Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Разработка системы оценки иммунотропной активности бета-лактамных антибиотиков по показателю апоптоза клеток лимфоидного ряда in vitro с использованием метода проточной цитофлуориметрии

На правах рукописи

РГБ ОД 1 8 ФЕе 20.12

РЕШЕТНИКОВ СТАНИСЛАВ ИГОРЕВИЧ

РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ОЦЕНКИ ИММУНОТРОПНОИ АКТИВНОСТИ БЕТА-ЛАКТАМНЫХ АНТИБИОТИКОВ ПО ПОКАЗАТЕЛЮ АПОПТОЗА КЛЕТОК ЛИМФОИДНОГО РЯДА IN VITRO С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛУОРИМЕТРИИ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Купавна 2001

Работа выполнена в Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова

Научные руководители: Заведующий кафедрой фармакологии фармацевтического факультета ММА имени И.М. Сеченова, доктор медицинских наук, профессор Р.Н. Аляутдин

Старший научный сотрудник НИИ детской гематологии

МЗ РФ, кандидат медицинских наук H.A. Щигленко Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Т.И. Муравьева

доктор медицинских наук, профессор B.JI. Ковалева

ор

Ведущая организация: Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия

Защита диссертации состоится «29» января 2002 г. в 10 часов 30 минут не заседании диссертационного совета № Д 217.004.01 во Всероссийском научном центре по безопасности биологически активных веществ по адресу: 142450, Московская область, поселок Старая Купавна, улица Кирова, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научного центра по безопасности биологически активных веществ.

Автореферат разослан « » декабря 2001 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Л.В. Корольченко

1. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Инфекционные процессы, развивающиеся на фоне иммунодефицита, тречаются в медицинской практике довольно часто. Исходя из этого, помимо ¡тотропной или патогенетической терапии, направленной на лечение основного эолевания, необходимым является назначение многоплановой сопроводительной рапии, к которой относится, в том числе, антибактериальная терапия, «меняемая с целью профилактики и лечения инфекционных осложнений. Однако практика показывает, что широкое применение антибактериальных едств приводит к развитию нежелательных побочных явлений, одним из которых ляется собственное влияние антибиотиков на состояние иммунной системы, 'льшинство исследователей приходит к выводу о неоднозначности действия тибиотиков различных групп на иммунокомпетентные клетки. Таким образом, изучение влияния антибиотиков на показатели иммунного атуса является особенно актуальным, поскольку эти средства часто назначаются фоне уже имеющегося иммунодефицита. С другой стороны, проведение добных исследований также целесообразно для обоснованного выбора тибактериального средства с наиболее подходящими иммуномодулирующими ойствами с учетом иммунного статуса, а также принимая во внимание прочие карственные назначения в конкретном клиническом случае. Как известно, центральную роль в специфическом адаптивном иммунном ответе рают лимфоциты, активно участвующие в процессе поддержания гомеостаза. В >рмальных условиях пролиферация и гибель лимфоцитов обычно взаимно авновешены, вследствие чего сохраняется постоянство клеточного состава, [бель клеток, в свою очередь, может быть реализовано либо путем некроза, либо оптоза. Апоптоз, или программированная клеточная гибель, является реализацией гюженных в геноме клеток суицидальных механизмов, активным и строго нтролируемым процессом самоуничтожения клетки. Апоптоз играет ключевую ль в нормальном обновлении тканей и, в том числе, несет ответственность за екращение иммунных реакций, опосредуемых лимфоцитами. Различные вические и химические агенты, включая лекарственные вещества различных [рмакологических групп, могут индуцировать или, напротив, отменять процесс оптоза клеток лимфоидного ряда, причем апоптотропное действие может быть ализовано в отношении как зрелого лимфоцита, так и предшественников. Таким образом, широкое применение антибактериальных средства, а также >огресс в области создания и внедрения новых лекарственных субстанций с >добным действием требует разработки методических систем, позволяющих ;енить различные аспекты иммунотропного потенциала антибиотика как на этапе клинической оценки, так в клинической практике в условиях in vitro.

С учетом вышеизложенного, разработка системы биологической оценки бе-лактамных антибиотиков по показателю апоптоза клеток лимфоидного ряда весь актуальна в качестве одного из обязательных параметров безопасности ЛВ.

Разработка подобной системы оценки бета-лактамных антибиотик соответствуют содержанию проекта федеральной программы по созданию применению комплекса стандартных биотест-систем для научно-исследовательск целей и контроля качества медицинских препаратов. Программа базируется основных положениях Закона Российской Федерации «О сертификации продукц и услуг» (№ 5151-1 от 10 июня 1993 года) и направлена на гарантирован!: обеспечение биологической безопасности населения. Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилась разработка системы оценки иммунотропи активности бета-лактамных антибиотиков по показателю апоптоза клет лимфоидного ряда человека in vitro в обычных условиях и услов* индуцированной иммунодепрессии.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выбрать биологические модели, позволяющие изучить и оценить влияние бе лактамных антибиотиков на апоптоз клеток лимфоидного ряда человека in vitre

2. Выбрать метод для количественного анализа апоптоза клеток лимфоидного р; человека in vitro и разработать оптимальные условия количественного анализ помощью выбранного метода.

3. Определить количественные показатели и дозозависимость апоптоза моде! клеток лимфоидного ряда человека in vitro под влиянием бета-лактамн антибиотиков в норме и условиях индуцированной иммунодепрессии.

4. Провести сравнительный анализ модулирующего влияния исследуемых бе лактамных антибиотиков на апоптоз моделей клеток лимфоидного ряда нормальных условиях и условиях индуцированной иммунодепрессии.

5. Разработать алгоритм системы биологической оценки бета-лактамн антибиотиков по показателю апоптоза на моделях клеток лимфоидного pj человека in vitro.

Научная новизна проведенных исследований.

1. Впервые предложен алгоритм системы биологической оценки бета-лактамн антибиотиков по показателю «апоптоз» на моделях клеток лимфоидного ряда vitro методом проточной цитофлуориметрии.

2. Впервые изучено влияние различных концентраций бета-лактамн антибиотиков на апоптоз клеток лимфоидного ряда человека in vitro мето; проточной цитофлуориметрии в обычных условиях.

3. Впервые изучено влияние различных концентраций бета-лактамн антибиотиков на апоптоз клеток лимфоидного ряда in vitro методом проточь цитофлуориметрии в условиях дексаметазон-индуцированной иммунодепресси

4. Впервые проведен сравнительный анализ апоптотропного дейст] исследованных бета-лактамных антибиотиков на моделях клеток лимфоид» ряда.

Практическая значимость.

Предложенная система биологической оценки на модели апоптоза клеток (мфоидного ряда человека in vitro методом проточной цитофлуориметрии может ;ужить основой для изучения апоптотропного действия как уже применяемых :та-лактамных антибиотиков, так и новых препаратов данной группы, годящихся на стадии доклинических исследований.

Разработанная система может быть использована для обоснованного выбора :та-лактамного антибиотика с учетом состояния лимфоцитов и их ранних эедшественников в конкретном клиническом случае.

С помощью предложенной системы биологической оценки возможно оценить и фогнозировать апоптоз клеток лимфоидного ряда человека под воздействием бета-штамных антибиотиков при различных режимах дозирования и с учетом прочих дарственных назначений.

