Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Клинические формы иерсиниозной инфекции и механизмы иммунной защиты у детей

На правах рукописи

РГБ ОД

Васякина Лали Иосифовна 2 7 0СВ Т '

Клинические формы иерсиниозной инфекции н механизмы иммунной защиты у детей

14.00.10 - инфекционные болезни 14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2002

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте детских инфекций Министерства здравоохранения РФ, г. Санкт-Петербург

Научные руководители:

член-корр. РАМН, профессор, доктор медицинских наук В.В.Иванова доктор медицинских наук Г.Ф.Железникова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор О.И.Кошиль доктор медицинских наук, профессор П.Г.Назаров

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственн медицинский университет им. академика И.П.Павлова

Защита состоится » 2002 г. в_ на заседай

диссертационного совета Д.215.002.01 в Военно-медицинской академии по ; ресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, д. 6.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке I енно-мединской академии

Автореферат разослан «-^ » ^Л/уи^ 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Ю.И.Ляшенк

/

Актуальность. В настоящее время проблема иерсиниозной инфекции сохраняет свою актуальность, несмотря на достигнутые успехи в изучении многих ее аспектов (Ющук Н.Д., Кареткина Г.Н. и соавт., 2000; Ценева Г.Я. и соавт., 2000).

Многообразие клинических проявлений, отсутствие патогномоничных симптомов, редкость моносиндромных вариантов определяют трудности распознавания иерсиниозной инфекции и значительную частоту диагностических ошибок. В основе клинического полиморфизма инфекции лежат как вариации вирулентности отдельных штаммов (Малов И.В. и соавт., 1999), так и генетически обусловленные особенности иммунного ответа на различные антигены возбудителя (Кузнецова Т.А., Беседнова Н.Н., 1997).

Иерсиниозная инфекция характеризуется циклическим течением, которое может нарушаться развитием затяжного течения и рецидивов, что определяется биологическими свойствами возбудителя, обладающего антифагоцитарной устойчивостью, а также особенностями иммунной реактивности организма (Беседнова Н. Н., Сомов Г. П., 2000; Исачкова JI.M. и соавт., 1996). В ряде источников сообщается, в частности, что рецидивирующее течение псевдотуберкулеза ассоциировано с низким антительным ответом к иммунодоминантному белку (26 Ю) наружной клеточной мембраны Y. pseudotuberculosis (Малов И.В. и соавт., 1994). Особенно часто (в 34% случаев) обострения псевдотуберкулеза регистрируются у детей раннего возраста. Частота рецидивов при псевдотуберкулезе колеблется от 10 до 53%, в разные годы частота рецидивов неодинакова (Борисова М.А.и соавт., 2000).

Доказана роль иерсиний в формировании хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта (Гордеец А.В. и соавт., 2000; Кузьмин А.В. и соавт., 1997; Климанова Е.М. и соавт., 1998). Иерсиниозная инфекция может быть триггером развития иммунопатологических процессов (гемолитическая анемия, тромбоцитопения, тиреоидит, гломерулонефрит, поражения сердца и суставов). В связи с этим следует дифференцировать иммунопатологию при хронических иерсиниозах и первичные коллагенозы и другие иммунопатологические заболевания, на фоне которых иерсиниозы принимают затяжное течение (Ющенко Г.В., 1998; Акбаров С.В. 1998, 2000).

Иммунный ответ осуществляется при тесном взаимодействии клеточного и гуморального звеньев, взаимодействие которых направлено на элиминацию патогена и восстановление иммунного гомеостаза (Ковальчук JI.B., Чередеев А.Н., 1997; Фрейдлин И.С., 1999; Ярилин А.А., 2000). Иммунологическая реактивность, наряду с особенностями возбудителя, обусловливает клинические

проявления болезни, ее течение и исход (Покровский В.И., 1994; Чередеев A.F 1995). Иммунокомпетентные клетки посредством выработки различных факт ров защиты и иммунорегуляции (цитокинов, иммуноглобулинов различив классов, компонентов системы комплемента), определяют скорость и эффе тивность иммунного ответа на патоген (Хаитов P.M. и соавт., 2000).

Несмотря на общепризнанную роль цитокинов в регуляции антигенсп цифической иммунной защиты и индукции реакций воспаления в инфицир« ванных тканях и органах (Фрейдлин И.С., 1998), цитокиновый профиль отвс у детей, больных иерсиниозной инфекцией, не изучался. Остается также нея ной роль индуцированного иерсиниями апоптоза (программированной клето' ной гибели) (Monack et al.,1998; Cornelis et al., 1998) в патогенезе иерсиниознс инфекции. Выявление роли апоптоза в иммунном ответе при иерсиниозной ю фекции должно способствовать совершенствованию патогенетической тераго детей с иерсиниозами.

Многообразие клинических проявлений иерсиниозной инфекции, недо таточная изученность многих звеньев патогенеза как острой инфекции, так ее затяжного и рецидивирующего течения, отсутствие информативных тесто позволяющих прогнозировать затяжное и рецидивирующее течение иерсинио ной инфекции, делает актуальным ее подробное клинико-иммунологическ* исследование на современном этапе.

Цель исследования: изучить клинические особенности иерсиниознс инфекции у детей и разработать систему иммунологических критериев тяж ста, а также развития затяжного и рецидивирующего течения инфекции.

Задачи исследования.

1.Дать характеристику клинических форм иерсиниозной инфекции у детей. 2.0пределить уровень экспрессии поверхностных маркеров Т- и В-лимфоцито (CD3, 4, 8,16, 20, 25, 95) в динамике болезни у детей с различными клиническими формами иерсиниозной инфекции.

3.Оценить уровень спонтанного апоптоза мононуклеарных клеток крови у детей с иерсиниозной инфекцией в динамике болезни. 4. Определить уровень про- и противовоспалительных цитокинов (TNF-a, IFN-y, EL-6, IL-4) в сыворотке крови и IL-2 in vitro у детей с иерсиниозной инфекцией в динамике болезни.

5.Оценить состояние клеточного и гуморального иммунитета больных по вел чине пролиферативного ответа Т-лимфоцитов на ФГА (ФГА-РБТЛ) и уровн продукции IgM, IgA, IgG и IgE. Сравнить уровень синтеза противоиерсинио ных антител при разных формах и течении иерсиниозной инфекции.

Научная новизна исследования.

При псевдотуберкулезе и кишечном иерсиниозе выделены и охарактеризованы клинические формы болезни, отражающие нарастание генерализации процесса.

Впервые произведено сравнение иммунного ответа детей с разными клиническими формами иерсиниозной инфекции по фенотипическому составу лимфоцитов крови, соотношению числа клеток с маркерами «позитивной» (CD25) и «негативной» (CD95) (Ковальчук Л.В.,Чередеев А.Н.,1998) активации лимфоцитов, уровню в крови цитокинов TNF-a, IFN-y, IL-4 и IL-6, IgA, M, G и E, ЦИК, титру противоиерсиниозных антител. Выявлены прогностические критерии нарастания генерализации иерсиниозной инфекции.

Впервые показана повышенная готовность лимфоцитов больных с иерсиниозной инфекцией к спонтанному апоптозу in vitro, в прямой зависимости от тяжести процесса.

Произведено сравнение иммунного статуса больных с моноформами, комбинированными и генерализованными формами иерсиниозной инфекции, вызванной разными видами иерсиний (Y. enterocolitica и Y.pseudotuberculosis) и сероварами Y. enterocolitica 03 и 09. Выявлены отличительные особенности иммунного реагирования детей со скарлатиноподобной формой псевдотуберкулеза и гепатита, вызванного Y. enterocolitica ОЗ, а также некоторые различия модуляции иммунного ответа при нарастании генерализации псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, вызванного Y. enterocolitica сероариантов ОЗ и 09.

Впервые выявлены конкретные иммунопатогенетические механизмы развития затяжного и рецидивирующего течения иерсиниозной инфекции у детей.

Охарактеризован особый иммунный статус детей с узловатой эритемой. Практическая значимость работы.

1. Разработана система иммунологических критериев нарастания генерализации иерсиниозной инфекции у детей.

2. Показана значимость иммунологического обследования для прогноза развития затяжного и рецидивирующего течения иерсиниозной инфекции у детей. Предложены алгоритмы прогноза негладкого течения иерсиниозной инфекции.

3. На основании полученных сведений даны рекомендации для дальнейшего диспансерного наблюдения детей, перенесших иерсиниозную инфекцию, у которых в процессе заболевания развилась узловатая эритема

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Максимальное число затяжных и рецидивирующих форм наблюдается у д тей с кишечным иерсиниозом, вызванным Y.enterocolitica 03 . Затяжное рецидивирующее течение заболевания возникает у детей, переносящих koi бинированные формы иерсиниозной инфекции, преимущественно с пораж нием печени или абдоминальным синдромом, в средиетяжелой и тяжелс форме.

2. Иммунологическими критериями генерализации псевдотуберкулеза кишечного иерсиниоза, вызванного Y.enterocolitica 09, являются следущ параметры: снижение в составе циркулирующего пула лимфоцитов числа' клеток фенотипа CD3+, CD4+, CD25+, повышение доли CD8+, CD 16 CD20+, CD95+ лимфоцитов, усиление спонтанного апоптоза лимфоцитов vitro, гиперпродукция цитокинов с выбросом в кровь больших количес TNF-a, IFN-y и IL-4, относительно низкая (на уровне значений у здоровь детей) способность Т-клеток к синтезу IL-2 in vitro, значительная активащ синтеза общего IgE.

