Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Регуляция пролиферативной активности асцитных клеток в динамике роста карциномы Эрлиха

£

На правах рукописи

ии3053741

Замай Анна Сергеевна

РЕГУЛЯЦИЯ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ АСЦИТНЫХ КЛЕТОК В ДИНАМИКЕ РОСТА КАРЦИНОМЫ ЭР ЛИХА

14.00.16 — патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2007

003053741

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Сибирский Федеральный Университет»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Савченко Андрей Анатольевич

Официальныеоппоненты:

доктор биологических наук, профессор Васильева Людмила Сергеевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «16» марта 2007 г. в 9 часов на заседании диссертационного совета Д 001.054.01 при ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН» по адресу: 664003, г Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН»

доктор биологических наук

Дубровина Валентина Ивановна

Автореферат разослан «_ » февраля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Проблема регуляции клеточной пролиферации в нормальных и трансформированных клетках — фундаментальная проблема биологии. Актуальность проблемы возрастает в связи широким распространением, особенно в последние годы, заболеваний, вызванных неконтролируемым делением клеток (доброкачественные и злокачественные опухоли и др.).

Механизмы, обеспечивающие пролиферацию клеток при прохождении клеточного цикла, мало доступны для изучения in vivo. Поэтому обычно в таких исследованиях используют культивируемые клетки (Варфоломеев С. Д., 1999). Очевидно, что такой подход не будет в полной мере отражать реальной динамики опухолевого роста в организме. Рост клеток в культуре определяется наличием эндогенных субстратов, продуктов жизнедеятельности и регуляторами, добавляемыми исследователем. В организме рост клеточной массы регулируется гораздо большим количеством эндогенных факторов. В частности, эндогенными ингибиторами пролиферации, которые не являются ни иммунными факторами, ни токсическими продуктами (Балаж А., 1982). Учесть влияние всех эндогенных факторов, определяющих рост опухоли в условиях организма, практически невозможно (Frame М.С., 2002). Тем не менее, можно проконтролировать их эффект на уровне клетки, поскольку они осуществляют свое воздействие через вторичные мессенджеры. Поэтому для решения проблемы оценки влияния эндогенных регуляторов на опухолевые клетки в разные фазы опухолевого роста достаточно определить уровень вторичных мессенджеров в клетке. При подсчете числа клеток, веса и объема опухоли выраженная S-образная форма кинетических кривых in vivo встречается довольно редко. Отклонения могут быть вызваны неоформленностью опухоли, наличием в ней неопухолевых клеток, ответными реакциями организма (Эммануэль Н.М., 1977). Однако при определенной схеме обработки кинетических исследований варианты опухолей обычно описывают с помощью S-образных кривых, поскольку при исследовании кинетики роста асцитной карциномы Эрлиха эффект организма на рост опухоли зачастую не учитывают. Другая проблема заключается в большом количестве факторов, повышение или понижение которых сопровождает активацию клеточного роста - это и катионы кальция, и уровень АФК, и рН„, а также

множество ростовых факторов и факторов транскрипции (Laurent А., 2005). Эти агенты необходимы в ходе клеточного деления, а влияния одного из них недостаточно. Тем не менее, для запуска каскада реакций пролиферации, скорее всего, требуются какой-то один фактор. Выяснить, который именно является пусковым, достаточно сложно. Работ, учитывающих одновременно большое количество факторов, необходимых для запуска роста клеточной массы, практически нет. Таким образом, оценить степень значимости каждого из них не представляется возможным. Хотя именно это важно для того, чтобы научиться управлять процессом клеточного роста при различных патологиях. Считается, что внутриклеточный кальций является наиболее важным мессенджером, регулирующим процессы пролиферации, дифференцировки, апоптоза и др. (Whitaker М., 2001, Laurent А., 2005, Luanna K.P., 2003). С другой стороны, известно, что нейтрализация кислородных радикалов ингибирует пролиферацию (Benhar М, 2002). Более того, показано, что активные формы кислорода выступают в роли посредника между внеклеточным сигналом и внутриклеточными эффекторами. Именно они определяют уровень окислительно-восстановительного потенциала в клетке, регулирующего клеточный метаболизм, в том числе, уровень экспрессии генов (O'Loghlen А., 2005). С третьей стороны, величина рНш регулирует активность факторов, контролирующих экспрессию генов и клеточный цикл. Доказано, что снижение рНш тормозит G2/M переход клеточного цикла, а его повышение, наоборот, активирует. Очевидно, что эти 3 фактора - Са2+, активные формы кислорода и рН,„ - связаны между собой и влияют друг на друга (Luanna K.P., 2003). Механизмы их взаимовлияния можно установить, только одновременно определив их уровень в клеточной популяции в момент подавления или стимуляции пролиферации.

Кроме того, определение корреляции между скоростью роста опухоли и физико-химическими параметрами, характеризующими функциональное состояние неопластической клетки - перспективный подход, как в изучении, так и в лечении рака.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - изучить механизмы влияния внутри- и внеклеточных факторов на регуляцию роста асцитной карциномы Эрлиха в условиях in vivo.

Цель исследования достигалась посредством решения следующих ЗАДАЧ:

1. Изучить качественный состав и функциональное состояние асцитных клеток в динамике роста опухоли.

2. Исследовать роль внутриклеточных регуляторов клеточной пролиферации (Са2+, рН, NAD(P)H) в развитии асцитной карциномы Эрлиха.

3. Исследовать физико-химические свойства цитоплазматической мембраны асцитных клеток.

4. Установить чувствительность асцитных клеток к АТФ в разные фазы роста карциномы Эрлиха.

5. Определить количество мононуклеарных клеток в селезенке в процессе роста карциномы Эрлиха.

