АОфрагм и SubGl/PI+, АОфрагм и BRDU+PI+, т.е. между количеством поздних апоптотических клеток. Количество ранних апоптотических клеток в популяции Ап+Р1- не коррелировало с уровнями апоптотических клеток, выявляемых во всех других популяциях с использованием различных методов.

Рис.1 Методы определения апоптотических клеток. А) Морфологическая детекция живых (неапоптотических), апоптотических клеток (отмечены стрелкой) с конденсированным хроматином (АО конд) и В) апоптотических клеток с фрагментированным хроматином (АО фрагм). Цитофлуориметрическое выявление апоптотических клеток: С) AnnexinV-FITC-kit, где R1 - живые клетки, R2 - ранние апоптотические (AnV+PI-) и R3 - поздние апоптотические клетки (AnV+PI+); D) JC-1 окрашивание, где R1 - живые, R2 -апоптотические клетки (JC-1); Е) APO-BrdU-kit, где R1 - живые клетки, R2 - ранние апоптотические (BrdU+PI-) и R3 - поздние апоптотические клетки (BrdU+PI+); F) выявление апоптотических клеток по гиподиплоидному количеству ДНК с PI окрашиванием, где R1 -живые клетки, R2 - апоптотические клетки (SubGl/PI+).

Таким образом, наши данные подтверждают, что перераспределение фосфатидилсеринов клеточной мембраны является наиболее ранним апоптотическим изменением [Pepper С. et al., 1997; Span L.F. et al., 2002], и, более того, согласно нашим данным, клетки с такими изменениями не детектируются никаким другим из использованных нами методов. Уровень Ап+Р1+ апоптотических клеток в высокой степени коррелировал как с количеством клеток, находящихся в апоптотических популяциях относительно ранних и/или промежуточных стадий апоптоза (JC-1, АО конд), так и в популяциях промежуточных / поздних стадий апоптоза (АО фрагм, subGl/PI). Следовательно, лейкемические клетки, выявляемые как Ап+Р1+ популяция,

находятся на промежуточных / поздних стадиях апоптоза и не являются полностью некротической популяцией. Из использованных методов выявление апоптотических клеток по гиподиплоидному количеству ДНК (subGl/PI) является наименее чувствительным. Другие методы оказались практически равноценными для выявления большинства апоптотических лейкемических клеток при В-линейном OJLJI у детей.

Влияние линейной принадлежности и степени дифференцировки острого лейкоза на способность лейкемических клеток к спонтанному апоптозу и чувствительность к химиопрепаратам in vitro. По нашим данным среди свежевыделенных лейкемических клеток костного мозга при первичном ОЛЛ количество апоптотических клеток составляет менее 3 %, тогда как после 20 часов культивирования — около 30 %. Поэтому для исследования способности лейкемических клеток к апоптозу нами было выбрано 20-часовое культивирование. Для исследования чувствительности лейкемических клеток к химиопрепаратам был использован МТТ-тсст, который рассматривается как косвенный способ определения лекарственно-индуцированного апоптоза [Hunnun Y.A., 1997].

Сравнительные исследования показали, что миелоидные лейкемические клетки менее подвержены спонтанному апоптозу in vitro по сравнению с лимфоидными клетками по данным всех методов детекции апоптоза (таблица 1).

Таблица 1

Спонтанный апоптоз опухолевых клеток при ОЛЛ и ОМЛ

Количество апоптотических клеток (%)2 после 20-

Методы 3 часового культивирования лейкемических клеток

п ОЛЛ л ОМЛ

АО конд 16,5(10,2-28,0) 6,7 (2,6-11,9) ***

АО фрагм 6,0 (3,0-15,2) 3,7(1,4-6,9)*

АО общий 125 30,0 (16,6-48,4) 37 9,3 (5,7-16,0)***

Sub-Gi/PI 110 6,8(3,2-15,8) 33 3,9(1,7-7,6)*

BrdU+PI- 15,5 (7,9-26,7) 8,0(4,1-11,6)**

BrdU+PI+ 7,9(2,8-18,6) 5,3 (3,5-8,5)

BrdU+ общи 72 27,4 (15,8-42,2) 16 14,1 (9,4-21,7) **

AnV+PI- 13,3 (4,9-16,3) 7,7 (4,9-8,8)

AnV+PI+ 17,2 (7,4-24,8) 6,3 (2,5-8,8) **

AnV+ общий 32 30,0 (19,4-38,9) 12 14,9(10,6-17,6)**

JC-1 39 31,1 (19,4-42,2) 9 6,9 (2,2-20,3) **

1. *- р<0,05; **- р<0,005; *** - р<0,0005.