3. В основе иммунопатогенеза затяжного или рецидивирующего течения ие синиозной инфекции лежит нарушение баланса «позитивной» активации ' лимфоцитов и активационного апоптоза клеток, участвующих в иммушк ответе. Общими критериями затяжного течения иерсиниозов можно счита недостаточную активацию Т-лимфоцитов, связанный с этим слаб! антительный ответ, сниженную пролиферативную активность Т-клетс высокую системную продукцию TNF-a и значительную активацию синте IgE. Критерием рецидивирующего течения иерсиниозной инфекции являет недостаточность клеточных механизмов защиты (редукция синтеза IFN-y vivo и IL-2 in vitro, угнетение пролиферативного ответа Т-лимфоцитов ФГА, снижение в циркуляции CD8+ Т-лимфоцитов). Рецидив иерсиниоз» инфекции возникал при наличии достаточно высокого титра антител к ант генам соответствующего возбудителя.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены:

- на XXIII итоговой научно-практической конференции НИИДИ (2001 год);

- на международной конференции «Инфекции, обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез), и другие актуальные инфекции» (Санкт-Петербург, 2000 год);

- на V научной конференции с международным участием «Дни иммунологи в Санкт-Петербурге-2001»;

- на всероссийской научно-практической конференции (НИИДИ, 2001 год). Публикации: по теме диссертации опубликовано 7 работ, из них в центральных изданиях-2.

Реализация результатов: в совторстве подготовлено учебное пособие для врачей «Новые технологии в диагностике, терапии и тактике этапного наблюдения иерсиниозной инфекции у детей» (2001). Получена приоритетная справка на изобретение «Способ прогнозирования развития затяжных форм иерсиниозной инфекции у детей» от 2.07.2001 № 2001117021. Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 197 страницах, состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 43 таблицами, 8 рисунками, указатель литературы содержит 102 отечественных и 93 зарубежных источников.

Материалы и методы исследований.

В ходе выполнения работы в 1998-2000 годах проведено клинико-лабораторное обследование 125 детей в возрасте от 5 до 15 лет, переносивших иерсиниозную инфекцию (ИИ) и находившихся в клиниках НИИ детских инфекций (Санкт-Петербург).

Псевдотуберкулез (ПСТ) наблюдали у 50 детей (40%). У 75 детей (60%) был диагностирован кишечный иерсиниоз (КИ), вызванный Y. enterocolitica сероваров 09 и 03, из которых у 56 детей (44,8%) отмечен КИ, вызванный Y. enterocolitica 09 (КИ 09), а у 19 детей (15,2%) КИ, вызванный Y. enterocolitica 03 (КИ 03). У 6 девочек, переносящих ПСТ, наблюдали развитие узловатой эритемы (УЭ).

Учитывая вариации сроков первого обследования, сравнение результатов проводилось только в сопоставимые сроки. Данные иммунного статуса больных ИИ сравнивали также с результатами обследования здоровых детей в возрасте 5-14 лет из физиологического детского дома (п=10).

Определение противоиерсиниозных антител (AT) проводили двукратно в стандартной серологической реакции агглютинации (РА), используя иерсини-озные корпускулярные антигены Y.enterocolitica ОЗ, Y.enterocolitica 09, Y.pseudotuberculosis производства "Предприятия по производству бактерийных препаратов НИИЭМ им. Пастера"(Санкт-Петербург) в бактериологической лаборатории НИИ детских инфекций (рук.д.м.н. A.C. Кветная). Средний геометри-ческий титр антител выражали в обратных логарифмах (1/lg). Про-лиферативную активность Т-лимфоцитов оценивали в реакции бласттрансфор-

мации лимфоцитов (РБТЛ) на фитогемагглютинин (ФГА) фирм «Difco»(CIlIA) в конечной концентрации 10 мкг/мл в культурах цельной крот с морфологическим учетом результатов (Новиков Д.К., 1996). Супрессию пр< лиферативного ответа устанавливали по числу бластных форм менее 65% наименьшее значение показателя у здоровых детей. Концентрацию иммунопт булинов (Ig) А, М, G классов определяли стандартным методом радиальнс иммунодиффузии по Mancini (1965) с использованием моноспецифичесы ангисывороток предприятия по производству бактерийных препарат« Нижегородского НИИЭМ. Содержание общего IgE определяли методе твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использование коммерческих тест-систем ТОО "Полигност" (Санкт-Петербург). Определен! общего пула ЦИК проводили методом преципитации полиэтиленгликолем i Digeon (1977) в планшетной модификации. Определение уровня цитокинов сыворотке крови (TNF-a, EFN-y, IL-4, IL-6) и в надосадочной жидкости (IL-определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) соответствии с инструкциями, прилагаемыми к наборам, производства ТО "Протеиновый контур" (НИИ ОЧБ, Санкт-Петербург). Для ориентировочн« оценки соотношения Thl/Th2 мы использовали коэффициент IFN-у/ IL-4 (Мс mann, Sad, 1996).

Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови проводи] с помощью панели моноклональных антител серии ИКО производства НЕ "Медбиоспектр" (Москва) в лимфоциготоксическом тесте (Кетлинский С J Калинина Н.М., 1998). Для оценки соотношения «позитивной» и «негативно] (Ковальчук Л.В., Чередеев А. Н.,1998) активации лимфоцитов мы ввели коэ! фициенг CD25/CD95.

Оценка спонтанного апоптоза in vitro проводилась по методу Gorla, Ь berti (1994) на базе института цитологии РАН.

Статистическая обработка данных проводилась на Pentium 166 ММХ использованием пакета программ Excel, достоверность различий оценивали : критерию Стъюдента.

Результаты исследований.

Клинические формы иерсиниозной инфекции у детей.

Острое течение ИИ наблюдалось у 80% больных ПСТ, у 89,2% болып КИ 09 и 52,6% детей с КИ 03. Затяжное течение отмечено нами у 12% 601

ных с ПСТ, у 5,4% детей с КИ 09 и у 15,8%- с КИ 03, рецидивирующее - у 8% детей с ПСТ, у 5,4%- с КИ 09 и у 31,6%- с КИ 03, что позволяет нам чаще прогнозировать затяжное и рецидивирующее течение у больных с КИ 03.

Возрастная структура ИИ представлена следующим образом: дети 5-8-летнего возраста составили 41,6%, в возрасте 9-11 лет - 31,2% и 27,2% - от 12 до 15 лет. Следовательно, в настоящее время заболеванию чаще подвержены дети более младшего возраста. По половому признаку дети распределились среди всех возрастных групп поровну.

Среди детей с ИИ отмечалось многообразие форм. По клиническим формам, различающимся по интенсивности общей интоксикации и выраженности отдельных симптомов, иерсиниозы были разделены на моноформы, комбинированные и генерализованные формы. При ПСТ в качестве моноформы была представлена скарлатиноподобная форма, при КИ -гастроинтестинальная, абдоминальная и гепатит.

При ИИ моноформы составили 24,8%, из них наибольшее число пришлось на КИ 03 (42,1%), наименьшее - на КИ 09 (14,3%), при ПСТ моноформы составили 30%. Комбинированные (смешанные) формы преобладали у больных с КИ 09 - 71,4%, при ПСТ и КИ 03 они составили 44% и 36,8% соответственно. Генерализованные формы в общей сложности составили 20% от общего числа, чаще встречались при ПСТ (26%).

При нарастании генерализации ПСТ от скарлатиноподобной к комбинированной и генерализованной форме наблюдали увеличение максимальной температурной реакции (соответственно, 38,12±0,12°С, 38,93±0,14°С и 39,65±0,14°С), длительности температурного периода (соответственно, 5,6±1,2 дней, 6,2±0,8 дней и 10,5±1,4 дней), длительности симптомов интоксикации (соответственно 6,7±0,8 дней, 8,8±0,6 дней и 12,8±0,7 дней): во всех случаях р< 0,05 между скарлатиноподобной и генерализованной формами.

При нарастании генерализации КИ также наблюдали увеличение максимальной температурной реакции (37,62±0,23°С, 38,52±0,19°С и 39,11±0Д6°С), длительности температурного периода (4,5±0,8 дней, 5,2±0,6 дней и 9,4±0,9 дней), длительности симптомов интоксикации (4,8±0,4 дней, 7,2±0,4 дней и 10,6±0,5 дней): р< 0,05 между моноформой и генерализованной формами.

Частота встречаемости основных симптомов, патогномоничных для ИИ (миалгии, артралгии, геморрагическая экзантема, ангина, лимфопролифератив-ный синдром, абдоминальный синдром, увеличение печени и селезенки, поражение почек) также нарастала по мере генерализации как ПСТ, так и КИ.