Разработанная система отличается высокой чувствительностью, точностью, эспроизводимостью результатов.

Связь целей и задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры армакологии фармацевтического факультета «Разработка биологической и эонофармакологической оценки положительного и отрицательного влияния JIC, апитков, пищевых добавок на одноклеточные модели и модели экспериментальных ивотных». Номер госрегистрации 01970007165.

Апробация материалов диссертации.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практической энференции кафедры фармакологии и фармацевтической химии армацевтического факультета ММА имени И.М. Сеченова (Москва, 2000); на 2-ой оссийской конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс цинической медицины» (Москва, 2001).

Публикации.

По материалам исследования опубликовано 4 печатные работы.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста и состоит из ведения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, езультатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, абота иллюстрирована 13 рисунками и 20 таблицами. Библиографический казатель включает 152 источника, из них 92 - иностранные. На защиту выносятся:

система биологической оценки иммунотропной активности бета-лактамных нтибиотиков по показателю апоптоза клеток лимфоидного ряда человека in vitro с спользованием метода проточной цитофлуориметрии; научно-методические сновы ее применения.

2. Содержание работы.

2.1. Материалы и методы исследования.

Объекты исследования.

Учитывая многообразие современных антибактериальных средств, в качест объектов исследования были выбраны бета-лактамные антибиотики из груш уреидопенициллинов, цефалоспоринов III и IV поколения, карбапенемс Пиперациллин, Цефотаксим, Цефоперазон, Цефепим, Меропенем. Критериями отбора послужили следующие факты:

• по имеющимся в литературе данным, отобранные бета-лактамные антибиоти обладают собственной иммунотропной активностью, которая в клиническ условиях чаще всего проявляется транзиторными лимфо- и нейтропенияг. однако их влияние на иммунный статус неоднозначно, так как существуют так: исследования, указывающие на наличие у цефалоспоринов III и IV поколен иммуностимулирующих свойств; некоторые исследования говорят об отсутств у бета-лактамных антибиотиков влияния на иммунный статус;

• «антисинегнойные» пенициллины, цефалоспорины III и IV поколения, карбапе-немы являются одними из наиболее часто назначаемых групп антибиотиков вследствие широкого спектра действия, выраженного бактерицидного эффекта, относительной безопасности, возможности проведения монотерапии; отобраннь для исследования препараты широко применяются при развитии инфекционных осложнений на фоне ятрогенной иммунодепрессии, вызванной назначением противоопухолевых средств.

Модели в исследовании.

В качестве модели нормальных иммунокомпетентных клеток в настоящ! исследовании были выбраны лимфоциты, выделенных из периферической кро здоровых доноров в возрасте от 18 до 27 лет на градиенте плотности фи кол верографина (d = 1,077 г/см3) по методу Воуш.

После выделения клетки ресуспендировали в среде RPMI 1640, содержащий 10 эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мМ глутамина, и культивировали в 2 луночных планшетах (Sigma) в термостате при 37°С во влажной атмосфере с 5

со2.

Индуцированную иммунодепрессию на модели лимфоцитов здоровых донор воспроизводили добавлением в культуру дексаметазона в концентрации 10 "3 мг/мл В качестве модели предшественников иммунокомпетентных клет использовались пре-В-лимфобласты лимфобластоидной клеточной линии L 1 полученной в НИИ канцерогенеза (Флейшман Е.В.) из мононуклеарных клет периферической венозной крови мужчины - донора крови. Культура содержит кл< аномальных клеток с кариотипов 46 ху llq+, характерных для остр! лимфобластных и монобластных лейкозов.

Выбор пре-В-лимфобластов в качестве модели бласттрансформированных имфоидных клеток был определен тем, что В-клеточные лейкозы встречаются в линической практике значительно чаще, нежели Т-формы.

Линия иммортализована путем инфицирования вирусом Эпштайна-Барр.

Клеточную линию культивировали в 24-луночных планшетах (Sigma) в ермостате при 37°С во влажной атмосфере с 5 % СОг в среде RPMI 1640, одержащий 20 % эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мМ глутамина.

Индуцированную иммунодепрессию на модели пре-В-лимфобластов имфобластоидной клеточной линии воспроизводили добавлением в культуру ;ексаметазона в концентрации 10 "Змг/мл.

В качестве модели для определения апоптотропного действия бета-лактамных нтибиотиков на бласттрансформированные клетки нативной крови использовали [ре-В-лимфобласты, выделенные из периферической крови больных пре-В-:имфолейкозом в составе фракции мононуклерных клеток при бластозе не менее 50

'о.

Клетки выделяли на градиенте плотности фиколл-верографина (d = 1,077 г/см3); «суспендировали в среде RPMI 1640, содержащий 10 % эмбриональной телячьей ыворотки и 2 мМ глутамина, и культивировали в 24-луночных планшетах (Sigma) в ермостате при 37°С во влажной атмосфере с 5 % СОг.

Индуцированную иммунодепрессию на модели пре-В-лимфобластов нативной :рови воспроизводили добавлением в культуру дексаметазона в концентрации 10 "3 1г/мл.

Методы в исследовании.

В связи с субъективностью и трудоемкостью оценки апоптоза с помощью юрфологических критериев в световой микроскопии после окрашивания клеток по 'омановскому-Гимзе или по Фельгену, в качестве основного метода для ;оличественного определения апоптоза клеточных моделей в настоящем [сследовании был выбран метод проточной цитофлуориметрии, который является ¡ыстрым и точным.

В основе метода лежит измерение интенсивности флуоресценции клеток после жрашивания их флуоресцентным веществом, способным связываться с различными труктурными компонентами клетки.

Для оценки клеточной гибели целесообразно использовать красители, способные [нтеркалировать между пар оснований нуклеиновых кислот, поскольку изменение остояния нуклеиновых кислот (дефрагментация ДНК) является одним из основных :ритериев апоптоза. Соответственно, после измерения интенсивности злуоресценции, этот показатель апоптоза может быть выражен количественно.

В настоящем исследовании в качестве красителя был использован пропидия юдид. Выбора красителя был определен следующими факторами: . Пропидия йодид быстро и эффективно реагирует с ДНК фиксированных :леток, позволяя проводить количественную оценку содержания ДНК в клетках. Это объясняется следующим образом: количество содержащегося ДНК зависит от

стадии клеточного цикла - максимальное количество присутствует в делящих (тетраплоидных) клетках. Покоящиеся соматические клетки содержат диплоиднь набор хромосом; клетки, находящиеся на пути к гибели (апоптозу), являют гиподиплоидными, то есть содержат значительно меньше ДНК за счет ] постепенного разрушения эндонуклеазами и, соответственно, несут меньше сайт связывания для пропидия йодида.

2. Стоимость пропидия йодида является минимальной среди прочих ДНК-тропных красителей, пригодных для проточной цитофлуориметрии.

Бета-лактамные антибиотики добавляли в культуру клеток в следующ концентрациях: Пиперациллин - 103, 206, 412, 824, 1650 мкг/мл; Цефотаксим - 5 107, 214, 430, 860 мкг/мл; Цефоперазон - 63, 125, 250, 500, 1000 мкг/мл; Цефепи\ 40, 80, 163, 326, 650 мкг/мл; Меропенем - 33, 66, 112, 224, 450 мкг/мл.