2. Данные представлены в значениях медианы (25 - 75 персентили).

3. Использованные сокращения расшифрованы в подписи к рисунку 1.

Условия культивирования не влияли на уровень спонтанного апоптоза миелоидных, но не лимфоидных лейкемических клеток, уровень апоптоза

которых снижался в присутствии аутоплазмы или кондиционированной среды, и увеличивался в отсутствии сыворотки.

Миелоидные лейкемические клетки по сравнению с лимфоидными оказались достоверно более резистентными ко всем исследованным цитостатическим химиопрепаратам (таблица 2).

Таблица 2

Лекарственная чувствительность лейкемических клеток _при ОЛЛ и ОМЛ_

Изучаемые препараты Лекарственная чувствительность LC 50 (мкг/мл) лейкемических клеток

п ОЛЛ п ОМЛ

Дексаметазон 92 0,08 (0,01-6,0) 13 6,0 (6,0-6,0) **

Преднизолон 100 0,29 (0,03-168,0) 12 250,0 (21,3-250,0) **

Винкристин 91 0,075 (0,04-2,4) 12 1,7(0,3-8,7)*

L-аспарагиназа2 95 0,48 (0,01-1,7) 12 3,5 (1,0-10,0)*

Рубомицин 47 0,029 (0,01-0,07) 15 0,1 (0,07-0,1) *

Доксорубицин 47 0,08 (0,02-0,12) 34 0,2 (0,15-0,4) ***

Цитарабин 48 0,57(0,3-1,3) 34 1,7(0,55-2,3)*

Этопозид 49 0,8 (0,48-2,7) 34 7,5(2,1-15,1)***

1. Данные представлены в значениях медианы (25 - 75 персентили).

2. LC50 для L-аспарагиназы выражали в Ед/мл.

3. *- р<0,05; ** - р<0,005; *** - р<0,0005.

По нашим данным Т- и В-линейные лейкемические клетки не отличаются по способности к спонтанному апоптозу. В то же время Т-линейные лейкемические клетки были в 24 раза (р=0,01) более чувствительны к дексаметазону по сравнению с В-линейными.

Сравнение различных субтипов В-линейного ОЛЛ (про-В; Common; преВ; зрелый-В) показало достоверное увеличение уровня спонтанного апоптоза лейкемических клеток в группе больных пре-В по сравнению с Common ОЛЛ при использовании APO-BrdU-kit или AnnexinV-kit. Так, уровень спонтанного апоптоза лейкемических клеток при пре-В субтипе ОЛЛ (п=24) при использовании APO-BrdU-kit составил 38,8 % (20,7-54,0), тогда как при Common ОЛЛ (п=36) - 21,0 % (12,8-37,6) при р=0,05. Наибольший уровень спонтанного апоптоза (р<0,05) наблюдали в группе больных с диагнозом зрелый В-линейный ОЛЛ (п=6) по сравнению с про-В, Common и пре-В субтипами первичного ОЛЛ, что было подтверждено несколькими методами детекции апоптоза. Связь спонтанного апоптоза и степени дифференцировки подтверждается также наличием обратной корреляционной зависимости между интенсивностью экспрессии CD34 лейкемическими клетками при В-линейном ОЛЛ и уровнем спонтанного апоптоза (R= -0,4 при р= 0,04; п=27).

Достоверных различий в чувствительности лейкемических клеток к химиопрепаратам между субтипами В-линейного OJIJI нами не выявлено. Однако нами отмечена тенденция к снижению чувствительности менее дифференцированных лейкемических клеток про-В субтипа (п=6) к дексаметазону, преднизолону, L-аспарагиназе, цитарабину и этопозиду в 48; 27; 3; 1,5 и 2,8 раза соответственно по сравнению с Common/пре-В субтипами. Выявлена слабая прямая корреляционная зависимость между количеством CD34+ клеток и чувствительностью к L-аспарагиназе (R=0,2 при р=0,06 и п=78), а также интенсивностью экспрессии CD34 на лейкемических клетках и их чувствительностью к цитарабину (R=0,4 при р=0,02; п=40) и этопозиду (R=0,3 при р=0,05; п=41). Сниженная химиочувствительность менее дифференцированных лейкемических клеток может быть связана с их сниженной способностью подвергаться апоптозу, что описано выше.