Генерализованные формы КИ 09 чаще наблюдались у детей младше возрастной группы (в 62,5% случаев), а генерализованные формы КИ 03 и ПС - у детей старшего возраста (соответственно в 50 % и 53,8 % случаев). Kom6i нированные формы КИ 09 и ПСТ также превалировали у детей младшей во: растной группы (50% и 40,9%), тогда как комбинированные формы КИ ОЗ ч: ще наблюдались у детей старшей возрастной группы (в 42,8 % случаев). Мон< формы при КИ 09 доминировали у детей младшей группы (62,5 %), при К 03 - у детей средней возрастной группы (50 %), при ПСТ - встречались у дете во всех возрастных группах с одинаковой частотой (по 33%). Выявлено, что з; тяжное течение заболевания возникало у детей, переносящих комбинированнь формы ИИ, преимущественно с поражением печени или абдоминальным сш дромом, в среднетяжелой и тяжелой форме. 50% детей, переносящих затяжж течение болезни, наблюдались гастроэнтерологом с диагнозом "дискинез! желчевыводящих путей", что, возможно, обусловило длительный и неэффе тивный саногенез и, соответственно, затяжное течение КИ. При КИ у 65 бол ных (86,7%) заболевание протекало в среднетяжелой форме, при ПСТ среди тяжелая форма встречалась в 84% случаев. Тяжелое течение было отмечено 13,3% больных с КИ и у 16% больных с ПСТ.

Иммунный ответ при различных клинических формах острой иерсинио ной инфекции (псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз). Анализ особенностей иммунного статуса при ИИ различной тяжести и течеш позволил установить роль определенных механизмов иммунной защиты в i патогенезе.

Тяжесть клинических проявлений ПСТ и КИ ассоциирована с отличия\ множества параметров иммунной реактивности и их динамики в ходе инфекц онного процесса (табл.1).

Установлено, что иммунологическими критериями нарастания генерал зации ПСТ и КИ 09 в острую фазу иерсиниозной инфекции могут быть сл дующие параметры: снижение в составе циркулирующего пула лимфоцит« числа Т-клеток фенотипа CD3+, CD4+, CD25+ и, наоборот, повышение ao¡ CD8+, CD16+, CD20+, CD95+ лимфоцитов, гиперпродукция цитокинов с bi бросом в кровь больших количеств TNF-a, IFN-y, IL-4, относительно низкая (i уровне значений у здоровых детей) способность Т-клеток к синтезу IL-2 in л tro, значительная активация синтеза общего IgE и умеренная - IgM и IgG.

У детей с генерализованной формой ПСТ и КИ 09 обнаруживалась г перпродукция IFN-y и сохранялся практически "нормальный" баланс IFN-y/IL

в острую фазу разных форм острой иерсиниозной инфекции у детей.

Формы СБЗ % СР4 % СИ8 % С016 % СВ20 % СР25 % СИ95 % ТОТ-а иг/мл ПЪГ-у иг/мл П.-4 пг/мл ФГА-РБТЛ % Титр АТЛ кЕ/л

Скарлатин. пет п=8 52,8 ±1,1 41,3 ±1,5 20,5 ±1,2 15,2 ±0,9 31,3 ±1,0 * 33,8 ±1,2 * 36,2 ±1,3 * 248±35 89±32 198±22 71,4±1,4 2,36±0,05 142±18

Комбинир. пет П=11 51,2 ±1,9 40,8 ±1,8 21,4 ±1,8 16,8 ±0,8 32,0 ±1,5 * 31,7 ±1,4 * 42,2 ±1,8 * # 389±17 * # 413±12 * # 88±17 и 65,1±1,8 2,10±0,06 # 192±11 * #

Генерализ. пет п=8 40,9 ±2,0 * # ■35,5 ±1.4 * # 26,5 ±1,0 * # 18,9 ±1,2 # 40,2 ±1,2 * # 28,8 ±1,5 * # 49,5 ±1,5 * # 563±24 * # 985±35 * # 586±31 * # 63,4±2,5 * # 1,58±0,03 # 403±18 * #

Гастроинт. КИ 09 п=7 56,8 ±2,1 42,3 ±1,5 20,1 ±1,8 16,1 ±0,7 27,1 ±1,2 39,2 ±1,6 * 38,2 ±1,1 * 78±22 78±35 56±38 72,8±1,8 2,24±0,07 92±34

Комбинир. КИ09 п=15 50,8 ±1,8 46,2 ±0,7 22,8 ±1,7 19,2 ±1,1 30,0 ±1,1 32,5 ±1,2 * # 42,8 ±2,0 * 258±24 * # 254±28 * # 109±23 68,4±1,5 * 2,28±0,08 195±12 * #

Генерализ. КИ09 П=8 45,1 ±1,5 * # 38,5 ±1,2 * 27,2 ±1,4 * и 22,1 ±0,8 * # 32,8 ±1,8 * 30,2 ±1,1 * # 51,6 ±1,4 * # 586±34 * # 952±95 * # 368±34 * и 55,8±1,9 * # 2,42±0,04 328±21 * #

Гепатит КИОЗ п=5 54,8 ±1,8 40,2 ±2,1 15,1 ±1,0 * 13,5 ±1,2 31,8 ±1,3 * 20,1 ±1,3 27,2 ±1,5 * 45±27 * 33±21 26±24 55,2±2,1 * 1,78±0,07 84±27

Генерал. КИОЗ п=5 53,1 ±1,4 45,2 ±2,0 25,1 ±1,8 # 16,2 ±1,1 30,7 ±1,4 35,5 ±1,8 * и 42,9 ±1,5 * и 298±38 * # 135±19 # 217±37 * # 69,2±2,0 # 2,24±0,06 # 257±45 * и

Здоровые дети п=10 57,5 ±3,0 45,5 ±1,9 21,2 ±1,8 15,5 ±1,8 23,5 ±2,5 18,8 ±1,8 22,2 ±1,6 124±33 92±24 67±28 75,0±2,2 Н/д 100±32

♦-отличие от нормы у здоровых детей достоверно при р по крайней мере <0,05 #- отличие от моноформы достоверно при р по крайней мере <0,05 Л - среднегеометрический титр антител (в 1/^) Н/д - нет данных

(1,68 при 1,37 у здоровых детей). По-видимому, интенсивная секреция IFN как главного медиатора защиты при внутриклеточных инфекциях обеспечива! активное функциональное состояние мононуклеарных фагоцитов и, в сине] гизме с гуморальными факторами иммунной защиты, приводила к эрадикащ патогена с полным клиническим выздоровлением детей с генерализованнс формой примерно в те же сроки, что и при менее тяжелых формах инфекции скарлатиноподобной при ПСТ и гастроинтестинальной при КИ 09 и комбин рованной при обеих инфекциях.

Известно, что экспрессия Fas (CD95) на поверхности Т- и В-лимфоцит< инфицированных лиц отражает уровень их активации in vivo антигенами во будителя (Mijawaki et al., 1992). Наиболее клинически информативным методе изучения апоптоза считают оценку спонтанного апоптоза лимфоцитов in vit (Brugnoni et al.,1997; Estaquier et al.,1995; Gorla et al.,1994).

Повышенная спонтанная гибель мононуклеаров в 48- или 72-часовс культуре, особенно выраженная у детей с генерализованной формой ПСТ или комбинированной формой КИ 09, была ассоциирована с увеличением чис. Fas(CD95)+ клеток среди лимфоцитов крови (табл.2).

Это позволяет предположить, что при данной инфекции реализуются м ханизмы активационного апоптоза, осуществляемые через взаимодейств! Fas/FasL. Вероятно, под действием избыточных стимулов к активации in vi' часть Т- и В-лимфоцитов, несущих Fas (CD95), приобретают повышенную чу ствительность к апоптозным сигналам и подвергаются in vitro спонтаннои апоптозу. У детей с генерализованной формой ИИ в острую фазу болезни сред Т-лимфоцитов преобладали CD8+ Т-клетки, часть из которых могли бьг CD95+ и подвергаться спонтанной гибели in vitro. Возможно, в услови высокого уровня антигенной стимуляции рост экспрессии CD95 и готовнос лимфоцитов к апоптозу направлен на предотвращение поликлональнс активации и пролиферации как Т-, так и В-лимфоцитов. Фазные изменен! апоптоза были сравнительно невелики: повышенная экспрессия CD95 усиленная гибель лимфоцитов в культуре сохранялись и в перио; клинического выздоровления.

По-видимому, ни гиперпродукцию цитокинов, ни повышенную гибе: свежевыделенных или культивированных мононуклеаров у детей с генерализ ванной формой ИИ не следует рассматривать как некую иммунологическую к тастрофу. Тяжелый инфекционный процесс в результате проведенной этиол гической и симптоматической терапии завершался относительно быстрым кл ническим выздоровлением, что является действенным критерием адекватное!

Табл.2.

Спонтанный апоптоз в культуре мононуклеаров при инкубации в течение 48 и 72 часов при двух клинических формах псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, вызванного У. еШегосоИйса 09.