Научная новизна исследования

Впервые получена динамика роста асцитной карциномы Эрлиха in vivo, которая отличалась от описанных в литературе подавлением роста опухоли на 12-е сутки после трансплантации опухоли и его стимуляцией на 13-е, что является дополнением к существующим представлениям о динамике опухолевого роста. В работе впервые проведено комплексное исследование динамики роста карциномы, которое позволило выявить закономерность между такими параметрами внутриклеточной сигнализации как [Са2+], NAD(P)H и рН. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что содержание катионов кальция в асцитных клетках в динамике роста зависит от наличия активных форм кислорода и эта зависимость определяется фазой опухолевого роста. Впервые выявлено, что эффект АТФ на асцитные клетки определяется фазой опухолевого роста и зависит от активных форм кислорода. Впервые показано, что в зависимости от фазы опухолевого роста повышение содержания катионов кальция в асцитных клетках осуществляется из разных источников - из внутриклеточных депо или внеклеточного пространства.

Практическая значимость исследования

Полученные результаты расширяют представление о механизмах взаимного влияния опухолевых клеток и клеток иммунной системы. Выявленные закономерности метаболических изменений в асцитных

клетках при стимуляции и торможении роста опухоли создают основу для разработки методов оптимизации путей коррекции патологических состояний организма, вызванных развитием опухоли. Исследование влияния АТФ на опухолевые клетки имеет практическую ценность в связи с его применением в медицинской практике в качестве фармакологического препарата, использующегося для подавления развития патологических процессов. Нами показано, что разнонаправленность эффектов АТФ может зависеть от функционального состояния клеток, определяющего скорость опухолевого роста, поскольку чувствительность асцитных клеток к АТФ зависит от фазы опухолевого роста. Наши данные доказывают, что действие фармакологических препаратов, использующихся в клинической практике для повышения содержания катионов кальция в неопластических клетках, в зависимости от стадии роста опухоли могут вместо цитотоксического эффекта стимулировать развитие гиперпролиферации, обостряющей течение онкологического процесса.

Основные положения диссертации используются в учебном процессе на Кафедре биофизики и биохимии и физиологии человека и животных Сибирского федерального университета.

Апробация результатов исследования

Результаты исследования докладывались на следующих конференциях: 18 съезде физиологического общества имени И.П. Павлова, г. Казань (2001); международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», г. Пущино (2003); 19 съезде физиологического общества имени И.П. Павлова, г. Екатеринбург (2004); международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», г. Пущино (2005); Межрегиональной научно-практической конференции «Объединение субъектов Российской федерации и проблемы природопользования в Приенисейской Сибири», г. Красноярск (2005); I Съезде физиологов СНГ, г. Сочи (2005). Работа прошла апробацию на Кафедре биофизики Красноярского государственного университета; на семинаре, проходившем в КНЦ СО РАН (2005); на научно-образовательном семинаре "Избранные главы биофизики" в Институте Биофизики СО РАН, г. Красноярск (2005), на Кафедре биохимии и физиологии человека и животных Красноярского государственного университета.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Кривая роста асцитной карциномы Эрлиха, полученная нами в экспериментах in vivo, отличается от классической S-образной провалом на 12-е сутки после трансплантации опухоли. Снижение числа клеток в области провала объясняется подавлением их митотической активности и стимуляцией гибели клеток путем апоптоза.

2. Повышение содержания внутриклеточного Са2+, уровня NAD(P)H и рН в асцитных клетках стимулирует рост опухоли. Содержание катионов кальция в асцитных клетках не зависит от вязкости мембран, но определяется уровнем активных форм кислорода.

3. Чувствительность асцитных клеток к АТФ определяется фазой роста карциномы Эрлиха и зависит от уровня активных форм кислорода.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и списка сокращений. Работа иллюстрирована 29 рисунками, 6 таблицами и одной схемой. В список литературы включено 63 отечественных и 174 зарубежных источника.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обозначена актуальность проблемы, цели и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость, основные положения, выносимые на защиту, апробация работы.

Первая глава диссертации посвящена обзору литературы, в котором описаны механизмы, основные закономерности клеточного цикла, его регуляция, а также их особенности при опухолевом росте. В первом параграфе приводятся литературные данные о кинетике опухолевого роста, карцинома Эрлиха рассматривается как модель клеток с неконтролируемой пролиферацией. Во втором параграфе обсуждается роль внеклеточных и внутриклеточных факторов в регуляции клеточного

цикла клеток опухоли. Обсуждается роль иммунной системы в пролиферации и элиминации клеток организма. Рассматриваются [Са2+], рН,„, NAD(P)H и их роль в регуляции клеточного деления. Внутриклеточный Са2+ - вторичный мессенджер в трансдукции окружающих стимулов. Он взаимодействует с фосфатными остатками ДНК и приводит к компактизации хроматина (Strick R., 2001), контролирует клеточный цикл во многих типах клеток (Whitaker М., 2001) при переходе из метафазы в анафазу (Muto А., 1996) и коррелирует с фазами клеточного цикла (AzharM., 2001). Связывание кальция хелатными агентами нарушает прогрессию митоза (Hepler Р.К., 1994). Пролиферация клеток в норме (Shrode L.D., 1997) и при неопластической трансформации ассоциирована с увеличением внутриклеточной pH (Reshkin S.J., 2000). Na-Н-обменник через увеличение рН1П участвует в регуляции синхронности перехода от G2 к М (Luanna K.P., 2003). Данные литературы свидетельствуют о том, что продукция активных форм кислорода коррелирует с клеточной пролиферацией через активацию специфических сигнальных путей (Benhar М., 2002), а антиоксиданты имеют противоположные эффекты на опухолевый рост (Laurent А., 2005). Повышенная продукция активных форм кислорода в раковых клетках, как полагают, приводит к нарушению ДНК и нестабильности генома, стимулирует развитие рака (Jackson A.L., 2001). В следующем параграфе рассматриваются физико-химические свойства мембраны и мембранносвязанные ферменты. Обсуждается роль изменений цитоплазматических мембран в приобретении опухолевой тканью свойств неограниченной пролиферации, анаплазии, метастазирования, инвазии. Далее приводится описание регуляции функционального состояния клеток внеклеточным АТФ. Рассматривается его метаболизм с помощью специфического фермента экто-АТФазы (Зиганшин А.У., 1999). Поскольку динамика опухолевого роста определяется не только клеточной пролиферацией, но и гибелью, то в заключительном параграфе раскрывается понятие апоптоза как фактора регуляции численности клеточной популяции. В конце главы делается краткое заключение по обзору литературы.