Сравнение М1-М2, МЗ, М4 субтипов первичного OMJI показало, что лейкемические клетки М1-М2 субтипов достоверно более подвержены спонтанному апоптозу по сравнению с МЗ (по данным морфологического анализа и AnnexinV-теста) и М4 субтипами (морфологический анализ). По данным другого метода (APO-BrdU-kit) МЗ характеризуется достоверно сниженной способностью к апоптозу по сравнению с М4 субтипом. При оценке химиочувствительности лейкемические клетки МЗ субтипа характеризовались достоверно сниженной чувствительностью к цитарабину, М4 - к этопозиду по сравнению с другими анализируемыми субтипами OMJI.

Взаимосвязь между показателями апоптоза, химиочувствителъностъю лейкемических клеток in vitro и их пролиферативной активностью. Проведенный корреляционный анализ при первичном В-линейном OJIJI показал, что из восьми исследованных цитостатических препаратов только для цитарабина (R= -0,27 при р=0,03; п=64) и L-аспарагиназы (R= -0,52 при р=0,02; п=21) снижение способности лейкемических клеток подвергаться спонтанному апоптозу сопровождается снижением чувствительности к индуцируемому этими препаратами апоптозу.

Анализ экспрессии апоптоз-ассоциированных молекул CD95 и CD95L на лейкемических клетках не выявил достоверного влияния этих молекул на уровень спонтанного апоптоза и химиочувствительность лейкемических клеток. В то же время была показана ингибирующая роль экспрессии антиапоптотического белка Вс1-2 на способность лейкемических клеток к спонтанному апоптозу (R= -0,48 при р=0,03 и п=20, морфологический метод определения апоптоза), но не на чувствительность к химиопрепаратам.

Так как снижение аккумуляции цитостатика внутри клетки является одной из основных причин резистентности опухолевых клеток к химиотерапии [Dalton W.S., 1997], мы исследовали влияние экспрессии белка множественной лекарственной устойчивости P-gp на чувствительность опухолевых клеток к химиопрепаратам in vitro. Установлено, что у пациентов с первичным OJIJI

лейкемические клетки существенно различаются по чувствительности к химиопрепаратам в зависимости от экспрессии Р-§р (по значению медианы для показателя экспрессии О, равным 0,13). Как видно из таблицы 3, лейкемические клетки с увеличенной экспрессией Р-§р (Б>0,13) проявляли сниженную лекарственную чувствительность ко всем исследуемым прапаратам, кроме дексаметазона, по сравнению с клетками с низкой экспрессией Р-£р.

Таблица 3

Влияние экспрессии Р-§р на лекарственную чувствительность лейкемических клеток при ОЛЛ

Изучаемые препараты Лекарственная чувствительность 1_С50 (мкг/мл)1 при различной экспрессии Р-2Р

п 0>0,13 п Б<0,13

Дексаметазон 12 0,21 (0,08-6,0) 20 0,23 (0,01-6,0)

Преднизолон 13 1,6 (0,38-246,0) 20 0,41 (0,04-250,0)

Винкристин 11 2,5 (0,99-15,6) 19 0,17(0,05-0,96)*

Ь-аспарагиназа 2 13 8,4(0,05-10,0) 20 0,21 (0,0005-1,2) *

Рубомицин 11 0,03 (0,01-0,07) 15 0,02 (0,01-0,08)

Доксорубицин 10 0,1 (0,07-0,2) 15 0,05 (0,01-0,08) *

Цитарабин 10 0,8 (0,38-2,0) 15 0,39 (0,26-0,39)

Этопозид 11 1,7 (0,65-6,8) 17 0,76 (0,54-1,3)

1. Результаты представлены в значениях медианы (25-75 персентили).

2. ЬС50 для Ь-аспарагиназы выражали в Ед/мл.

3. *-р<0,05.

Сниженная пролиферативная способность опухолевых клеток также влияет на чувствительность к химиопрепаратам. В то же время устойчивость опухолевых клеток к лекарственным препаратам может быть обусловлена очень высокой пролиферативной активностью этих клеток - резистентностью повторного роста [Рге1з1ег Н.О., 1997]. Исследования связи между количеством клеток в различных фазах клеточного цикла и значениями ЬС50 для исследуемых препаратов при В-линейном ОЛЛ показали наличие слабой обратной корреляционной зависимости между ЬС50 для Ь-аспарагиназы (11= -0,28 при р=0,05; п=50), этопозида (Я= -0,29 при р=0,06; п=27) и количеством пролифериругощих лейкемических клеток, находящихся в 8+ОгМ фазах клеточного цикла. Наиболее четко взаимоотношения между