форма Первое обследование Второе обследование

Общее число погибших клеток, Число апоптозных Общее число пошбших клеток, % Число апоптозных

% (окраска трипаиовым синим) клеток, % (огааска PI) (окраска тр1шановым синим) клеток, % (окраска PI)

& 48ч 72 ч 48ч 72 ч & 48ч 72 ч 48ч 72 ч

1. Скарлатин. 7,6±0,2 37,3±1,2 45,3±2,3 32,7±1,5 39,2±1,4 4,2±0,4 32,2±1,6 38,5±2,7 29,2±1,4 33,8±1,5

пет п=5 * * * * * ** * ** * * * **

2.Генерализ. пет 9,2±0,4 * 46,3±3,2 * 53,1±2,1 * 42,5±1,9 * 50,8±2,6 * 4,4±0,5 38,4±1,7 * * * 47,6±0,9 * * * 33,5±1,5 * ** 40,2±2,3 *

п=5

pl,2 <0,01 <0,05 <0,05 <0,01 <0,01 <0,05 =0,01 <0,05

1.Г\пнтест. 2,8±0,4 19,2±1,4 24,8±1,1 17,8±1,1 19,8±1,4 2,2±0,2 20,1±1,7 22,8±1,8 15,б±1,2 16,4±1,0

КИ09 * * * *

п=3

2.Комб1ШИр. КИ 09 5,4±0,4 * . 33,4±1,2 * 35,6±1,3 * 26,6±1,2 33,4±1,0 * 4,4±0,4 28,3±1,3 * * + 31,8±1,2 * ** 23,6±1,1 * 24,6±1,2 * **

п=5

Р1,2 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,05 <0,001 <0,001 <0,001

Здоровые дети п=5 2,0±1,0 15,0±2,0 18,6±1,5 8,5±1,4 12,2±2,4 2,0±1,0 15,0±2,0 18,6±1,5 8,5±1,4 12,2±2,4

*- отмечено достоверное отличие от показателя у здоровых детей при р по крайней мере < 0,05 """-отмечено достоверное отличие от показателя в острую фазу при р по крайней мере < 0,05 &- свежевыделенные мононуклеары PI-propidium iodide

и эффективности не только принятых лечебных мер, но и иммунного отвел сбалансированности основных его звеньев, включая процессы активации апоптоза.

Сниженный в острую фазу антигенспецифический антительный ответ пр ПСТ также может служить критерием возможного нарастания генерал из аци процесса (см.табл.1). Можно предположить, что недостаточное! антителообразования в начальную критическую фазу иммуногенеза являете важным патогенетическим фактором нарастания генерализации инфекции развития тяжелых форм псевдотуберкулеза с вовлечением в процесс многн органов и систем. Выздоровление при генерализованной форме происходил при наиболее интенсивном накоплении AT, что свидетельствует об активаци гуморальных механизмов иммунной защиты по мере генерализации инфекции,

Антигенспецифический иммунный ответ при КИ 09 характеризовав относительно высоким уровнем антител при комбинированной и, особенно, п нерализованной формах инфекции.

По совокупности представленных данных можно заключить, что разр( шение ИИ у детей требует согласованного участия клеточных и гуморальны механизмов защиты. Генерацию антигенспецифических Th2, в дополнение Thl, отмечали неоднократно даже при бактериальных инфекциях с исюпоч! тельно внутриклеточной локализацией возбудителя (Kaufman et al.,1993; Mo: mann, Sad, 1996). По-видимому, протективная роль Th2 и гуморальной форм иммунного ответа значительно возрастает при инфекциях с двойной локализ; цией бактерий: внутри- и внеклеточной. Иерсиниозная инфекция принадлеж! к инфекциям именно такого типа.

Сравнительная характеристика иммунного ответа при иерсиниозной ш фекции, вызванной разными серотипами возбудителя.

В ходе анализа полученных результатов мы обратили внимание на нею торые существенные особенности иммунного статуса у детей, имевших exoj ные клинические формы иерсиниозной инфекции, вызванной разными серов: риантами патогенных иерсиний (см. табл.1). Моноформа КИ 03, развившаяся форме гепатита, вызывала иной профиль иммунного ответа по сравнению моноформами КИ 09 и ПСТ.

Характерными чертами иммунного ответа детей с гепатитом, вызванны Y. enterocolitica сероварианта 03, были недостаточность CD8+ лимфоцитов пр повышенном уровне в крови CD20+ лимфоцитов, смещение баланса маркере активации CD25/CD95 (0,74 vs 1,03 при моноформе КИ 09 и vs 0,85 у здоровь детей) в сторону преобладай!» негативно активированных лимфоцитов с п

товностью к развитию анергии и к апоптозу (см. табл.1). С этой особенностью ассоциировалось угнетение ответа Т-лимфоцитов на ФГА синтезом IL-2 и пролиферацией. Низкий уровень в сыворотке крови как провоспалительных (TNF-a и IFN-y), так и противовоспалительного (IL-4) цитокинов свидетельствовал о недостаточной активации Th обоих фенотипов (Thl и Th2). Это сочеталось с усиленным накоплением ЦИК (0,156±0,П vs 0,115±0,10 в «норме», р<0,05) в результате замедленной их элиминации профессиональными фагоцитами.

Особенности иммунного ответа детей данной группы могли быть обусловлены известной высокой вирулентностью Y. enterocolitica сероварианта 03 (Воскресенская Е.А., Ценева Г.Я., 1996), способностью этого возбудителя нарушать активацию Т-лимфоцитов и клеточно-опосредованную форму иммунного ответа. С другой стороны, фактором патогенеза данной клинической формы с локализацией воспалительного процесса в печени, возможно, была изначальная недостаточность синтеза IgA (0,62±0,13 vs 1,18±0,11 у здоровых детей, р<0,05), которая послужила причиной быстрой диссеминации иерсиний из кишечного тракта. Можно предположить, что локализация воспалительных очагов в печени усугубляет иммуносупрессию, вызываемую факторами вирулентности Y. enterocolitica 03. Возникновение дополнительных очагов воспаления в других компартментах лимфоидной ткани или мононуклеарных инфильтратов во внутренних органах и тканях способствует преодолению индуцированной Y. enterocolitica ОЗ иммуносупрессии, изменению цитокинового ответа и активации Т-лимфоцитов CD25+, синтезирующих IL-2 in vitro, нарушенной при гепатите. Это сопровождается усилением продукции антител, относительно низкой при гепатите.

Отличиями иммунного статуса детей с моноформой КИ 09 и ПСТ были существенно большее число CD25+ Т-лимфоцитов и меньшее - CD20+ В-лимфоцитов в острую фазу КИ 09, чем при ПСТ.

Важной иммунологической особенностью скарлатиноподобной формы острого ПСТ была значительно большая выраженность апоптоза свежевыде-ленных или культивированных мононуклеаров (по всем использованным показателям), чем при гастроинтестинальной форме КИ 09, в обе фазы болезни (см. табл.2). Этому соответствовал более высокий (почти втрое в острую фазу) сывороточный уровень TNF-ct при скарлатиноподобной форме ПСТ по сравнению с гастроинтестинальной формой при КИ 09 (248±35 vs 78±22, р < 0,01).

В острую фазу скарлатиноподобной формы ПСТ более высоким был уровень И-4 (198±22 уб 56±38, р<0,05). По-видимому, при скарлатиноподобн форме ПСТ больший стимул к активации получали ТЬ2 (основные продуцен 1Ь-4). Выраженную стимуляцию гуморального иммунитета иллюстрировал ( лее высокий пул при моноформе ПСТ по сравнению с КИ 09 (9,76±0,1 8,56±0,27, р<0,05).

Существенных различий фенотипического состава лимфоцитов у дете! комбинированными формами ПСТ и КИ 09 мы не обнаружили, исключением большей степени С04+ Т-лимфопении (40,8±1,8 % ув 46,2±0,' , р<0,05) в острую фазу ПСТ и большей мобилизации СБ20+ В-лимфоцт (34,8±0,7% ув 29,6±1,5%, р<0,05) в фазу выздоровления, по сравнению комбинированной формой КИ 09. Кроме того, выброс в циркуляц: провоспалительных цитокинов ТЫБ-а и П-ЪГ-у в обе фазы ПСТ превышал у] вень секреции этих цигокинов при КИ 09 (389±17 пг/мл Ув 258±28 пг/мл ТЪ а, р<0,05 и 413±12 пг/мл Ув 254±28 пг/мл №N-7, р<0,05, острая фаза). Вме< взятые, эти различия свидетельствовали об относительно большей тяжес комбинированной формы ПСТ, чем КИ 09.

При сравнении иммунного статуса у детей с генерализованными форе ми иерсиниозной инфекции, вызванными У.рзеис1оЦ1Ьегси1о515, У. еШегосоШ серовариантов 03 и 09, мы выявили существенные различия по целому ря параметров.

Наиболее выраженный цитокиновый ответ (по уровню в сыворотке крс ЮТ-а, №N-7 и 1Ь-4) и гуморальный профиль иммунного ответа (по чис С020+В-лимфоцитов, содержанию в крови общего 1§Е и 1§0, нарастай антител в ходе болезни) мы наблюдали у детей с генерализованной форм ПСТ. Сходный иммунный статус имели дети с генерализованной формой I 09 (см.табл. 1).

У детей с генерализованными формами ПСТ и КИ 09 в острую ф; болезни число готовых к апоптозу СБ 95+ лимфоцитов превалировало I позитивно активированными СБ25+ Т-лимфоцитами (коэффициент СБ25/СЕ при КИ 09 и ПСТ соответственно 0,59±0,03 и 0,58±0,02 уб 0,85±0,05 в "нор! р<0,05), что сочеталось с "нормальным" уровнем продукции 1Ь-2 и сниженн пролиферативным ответом Т-лимфоцигов на ФГА.