Исследуемые разведения соответствовали концентрациям антибиотиков в плаз! крови в течение нескольких периодов полувыведения после болюсно внутривенного введения максимальной терапевтической дозы препарата, а таю плазматическим концентрациям, в 2 и 4 раза превышающим максимальные.

Время культивации клеток составляло 24, 48, 72, 120 часов, что соответствова временным периодам, указанным в различных методических рекомендациях : апоптозу. Клетки культивировали с добавлением митогена; в качестве митоге использовали фитогеммаглютинин (ФГА) (Bacto) в концентрации 10 мкг/.v Культивация проводилась в 24-луночных планшетах (Sigma) с концентраци лимфоцитов 2 х 106/мл.

После оценки жизнеспособности и подсчета, лимфоциты в концентрации 2 тыс/мл обрабатывали РНК-азой (Sigma), после чего для проникновения красител; ядро, клетки в течении 30 минут инкубировали в гипотоническом растворе 0,1 трисцитратного буфера и 0,1 % Тритона-Х, образующего микропоры в клеточн мембране. Затем клетки окрашивали пропидия йодидом (BioRad), в концентрац: 10 мкл на 1 млн клеток и инкубировали 30 минут, после чего анализировали проточном цитометре фирмы Becton Dickenson.

Клетки, окрашенные флуоресцентным красителем, вводились с потою физиологического буфера в проточную ячейку с частотой до (3-10) • 103 cei Свободная струя буфера, содержащего клетки, формировалась специальным соши и пересекала лазерный пучок, возбуждающий излучение. Излучение флуоресценц и излучение, рассеянное на 90°, собирались специальной линзой. Измерен интенсивности флуоресценции происходило с помощью оптических датчик (фотоумножителей - ФЭУ). Для регистрации флуоресценции в нескольк интервалах длин волн использовали несколько дихроичных светоделителей полосовых фильтров для выделения требуемых диапазонов.

Анализ количества ДНК проводили при помощи гистограммы, соответствуют флуоресценции красителя пропидия йодида.

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью програмг Statgraf на IBM PC-совместимом персональном компьютере. Для каждой сер данных вычисляли среднее арифметическое (М), ошибку среднего (т). В таблиц

результаты представлены в виде М±т. Для сравнения средних использовали t-сритерий Стьюдента.

2.2. Результаты собственных исследований н их обсуждение.

Для достижения основной цели исследования - создания системы биологической зценки бета-лактамных антибиотиков на модели апоптоза клеток лимфоидного ряда : помощью метода проточной цитофлуориметрии - необходимо было изучить шоптотропное действие бета-лактамных антибиотиков in vitro как на лимфоциты щоровых доноров, так и на клетки - предшественники лимфоцитов (в нашем случае ipe-B-лимфобласты клеточной линии и нативной крови).

1.2.1. Определение и сравнительный анализ количественных показателей и зависимости апоптоза от дозы бета-лактамных антибиотиков на модели мононуклеарных клеток здоровых доноров in vitro.

Результаты влияния различных концентраций исследованных бета-лактамных штибиотиков на апоптоз лимфоцитов здоровых доноров in vitro представлены в таблицах 1-5. Как видно из полученных данных, бета-лактамные антибиотики указывают отчетливое дозозависимое антиапоптотическое действие в диапазоне «следованных концентраций. Следует также отметить, что выявленная ¡акономерность сохраняется в большинстве изученных временных периодах сультивации. При использовании в культуре в качестве митогена {штогеммаглютинина (ФГА) показатели апоптоза достоверно увеличиваются; это тодтверждает тот факт, что чаще всего именно в активированном состоянии клетка шособна к выполнению той или иной заложенной в ней функции или программы, в гом числе и апоптотической гибели [56]. Поскольку in vivo лимфоциты непрерывно тодвергаются активирующим сигналам, применение в культуре в качестве митогена • ФГА - позволяет смоделировать состояние активации и выявить закономерности шоптотропного действия бета-лактамных антибиотиков с максимальным гриближением к условиям живого организма.

Результаты влияния различных разведений Пиперациллина представлены в таблице 1. Как видно из полученных данных, наиболее показательно Пиперациллин зтменял апоптоз при культивации с ФГА в течение 72 и 120 часов, причем с увеличением периода культивации процесс отмены апоптоза в ряду стандартных сонцентраций антибиотика становится более интенсивным: при 72 часах <ультивации - с 39 ±2,2% (С = 103 мкг/мл) до 21 ±0,7% (С = 1650 мкг/мл); при 120 юсах культивации - с 35 ±1,6% (С = 103 мкг/мл) до 16 ±1,5% ;С = 1650 мкг/мл).

Таблица

Влияние Пиперациллина на относительное содержание апоптотических лимфоцит

в культуре (%) (М ± т)

Концентрации Пиперациллина 24 часа без ФГА 24 часа с ФГА 48 часов без ФГА 48 часов с ФГА 72 часа без ФГА 72 часа с ФГА 120 часов без ФГА 120 часов с ФГА

103 мкг/мл 7 ±0,3» 5 ± 1,1* 22±0,7* 25 ±1,3* 23±0,3* 39 ±2,2* 25±0,4* 35 ±1,6*

206 мкг/мл 7 ± 0,7» 5± 1,2* 21 ±0,6* 28 ±1,5* 25±0,7* 36 ±1,7* 27±0,3* 24 ±1,3*

412 мкг/мл 6 ±0,5* 3 ± 0,8* 23±0,7* 24±1,6* 19±0,3* 33 ±0,9* 19±1,7* 21 ±2,1*

824 мкг/мл 6 ± 0,3* 2 ± 0,6* 19±1,0* 25 ±1,4* 22±0,5* 26 ±1,3* 26±2,1 * 19 ±2,2*

1650 мкг/мл 6 ± 0,9* 2 ± 1,3* 20±1,1* 20 ±2,0* 23±0,6* 21 ±0,7* 23±1,1* 16 ±1,5*

Контроль 7± 1,6* 9± 1,5* 23±0,6* 27 ±1,7* 29±1Д* 35 ±2,4* 32±0,8*

*р < 0,05

При наименьшей концентрации Цефотаксима (53 мкг/мл) гибель клет достигала от 5±1,1 процентов при 24-часовой культивации с ФГА до 25±: процентов при 120 часах культивации с ФГА (таблица 2). В то же время, п концентрации препарата 860 мкг/мл процент апоптотических лимфоцитов состав от 2+1,3 при 24-часовой культивации до 16±1,5 при 120 часах культивации активацией ФГА). Гибель лимфоцитов в контроле была либо максимальной (1 часов культивирования с ФГА), либо достоверно приближалась к результат культивирования с минимальной концентрацией цефалоспорина (48-часоЕ культивирование без ФГА и с ФГА; 72- и 120 часовое культивирование без ФГ/ Наиболее выраженное антиапоптотическое действие Цефотаксима бы продемонстрировано при культивации лимфоцитов в течение 72 часов и 120 часо: ФГА, когда количество апоптотических клеток при культивации с максимальн концентрацией антибиотика уменьшилось по сравнению с контролем более чем i раза.