Во второй главе описаны материалы и методы исследования. Эксперименты выполнены на 240 белых мышах-самцах линии ICR. Трансплантация асцитной карциномы Эрлиха производилась от одного

животного другому. Каждой мыши вводили по 5 млн. клеток. Выделение асцитных клеток производили на 3, 5, 7-14, 16 сутки после трансплантации опухоли. Из брюшной полости собирали весь асцит, брюшину трижды промывали физиологическим раствором. Собранные клетки трижды отмывали в среде Хенкса. Для подсчета концентрации асцитных клеток в опухоли использовали камеру Горяева. Зная общий объем асцита и концентрацию асцитных клеток в нем, рассчитывали общее количество опухолевых клеток в животном-опухоленосителе. Митотический индекс определяли микроскопически (Рогозин Е.А., 2003) на микроскопе Olympus ВХ51. Апоптоз и некроз определяли методом флуоресцентной микроскопии на микроскопе Olympus ВХ51 с помощью прижизненных красителей Hoechst 33342 и Propidium iodide (Izumov D.S., 2004). Мононуклеарные клетки выделяли из свежевыделенной селезенки. Фракцию мононуклеарных клеток отделяли от остальных путем центрифугирования в растворе фиколл-верографина плотностью 1,083 г/мл (Донцов В.И., 1990). Скорость потребления кислорода определяли полярографически на кислородомере типа №5221, используя электрод №5972 с тефлоновой мембраной. Энергетическое состояние асцитных клеток оценивали по соотношению Pi/ß-NTP, которое определяли с помощью 3|Р-ЯМР-спектроскопии на жидкостном ЯМР-спектрометре Bruker Avance DPX200 (Fu К.К., 1990, Toxer G.M., 1992, Бубновская Л.Н., 2002). Экстракты готовили по методике, описанной Бубновской JI.H., 2002. [Са2+|1П определяли с помощью флуоресцентного зонда Fura-2AM (2,5 мкМ) на спектрофлуориметре Aminco Bowman Series 2, Thermo Spectronic (USA (Grinkievich Y., 1985, Черных A.M., 2004). Активность Ca-АТФазы, №,К-АТФазы (Болдырев A.A., 1977) и экто-АТФазы (Зиганшин А.У., 1999) в асцитных клетках оценивалась по количеству неорганического фосфата, образовавшегося при гидролизе АТР препаратами ферментов. Количественное определение неорганического фосфата проводили методом Ратбуна и Бетлах (Rathbun W.B., 1969). Белок определяли микробиуретовым методом (Кочетов Г.А., 1971). Изменение собственной флуоресценции NAD(P)H в асцитных клетках проводили спектрофлуориметрически на спектрофлуориметре Aminco Bowman Series 2, Thermo Spectronic (USA) (Petty H.R., 2001). Определение pH в асцитных клетках с помощью флуоресцеина изотиоцианата изомера I проводили на спектрофлуориметре Aminco Bowman Series 2, Thermo Spectronic (USA)

(Gore M.G., 2000). Определение микровязкости мембран клеток проводили спектрофлуориметрически с помощью гидрофобного зонда пирена (3 мкМ) на спектрофлуориметре Aminco Bowman Series 2, Thermo Spectronic (USA) (Бордюшков Ю.Н., 2000). Статистическую обработку результатов осуществляли в программе Statistica 7.0.

В третьей главе описаны результаты исследования. В первом параграфе описывается изменение функциональных показателей карциномы в динамике ее роста. Установлена особенность поведения кривой роста асцитной карциномы Эрлиха in vivo в виде снижения количества асцитных клеток на 12-е сутки после трансплантации опухоли и следующего за ним резкого возрастания их числа (Рис.1). Интенсивность пролиферации мы оценивали по скорости удвоения числа клеток в опухоли (Рис.2).

число удвоений в сутки

2,0

1,5 -,

1,0-

0,5

0,0

-0,5

D 2 4 6 8 10

2 4 6 8 10 12 14 16 сутки после трансплантации опухоли сутки после трансплантации опухоли

Рис. 1. Динамика роста асцитной Рис. 2. Число удвоений клеток.

карциномы Эрлиха. Примечание

(достоверность отличия от

предыдущей точки): * Р<0,05;

** Р<0,01; *** Р<0,001.

Из графика видно, что на 12-е сутки клетки начали погибать, но уже на 13-е и 14-е сутки скорость удвоений клеток повышалась и делилась почти каждая вторая клетка. Для получения дополнительных доказательств о снижении пролиферативной активности на 11-е сутки мы определили динамику митотического индекса (Рис.3) в процессе роста асцитной карциномы Эрлиха, поскольку он коррелирует со многими маркерами пролиферации (Vincent-Salomon А., 2004). На 5-е сутки митотический индекс составлял 22,0±1,6%, затем он постепенно снижался и на 11-е сутки становился равным 6,7±0,8% (Р<0,001), а на 12-е, 13-е сутки увеличивался

до уровня 5-ых суток (Р<0,001). Затем снижался, и в терминальную фазу роста асцитные клетки прекращали деление.