Значительно отличался от вышеописанного иммунный ответ у дете1 генерализованной формой КИ 03. Изменения иммунного и цитокинов« статуса в этой группе были наименьшими, и по большинству параметров (чи<

CD3+, CD4+, CD8+, CD 16+, CD20+ лимфоцитов, уровню ЦИК, содержанию в крови IFN-y) не выходили за пределы колебаний в группе "контроля". Отличительной особенностью гуморального иммунитета этих детей был низкий уровень продукции IgG при, однако, высоком среднегеометрическом титре антител к Y. enterocolitica ОЗ.

Можно отметить некоторые парадоксальные, на первый взгляд, черты иммунного ответа при генерализованной форме КИ ОЗ. При некоторой активации Th2 (повышенный в сравнении с «нормой» уровень IgE и IL-4), но не IFN-у-синтезирующих клеток (коэффициент IFN-yAL-4=0,6), у этих детей в острую фазу отмечалась "нормализация" баланса CD25/CD95 (0,83 при «норме» 0,85), усиленное накопление активированных CD25+ Т-лимфоцигов, значительная стимуляция синтеза in vitro IL-2 и высокий пролиферативный ответ Т-лимфоцитов на ФГА, то есть известные признаки мобилизации клеточной формы иммунной защиты.

По-видимому, перечисленные особенности иммунного ответа при генерализованной форме, вызванной тремя разными серотипами иерсиний, определяются неоднозначной реакцией иммунной системы на диссеминацию во внутренние органы и ткани иерсиний с различными вирулентными свойствами.

Особенности иммунного ответа при затяжном и рецидивирующем течении ИИ.

Одной из основных задач исследования было выявление причин развития затяжных и рецидивирующих форм ИИ и поиск для них прогностических критериев в острую фазу болезни.

Иммунопатогенетические факторы при затяжном течении ИИ.

Для того, чтобы выявить факторы иммунопатогенеза затяжного течения ИИ, мы сравнили данные иммунного статуса в аналогичные сроки от начала болезни (2-ая неделя) у детей с гладким течением острой ИИ (фаза реконвалесценции) и детей с затяжным течением ИИ.

При формировании затяжного течения ИИ у детей имелись значимые изменения во всех звеньях иммунного ответа (табл.3). По-видимому, ключевым фактором иммунного дисбаланса явилось нарушение активации Т-лимфоцигов. Следствием нарушения активации Т-клеток, вероятно, и была супрессия в виде снижения ответа на ФГА, низкого уровня IFN-y, значительно сниженного по сравнению с «нормой» пула CD8+ Т-клеток и недостаточности

Таблица 3,

Сравнительная характеристика иммунологических параметров при остром и затяжном течении иерсиниозной инфекции

(2-я неделя от начала болезни).

течение СОЗ % СЭ4 % СБ8 % С016 % СБ20 % СВ2 5 % СВ95 % Т№-а пг/мл пг/мл И-4 пг/мл 11.-6 пг/мл 1Ь-2А ФГА- РБТЛ % кЕ/л Титр АТ

1. Острое течение ПСТп=11 50,1 ±1,9 41,2 ±0,9 21,2 ±0,8 15,0 ±0,5 34,8 ±0,7 * 28,5 ±1,1 * 33,4 ±0,9 * 249±14 * 312±25 * 109±17 54±7 0,94 ±0,08 72,5 ±2,5 90±24 2,52 ±0,05

2.3атяжное течение пет п=3 50,0 ±1,5 40,5 ±1,2 14,1 ±1,2 * #* 14,1 ±0,4 35,9 ±1,3 * 24,5 ±1,2 * ** 28,4 ±0,4 428±34 112±28 ** 158±27 175±19 ♦ ** 0,98 ±0,14 58,7 ±1,2 * ** 547±59 1,24 ±,06 **

1. Острое течение КИ09 п=15 54,7 ±2,1 45,2 ±1,4 21,5 ±1,4 15,4 ±1,4 29,8 ±1,4 * 28,6 ±1,3 * 35,2 ±1,2 * 185±28 112±19 92±25 79±19 1,19 ±0,06 70,5 ±1,8 147±16 2,16 ±0,06

2. Затяжное течение КИ09 п=3 51,1 ±1,5 41,7 ±0,9 15,8 ±1,0 15,9 ±0,7 29,5 ±1,1 * 23,1 ±1,3 ** 25,7 ±1,4 »* 294±28 * ** 89±23 114±24 112±31 1,05 ±0,15 62,1 ±2,5 * ** 317±27 1,78 ±0,07 **

1. Острое течение КИОЗ п=5 56,2 ±1,8 42,8 ±2,0 22,1 ±1,5 15,9 ±0,8 27,9 ±1,8 * 25,2 ±1,5 * 31,2 ±1,8 * 118±38 79±32 135±28 121±20 1,08 ±0,09 81,2 ±2,0 189±38 2,32 ±0,05

2. Затяжное течение КИОЗ п=3 46,2 ±1,5 * ** 38,2 ±1,4 * 14,5 ±1,1 * ** 11,3 ±0,9 42,5 ±1,9_ 19,5 ±1,6 ** 21,5 ±1,3 415±37 * ** 52±19 149±31 167±24 * 0,65 ±0,12 #* 57,2 ±1,4 412±38 * ** 1,70 ±0,10 **

Здоровые дети п=10 57,5 ±3,0 45,5 ±1,9 21,2 ±1,8 15,5 ±1,8 23,5 ±2,5 18,8 ±1,8 22,2 ±1,6 124±33 92±24 67±28 59±27 0,66 ±0,20 75,0 ±2,2 100±32 Н/д

*-отличие от нормы у здоровых детей достоверно при р по крайней мере <0,05 **-отличие от уровня у детей с острым течением достоверно при р по крайней мере <0,05

л-в супернатанте 72-часовых культур цельной крови с добавлением ФГА (10 мкг/мл), в единицах оптической плотности

антителообразования, при высоком содержании в крови общего IgE (см.табл. 3).

Значимым общим фактором патогенеза затяжного течения иерсиниозов, по-видимому, можно считать слабый антительный ответ. Он и послужил причиной пролонгированной внеклеточной персистенции иерсиний и индукции факторами их патогенности провоспалительного монокина TNF-a.

У детей с затяжным течением КИ 03 по сравнению с затяжным течением ПСТ и КИ 09 мы наблюдали особенно ярко выраженную супрессию клеточного звена защиты: более низкое число CD3+, CD4+ Т-лимфоцитов, ЕК (CD 16) при выраженной мобилизации В-лимфоцитов, «нормальное» содержание активированных CD25+ и CD95+ лимфоцитов, сниженный ответ Т-лимфоцитов на ФГА; самый низкий уровень IFN-y (по средним данным) в крови и синтеза IL-2 в культуре.

Таким образом, прогностическими критериями затяжного характера течения ИИ на 2-й неделе заболевания могут быть следующие показатели: низкие титры специфических AT, не достигающие 2 (в 1/lg), сниженное относительно «нормы» число (%) CD8+ Т-лимфоцитов, "нормальное" содержание в крови активированных лимфоцитов, сниженный ответ Т-лимфоцитов на ФГА, вдвое и более превышающий "норму" уровень TNF-a и повышенные концентрации общего IgE.

Иммунопатогенетические факторы рецидивирующего течения ИИ.

При обследовании в острую фазу болезни детей с рецидивирующим в дальнейшем течением КИ 03 мы выявили у них значительное снижение экспрессии маркеров активации CD25 и CD95 с нарушением баланса «позитивной» и «негативной» активации Т-лимфоцитов (CD25/CD95 ниже "нормы", р<0,05) (табл.4). Иммунный статус детей с рецидивирующим в дальнейшем течением КИ ОЗ в острую фазу болезни характеризовался резкой недостаточностью клеточных механизмов защиты (редукция синтеза IFN-y in vivo и IL-2 in vitro, угнетение пролиферативного ответа Т-лимфоцитов на ФГА, снижение в циркуляции CD8+ Т-лимфоцитов, гиперпродукция общего IgE) (см. табл.4). Неэффективность иммунного ответа способствовала длительной персистенции иерсиний, свидетельством чего явилась индукция повышенного количества провоспалительного монокина TNF-a не только в острую фазу, но и при видимом клиническом "выздоровлении".

Рецидив возникал, как правило, при наличии достаточно высокого титра антител к антигенам соответствующего возбудителя. Следовательно, интенсив-

Таблица 4.

Иммунологические показатели при остром и рецидивирующем течении кишечного иерсиниоза.