чувствительностью клеток к рубомицину, доксорубицину, цитарабину и пролиферативной активностью клеток отражаются значениями корреляций между химиочувствительностью и показателем БА^М. Оказалось, что чем больше содержание клеток в Б-фазе и меньше в С2М-фазах, тем более чувствительны лейкемические клетки к рубомицину (Я= -0,5 при р=0,01; п=25), доксорубицину (11= -0,48 при р=0,01; п=26) и цитарабину (Я= -0,38 при р=0,05; п=27). Оценка связи пролиферации и спонтанного апоптоза лейкемических клеток выявила слабую обратную корреляционную зависимость (Л= -0,26 при

р=0,06; п=53) между количеством клеток в С2М-фазах и количеством апоптотических клеток с конденсированным хроматином. Следовательно, снижение химиочувствительности клеток, находящихся в 02М-фазе, можно объяснить снижением способности этих клеток вступать в апоптоз.

Плоидность, наряду с показателями клеточного цикла, является важной характеристикой опухолевой клетки [Ross J.S., 1996]. Мы выявили достоверное увеличение количества апоптотических клеток (по данным морфологического метода) в популяциях, содержащих клетки с гиподиплоидным (менее 46) (50,5 % (34,1-63,1), п=6) и гиперплоидным (более 50) числом хромосом (44,0 % (28,066,6), п=21) по сравнению с уровнем спонтанного апоптоза лейкемических клеток с эуплоидным (46) содержанием хромосом (32,0 % (16,0-45,0), п=42) в группе больных с B-линейным OJIJ1. Достоверное снижение LC50 для винкристина (в 300 раз) наблюдали для лейкемических популяций, в состав которых входят клетки с гиподиплоидным количеством хромосом по сравнению с эуплоидным числом хромосом. Популяции, содержащие лейкемические клетки с гиперплоидным числом хромосом, достоверно более чувствительны к L-аспарагиназе (в 47 раз) по сравнению с клетками с эуплоидным набором хромосом.

Связь уровня спонтанного апоптоза и чувствительности лейкемических клеток к химиопрепаратам in vitro с ответом на терапию (протокол ALL-BFM-90M). Важным прогностическим фактором при ОЛЛ у детей является ранний ответ на терапию, который определяется по содержанию властных клеток в периферической крови на 8-й день терапии преднизолоном [Gaynon P.S. et al., 1997]. Согласно нашим данным, в группе пациентов, ответивших на 8-й день терапии (содержание бластных клеток в периферической крови менее 1000/мкл), отмечалась лучшая чувствительность к глюкокортикоидам (для дексаметазона различия по медиане составили более чем в 99, преднизолона - в 300 раз, однако данные не достоверны), винкристина (в 5 раз, р<0,05) и L-аспарагиназы (в 8 раз, р<0,05) по сравнению с группой не ответивших пациентов (содержание бластных клеток в периферической крови более 1000/мкл). В то же время значительных различий в уровне спонтанного апоптоза в группах с различным ответом на 8-й день терапии нами выявлено не было.

При оценке ответа на терапию на 15-й день нами показано, что лейкемические клетки больных ОЛЛ, не ответивших на индукционную химиотерапию на 15-й день, проявляли сниженную (от 1,2 раза для винкристина до более чем 36 раз для преднизолона) лекарственную чувствительность ко всем исследуемым препаратам по сравнению с группой ответивших больных, однако только для цитарабина различия были достоверны (р=0,05). Кроме того, наблюдалась устойчивая тенденция к снижению способности опухолевых клеток к спонтанному апоптозу в группе не ответивших больных по сравнению с группой ответивших при определении

апоптотических клеток всеми использованными методами (однако различия недостоверны из-за значительного разброса индивидуальных данных).

Следующим этапом работы была оценка совместного влияния исследуемых биологических показателей лейкемических клеток на ранний ответ на терапию при В-линейном OJIJI. Показано, что среди больных с одновременно сниженными количеством пролиферирующих клеток (в S-фазе) и сниженной чувствительностью к преднизолону не ответили на терапию на 15-й день 11 из 29 пациентов (37,9 %), по сравнению с 2 из 11 (11,1 %) в группе больных с большим количеством пролиферирующих клеток и лучшей чувствительностью к преднизолону (р=0,04). Аналогичные тенденции были получены при совместном анализе пролиферативной активности лейкемических клеток и их чувствительности к дексаметазону, винкристину и L-аспарагиназе.