Снижение митотической активности не могло в полной мере объяснить спад числа клеток опухоли ня12-е сутки, поэтому мы определяли качественный состав клеточной популяции, т.е. оценивали в ней долю живых клеток и клеток, находящихся в состоянии апоптоза и некроза. Доля некротических клеток в опухоли на протяжении ее роста практически не менялась, и составляла в среднем (12,9±0,9)% от общего числа клеток. До 10-х суток было стабильным и количество клеток в состоянии апоптоза (3,4±0,8)%, однако на 11-е сутки доля апоптотических клеток резко увеличивалось до (29±8,2)% (Р<0,01). Следует отметить, что увеличение числа апоптотических клеток совпадало с уменьшением митотического индекса.

Обычно снижение роста к клеточной популяции объясняется истощением субстрата и накоплением в среде продуктов жизнедеятельности (Варфоломеев С.Д., 1999). Небольшие сдвиги содержания АТФ в клетке могут изменять клеточный метаболизм (Brown G.C., 1992), а интенсификация окислительного метаболизма может стимулировать ускорение пролиферации (Karu Т.1., 1989). Поэтому для того, чтобы определить причину подавления митотической активности асцитных клеток и увеличения числа апоптотических клеток в опухоли оценивали энергетический статус опухоли в динамике ее развития. Метаболическая активность асцитных клеток, определенная по скорости потребления кислорода, на протяжении всего роста опухоли была достаточно высокой -в среднем 2,0±0,5 % на мг белка, а изменения недостоверны. ЯМР-спектроскопия считается достаточно удобным методом оценки энергетического статуса опухолевых клеток и позволяет судить о реальном энергообеспечении клеток (Toxer G.M., 1992). 3|Р-ЯМР спектры экстрактов асцитных клеток представлены на рис.3. Энергетическое состояние клетки оценивали по Pi/ß-NTP (Рис.4). Начиная с 7-х и до 12-х суток, энергетическое состояние асцитных клеток заметно ухудшилось, что соответствовало нашим первоначальным предположениям. Не очень понятным оказалось то, что 12-е сутки характеризовались наиболее плохим энергоснабжением асцитных клеток, хотя именно в этот период мы наблюдали максимальное ускорение роста опухоли. Таким образом,

соотношение Р1/ЫТР уменьшается в процессе роста опухоли и не взаимосвязано с уровнем митотической активности и апоптозом.

МАО(Р)Н

О -2 -4 -в -8 -10 -12 -14

Рис.3. 31Р-ЯМР- спектр экстракта асцитных клеток на 5 сутки после трансплантации опухоли.

4 6 8 10 12 14 16 сутки после трансплантации опухоли

Рис.4. Изменение РУр-ЫТР в асцитных клетках в динамике роста АКЭ. Примечание (достоверность отличия предыдущей точки): * Р<0,05;** Р<0,01; *** Р<0,001.

от

Во' втором параграфе идет речь об основных регуляторах клеточной пролиферации - Са2+, активных формах кислорода, рН. Поскольку в наших экспериментах разные стадии роста опухоли характеризовались неодинаковой митотической активностью, одной из наиболее важных задач нашей работы стало определение внутриклеточной [Са2+], способной стимулировать пролиферацию в асцитных клетках. Выявлены значительные изменения содержания кальция в асцитных клетках в процессе роста опухоли (Рис.5). Таким образом, при сравнении динамики роста опухоли и изменения содержания катионов кальция в асцитных клетках, мы обнаружили, что повышение внутриклеточной [Са2+] на 12-е сутки предваряло увеличение числа асцитных клеток в опухоли на 13-е сутки, что, вероятно, является свидетельством участия Са2+ в стимуляции клеточной пролиферации. Причем внутриклеточная [Са2+], активировавшая рост опухоли в наших исследованиях, соответствовала концентрации, стимулирующей пролиферацию в преадипоцитах (около 200 нМ) (Оо^асЬеуа Ь.Р., 2003).

[Саг\, нМ

***

200

150

100

50

0-I-,-,-,-,-,-

4 6 8 10 12 14 16 сутки после трансплантации опухоли

Рис.5. Изменение содержания кальция в клетках карциномы Эрлиха в процессе ее роста. Примечание (достоверность отличия от предыдущей точки): * Р<0,05; *** Р<0,001.

Для установления одной из возможных причин изменения содержания Са2+ в асцитных клетках на разных стадиях опухолевого роста определяли активность Са-АТФазы. Следует отметить, что во время повышения содержания Са2* в клетках на 10-е и 12-е сутки активность фермента была снижена, что могло способствовать поддержанию концентрации катионов кальция на высоком уровне в этот период. По сравнению с 11-ми (0,32±0,04 мкмоль Pi/мг белка в час) уже на 12-е сутки Са-АТФаза начала активизироваться и достигла значения 0,37±0,04 мкмоль Pi/мг белка в час (Р<0,05). К 13-м суткам возросла еще больше 0,7±0,08 мкмоль Pi/мг белка в час (Р<0,01), что возможно и привело к уменьшению концентрации кальция в клетках асцитной карциномы на 13-е сутки. Повышение концентрации внутриклеточного Са2+ может быть следствием увеличения вязкости клеточной мембраны, из-за усиления пассивной диффузии и ингибирования ионных насосов. В связи с этим, мы оценивали вязкость мембраны. Результаты исследований показали, что параметры микровязкости липидного бислоя (в среднем 0,66±0,002 отн. ед.) и белок-липидных контактов (в среднем 0,53±0,001 отн. ед.) в процессе роста асцитной карциномы Эрлиха практически не изменялись. Однако интересным оказался тот факт, что величины относительной микровязкости были значительно выше, чем в нормальных не трансформированных клетках.