Течение СБ8 % сто % С025 % СБ95 % СБ25/ С095 ФГА- РБТЛ % 1Ь-2А ТЫР-а пг/мл 1Ш-у пг/мл 18Е Ке/л Титр АТ

Гладкое 1-е обсл. п=16 22,1±1,4 24,2±3,1 30,0±2,0 * 43,0±3,9 * 0,70±0,05 67,9±1,8 1,30±0,16 108±46 110±26 152±41 2,16± 0,2

Рецидив. 1-е обсл. п=6 16,5±1,б * ** 35,1±3,3 * ** 16,1±1,4 ** 29,0±2,1 * ** 0,55±0,03 * ** 56,2±1,9 * #* 0,54±0,18 ** 343±66 * ** 16±5 # ** 960±24 * ** 0,84:1: 0,3**

Гладкое 2-е обсл. п=16 23,0±1,9 23,3±2,4 25,0±2,0 40,0±2,2 0,63±0,04 69,3±1,8 0,83±0,15 92±36 115±32 81 ±34 2,24* о,1

Рецидив. 2-е обсл. п=6 16,3 ±2,1 * 33,2±2,3 * ** 15,0±1,4 ** 28,1±1,7 * ** 0,54±0,03 * ** 60,1±1,8 * ** 0,41 ±0,24 292±72 * ** 30±6 * ** 930±36 * ** 1,71* 0,3

Здоровые 21,2±1,8 23,5±2,5 18,8±1,8 22,2±1,6 0,85±0,4 75,0±2,2 0,66±0,20 124±33 92± 24 100±32 Н/д

Л-в супернатанте 72-часовых культур цельной крови с добавлением ФГА (10 мкг/мл), в единицах оптической плотности

*-отмечено достоверное отличие от показателя у здоровых детей при р по крайней мере <0,05

**- отмечено достоверное отличие от показателя у детей с гладким течением при р по крайней мере <0,05

ное антителообразование не могло предотвратить развитие рецидива иерсини-озной инфекции. По-видимому, основой рецидива ИИ послужил сохранившийся внутриклеточный пул иерсиний, который сам по себе был следствием недостаточной эффективности раннего иммунного ответа.

Отличительными особенностями иммунного реагирования детей с УЭ (узловатой эритемой) при ПСТ (затяжное течение) была системная гиперпродукция цитокинов: TNF-a, IFN-y, IL-4 и IL-6, причем уровень основного медиатора клеточной защиты IFN-y превышал "контрольный" более чем в 10 раз. Одновременно у детей с УЭ обнаруживали высокие титры антител (2,87+0,09 vs 1,24±0,06 у детей с затяжным течением ПСТ без УЭ, р<0,0001). Примечательной особенностью детей с УЭ была недостаточность в крови CD95+ лимфоцитов: 17,2+1,5% vs 22,2±1,6% в «норме», р<0,05 и vs 28,4+0,4% у детей с затяжным течением ПСТ без синдрома УЭ, р<0,001. Коэффициент CD25/CD95 у них превышал «контрольные» значения (1,21±0,06 vs 0,85±0,07, р<0,05).

Можно предположить, что дети с УЭ представляют собой группу наиболее чувствительных к возбудителю ПСТ детей, отвечающих при распространении иерсиний чрезмерной активацией продуцентов как провоспалительных, так и антивоспалительных цитокинов (TNF-a, IFN-y, IL-4, IL-6) выраженной продукцией поликлональных Ig четырех классов, особенно IgE (1257+58 кЕ/л vs 547±59 кЕ/л при затяжном течении ПСТ без синдрома УЭ, р<0,001), значительным накоплением ЦИК (0,362±0,036 vs 0,112±0,06, р<0,01). Возможно, одним из проявлений гиперреактивности явилось нарушение активационного апоптоза в ходе иммунного ответа. Защита от апоптоза эффекторов иммунного воспаления, в частности, продуцентов IFN-y CD8+ Т-лимфоцитов, число которых у детей с УЭ было значительно повышенным, а также поликлонально активированных В-лимфоцитов могла привести к развитию синдрома УЭ.

Проведенное нами исследование подтверждает важную роль баланса между активацией иммунокомпетентных клеток и их апоптозом в определении характера течения ИИ. Длительная мобилизация CD25+ и CD95+ лимфоцитов сопутствует острому течению ИИ, недостаточная экспрессия маркеров активации - затяжному или рецидивирующему. При этом повышенная готовность лимфоцитов к гибели in vitro через апоптоз, вероятно, отражает защитный механизм предотвращения избыточной экспансии активированных лимфоцитов, что особенно важно при генерализованных формах ИИ. В орга-

низме больных апоптоз может осуществляться через Fas-FasL взаимодейст: или происходить под влиянием TNF-a.

В заключение подчеркнем важность разностороннего иммунологическ обследования больных, дающего возможность отбора наиболее клиниче» информативных показателей при ИИ, вызванной иерсиниями с разными ви лентными свойствами.

По представленным данным, высоко информативны такие показате как число (%) CD25+ и CD95-I- лимфоцитов, а также коэффициент CD25/CD что согласуется с выводами авторов, применявших ранее эти показатели i аллергических заболеваниях у детей (Феденко Е.С., 2000).

Тесно связаны с особенностями клинических проявлений ] характеристики системного цитокинового ответа (уровни TNF-a, IFN-y и IL-крови), а также содержание в крови общего IgE.

Выводы.

1. Максимальное число затяжных и рецидивирующих форм наблюдается у тей с кишечным иерсиниозом, вызванным Y.enterocolitica ОЗ. Затяжное рецидивирующее течение заболевания возникает у детей, переносящих к< бинированные формы иерсиниозной инфекции, преимущественно с пора: нием печени или абдоминальным синдромом, в среднетяжелой и тяже; форме.

2. Иммунологическими критериями нарастания генерализаг псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, вызванного Y.enterocolitica ( являются: снижение в составе циркулирующего пула лимфоцитов числа клеток фенотипа CD3+, CD4+, повышение доли CD8+ Т-клеток, CD 16+ 1 CD2(H- B-клеток, CD95+ лимфоцитов, снижение коэффициента CD25/CD увеличение спонтанного апоптоза лимфоцитов in vitro, гиперпродую цитокинов TNF-a, IFN-y и EL-4, угнетение ответа Т-лимфоцигов на ФГА, носительно низкая (на уровне значений у здоровых детей) способность клеток к синтезу IL-2 in vitro, повышенное содержание в крови общего IgE

3. Маркерами затяжного течения иерсиниозной инфекции на 2-й нед заболевания являются: недостаточное число (%) активированных CD25-CD95+ клеток среди лимфоцитов, низкие титры противоиерсиниозн антител, сниженная пролиферативная активность Т-клеток, высо! сывороточный уровень TNF-a и значительно повышенное содержали« крови общего IgE. Рецидив иерсиниозной инфекции возникает при нал№

достаточно высокого титра антител к антигенам возбудителя. В основе рецидивирующего течения кишечного иерсиниоза, вызванного Y.enterocolitica 03, лежит нарушение процессов активации лимфоцитов и недостаточность клеточных механизмов защиты (редукция синтеза IFN-y in vivo и IL-2 in vitro, угнетение пролиферативного ответа Т-лимфоцитов на ФГА, снижение доли CD8+ Т-клеток среди лимфоцитов, гиперпродукция общего IgE).

4. Моноформы иерсиниозной инфекции, вызванные разными серотипами патогенных иерсиний, имеют не только различные клинические проявления, но и иммунологические особенности, свидетельствующие о различиях иммунного ответа на внедрение иерсиний с разными вирулентными свойствами.

5. Больные с узловатой эритемой (и при затяжном, и при рецидивирующем течений псевдотуберкулеза) формируют своеобразный иммунный ответ, характеризующийся чрезмерной активацией продукции как провоспалительных, так и антивоспалительных цитокинов, поликлональных иммуноглобулинов четырех классов, значительным накоплением ЦИК.

Практические рекомендации:

1. Критериями нарастания генерализации псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, вызванного Y. enterocolitica 09, при обследовании в первую неделю заболевания могут быть нарушения субпопуляционного состава циркулирующего пула лимфоцитов, снижение коэффициента CD25/CD95 относительно «нормы», угнетение ответа Т-лимфоцитов на ФГА, гиперпродукция in vivo цигокинов TNF-a, IFN-y и IL-4, значительно повышенное содержание в крови общего IgE (>200 кЕ/л).

2. Критериями генерализации кишечного иерсиниоза, вызванного Y. enterocolitica 03, при обследовании в первую неделю заболевания могут служить следующие изменения показателей иммунного статуса в сравнении с их величиной при гепатите: нарастание числа (%) CD8+ Т-лимфоцитов, увеличение числа активированных CD25+ и CD95+ лимфоцитов, усиление ответа Т-лимфоцитов, стимулированных ФГА, продукцией IL-2 in vitro и пролиферацией, повышение сывороточного уровня TNF-a, IL-4 и IL-6 (выше «нормального»), сниженное в сравнении с «нормой» содержание в крови IgG и, наоборот, повышенное - общего IgE, а также нарастание титра противоиер-синиозных антител выше 2 (1/lg).

3. Прогностическими критериями затяжного характера течения иерсиниозной инфекции при обследовании на второй неделе заболевания могут служить:

низкие титры специфических антител, не достигающие 2 (в 1/lg), снижен! относительно «нормы» число (%) CD8+ Т-клеток, относительно низкое < держание в крови активированных CD25+ и CD95+ лимфоцитов, сниженн ответ Т-лимфоцитов на ФГА, вдвое и более превышающий «норму» уров( TNF-a в крови, повышенное содержание в сыворотке крови общего 1 (>200-300 кЕ/л).