Нерешенной проблемой в лечении лейкозов у детей являются рецидивы, возникающие примерно в 30 % случаев [Pui С.Н., 1994]. По нашим данным, у пациентов с de novo острым лейкозом, у которых впоследствии развился ранний рецидив, лейкемические клетки имеют достоверно сниженную способность к спонтанному апоптозу (но не химиочувствительность) по сравнению с пациентами со стабильной полной ремиссией (рисунок 2).

100 85 70 55 40 25 10 -5 ■

I I АОконд И АОфрагм iiS АО сумщ

ГАЧ^ЧМ

Равнин рецидив

Ремиссия

Рис. 2 Уровень спонтанного апоптоза опухолевых клеток при de novo В-линейном OJIJI в зависимости от дальнейшего течения заболевания. Количество пациентов в группе с ранним рецидивом - 10 человек, с ремиссией - 77. Апоптотические клетки выявляли морфологическим методом.

Чувствительность лейкемических клеток при рецидивах OJIJI по сравнению с de novo OJIJI была снижена ко всем исследованным препаратам кроме винкристина, причем для преднизолона (в 150 раз, р=0,04) и доксорубицина (в 1,5 раза, р=0,05) результаты были достоверны. При рецидивах OJIJI лейкемические клетки характеризуются также сниженной способностью к спонтанному апоптозу по сравнению с de novo OJIJI. Так, по данным

морфологического метода при рецидивах OJIJI (п=32) уровень спонтанного апоптоза лейкемических клеток составил 20,0% (10,8-29,6) по сравнению с 30,0% (16,6-48,4) при первичных (п=125) ОЛЛ (р=0,04).

При рецидивах ОМЛ, в отличие от ОЛЛ, лейкемические клетки имели сходные уровни химиочувствительности с таковым при de novo ОМЛ. В то же время, по данным AnnexinV-kit наблюдали снижение уровня как раннего (р=0,03), так и позднего (р=0,3), и, соответственно, суммарного (р=0,07) уровня спонтанного апоптоза лейкемических клеток при рецидивах ОМЛ (п=4) по сравнению с первичными ОМЛ (п=12).

Таким образом, прогрессия острого лейкоза с развитием рецидива заболевания сопровождается снижением способности лейкемических клеток подвергаться спонтанному и лекарственному (в случае ОЛЛ) апоптозу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. При определении уровня спонтанного апоптоза лейкемических клеток при de novo В-линейном ОЛЛ у детей установлено наличие высокой прямой корреляционной связи между данными, полученными с помощью методов, выявляющих промежуточные стадии апоптоза. Наиболее ранние апоптотические клетки обнаруживаются только при анализе локализации фосфатидилсерина мембраны [2,4,8,13,15].

2. Лейкемические клетки при ОМЛ обладают сниженными способностью к спонтанному апоптозу и чувствительностью к химиопрепаратам по сравнению с ОЛЛ. Опухолевые клетки при М1-М2 субтипах проявляют большую способность к спонтанному апоптозу по сравнению с клетками МЗ и М4 субтипов de novo ОМЛ [4, 8,9,13,14,15].

3. Лейкемические клетки пре-В субтипа более подвержены спонтанному апоптозу, чем клетки Common субтипа de novo В-линейного ОЛЛ, при этом низкий уровень спонтанного апоптоза ассоциируется с высокой экспрессией антиапоптотического белка Вс1-2 [4, 5].

4. Лекарственная устойчивость лейкемических клеток при de novo В-линейном ОЛЛ сочетается с высоким уровнем экспрессии CD34 (устойчивость к L-аспарагиназе, цитарабину и этопозиду), гиподиплоидным числом хромосом (к винкристину), сниженным количеством пролиферирующих клеток (к L-аспарагиназе, этопозиду), экспрессией белка P-gp (к винкристину, L-аспарагиназе, доксорубицину) и низкой способностью к спонтанному апоптозу (к цитарабину и L-аспарагиназе) [5,10,11,12,16].

5. Низкий уровень спонтанного апоптоза лейкемических клеток при de novo В-линейном ОЛЛ указывает на возможность развития раннего рецидива заболевания. Рецидив острого лейкоза характеризуется сниженной способностью опухолевых клеток к спонтанному апоптозу по сравнению с de novo ОЛЛ и ОМЛ [1,3,6, 7,9,14,17].

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах:

1. Савицкий В.П., Буглова С.Е., Шман Т.В., Алейникова О.В. Особенности показателей клеточного цикла и спонтанного апоптоза бластных клеток при остром лимфобластном лейкозе // Гематология и трансфузиология.-2002.-Т. 47, № 1.-С.З-6.