Хорошо известно, что пролиферативная активность клеток зависит от интенсивности окислительного метаболизма (Karu T.I:, 1989). Редокс-

потенциал определяется балансом окислительно-восстановительных эквивалентов в динамическом равновесии (NAD+/NADH и NADP+/NADPH), а метаболические волны NAD(P)H ответственны за реализацию передачи межклеточных сигналов {Petty H.R., 2001) через образование активных форм кислорода. Чтобы оценить роль кислородных радикалов в регуляции роста опухоли, мьг определяли уровень собственной флуоресценции N AD(P)H в клетках опухоли (Рис.6).

1Са21,„, нМ

NAD(P)H, усл. ед. 0,120,10

0,08

0,06-

200-

150

100-

50-

LI

4 5 8 10 12 14 16 сутки после транплантации опухоли

Рис.6. Изменение флуоресценции ИАО(Р)Н асцитных клетках. Примечание (достоверность

отличия от предыдущей точки): * Р<0,05; ** Р<0,01,

4 5 6 7 8 3 1011121314 15 1в сутки после трансплантации опухши

Рис.7. Влияние N-acetyl-L-cystein на содержание Са2+ и асцитных клетках.

ЕЕШ - 1Са к;

|--| - \СягЪ в отсутствие АФК

после инкубации с >3-асе1у1-Ь-суйете, (конечная концентрация 10 мкМ).

Примечание (достоверность отличия между столбцами): * Р<0,05; ** Р<0,01. Оказалось, что увеличение [Са1'] в асцитных клетках на 12-е сутки совпало с повышением флуоресценции КАХ>(Р)Н, что соответствует предположенито о важной роли кислородных радикалов в стимуляции опухолевого роста.

Для установления роли активных форм кислорода в регуляции содержания Са2+ в асцитных клетках мы определяли концентрацию катионов после инкубации асцитных клеток с М-ацетил-Ь-цистеином, который Нейтрализует активные радикалы (О'ХлщЫеп А., 2006).

Выявлено, что изменение концентрации Са2+ в асцитных клетках при подавлении активных форм кислорода зависело от фазы развития опухоли (Рис.7). Причем, чем ниже была начальная концентрация катионов кальция в клетке, тем в меньшей степени она зависела от кислородных радикалов. Зависимость концентрации внутриклеточного Са2+ от наличия активных форм кислорода была максимальной на 12-е сутки.

Как показано многочисленными исследованиями, увеличение внутриклеточного рН (рНш) активирует клеточную пролиферацию (Shrode L.D., 1997) и обязательно сопровождает неопластическую трансформацию (Reshkin S.J., 2000). Причиной увеличения рНт в опухолевых клетках считается активация Ка+/Н+-обменника плазматической мембраны, выводящего Н+ из клетки (Noel J., 1995), которая происходит перед переходом G2/M, в результате чего кратковременно повышается рНт. Именно это повышение и обладает разрешающим эффектом на запуск клеточной пролиферации (Luanna К.Р., 2003). Поэтому для того, чтобы определить, на какой стадии находились клетки в момент подавления роста опухоли, мы определяли рН,„. В наших экспериментах значение рН,„ заметно изменялось в процессе роста опухоли (Рис.8).

рН, усл. ед.

сутки после транплантации опухоли

Рис.8. Изменение рН,п клеток асцитной карциномы Эрлиха в ходе ее роста. Примечание (достоверность отличия от предыдущей точки): * Р<0,05; *** Р<0,001.

С 5-е по 10-е сутки рНт имела тенденцию к увеличению, хотя ее изменения были незначительными, возможно из-за того, что клетки в опухоли находились на разных стадиях клеточного цикла. На 11-е сутки

происходило резкое снижение рН в клетках опухоли. Известно, что если значение рНш невелико, то Б-фаза задерживается и замедляется переход С2/М, поскольку при снижении рНш замедляется экспрессия циклина В1 и подавляется киназная активность Сйс2. Увеличение внутриклеточного рН достаточно для запуска перехода С2/М (Ьиаппа К.Р., 2003). Изменение рНш в наших исследованиях практически полностью совпадало с динамикой роста карциномы Эрлиха.

Третий параграф посвящен изменениям чувствительности асцитных клеток к внеклеточным регуляторам (экстраклеточная АТФ) в процессе роста опухоли. Для оценки возможности регуляции клеточного роста внешними факторами необходимо было измерить чувствительность асцитных клеток к биологически активным веществам в разные фазы роста карциномы. В качестве такого биологически активного вещества был выбран АТФ. Экстраклеточный АТФ считается важным фактором, регулирующим [Са2+] в клетке (Баумуратов А.С., 2004, УапоуегЬе^Ие К., 2003). АТФ секретируется большинством типов клеток, в том числе и клетками асцитной карциномы Эрлиха. (Зиганшин А.У., 1999). Биологический эффект увеличения концентрации катионов кальция в клетке под влиянием АТФ проявляется через активацию Ыа+/Н+-обмена, экспрессию онкогена с-шус, повышение содержания Са2+ в митохондриях, гиперполяризацию клеточной мембраны, активацию Са-зависимых К-каналов и сокращение объема клетки (Карелин А.А., 2000). В наших исследованиях эффект экстраклеточного АТФ на [Са:+] в асцитных клетках определялся стадией опухолевого роста (Рис.8). При этом наблюдалась зависимость степени повышения цитозольного кальция под влиянием АТФ от начальной концентрации катиона. Известно, что повышение [Са2+] в клетках под действием АТФ может осуществляться как за счет усиления его входа из внеклеточного пространства, так и внутриклеточных депо. Чтобы определить источник Са2+ при его повышении в активированных с помощью АТФ асцитных клетках оценивали разницу в увеличении концентрации Са2+ под влиянием АТФ в присутствии свободного Са2+ во внеклеточной среде и в среде со связанным с помощью ЭГТА Са2+. Обнаружено, что на 12-е сутки после трансплантации опухоли повышение концентрации кальция под воздействием АТФ происходило в основном за счет входа катионов из внеклеточного пространства (отсутствие Са2* во внеклеточной среде

¡¡локировало повышение его со; ЛТФ примерно на 80%) (Рис.9).