Таблица

Влияние Цефотаксима на относительное содержание апоптотических лимфоцито!

культуре (%) (М ± т)

Концентрации 24 24 48 48 72 72 120 120

Цефотаксима часа часа часов часов часа часа часов часов

без с без с без с без с

ФГА ФГА ФГА ФГА ФГА ФГА ФГА ФГА

53 мкг/мл 4 ±0,3* 5 ± 1,1* 20 ±0,4* 26 ±1,3* 29 ±0,2* 28 ±2,2* 33 ±0,4* 25 ±1,6*

107 мкг/мл 4 ±0,5* 5 ± 1,2* 20 ±0.5* 27 ±1,5* 28 ±0,8* 20 ±1,7* 29 ±0,3* 24 ±1,3*

214 мкг/мл 3 ± 0,8* 3 ± 0,8* 22 ±1,1* 24 ±1,6* 25 ±0,6* 17 ±0,9* 32 ±0,7* 23 ±2,1*

430 мкг/мл 5 ±0,3* 2 ± 0,6* 23 ±0,9* 24 ±1,4* 25 ±0,3* 15 ±1,3* 23 ±0,6* 20 ±2,2*

860 мкг/мл 3 ± 0,5* 2 ± 1,3* 23 ±0.4* 20 ±2,0* 27 ±0,3* 12 ±0,7* 28 ±0,4* 16±1,5*

Контроль 7 ± 0,6* 9± 1,5* 22 ±1,2* 27 ±1,7* 29 ±0,5* 35 ±2,4* 32 ±0,5* 45 ±2,6*

* р<0,05

Для антибиотика Цефоперазона процент вошедших в апоптоз лимфоцитов юставил при минимальной концентрации препарата (С = 63 мкг/мл) от 7 ± 1,4 до 51 : 2,4 процентов соответственно (таблица 3). Следует отметить тот факт, что ;нтиапоптотическое действие стандартных концентраций Цефоперазона на модели [имфоцитов здоровых доноров было особенно показательно при культивации с £>ГА в течение 24 и 48 часов. При увеличении времени культивации дозозависимая >тмена апоптоза приобретала менее выраженный характер.

Таблица 3.

влияние Цефоперазона на относительное содержание апоптотических лимфоцитов в

культуре (%) (М ± т)

Концентрации Цефоперазона 24 часа без ФГА 24 часа с ФГА 48 часов без ФГА 48 часов с ФГА 72 часа без ФГА 72 часа с ФГА 120 часов без ФГА 120 часов с ФГА

63 мкг/мл 7 ± 0,4» 7± 1,4* 20 ±0,8* 19 ±2,6* 30 ±0,6* 30 ±1,5* 28±0,4* 51 ±2,4*

125 мкг/мл 6 ± 0,9* 4 ±0,8* 23 ±0,6* 17±1,8* 29 ±0,4* 29 ±0,7* 24±0,3* 47 ±1,6*

250 мкг/мл 7± 1,1* 4 ± 0,6* 21 ±0,5* 15 ±1,6* 29 ±0,7* 22 ±1,6* 19±1,8* 38 ±1,2*

500 мкг/мл 8 ± 0,7« 3 ± 0,4* 17 ±0,8* 12 ±0,9* 28 ±0,6* 20 ±1,3* 27±2,1* 23 ±0,8*

1000 мкг/мл 6 ± 0,5* 1 ± 0,3* 20 ±1,2* 5 ± 1,1* 29 ±0,8* 22 ±2,1* 23±1,1* 30 ±1,3*

Контроль 7 ± 0,8* 8± 1,5* 23 ±1,4* 26 ±1,2* 32 ±0,6* 39 ±2,5* 33±0,8* 50 ±2,3*

'р < 0,05

Процент апоптотических клеток в культуре лимфоцитов при добавлении Дефепима в минимальной концентрации, равной 40 мкг/мл, составил от 5±0,8 до (6±2,6 процентов при времени культивации с ФГА от 24 до 120 часов :оответственно (таблица 4). Характерная антиапототическая активность Цефепима 1ри повышении дозы наиболее показательно проявлялась на модели 48-часовой ;ультивации с добавлением ФГА. При удлинении временного периода культивации 1,0 72 и 120 часов положительная дозозависимая динамика антиапоптотического (ействия становилась менее выраженной. В целом, воздействие Цефепима на 1ПОПТОЗ лимфоцитов здоровых доноров было более сдержанным, нежели у других 1сследованных на данной модели препаратов.

Таблица 4.

Влияние Цефепима на относительное содержание апоптотических лимфоцитов в

культуре (%) (М ± т)

Концентрации Цефепима 24 часа без ФГА 24 часа с ФГА 48 часов без ФГА 48 часов с ФГА 72 часа без ФГА 72 часа с ФГА 120 часов без ФГА 120 часов с ФГА

40 мкг/мл 3 ± 0,7* 5 ± 0,8* 22±0,8* 24±2,2* 35±0,5* 37±1,6* 35±0,9* 46±2,6*

80 мкг/мл 4 ±0,5* 3 ± 1,3* 20±0,7* 23±1,4* 28±0,3* 35±1,3* 28±0,6* 44±0,7*

163 мкг/мл 5 ± 0,8* 3 ± 0,5* 24±0,7* 25±1,6* 23±0,9* 33±1,4* 32±0,3* 37±1,5*

326 мкг/мл 5 ±0,3* 1 ± 0,2* 21±0,8* 16±0,9* 28±1,7* 38±1,8* 28±0,6* 42±1,3*

650 мкг/мл 3 ± 0,3* 1 ± 0,3* 20±0,5* 14±!,2* 20±0,4* 37±2,4* 27±0,9* 42±1,4*

Контроль 6 ±0,7* 7 ± 0,9* 23±0,6* 26±2,3* 35±0,6* 39 ±2,3* 34±0,9* 50±3,2*

*р < 0,05

Влияние стандартных разведений Меропенема на апоптоз лимфоцитов здоровь доноров в присутствии митогена (ФГА) отличалось широким диапазоном значени особенно при 72-часовой культивации (с 32 % до 8 %). В культуре без добавлен! фитогеммаглютинина дозозависимость антиапоптотического действия Меропенел практически не проявлялась (таблица 5).