2. Алейникова О.В., Потапнев М.П, Сыцкевич О.Н., Буглова С.Е., Углова Т.А., Юцкевич Р.И., Савицкая Т.В., Кустанович А.М., Федорова Л.Ю., Сахарова О.Г., Пролесковская И.В., Савицкий В.П., Шман Т.В. Улучшение диагностики детских острых лейкозов в республике Беларусь // Гематология и трансфузиология.-2002.-Т. 47, № 2.-С.42-44.

3. Шман Т.В., Углова Т.А., Савицкий В.П. Связь лекарственной чувствительности, спонтанного апоптоза лейкемических клеток с факторами прогноза при В-линейном остром лимфобластном лейкозе у детей // Гематология и трансфузиология.-2002.-Т. 47, № 4.-С.8-10.

4. Savitskiy V.P., Shman T.V., Potapnev М.Р. Comparative measurement of spontaneous apoptosis in pediatric acute leukemia by different techniques // Cytometry Part В (Clinical Cytometry).-2003.-Vol. 56B, № 1.- P. 16-22.

5. Savitskiy V.P., Shman T.V., Potapnev M.P. Spontaneous apoptosis and proliferative activity of leukemic cells from children with ALL: relationship with susceptibility in vitro to anticancer drugs // Exp. Oncology.-2003.-Vol. 25, № 3.-P. 233-235.

6. Шман T.B., Савицкий В.П., Алейникова О.В. Клиническое значение биологических свойств лейкозных клеток при В-линейном остром лимфобластном лейкозе у детей // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии.-2003.- Т. 2, № 4,- С. 23-26.

Статьи в рецензируемых сборниках:

7. Шман Т.В., Савицкий В.П., Белевцев М.В., Потапнев М.П. Характеристика клеточного цикла, спонтанного апоптоза и лекарственной чувствительности опухолевых клеток при ОЛЛ у детей // Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии: Сб. материалов Международной научно-практической конференции.-Минск, 25-27 октября 2000 Г.-С.77-81.

8. Савицкий В.П., Шман Т.В., Потапнев М.П. Исследование апоптоза опухолевых клеток при острых лейкозах у детей методами проточной цитофлуориметрии и флуоресцентной микроскопии // Методы проточной цитометрии в медицинских и биологических исследованиях: Сб. научн. трудов под ред. М.П. Потапнева. -Минск, 2003.- С. 105-112.

Тезисы докладов в материалах научных конференций и съездов: 9. Углова Т.А., Шман Т.В. Определение in vitro спонтанного и индуцированного апоптоза опухолевых клеток у больных острым лейкозом // Актуальные вопросы детской онкологии и гематологии: Материалы VIII Междунар. симпоз.-Минск, 27-29 апреля 2000 г.- С. 116-118. Ю.Углова Т.А., Шман Т.В., Юцкевич Р.И. Характеристика лекарственной чувствительности лейкемических клеток в различных цитогенетических группах при остром лимфобластном лейкозе у детей // Материалы II съезда детских онкологов и гематологов России, Ростов-на-Дону, 4-6 июня 2001 г. // Детская онкология.-2001.- С. 184.

П.Савицкий В.П., ШманТ.В., Белевцев М.В., Потапнев М.П. Исследование функционального состояния Р-гликопротеина (Pgpl70) методом проточной цитофлуориметрии // Актуальные вопросы детской онкологии и гематологии: Сб. тезисов Междунар. симпоз.-Минск, 25-27 апреля 2002 г.- С. 114-116.

12.Шман Т.В., Белевцев М.В., Савиций В.П., Кустанович A.M., Юцкевич Р.И., Стасевич И.В., Углова Т.А. Характеристика лекарственной чувствительности при первичном В-линейном остром лимфобластном лейкозе у детей // Актуальные вопросы детской онкологии и гематологии: Сб. тезисов Междунар. симпоз.-Минск, 25-27 апреля 2002 г.- С. 144-146.

13.Шман Т.В., Савицкий В.П. Использование различных методов определения апоптотический клеток при острых лейкозах у детей // Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии: Материалы VI Всероссийской научной конференции с международным участием, Санкт-Петербург, 20-23 мая 2002 г. // Мед. иммунология.-2002.-Т.4, № 2,- С. 316.

14.Шман Т.В. Изучение лекарственной чувствительности опухолевых клеток при острых лейкозах у детей с использованием МТТ-теста // Материалы VI Республиканского съезда врачей-лаборантов Республики Беларусь, Брест // Медицинская панорама.-2002.-Т. 20,- С. 80.