сутки после трансплантации опухоли

Рис.8. Влияние АТФ на [Са:]

з клетках асцитной карциномы

а динамике ее роста.

ШЖЗ - [Сй2+] в асцитных

клетках

I - увеличение [Са2+] после добавления АТФ (конечная концентрация 2м М); Примечание (достоверность отличия между столбцами): * Р<0,05; ** Р<0,01-

в асцитных клетках под влиянием

[Саг\ нМ

Рис.9. Влияние ЭГТА на [Саа+] в асцитных клетках под действием АТФ на 12 сутки. Кривая 1 -увеличение [Са"'| под действием АТФ в среде с Са'+; кривая 1 -увеличение [Са:+] под действием АТФ в среде со связанным с помощью ЭГТА Са2\

Для установления одной из возможных причин различия эффектов ЛТФ на асцитные клетки в разные фазы развития карциномы Эр лиха мы определяли активность экто-АТФазы. Экто-АТФаза — мембранный фермент. функциональнее значение которого заключается в гидролизе экстраклеточного АТФ (3 и га и шин Л.У., 1999), Известно, например, что ингибировайие экто-АТФазы приводит к спонтанной пролиферации В-лимфоцитов (Dombrowski К.F., 2000), Поэтому можно предположить, что эффект АТФ на асцитные клетки мог определяться работой экто-АТФазы. Оказалось, что активность фермента в процессе роста опухоли изменялась незначительно, за исключением 12-х и 13-х суток, в этот период активность фермента оказалась сниженной более чем в 2 раза и составляла 0,09^0,015 мкмоль Рн/мг белка в час. Не исключено, что подавление активности экто-АТФазы на 12-е сутки могло стать одной из причин повышенной реакции асцитных клеток на АТФ и это время. Возможно,

именно фермент, обладающий высокой активностью в другие периоды роста опухоли, препятствовал приросту цитозольного кальция в клетках под влиянием АТФ, локально расщепляя его.

В четвертом параграфе обсуждается возможная роль иммунной системы в инициации провала в динамике роста асцитной карциномы Эрлиха. Лимфоциты, как известно, способны регулировать пролиферацию любых типов клеток, поэтому, естественно, что рост-регулирующие функции лимфоцитов играют важную роль в патогенезе опухолевого роста и его ограничении. Количество мононуклеарных клеток число достоверно увеличилось дважды на 7-е сутки (Р<0,05) и на 10-е, 11-е сутки (Р<0,001). Очевидно, что 11-е сутки оказались для опухоли критическими. Именно в этот период в опухоли создались условия, способствовавшие снижению митотической активности и гибели асцитных клеток. Вероятно, повышение числа мононуклеарных клеток в селезенке на 10-е и 11-е сутки и их выход опуда в кровоток (поскольку на 12-е сутки клеток в селезенке стало меньше) и спровоцировало апоптоз в асцитных клетках.

Рис. 10. Изменение количества мононуклеарных клеток селезенки в динамике роста асцитной карциномы Эрлиха.

Примечание (достоверность отличия от предыдущей точки): * Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,001.

В заключении представлено обобщение полученных результатов и перспективы проведенного исследования. В ней делается заключение о динамике роста асцитной карциномы Эрлиха, полученной в наших экспериментах, характеризующейся спадом числа клеток на 12-е сутки после трансплантации опухоли и увеличением их числа на 13-е сутки.

число клеток х10

350 300 250 200 150 100

50- I Ч

0-1—.—I—■—.—.—■—.—.—■—г

4 6 8 10 12 14 16 сутки после трансплантации опухоли

Снижение числа асцитных клеток в опухоли на 12-е сутки было вызвано подавлением митотической активности и их гибелью путем апоптоза на [1-е сутки. Увеличение количества клеток на 13-е сутки происходило вследствие активации митотических процессов. Подавление митотической активности и стимуляция гибели асцитных клеток на 11-е сутки не были связаны с ухудшением энергетического статуса асцитных клеток. Результаты исследований позволили предположить, что как подавление роста опухоли, так и ее стимуляция может реализовываться при участии катионов кальция. Увеличение содержания Са2+ в асцитных клетках на 12-£■ сутки, характеризующиеся высокой пролиферативной активностью, совпало с повышением собственной флуоресценции КАО(Р)Н, что с оответствует предположению о важной роли активных форм кислорода в стимуляции опухолевого роста. Более того, как показали эксперименты, содержание кальция в клетке находится под контролем кислородных радикалов. И особенно это ярко проявляется в период наиболее быстрого роста опухоли. 11-е сутки характеризовались снижением рН,„, видимо, в зто время произошла задержка клеточного цикла (митотический индекс был минимален), а на 12-е сутки, когда рН,„ увеличился, пролиферативная активность клеток возросла. Причем, возможно, этот момент произошла синхронизация клеточного цикла, о чем свидетельствует общее увеличение рНш в популяции клеток. Чувствительность асцитных клеток к АТФ зависит от функционального состояния клеток и определяется фазой развития опухоли. Проявление эффекта АТФ на клетки контролируется активных форм кислорода. Максимальное увеличение числа мононуклеарных клеток предшествовало снижению количества асцитных клеток в опухоли и совпадало со снижением пролиферативной активности клеток и стимуляцией апоптоза. Можно предположить, что возможной причиной подавления роста опухоли на 12-е сутки после трансплантации опухоли стала активация иммунной системы

На основании вышеизложенного можно предложить следующую схему и таблицу механизмов регуляции роста АКЭ.