Таблица

Влияние Меропенема на относительное содержание апоптотических лимфоцитов

культуре (%) (М ± т)

Концентрации Меропенема 24 часа без ФГА 24 часа с ФГА 48 часов без ФГА 48 часов с ФГА 72 часа без ФГА 72 часа с ФГА 120 часов без ФГА 120 часов с ФГА

33 мкг/мл 4 ± 0,3* 5 ± 0,8* 21±0,8* 24±2,2* 27±0,2* 32±1,6* 42±0,3* 46±2,6*

66 мкг/мл 5 ± 0,9* 3 ± 1,3* 24±0,5* 22±1,4* 25±0,6* 30±1,3* 40±0,5* 43±0,7*

112 мкг/мл 5 ± 1,1* 3 ± 0,5* 19±1,5* 25±1,6* 22±0,2* 12±1,4* 36±0,3* 38±1,4*

224 мкг/мл 6 ±0,7* 1 ± 0,2* 22±0,3* 17±0,7* 26±0,3* 9±1,8** 38±0,8* 42±1,3*

450 мкг/мл 7 ±0,3* 1 ±0,3» 24±0,7* 13±1Д* 25±0,4* 8±2,4** 45±0,3* 40±1,7*

Контроль 7 ± 0,8* б ± 0,9* 23±1,5* 26±2,3* 28±0,5* 33±2,3* 42±0,5* 49±3,3*

*р < 0,05; **р< 0,01

Таким образом, по результатам исследования наиболее выраженн антиапоптотическое действие в отношении лимфоцитов здоровых доноров бы. характерно для Цефоперазона, причем выраженность действия напрямую зависе от концентрации препарата в культуре (на модели 48-часового культивирования ФГА). При том же временном периоде культивирования Цефепим и Меронем так; проявляли антиапоптотический дозозависимый эффект, однако проапототическ] «скачок» со стандартной концентрации С 3 (163 и 112 мкг/мл соответствен!: придал тенденции неодназначный оттенок. Цефотаксим и Пиперациллин снижа апоптоз лимфоцитов здоровых доноров значительно меньше (рисунок 3).

3исунок 3. Влияние бета-лактамных антибиотиков на апоптоз лимфоцитов

здоровых доноров при 48-часовом культивировании с добавлением ФГА.

При культивировании в течение 72 часов с добавлением ФГА наиболее выражено ;нижали апоптоз лимфоцитов Меропенем и Цефотаксим. Апоптотропное действие Ъшерациллина носило «фазовый» характер: сначало повышение клеточной гибели з сравнении с контролем, затем, по мере повышения концентрации антибиотика в <ультуре, наблюдалось достоверное снижение апоптоза. Обратный эффект при 72-шсовом культивировании проявлял Цефепим: до концентрации С 3 (163 мкг/мл) шотоз лимфоцитов снижался, при дальнейшем увеличении концентрации процент шоптотических лимфоцитов увеличивался (рисунок 4).

% апопто-тических клеток

Контроль

СЗ

Стандартные концентрации

С 4 С 5

- 45 40 35 30 25 20 15 10 5 О

-Меропенем -

-Цефотаксим

Цефоперазон ■

-Пиперациллин ■

-Цефепим

Рисунок 4. Влияние бета-лактамных антибиотиков на апоптоз лимфоцитов

здоровых доноров при 72-часовом культивировании с добавлением ФГА.

На модели лимфоцитов нормальных доноров при 120-часовом культивирован наиболее выраженная способность отменять апоптоз была выявлена Пиперациллина и Цефотаксима (рисунок 5).

% алопто-тачесшх клеток

Контроль С1 С 2 СЗ С 4

Стандартные концентрации

С 5

-Цефотаксим ■

-Пиперациллин —Ж—Цефоперазон ■

-Меропенем —К— Цефепим I

Рисунок 5. Влияние бета-лактамных антибиотиков на апоптоз лимфоцитов

здоровых доноров при 120-часовом культивировании с добавлением ФГА.

Особенный интерес представляло изучение возможности бета-лактамных нтибиотиков влиять на апоптоз нормальных лимфоцитов в условиях [ндуцированной иммунодепрессии, поскольку исследуемые препараты часто [азначаются для лечения и профилактики инфекций, возникших на фоне [ммунодефицита, вызванного проводимой противоопухолевой терапией. Выбор [ексаметазона в качестве индуктора апоптоза в модели иммунодепрессии основан (а широком применении этого глюкокортикостероида для лечения гемобластозов; 'читывался также тот факт, что индукция апоптоза под воздействием люкокотикостероидов является классической и хорошо отработанной моделью шдукции апоптоза in vitro [56].

Результаты изучения влияния различных концентраций бета-лактамных [нтибиотиков на апоптоз лимфоцитов здоровых доноров в условиях шдуцированной in vitro ятрогенной иммунодепрессии представлены в таблицах 6,0. Как видно из полученных данных, бета-лактамные антибиотики в кследованных концентрациях способны вызывать в большинстве случаев (озозависимую отмену апоптоза, индуцированного введением в культуру раствора ексаметазона в концентрации 10"3мг/мл.

Результаты влияния серии стандартных разведений Пиперациллина на апоптоз шмфоцитов в условиях дексаметазон-индуцированной иммунодепрессии тредставлены в таблице 6. Наиболее выражено Пиперациллин снижает апоптоз при сультивировании в течение 48 часов с ФГА (9 % апоптотических клеток при максимальной концентрации антибиотика, что в 3,8 раза меньше, чем в контроле).

Таблица 6.

Злияние Пиперациллина на относительное содержание апоптотических лимфоцитов

(%) (М ± ш) в условиях ятрогенной иммунодепрессии

Концентрации Пиперациллина 24 часа без ФГА 24 часа с ФГА 48 часов без ФГА 48 часов с ФГА 72 часа без ФГА 72 часа с ФГА 120 часов без ФГА 120 часов с ФГА

103 мкг/мл 10±0,7* 1 \±2,2* 33±2,2» 16±0,2* 50±1,3* 56±0,5* 74±0,6» 65±0,5*

206 мкг/мл 9±0,5* 11±1,0* 30±2,1* 15±0,9* 49±0.8* 51±0,8* 72±0,7* 62±0.5*

412 мкг/мл 9±0,5* 13±0,5* 27±0,3» 13±0,1* 45±0,4* 40±1,6* 61 ±0,5* 58±1,7*

824 мкг/мл 7±0,4* 9±0,8» 26±0,9» 14±2,3* 39±0,7* 28±2,1* 58±0,3» 43±2,0*

1650 мкг/мл 8±0,3»* 6±0,7* 26±0,1* 9±0,2* 37±0,8* 27±!,3* 49±0,8» 45±1,1*

Контроль 10±1,2» 15±1,2* 33±0,8* 35±2,4* 42±1,6* 5б±2,3* 75±2,5» 70±2,3»

>р<0,05;**р<0,01

Цефотаксим при культивации лимфоцитов в течение 24, 48 и 72 часов с добавлением ФГА оказывал дозозависимое антиапоптотическое действие, при этом цинамика отмены апоптоза в указанных периодах культивации оставалась этносительно стабильной (таблица 7). Так, при культивации в течение 24 часов количественный показатель индуцированного апоптоза в культуре с ФГА уменьшился с 20 ± 1,1 до 7 ± 0,3 процентов (в ряду стандартных разведений); при 48-часовой культивации - с 20 ± 1,3 до 7 ± 0,4; при 72-часовой культивации - с 21 ± 2,2 до 9 ± 0,5. Однако при увеличении времени культивации до 120 часов

положительная динамика в отношении отмены дексаметазон-индуцированно] апоптоза исчезала, причем в концентрации 860 мкг/мл было отмечена обрати; тенденция (120-часовая культивация с ФГА).