15.Shman T.V., Savitskiy V.P., Potapnev М.Р. Definition of spontaneous (culture-induced) apoptosis in leukemic cells and potential clinical relevance in childhood acute leukemia // 31st Annual meeting of the International Society for experimental hematology // Exp. Hematol.-2002.-Vol. 30, N 6, Suppl. 1 .-P. 146.

16.Шман T.B., Савицкий В.П. Исследование экспрессии и функционального состояния P-gp при OJIJI у детей // Биологические основы терапии онкогема-тологических заболеваний у детей: Материалы III симпозиума, Москва, 6-7-февраля 2003 г. // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии.-2003.-Т. 1,№2.-С. 102.

17. Алейникова О.В., Углова Т.В., Шман Т.В. Клиническое значение биологических свойств лейкозных клеток при остром лимфобластном лейкозе у детей // Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей: Материалы III симпозиума, Москва, 6-7 февраля 2003 г. // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии.-2003.-Т. 1, № 2.-С. 98.

Методические рекомендации и инструкиии на метод применения:

Алейникова О.В., Потапнев М.П., Углова Т.А., Буглова С.Е., Савва H.H., Пролесковская И.В., Шман Т.В., Савицкий В.П. Стратификация групп риска у детей с острым лимфобластным лейкозом: Метод, рекомендации / РНПЦДОГ.-Минск, 2000.-30 с.

Мицкевич П.Б., Космачева С.М., Ибрагимова Ж.А., Шман Т.В., Мыслицкий В.Ф. Применение МТТ-теста для оценки чувствительности лейкозных клеток к цитостатическим препаратам in vitro и прогнозирования ответа на химиотерапию при лейкозах: инструкция на применение. - Минск, 2003.-22 с.

РЭЗЮМЭ

Шман Таццяна Шктарауна

Спантанны апаптоз i лекавая устойл1васць пухлшных клетак да х1м1япрэпаратау in vitro пры вострых лейкозах у дзяцей

Ключавыя словы: востры лейкоз, спантанны апаптоз, лекавая устойл1васць, клетачны цыкл, P-gp, Bcl-2.

Аб'ект даследавання: Лейке\ичныя клетю касцявога мозгу дзяцей з дыягназам востры лейкоз.

Прадмет даследавання: Здольнасць лейкем1чных клетак да спантаннага апаптозу i да цытатакачнага уздзеяння х1м1япрэпаратау in vitro.

Мэта даследавання: Ацэнка здольнасщ лейкем1чных клетак да спантаннага апоптозу i анашз ix адчувальнасщ да х1м1япрэпаратау in vitro у залежнасщ ад лшейнага паходжання, ступен1 дыферэнцыроую i шшых б^ялапчных. асабл1васцей пухлшных клетак пры вострых лейкозах у дзяцей.

Метады даследавання: метады кyльцiвipaвaння лейкемшных клетак; флуарэсцэнтна-мкраскашчны i цытафлуарыметрычны метады выяулення апаптатычных клетак; метыл-тыязол-тэтразол1умбрамщ метад вызначэння адчувальнасщ лейкем!чных клетак да х1м1япрэпаратау; цытафлуарыметрычны анал13 клетачнага цыклу; ¡мунафенатышчны i цытагенетычны анал1зы; метады CTaTbiCTbiKi.

BbuiiKi работы: Вызначана, што м1елощныя лейксм1чныя клети у супрацьлегласць да л1мфощных, валодаюць зшжанай здольнасцю да спантаннага апаптозу i адчувальнасцю да х1м1япрэпаратау. Пры гэтым лeйкeмiчныя клетк1 розных субтыпау de novo вострага Mie.ioiflnara лейкозу адрозшваюцца пaмiж сабой па здольнасщ падпадаць пад уздзеянне спантаннага апоптозу i па адчувальнасщ да х1м1япрэпаратау in vitro.

Лейкем1чныя клетю прэ-В субтыпу падпадаюць пад спантанны апаптоз у большай CTyneHi, чым oeTKi Common субтыпу de novo В-лшейнага вострага л1мфабласнага лейкоза, пры гэтым шзга узровень спантаннага апаптозу асацьправаны з высокай экспрэаяй антыапаптатычнага бялка Bcl-2 i паказвае на магчымасць узшкнення ранняга рэцыдыву захворвання.

Лекавая устошпваць лейкем1чных клетак пры de novo В-лшейным вострым л1мфабласным лейкозе спалучаецца з высоюм узроунем экспрэсп CD34, гшадыплощнай колькасцю храмасом, пашжанай колькасцю прал1ферыруючых клетак, экспрэаяй бялка P-gp i шзкай здольнасцю да спантаннага апаптозу.