4. Прогностическими критериями рецидивирующего характера течения i шечного иерсиниоза, вызванного Y. enterocolitica 03, при обследовании первой неделе болезни являются: резко сниженный (ниже «нормальной уровень в крови IFN-y, сниженный ответ Т-лимфоцитов на ФГА, снижени циркуляции числа CD8+ Т-лимфоцитов при повышенном числе CD20+ лимфоцитов, «нормальное» количество активированных CD25+ лимфоци-и сниженный относительно «нормы» коэффициент CD25/CD95, гиперп дукция (>900 кЕ/л) общего IgE.

5. Синдром узловатой эритемы при псевдотуберкулезе возникает у дете! измененной реактивностью, характеризующейся гиперпродукцией общ IgE, чрезмерным цитокиновым ответом, поликлональной активацией лимфоцитов, высоким уровнем антителообразования, нарушением бала активации и апоптоза иммунокомпетентных клеток.

6. Рекомендуется длительное диспансерное наблюдение с периодическим ] мунологическим обследованием детей, перенесших псевдотуберкулез с f витаем узловатой эритемы.

Выражаю глубокую благодарность профессору Н.М. Калининой, км.н. Н.И.Давыдовой (Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины МЧС России) и МЛЛавленко (Институт цитологии РАН) за методическую и консультативную помощь.

Особую благодарность выражаю к.м.н. М.КБехтеревой (НИЩИ) за неоценимую помощь в разборе сложных клинических случаев.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертаиии:

1. Особенности иерсиниозной инфекции на современном этапе // «Актуальные вопросы детской инфектологии» - сборник трудов XXII НПК НИИДИ-СП6.-2000 - с. 41-48. (в соавт. Бехтерева М.К., Тихомирова ОБ., Железни-кова Г.Ф., Кветная A.C., Волкова М.О. и др.)

2. Иерсиниозная инфекция у детей: клиника, иммуногенез, терапия // «Новые технологии в терапии и профилактике инфекционных заболеваний у детей»

- сборник трудов Всероссийской НПК.- СПб, 2000,- с. 59. (в соавт. Тихомирова О.В., Бехтерева М.К., Железникова Г.Ф. и др.).

3. Клинико-патогенетические аспекты иерсиниозной инфекции у детей // «Инфекции, обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез) и другие актуальные инфекции» - мат. конф. с международным участием.- СПб, 2000.

- с. 22-23. (в соавт. Иванова В.В., Тихомирова О.В., Бехтерева М.К., Железникова Г.Ф., Кветная A.C.).

4. Иммунологические критерии затяжного течения иерсиниозной инфекции у детей // Медицинская иммунология.- 2001. - т.З, № 2. - с.215. (в соавт. Железникова Г.Ф., Иванова В.В., Монахова Н.Е., Павленко М.П., Попова H.A., Бехтерева М.К., Кветная A.C., Железова Л.И.).

5. Иммунный ответ при остром псевдотуберкулезе у детей // Медицинская иммунология,- 2002,- т.4. - №1. - с. (в соавт. Железникова Г.Ф., Иванова В.В., Монахова Н.Е., Попова H.A., Павленко М.А., Железова Л.И., Бехтерева М.К., Тихомирова О.В.)

Актуальность. В настоящее время проблема иерсиниозной инфекции сохраняет свою актуальность, несмотря на достигнутые успехи в изучении многих ее аспектов (90. 96, 97).

Многообразие клинических проявлений, отсутствие патогномоничных симптомов, редкость моносиндромных вариантов определяют трудности распознавания иерсиниозной инфекции и значительную частоту диагностических ошибок. В основе клинического полиморфизма инфекции лежат как вариации вирулентности отдельных штаммов (48), так и генетически обусловленные особенности иммунного ответа на различные антигены возбудителя (39).

Иерсиниозная инфекция характеризуется циклическим течением, которое можег нарушаться развитием затяжного течения и рецидивов, что определяется биологическими свойствами возбудителя, обладающего антифагоцитарной устойчивостью, а также особенностями иммунной реактивности организма (8, 26). В ряде источников сообщается, в частности, что рецидивирующее течение псевдотуберкулеза ассоциировано с низким антительным ответом к иммунодоминантном> белку (26 kD) наружной клеточной мембраны Y. pseudotuberculosis (48). Особенно часто (в 34% случаев) обострения псевдо туберкулеза регистрируются у детей раннего возраста. Частота рецидивов при псевдотуберкулезе колеблется от 10 до 53°о. в разные годы частота рецидивов неодинакова (9).

Доказана роль иерсиний в формировании хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта (8. 9. 15). Иерсиниозная инфекция может быть триггером развития иммунопатологических процессов (гемолитическая анемия, тромбоцитопения. тиреоидит, гломерулонефрит, поражения сердца и суставов). В связи с >тим следует дифференцировать иммунопатологию при хронических иерсинио ia\ и первичные коллагенозы и другие иммунопатологические заболевания, на фоне которых иерсиниозы принимают затяжное течение (1, 96).

Иммунный ответ осуществляется при гесном взаимодействии клеточного и гуморального звеньев. взаимодействие которых направлено на элиминацию патогена и восстановление иммунного гомеостаза (33. 35. 91. 83. 100) особенностями возбудителя, обусловливает клинические проявления болезни, ее течение и исход (83. 91). Иммунокомпетентные клетки посредством выработки различных факторов защиты и иммунорегуляции (цитокинов, иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента), определяют скорость и эффективность иммунного ответа на патоген (86).

Несмотря на общепризнанную роль цитокинов в регуляции антигенспецифической иммунной защиты и индукции реакций воспаления в инфицированных тканях и органах (83). цигокиновый профиль ответа у детей, больных иерсиниозной инфекцией, не изучался. Остается также неясной роль индуцированною иерсиниями апопгоза (программированной клеточной (ибели) (119. 155) в паютенезе иерсиниошой инфекции. Выявление роли апопгоза в иммутп.ом ответе при иерсиниозной инфекции должно способе 1вова1Ь совершенствованию патогенетической терапии детей с иерсинио зами.

Многообразие клинических проявлений иерсиниозной инфекции, недостаточная изученность мно!Их звеньев патогенеза как острой инфекции. Iак и ее затяжною и рецидивирующего течения. отсутствие информативных 1есюв. позволяющих про1 нозирова!ь затяжное и рецидивирующее течение иерсиниозной инфекции, делает актуальным ее подробное клинико-иммчнолот ическое исследование на современном лапе.

Цель исследования, изучить клинические особенности иерсиниозной инфекции у детей и разработать систему иммунологических критериев тяжести, а также развития затяжного и рецидивирующего гечения инфекции.

Задачи исследования. 1 .Дать характеристику клинических форм иерсиниозной инфекции у детей.

2.Определить уровень жспрессии поверхностных маркеров Г- и В-лимфоцитов (CD3. 4. 8, 16. 20. 25. 95) в динамике болезни у детей с различными клиническими формами иерсиниозной инфекции.

3.Оценить уровень спонтанною апопгоза мононуклеарных клеток крови у детей с иерсиниозной инфекцией в динамике болезни.

4. Определить уровень про- и противовоспалительных цитокинов (TNF-a. IFN-у. IL-6. IL-!) в сыворотке крови и IL-2 in vitro у детей с иерсиниозной инфекцией в динамике болезни

5.Оценить состояние клеточного и гуморального иммунитета больных по величине пролиферагивного ответа Т-лимфоцитов на ФГА (ФГА-РБТЛ) и уровню продукции IgM. Ig/V Ig(i и Igh. Сравни ib уровень синтеза прогивоиерсиниозных антител при разных формах и течении иерсиниозной инфекции.

Иа\чная новизна исследования .

При псевдо туберкулезе и кишечном иерсиниозе выделены и охарактеризованы клинические формы болезни, отражающие нарастание I енерали шции процесса.

Впервые произведено сравнение иммунною ответа детей с разными клиническими формами иерсиниозной инфекции по фенотипическому составу лимфоцитов крови, соотношению числа клеток с маркерами «позитивной» (CD25) и «нетивной » (С1)95) (Ковальчук Л.В .Чередеев Д.[1.1998) активации лимфоцитов, уровню в крови цитокинов TNF-a. IFT^-y. IL-4 и IL-6, IgA. ivt. G и К. ЦИК. тифу противоиерсинио>.ных антител. Выявлены прогностические критерии нарастания генерализации иерсиниозной инфекции.

Впервые показана повышенная готовность лимфоцитов больных с иерсиниозной инфекцией к спонтанному апоптозу in vitro, в прямой швисимости от тяжести процесса.

Произведено сравнение иммунного статуса больных с моноформами, комбинированными и генерализованными формами иерсиниозной инфекции. вызванной разными видами иерсиний (Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis) и сероварами Y. enterocolitica 03 и 09. Выявлены отличительные особенности иммунного реагирования детей со скарлатиноподобной формой псевдотуберкулеза и гепатита, вызванного Y. enterocolitica ОЗ. а также некоторые различия модуляции иммунного ответа при нарастании генерализации псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза. вызванного Y. enterocolitica сероариантов ОЗ и ()9.