Таблица

Влияние Цефотаксима на относительное содержание апоптотических лимфоцитов (%) (М ± т) в условиях ятрогенной иммунодепрессии

Концентрации Цефотаксима 24 часа без ФГА 24 часа с ФГА 48 часов без ФГА 48 часов с ФГА 72 часа без ФГА 72 часа с ФГА 120 часов без ФГА 120 часов с ФГА

53 мкг/мл 13±0,4* 20±1,1* 19±0,8* 20±1,3* 28±0,8* 21±2,2* 30±0,3* 21±2,4*

107 мкг/мл 12±0,2* 17±1,7* 20±0,3* 19±1,5* 25±0,3* 15±1,2* 30±0,2* 19±1,3*

214 мкг/мл 13±0,9* 13±0,7* 18±0,3* 14±2,1 * 25±0,6* 12±1,4* 25±0,7* 15±0,7*

430 мкг/мл 11±0,4* 9 ±0,5* 16±0,7* 13±1,5** 23±0,8* 10±0,8* 24±0,6* 15±0,9*

860 мкг/мл 12±1,0* 7 ±0,3** 14±0,6* 7 ±0,4* 21±0,3* 9 ± 0,5* 24±0,8* 19±0,4*

Контроль 13±1,0* 19±1,2* 27±1,4* 33±0,5* 37±0,1* 47±1,3* 69±0,3* 65±1,5*

* р < 0,05; **р< 0,01

В отличие от Цефотаксима, Цефоперазон обнаружил более стабильш антиапоптотическое действие в условиях индуцированной иммунодепресси Показатель апоптоза лимфоцитов в большинстве периодов культивации достовер! снижался при повышении концентрации препарата (таблица 8).

Таблица

Влияние Цефоперазона на относительное содержание апоптотических лимфоцита] (%) (М ± т) в условиях ятрогенной иммунодепрессии

Концентрации Цефоперазона 24 часа без ФГА 24 часа с ФГА 48 часа без ФГА 48 часов с ФГА 72 часа без ФГА 72 часа с ФГА 120 часов без ФГА 120 часов с ФГА

63 мкг/мл 14±0,2* 17±1,4* 23±1,5* 30±1,8* 32±0,1* 27±1,9* 54±0,1* 35±2,8*

125 мкг/мл 13±0,5* 15±1,3* 19±0,9* 24±1,4* 33±0,8* 11±0,3* 55±0,6* 25±1,8*

250 мкг/мл 10±0,7* 15±0,9* 17±0,2* 22±1,5* 27±0,4* 17±0,7* 53±0,3* 21±1,5*

500 мкг/мл 9±0,2* 8± 1,3* 17±0,1* 11±0,4* 25±0,3* 16±1,7* 40±0,2* 25±0,3*

1000 мкг/мл 10±0,5* 9 ±0,7* 13±1,2* 13±0,б* 20±0,4* 10±1,4* 45±0,8* 15±0,6*

Контроль 13±0,6* 19±2,2* 29±1,0* 35±1,3* 38±0,9* 49±1,5* 68±0,1* 68±1,6*

* р < 0,05

Результаты влияния серии стандартных разведений Цефепима и Меропенема 1 апоптоз лимфоцитов в условиях дексаметазон-индуцированной иммунодепресср представлены в таблицах 9 и 10 соответственно.

Таблица 9.

Влияние Цефепима на относительное содержание апоптотических лимфоцитов (%) (М ± т) в условиях ятрогенной иммунодепрессии

Концентрации Цефепима 24 часа без ФГА 24 часа с ФГА 48 часов без ФГА 48 часов с ФГА 72 часа без ФГА 72 часа с ФГА 120 часов без ФГА 120 часов с ФГА

40 мкг/мл 12± 0,8* 20±0,7* 23±0,1* 25±1,8* 42± 1,6* 39±2,4* 51 ±0,6* 60 ±2,7*

80 мкг/мл 10±0,2* 15±0,3* 22±0,8* 21±1,3* 40± 2,0* 40±2,0* 50 ±0,4* 55 ±2,3*

163 мкг/мл 10± 0,9* 14±1,4* 19±0,2* 15±2,5* 37± 0,6* 35±3,0* 46 ±0,8* 53 ±1,2*

326 мкг/мл 8± 0,2* 10±1,9* 18±0,9* 16±0,6* 36±0,3* 30±1,6* 44 ±0,3* 50 ±0,8*

650 мкг/мл 7± 0,2* 9±2,1 * 16±0,3* 12±0,7* 36± 0,7* 29±1,3* 36± 0,7* 42 ±0,6*

Контроль 13± 1,3* 18±2,6* 29±0,5* 37±1,5* 42± 0,2* 52±2,9* 70± 0.8* 67 ±1,6*

* р < 0,05

Таблица 10.

Влияние Меропенема на относительное содержание апоптотических лимфоцитов (%) (М ± т) в условиях ятрогенной иммунодепрессии

Концентрации 24 24 48 48 72 72 120 120

Меропенема часа часа часов часов часа часа часов часов

без с без с без с без с

ФГА ФГА ФГА ФГА ФГА ФГА ФГА ФГА

33 мкг/мл 11 ±0,4* 13 ±0,7* 23 ±0,4* 30 ±1,8* 30 ±0,7* 27 ±2,4* 53 ±0,1* 64 ±2,7*

66 мкг/мл 9 ±0,5* 10 ±0,3* 17 ±1,2* 27 ±1,3* 28 ±0,6* 16 ±2,0* 50 ±0,3* 63 ±2,3*

112 мкг/мл 7 ±0,7* 11 ±1,4* 16±1,3* 25 ±2,5* 27 ±0,2* 15 ±3,0* 43 ±0,7* 40 ±1,2*

224 мкг/мл 3±0,3* 7 ±1,9* 16 ±0,2* 23 ±0,6* 26 ±0,9* 14 ±1,6* 40 ±0,8* 45 ±0,8*

450 мкг/мл 5 ±0,8* 6 ±2,1* 15 ±0,1* 11 ±0,7* 19 ±1,1* 13 ±1,3* 42 ±0,2* 39 ±0,6*

Контроль 10 ±0,2* 14 ±2,6* 30 ±0,3* 34 ±1,5* 38 ±0,2* 50±2,9* 64 ±0,6* 65 ±1,6*

* р < 0,05

Таким образом, согласно результатам настоящего исследования наиболее выраженная способность отменять проапоптогенное действие дексаметазона на модели лимфоцитов периферической крови характерна для Цефотаксима и Пиперациллина (при 48-часовом культивировании). В целом, дозозависимое антиапоптотическое действие прослеживалось у всех препаратов, менее всего у Меропенема (рисунок 6).

Контроль С1 С 2 СЗ С 4 С5

Стандартные концентрации |—В—Цефотаксим —♦—Пиперациллин —Ж— Мероленем —А— Цефепим —Н— Цефоперазон |

Рисунок 6. Влияние бета-лактамных антибиотиков на апоптоз лимфоцитов здоровых доноров при 48-часом культивировании с добавлением ФГА в условиях индуцированной иммунодепрессии.

На модели дексаметазон-индуцированной иммунодепрессии при 72-часово культивировании наиболее эффективно отменял апоптоз Цефотаксим, сопоставимс действие проявилось у Цефоперазона и Меропенема; менее эффективно влиял Цефепим и Пиперациллин (рисунок 7).

% апопто- 30 тических клеток

Контроль

С 2 СЗ

Стандартные концентрации

-Цефотаксим •

-Цефоперазон ■

-Меропенем ■

-Цефепим ■

-Пиперациллин |

Рисунок 7. Влияние бета-лактамных антибиотиков на апоптоз лимфоцитов

здоровых доноров при 72-часовом культивировании с добавлением ФГА в условиях индуцированной иммунодепрессии.