Вобласць выкарыстання: анкалапчная гематалопя

РЕЗЮМЕ

Шман Татьяна Викторовна Спонтанный апоптоз и лекарственная чувствительность опухолевых

клеток к химиопрепаратам in vitro при острых лейкозах у детей

Ключевые слова: острый лейкоз, спонтанный апоптоз, лекарственная чувствительность, клеточный цикл, белок P-gp, белок Вс1-2.

Объект исследования. Лейкемические клетки костного мозга детей с диагнозом острый лейкоз.

Предмет исследования. Способность лейкемических клеток подвергаться спонтанному апоптозу и цитотоксическому действию химиопрепаратов in vitro.

Цель исследования: Оценка способности лейкемических клеток к спонтанному апоптозу и анализ их чувствительности к химиопрепаратам in vitro в зависимости от линейного происхождения, степени дифференцировки и других биологических особенностей опухолевых клеток при острых лейкозах у детей.

Методы исследования: методы культивирования лейкемических клеток; флуоресцентно-микроскопический и цитофлуориметрические методы выявления апоптотических клеток; метил-тиазол-тетразолиумбромид метод определения чувствительности лейкемических клеток к химиопрепаратам; цитофлуориметрический анализ клеточного цикла; иммунофенотипический и цитогенетический анализы; методы статистики.

Результаты работы: Установлено, что миелоидные лейкемические клетки, в отличие от лимфоидных, обладают сниженными способностью к спонтанному апоптозу и чувствительностью к химиопрепаратам. При этом лейкемические клетки различных субтипов de novo острого миелоидного лейкоза различаются между собой по способности подвергаться спонтанному апоптозу и по чувствительности к химиопрепаратам in vitro.

Лейкемические клетки пре-В субтипа более подвержены спонтанному апоптозу, чем клетки common субтипа de novo В-линейного острого лимфобластного лейкоза, при этом низкий уровень спонтанного апоптоза ассоциируется с высокой экспрессией антиапоптотического белка Вс1-2 и указывает на возможность развития раннего рецидива заболевания.

Лекарственная резистентность лейкемических клеток при de novo В-линейном остром лимфобластном лейкозе сочетается с высоким уровнем экспрессии CD34, гиподиплоидным количеством хромосом, сниженным количеством пролиферирующих клеток, экспрессией белка P-gp и низкой способностью к спонтанному апоптозу.

Область применения: онкогематология.

ABSTRACT

Shmati Tatsiana Victorovna

Spontaneous apoptosis and chemosensitivity of tumour cells in vitro in childhood acute leukemia

Key words: acute leukemia, spontaneous apoptosis, chemosensitivity, cell cycle, P-gp, Bcl-2.

Object of study. Bone marrow-derived tumour cells in children with acute leukemia.

Subject of study. Ability of leukemic cells to undergo spontaneous apoptosis and sensitivity in vitro of leukemic cells to anticancer drugs.

Aim of the study: Evaluation of the ability of leukemic cells to undergo to spontaneous apopotosis and analysis of leukemic cells sensitivity to anticancer drugs in vitro in connection with lineage origin, stage of differentiation and other biological properties of leukemic cells in childhood acute leukemia.

Methods: Cultivation of leukemic cells; apoptosis detection by fluorescent microscopy and flow cytometry methods; chemosensitivity analysis of leukemic cells by methyl-thiazol-tetrazolium bromide method; flow cytometry evaluation of cell cycle distribution; immunophenotyping and cytogenetic assays; statistical analyses.

Results: It was shown that myeloid leukemic cells were less sensitive to spontaneous apoptosis and more resistant to anticancer drugs than lymphoid leukemic cells. Cells of the subtypes of de novo acute myeloid leukemia differed in level of spontaneous apoptosis and drug resistance in vitro.

Pre-B leukemic cells were more prone to spontaneous apoptosis than Common de novo B-lineage acute lymphoblastic leukemia. Low level of spontaneous apoptosis was associated with high expression of antiapoptotic Bcl-2 protein. Decreased level of spontaneous apoptosis is a predictive factor of early relapse in B-lineage acute lymphoblastic leukemia.

Drug resistance of leukemic cells in de novo B-lineage acute lymphoblastic leukemia was associated with high level of CD34 expression, hypodiploid number of chromosome, decreased level of cell proliferation, P-gp expression and low ability to undergo spontaneous apoptosis.

Field of application: oncohematology.