Организм

Удаление метаболитов

Питательные вещества,

Х)о

(_) Продакш

Популяция асцитных клеток

О о

ГТаракринные и аугкрииныв регуляторы о АТФ

О

Квйлоны

ч>°

Иммунные Факторы

Отрицательно влияет Положительно влияет

Схема 1. Интегральные механизмы регуляции роста опухоли. Примечание: собственные данные выделены курсивом.

Таблица!.

Сводные результаты, характеризующие свойства асцитных клеток во время экспоненциальной илинейной стадии роста АКЭ.

Процессы Свойства опухоли Свойстваклеток Энергетические характеристики Регуляция [Са >]п Количество мононуклеа-рных клеток селезенки

Экспонен -циальный рост (3 -7 сутки) Число клеток в опухоли Зсут -1 х 10® 7сут-5*108 Число клеток в апоптозе 7 сут -0,2 x10е в некрозе 7сут.-1 >10' МИ-20% Скорость удвоения -1,3 делений /суг. [Са*]~б2нМ [№ *] - 71 ммоль/л Вязкость мембраны(белок/лип идная зона 0,053 отн ед липидныйбислой 0,066отн ед) ЫАХ) (Р)Н ~ 0,09 уел ед рН повышается с 0,09 до 0,22 уел ед Активность Са-АТФазы 0,6 мкмоль Рн/106 кл /час Активность №,К-АТФазы4,8мкмольРн/106 кл/час Активность экто -АТФазы 0,2 мкмоль Рн/106 кл /час Р1/№Р -0,8 Дыхание 2,1 МКМОЛЬ О 2 на мг белка Содержание глюкозы в асцитной жидкости =0 АТФ увеличивает [Са на 20нМ в отсутствие АФК[Са*]т уменьшается на 4гМ в отсутствие АФК АТФ не влияет на ГСа*]п Увеличивается с 64 х Ю6 до 142 *106

Линейный рост (9-10 сутки) Число клеток в опухоли 9 сут - 9 х ю8 Юсуг - 10x10® Число клеток в апоптозе 9 сут -0,2 х 10® внекрозе Юсуг-1 х 10® МИ 10% Скорость удвоения - 0,2 делений /сут [Сап увеличивается с 57нМдо97нМ [№ *] щ - 40 ммоль/л Вязкость мембраны (белок/липидная зона 0,055отн ед) №Ш(Р)Н~ 0,07 уел ед рН ~ 0,35 уел ед Активность Са-АТФазыснижается с 0,7 до 0,3 мкмоль Рн/10* кл/час Активность №,К-АТФазысни жается с 4,8 до 2,5 мкмоль Рн/106 кл/час Активностьэют -АТФазы ОД мкмоль Рн/10* кл /час Р1/ОТР снизилось с 2,5 до 1,3 Дыхание 2,4 мкмоль О 2 на мг белка Содержание глюкозы в асдитной жидкости =0 АТФ практически не влияет на [Са*-]и в отсутствие АФК [Са г*]ю незначительно умен ьшается в отсутствие АФК под действием АТФ [Са *]„ незначительно Увеличивается с 79x10 6 до 249 х Ю6

Таблица 2.

Сводные результаты, характеризующие свойства асцитных клеток во время блокады стимуляции иторможения роста АКЭ.

Процессы Свойства опухоли Свойстваклеток Энергетические характеристики Регуляция [Са2*],, Количество монокуклеарн ых клеток селезенки

Блокада роста (11 сутки) Число клеток в опухоли 12x10" Число клеток в апоптозе 4« 10" в некрозе 1 * 108 МИ 6,6 % Скоростьудвоения -0,6 делений в сутки [Са * ]~ 63 нМ [Na *] - 95 ммоль/л Вязкостьмембраны (белок/липиднаязона 0,053 отн ед. липидныйбислой 0,066 отн ед) NAD (Р)Н -0,06 усл. ед рН -0,16 уел ед Активность Са-АТФазы0,2мкмольРн/10г' кл/час Активность Ыа,К-АТФазы 5,4 мкмоль Рн/Ю* кл /час Активность экто -АТФазы 0,2 м кмоль Рн/104 кл /час Р|/ЫГР -2,0 Дыхание 1,5мкмольС>2 на мг белка Содержание глюкозы в асцитаой жидкости =0 А"1Ф практически не влияетна (Са !*]i в отсутствие АФК [Са *] „ незначительно уменьшается в отсутствие А ФК поддействием АТФ [Са ^J,, незначительно 290x10"

Стимуляция роста (12сугси) Число клеток в опухоли 8»10' Число клеток в апоптозе 1,5 х 10® внекрозе 1 * 10е МИ~21,5% Скорость удвоения -0,4 делений в сутки [Са 189нМ [Na *] - 48 ммоль/л Вязкость мембраны (белок/липидная зона 0,055 отн ед липидныйбислой0,066отн ед) NAD(P)H -~0,1 уел ед рН - 0,64 уел ед Активность Са-АТФазы 0,4 мкмоль Рн/106 кл /час Активность №,К-АТФазы 26,4 мкмольРн/Ш'клУчас Активность экто -АТФазы 0,09 мкмоль Рн/10 6кл /час Р1/1ЧГР- 3,8 Дыхание 1,9 МКМОЛЬ О 2 на мг белка Содержание глюкозы в асцитаой жидкости =0 АТФ увеличивает [Са*]1 на90нМ в отсутствие АФК [Са уменьшается на80нМ в отсутств иг АФК поддействием АТФ [Са повышается на80нМ 101x10"