При культивировании исследуемых препаратов в .течение 120 часов в условиях дексаметазон-индуцированного апоптоза обнаружилось следующее: антиапоптотическое действие Цефепима, Меропенема и Пиперациллина нивелировалось, однако эффект отмены апоптоза, вызванного глюкокортикостероидом, сохранился у Цефотаксима и Цефоперазона и был довольно значительным (рисунок 8).

т 801 ±70;

I

г 60 I 50; т 40

Т 30

1 о

Стандартные концентрации

■ Цефотаксим Ф Цефоперазон —Ж—Цефепим —А—Меропенем —X—Пи пера ци л пин I

Рисунок 8. Влияние бета-лактамных антибиотиков на апоптоз лимфоцитов здоровых доноров при 120-часовом культивировании с добавлением ФГА в условиях индуцированной иммунодепрессии.

2.2.2. Определение и сравнительный анализ количественных показателей и зависимости апоптоза от дозы бета-лактамных антибиотиков на модели пре-В-лимфобластов клеточной линии в норме и условиях индуцированной иммунодепрессии.

Результаты влияния различных концентраций исследованных бета-лактамных антибиотиков на апоптоз лимфобластов пре-В-лимфобластоидной клеточной линии Ь 13 представлены в таблицах 11-15. Как видно из полученных данных, большинство бета-лактамных антибиотиков оказывают дозозависимое антиапоптотическое действие в диапазоне исследованных концентраций. Поскольку пре-В-лимфобласты клеточной линии иммортализованы и находятся в состоянии клеточной пролиферации, данная модель изначально активирована и не нуждается в дополнительном использование митогена.

Апоптотропный эффект Пиперациллина был наиболее выражен при 48, 72 и 120 часах культивации, как в нормальных условиях, так и в условиях дексаметазон-индуцированной иммунодепрессии. Однако в действии этого препарата была обнаружена следующая особенность: на модели лимфобластов в нормальных

условиях при 48-, 72- и 120-часовом культивировании Пиперациллин минимальной концентрации (103 мкг/мл) увеличивал апоптоз клеток в сравнении контролем в 1,4 - 2,2 раза; при увеличении концентрации процент апоптотически клеток дозозависимо уменьшался. Этот характерный эффект был обозначен ка «апоптоз минимальной концентрации». При культивировании в условия дексаметазон-индуцированной иммунодепрессии эта особенность действа исчезала; Пиперациллин отменял апоптоз, индуцированный дексаметазоном, прямой зависимости от концентрации антибиотика в культуре (таблица 11).

Особенность дозозависимого апоптотропного действия, обнаруженная Пиперациллина, была выявлена и при культивировании лимфобластов Цефотаксимом. Однако в сравнении с Пиперациллином, эффект Цефотаксима бы менее выражен и проявлялся в основном при культивировании в течение 72 и 12 часов (таблица 12).

Таблица 1

Влияние Пиперациллина на относительное содержание апоптотических лимфобластов (%) (М ± т) в культуре клеточной линии в нормальных условиях и условиях индуцированной иммунодепрессии

Концентрации 24 24 48 48 72 72 120 120

Пиперацил- часа часа часов часов часа часа часов часов

лина без с без с без с без с

Оех Оех Оех Оех Рех Оех Оех Оех

103 мкг/мл 29±0,5* 52± 1,1* 40±0,7* 57±1,3* 76±0,4* 81±1,5* 80±0,4* 93±1,6*

206 мкг/мл 27±0,4» 49 ±1,2* 35±0,3* 44±1,5* 74±0,7* 79±1,4* 71 ±0,5* 75±1,3*

412 мкг/мл 23±0,2* 47 ±0,8* 29±0,9* 39±1,6* 67±1,4* 77±0,8* 54±0,4* 70±2,1*

824 мкг/мл 20±0,9* 30 ±0,6* 25±0,3* 26±1,4* 34±0,9* 55±0,4* 43±1,7* 48±2,2*

1650 мкг/мл 23±0,6* 25 ±1,3* 26±1,4* 25±2,0* 30±0,4* 27±0,8* 37±0,8* 30±1,5*

Контроль 30±1,1* 49± 1,5* 29±0,5* 63±1,7* 29±1,5* 86±2,8* 34±1,2* 95±2,6*

* р < 0,05

Таблица 1!

Влияние Цефотаксима на относительное содержание апоптотических лимфобласто (%) (М ± т) в культуре клеточной линии в нормальных условиях и условиях индуцированной иммунодепрессии

Концентрации Цефотаксима 24 часа без Оех 24 часа с Оех 48 часов без Оех 48 часов с Оех 72 часа без Оех 72 часа с Оех 120 часов без Оех 120 часов с Оех

53 мкг/мл 27±0,2* 45±1,1* 33±0,7* 50±1,3* 43±0,9* 60±2,2* 63±0,3* 96±1,6*

107 мкг/мл 25±0,7* 37±1,2* 33±0,3* 42±1,5* 40±0,2* 56±1,7* 52±0,6* 83±1,3*

214 мкг/мл 25±0,9* 32±0,8* 27±1,1* 37±1,6* 36±0,5* 54±0,9* 50±0,4* 75±2,1*

430 мкг/мл 26±0,3* 24±0,6* 24±1,3* 36±1,4* 33±0,3* 55±1,3* 49±0,3* 65±2,2*

860 мкг/мл 20±2,0* 23±1,3* 25±0,5* 37±2,0* 33±0,7* 44±0,7* 55±0,2* 64±1,5*

Контроль 30±1,0* 49± 1,5* 29±0,5* 63±1,8* 29±0,5* 86±1,8* 34±0,2* 95±2,5*

Эффекты Цефоперазона на апоптоз лимфобластов клеточной линии в норме и условиях индуцированной иммунодепрессии представлены в таблице 13. Как видно -13 полученных результатов, для действия Цефоперазона также характерно увеличение апоптоза лимфобластов при минимальных концентрациях препарата [при 48-, 72-, 120-часовом культивировании без дексаметазона); при повышении концентрации антибиотика апоптоз снижался.

Таблица 13.