Впервые выявлены конкретные иммунопатогенетические механизмы развития затяжного и рецидивирующего течения иерсиниозной инфекции у детей.

Охарактеризован особый иммунный статус детей с узловатой >ритемой. Практическая значимость работы состоит в том. что разработана система иммунологических критериев нарастания генерализации иерсиниозной инфекции \ детей, показана значимость иммунологического обследования для прогноза развития ее затяжною и рецидивирующею течения, предложены алгоритмы прогноза негладкою течения иерсиниозной инфекции: на основании по.тученных сведений даны рекомендации для дальнейшего диспансерного наблюдения детей, перенесших иерсиниозную инфекцию, у которых в процессе заболевания ра звилась узловатая »ригема.

Апробация работы Основные положения диссертации доложены:

- на XXIII итоговой научно-практической конференции НИИДИ (2001 год):

- па международной конференции ((Инфекции, обусловленные иерсиниями (иерсиниоз. псевдогуберк\лез), и другие актуальные инфекции» (Санкт-Петербург. 2000 год):

- на V научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербург е-2001».

- на всероссийской научно-практической конференции (НИИДИ, 2001 год). Публикации: по теме диссертации опубликовано 7 работ, из них в центральных изданиях-2.

Реализация результатов: в совгорстве подготовлено учебное пособие для врачей «Новые технологии в диагностике, терапии и тактике этапного наблюдения иерсиниозной инфекции у детей» (2001). Получена приоритетная справка на изобретение «Способ прогнозирования развития затяжных форм иерсиниозной инфекции у детей» от 2.07.2001 № 2001117021. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Максимальное число затяжных и рецидивирующих форм наблюдается у детей с кишечным иерсиниозом. вызванные Y.enterocolitica ОЗ . Затяжное и рецидивирующее течение заболевания возникает у детей, переносящих комбинированные формы иерсиниозной инфекции, преимущественно с поражением печени или абдоминальным синдромом, в среднетяжелой и тяжелой форме.

2 Имм\ноло1 ическими критериями генерализации псевдо туберкулеза и кишечною иерсиниоза. вызванного Y.enterocolitica 09. являются следущие параметры: снижение в cociaee циркулирующего пула лимфоцитов числа Т-клеток фенотипа CI)3 . CD4-. CD25 . повышение доли С1)8*. СГ)16ч С 1)20 . CW5 лимфоцитов, усиление спотанного апопгоза лимфоцитов in \itro. Iиперпродукция циюкинов с выбросом в кровь больших количеств l'Nl'-а. IFN-y и П.-4. относительно низкая (на уровне шачений у здоровых дегей) способность Т-клеток к синтезу II.-2 in vitro, значительная активация сип теш ooiuei о IgK. H основе имм\Honaioiенеза штяжното или рецидивирующего течения иерсиниозной инфекции лежит нарушение баланса «позитивной» активации Г-лимфоцитов и активационною апоптоза клеток, участвующих в иммунном ответе. Общими критериями затяжного течения иерсиниозов можно считать недостаточную активацию 1-лимфоцитов, связанный с утим слабый ангительный ответ, сниженную пролиферативную активность Т-клеток. высокую системную продукцию TNF-a и значительную активацию синтеза IgE. Критерием рецидивирующего течения иерсиниозной инфекции является недостаточность клеточных механизмов защиты (редакция синтеза IFN-y in vivo и IL-2 in vitro. угнетение пролиферативного ответа Т-лимфоцитов на ФГА, снижение в циркуляции CD8 + Г-лимфоцитов). Рецидив иерсиниозной инфекции возникал при наличии достаточно высокою титра антител к антигенам соответствующего возбудителя.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 197 страницах, состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 43 таблицами. 8 рисунками, указатель литературы содержит 102 отечественных и 93 зарубежных источников.

Выводы.

1. Максимальное число затяжных и рецидивирующих форм наблюдается у детей с кишечным иереи ниозом. вызванным Y.enterocolitica ОЗ. Затяжное и рецидивирующее течение заболевания возникает у детей, переносящих комбинированные формы иерсиниозной инфекции, преимущественно с поражением печени или абдоминальным синдромом, в среднетяжелой и тяжелой форме.

2. Иммунологическими критериями нарастания генерализации псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, вызванного Y.enterocolitica 09, являются: снижение в составе циркулирующего пула лимфоцитов числа Т-клеток фенотипа CD3+, CD4+, повышение доли CD8+ Т-клеток, CD16+ ЕК, CD20+ В-клеток, CD95+ лимфоцитов, снижение коэффициента CD25/CD95, увеличение спонтанного апоптоза лимфоцитов in vitro, гиперпродукция цитокинов TNF-чх, IFN-y и IL-4, угнетение ответа Т-лимфоцитов на ФГА, относительно низкая (на уровне значений у здоровых детей) способность Т-клеток к синтезу IL-2 in vitro, повышенное содержание в крови общего IgE.

3. Маркерами затяжного течения иерсиниозной инфекции на 2-й неделе заболевания являются, недостаточное число (°о) активированных CD25+ и CD95+ клеток среди лимфоцитов, низкие титры противоиерсиниозных антител, сниженная пролиферативная активность Т-клеток, высокий сывороточный уровень TNF-a и значительно повышенное содержание в крови общего IgE. Рецидив иерсиниозной инфекции возникает при наличии достаточно высокого титра антител к антигенам возбудителя. В основе рецидивирующего течения кишечного иерсиниоза, вызванного Y.enterocolitica ОЗ, лежит нарушение процессов активации лимфоцитов и недостаточность клеточных механизмов защиты (редукция синтеза IFN-y in vivo и IL-2 in vitro, угнетение пролиферативного ответа Т-лимфоцитов на ФГА. снижение доли СЭ8+ Т-клеток среди лимфоцитов, гиперпродукция общего

4. Моноформы иерсиниозной инфекции, вызванные разными серотипами патогенных иерсиний, имеют не только различные клинические проявления, но и иммунологические особенности, свидетельствующие о различиях иммунного ответа на внедрение иерсиний с разными вирулентными свойствами.

5. Больные с узловатой эритемой (и при затяжном, и при рецидивирующем течении псевдотуберкулеза) формируют своеобразный иммунный ответ, характеризующийся чрезмерной активацией продукции как провоспалительных. так и антивоспалительных цитокинов. поликлональных

• иммуноглобулинов четырех классов, значительным накоплением ЦИК.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Критериями нарастания генерализации псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, вызванного Y. enterocolitica 09, при обследовании в первую неделю заболевания могут быть нарушения субпопуляционного состава циркулирующего пула лимфоцитов, снижение коэффициента CD25/CD95 относительно «нормы», угнетение ответа Т-лимфоцитов на ФГА, гиперпродукция in vivo цитокинов TNF-a, IFN-y и IL-4, значительно повышенное содержание в крови общего IgE (>200 кЕ/л).

2. Критериями генерализации кишечного иерсиниоза, вызванного Y. enterocolitica 03, при обследовании в первую неделю заболевания могут служить следующие изменения показателей иммунного статуса в сравнении с их величиной при гепатите: нарастание числа (%) CD8+ Т-лимфоцитов, увеличение числа активированных CD25+ и CD95+ лимфоцитов, усиление ответа Т-лимфоцитов, стимулированных ФГА, продукцией IL-2 in vitro и пролиферацией, повышение сывороточного уровня TNF-a, IL-4 и IL-6 (выше «нормального»), сниженное в сравнении с «нормой» содержание в крови IgG и, наоборот, повышенное -общего IgE. а также нарастание титра противоиерсиниозных антител выше 2

I lg).

3. Прогностическими критериями затяжного характера течения иерсиниоэной инфекции при обследовании на второй неделе заболевания могут служить: низкие титры специфических антител, не достигающие 2 (в I/lg), сниженное относительно «нормы» число (%) CD8+ Т-клеток, относительно низкое содержание в крови активированных CD25+ и CD95+ лимфоцитов, сниженный ответ Т-лимфоцитов на ФГА, вдвое и более превышающий «норму» уровень TNF-a в крови, повышенное содержание в сыворотке крови общего IgE (>200-300 кЕ/л).

4. Прогностическими критериями рецидивирующего харг\лтера течения кишечного иерсиниоза. вызванного У. ет^егосоНПса 03. при обследовании на первой неделе болезни являются: резко сниженный (ниже «нормального») уровень в крови 1ГЫ-у. сниженный ответ Т-лимфоцитов на ФГА, снижение в циркуляции числа СЭ8+ Т-лимфоцитов при повышенном числе 0)20 ^ В-лимфоцитов. «нормальное» количество активированных С 1)25 * лимфоцитов и сниженный относительно «нормы» коэффициент С025С095, гиперпродукция ( -900 кЕ/л) общего 1дЕ.

5. Синдром узловатой эритемы при псевдотуберкулезе возникает у детей с измененной реактивностью, характеризующейся гиперпродукцией общего ^Е, чрезмерным цитокиновым ответом, поликлональной активацией В-лимфоцитов, высоким уровнем антителообразования, нарушением баланса активации и апоптоза иммунокомпетентных клеток.

6. Рекомендуется длительное диспансерное наблюдение с периодическим иммунологическим обследованием детей, перенесших псевдотуберкулез с развитием узловатой эритемы.