Терминальная стадия (торможение роста) (14-16сутки) Число клеток в опухоли 14сут. 18* 10* 1бсут. 1бх 10* Число клеток в апоптозе 14сут. 1 «10* 16сут 9 хЮк в некрозе 1*10' МИ снизился с 6 % до 0 Скоростьудвоения снижается с0,7до -0,2 делений в сутки [Са*]„~54нМ [Na *] щ снизилась с 119 до 78 ммоль/л Вязкость мембраны (белок/липидная зона 0,055 отн ед, липидный бислой 0,065 отн ед) NAD (Р)Н~ 0,07 уел ед [Н -0,35 уел ед Активность Са-АТФазы снижается с 1,29 до 0,3 мкмольРн/106 кл/час Активность Na.K-АТФазы-6,4 мкмоль Рн/106кл /час Активность экто-АТФазы ~ 0,2 мкмоль Рн/10 "кл /час Р1/1МТР-1,1 Дыхание 1,9мкмольОа намгбелка Содержание глюкозы в асцита ой жидкости =0 АТФ практически не влияетна (Са*]„ вотсутствие АФК [Са щ незначительно уменьшается в отсутствие АФК поддействием АТФ [Са ^Jin незначительно Снижается с 15 х 10е до7 х106

выводы

1. Установлена особенность поведения кривой роста асцитной карциномы Эрлиха in vivo, в виде устойчиво проявлявшегося снижения количества асцитных клеток на 12-е сутки после трансплантации опухоли.

2. Снижение числа асцитных клеток в опухоли на 12-е сутки вызвано подавлением митотической активности и гибелью клеток путем апоптоза на 11-е сутки. Увеличение количества клеток на 13-е сутки происходило вследствие активации митотических процессов.

3. Соотношение Pi/NTP уменьшается в процессе роста опухоли и не взаимосвязано с уровнем митотической активности и апоптозом.

4. Повышение содержания внутриклеточного Са2+, уровня NAD(P)H и pH в асцитных клетках являются факторами, стимулирующими рост опухоли. При подавлении и стимуляции митотической активности асцитных клеток изменение этих показателей согласованно.

5. Содержание катионов кальция в асцитных клетках определяется фазой опухолевого роста, имеет 2 максимума на 10-е и 12-е сутки, контролируется АФК, но не зависит от вязкости цитоплазматической мембраны.

6. Чувствительность асцитных клеток к АТФ зависит от функционального состояния клеток и определяется фазой развития опухоли. Максимальная чувствительность асцитных клеток к АТФ проявляется на 12-е сутки, т.е. в момент стимуляции пролиферативных процессов.

7. Скорость роста опухоли и число асцитных клеток в состоянии апоптоза зависит от численности мононуклеарных клеток в селезенке. Повышение количества мононуклеарных клеток в селезенке предваряет подавление роста опухоли и увеличение числа асцитных клеток в состоянии апоптоза.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ:

1. Замай, A.C. Мембранный потенциал и внутриклеточный кальций асцитных клеток карциномы Эрлиха с разной скоростью пролиферации / A.C. Замай, Т.Н. Замай // Российский физиологический журнал. -2004. -Т.90. -№8. -С.252.

2. Замай, Т.Н. Концентрация внутриклеточного кальция в асцитных клетках карциномы Эрлиха с разной скоростью пролиферации / Т.Н.

Замай, A.C. Замай // Успехи современного естествознания. -2004. -№5.-С. 122.

3. Замай, A.C. Изменение Физико-химических показателей мембран асцитных клеток карциномы Эрлиха в процессе роста опухоли / A.C. Замай, Т.Н. Замай // Доклады Академии наук. -2005. -Т.402. -№2. -С. 265-267.

4. Замай, Т.Н. Механизмы регуляции клеточного гомеостаза в условиях воздействия экстремальных факторов среды / Т.Н. Замай, A.C. Замай // Вестник КрасГУ. Биологическая серия. -2005. -Вып. 5. -С. 247-252.

5. Замай, Т.Н. Влияние АТФ на концентрацию катионов кальция в асцитных клетках карциномы Эрлиха в динамике ее роста / Т.Н. Замай, A.C. Замай // Биохимия. -2006. -Т. 71. -Вып. 10. -С. 1347-1353.

6. Замай, A.C. Влияние АТФ на асцитные клетки в разные фазы опухолевого роста / A.C. Замай, Т.Н. Замай // Материалы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино. -2005. -С. 48-51.

7. Замай, Т.Н. Изменение концентрации кальция в асцитных клетках карциномы Эрлиха в динамике ее роста / Т.Н. Замай, A.C. Замай. Материалы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино. -2005. -С. 51-54.

8. Замай, A.C. Действие АТФ на асцитные клетки в разные фазы опухолевого роста / A.C. Замай // Научные труды I Съезда физиологов СНГ. Москва: «Медицина-здоровье». -2005. -Т. 1. -№ 22. -С. 12.

9. Замай, A.C. Особенности регуляции в асцитных клетках на разных стадиях опухолевого роста / Замай, A.C. // Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Объединение субъектов Российской федерации и проблемы природопользования в Приенисейской Сибири». Красноярск. -2005. -С. 322.

Подписано в печать /£. 0£ а ¿с' у формат 60x84/16. Бумага тип. Печать офсетная. Усл. печ. л. /. Тираж /г"'^ Заказ

Отпечатано в ИЦ Института естественных и гуманитарных наук СФУ

660041 г. Красноярск, пр. Свободный, 79.