Влияние Цефоперазона на относительное содержание апоптотических лимфобластов (%) (М ± ш) в культуре клеточной линии в нормальных условиях и условиях индуцированной иммунодепрессии

Концентрации Цефоперазона 24 часа без Dex 24 часа с Dex 48 часов без Оех 48 часов с Dex 72 часа без Dex 72 часа с Dex 120 часов без Оех 120 часов с Dex

63 мкг/мл 25±0,5* 34± 1,1* 37±0,7* 63 ±1,3* 74±0,4* 74±2,2* 50±0,2* 90±1,6*

125 мкг/мл 24±0,2* 32±1,2* 32±0,6* 62 ±1,5* 73±0,7* 74±1,7* 54±0,1* 89±1,3*

250 мкг/мл 23±0,2* 29± 0,8* 25±1,4* 66 ±1,6* 65±1,4* 63±0,9* 54±0,3* 87 ±2,1*

500 мкг/мл 22±0,1* 25 ±0,6* 20±1,1* 50 ±1,4* 30±0,9* 40±1,3* 41 ±0,5* 70±2,2*

1000 мкг/мл 23±0,3* 25±1,3* 25±0,9* 43 ±2,0* 30±0,4* 33±0,7* 29±0,9* 71 ±1,5*

Контроль 30±1,3* 49± 1,4* 29±0,3* 63±1,6* 29±1,5* 86±2,8* 34±1,3* 95±2,7*

* р < 0,05

Для апоптотропного действия стандартных разведений Цефепима характерно следующее: при культивации в течение 24 и 48 часов как в нормальных условиях, так и при добавлении дексаметазона было отмечено отчетливое антиапоптотическое дозозависимое действие. Однако при увеличении времени культивации до 72 и 120 часов эффект отмены дексаметазон-индуцированного апоптоза в значительной степени нивелировался, а при действии Цефепима на лимфобласты в нормальных условиях наблюдался эффект «апоптоза минимальной концентрации», описанный для Пиперациллина, Цефотаксима и Цефоперазона (таблица 14).

Таблица 14.

Влияние Цефепима на относительное содержание апоптотических лимфобластов (%) (М ± т) в культуре клеточной линии в нормальных условиях и условиях индуцированной иммунодепрессии

Концентрации Цефепима 24 часа без Dex 24 часа с Dex 48 часов без Оех 48 часов с Dex 72 часа без Dex 72 часа с Dex 120 часов без Оех 120 часов с Dex

40 мкг/мл 29±0,4* 42± 1,1* 23±1,1* 50±1,3* 45±0,3* 89±2,2* 51 ±0,4* 94±1,6*

80 мкг/мл 28±0,3* 40±1,2* 24±1,2* 53±1,5* 44±0,9* 85±1,7* 55±0,7* 92±1,3*

163 мкг/мл 26±0,4* 38 ±0,8* 22±0,1* 42±1,6* 36±0,2* 84±0,9* 43±0,6* 93±2,1*

326 мкг/мл 25±0,5* 37 ±0,6* 20±0,5* 44±1,4* 31±1,6* 81±1,3* 39±0,3* 81 ±2,2*

650 мкг/мл 25±0,8* 35 ±1,3* 19±0,3* 35 ±2,0* 28±0,6* 73±0,7* 38±0,8* 72 ±1,5*

Контроль 30±1,2* 49± 1,2* 29±0,8* 63±2,8* 29±1,2* 86±2,0* 34±2,2* 95±1,2*

Как и большинство исследованных бета-лактамных антибиотиков, Меропене отменял дексаметазон-индуцированный апоптоз. Однако отдельного рассмотрени заслуживает действие стандартных разведений Меропенема на программированну) клеточную гибель пре-В-лимфобластов в нормальных условиях: эффект «апопто: минимальный концентрации», проявившийся при 48-,72- и 120-часово культивировании, при культивации в течение 72 часов приобрел некотору: модификацию, выраженную в повторным «скачке» апоптоза в эксперименте максимальной концентрацией Меропенема (450 мкг/мл). Результаты представлены таблице 15.

Таблица 1!

Влияние Меропенема на относительное содержание апоптотических лимфобластов (%) (М ± т) в культуре клеточной линии в нормальных условиях и условиях индуцированной иммунодепрессии

Концентрации Меропенема 24 часа без Dex 24 часа с Dex 48 часов без Оех 48 часов с Dex 72 часа без Dex 72 часа с Dex 120 часов без Dex 120 часов с Dex

33 мкг/мл 27±0,6* 40 ±1,1* 45±0,2* 59 ±1,3* 69±0,3* 90±2,2* 75±0,7* 83±1,6*

66 мкг/мл 24±0,2* 35 ±1,2» 44±0,3* 52 ±1,5* 63±0,5* 74±1,7* 64±0,4* 73±1,3*

112 мкг/мл 25±0,9* 33 ±0,8* 45±1,5* 45 ±1,6* 60±0,4* 50±0,9* 50±0,8* 66±2,1*

224 мкг/мл 26±0,1» 29 ±0,6* 28±1,3* 41 ±1,4* 57±0,7* 34±1,3* 55±0,1* 65 ±2,2*

450 мкг/мл 24±0,8* 28 ±1,3* 27±0,7* 29 ±2,0* 90±0,3* 40±0,7* 42±0,7* 35±1,5*

Контроль 30±1,1* 49± 1,9* 29±0,5* 63±1,8* 29±0,3* 86±1Д* 34±2,2* 95±3,8*

* р < 0,05

Таким образом, во влиянии бета-лактамных антибиотиков на апоптоз пре-Е лимфобластов клеточной линии была обнаружена закономерность, название «апоптозом минимальной концентрации». Она заключается в способное! исследованных антибиотиков увеличивать показатель апоптоза при введении культуру в минимальных исследованных концентрациях, при этом последующ« антиапоптотическое действие, развивающего при увеличении дозы препарат сохраняется. При 72-часовом культивировании этот эффект был наиболее выражен Пиперациллина, Цефоперазона, Меропенема; под действием Меропенема, помим этого, наблюдался повторный «скачок» апоптоза при концентрации препарата 4í мкг/мл (рисунок 9).

Стандартные концентрации

Цефотаксим —•—Цефепим —Ж—Пиперациллин —А—Цефоперазон —^—Марспенем I

Рисунок 9. Влияние бета-лактамных антибиотиков на апоптоз лимфобластов в культуре клеточной линии при 72-часовом культивировании в в нормальных условиях.

На модели пре-В-лимфобластов в условиях иммунодепрессии бета-лактамные антибиотики отменяли проапоптотическое действие дексаметазона, однако, в сравнении со сходным эффектом, выявленным на лимфоцитарной модели, действие в отношении дексаметазон-индуцированного апоптоза бластов было менее выражено и проявлялось, в основном, в диапазоне высоких доз. Минимальное антиапоптотическое действие характерно для Цефепима; более выражен эффект у Цефоперазона, Меропенема и Пиперациллина (рисунок 10).

% апопто-тнческах клеток

100 -90 -80 | 70 -60 -50 -40 -30 -20 -f 10 f 0 т-

т 100 f 90

- 60

- 50 -- 40 -- 30

- 20 - 10

О

Контроль С1 С 2 СЗ С 4 С5

Стандартные концентрации

Рисунок 10. Влияние бета-лактамных антибиотиков на апоптоз лимфобластов в культуре клеточной линии при 72-часовом культивировании в условиях индуцированной иммунодепрессии.

2.2.3. Определение и сравнительный анализ количественных показателей и зависимости апоптоза от дозы бета-лактамных антибиотиков на модели лимфоидных клеток крови больных пре-Б-лейкозом в норме и условиях индуцированной иммунодепрессии.

Результаты влияния различных концентраций исследованных бета-лактамнь антибиотиков на апоптоз мононуклеарной фракции (пре-В-лимфобласты нормальные лимфоциты) периферической крови больных пре-В-лейкозом in vit представлены в таблицах 16-20. Как видно из полученных данных, бета-лактамнь антибиотики оказывают дозозависимое антиапоптотическое действие в диапазо! исследованных концентраций.

На модели мононуклеарной фракции, содержащей лимфобласты и зрель лимфоциты, Пиперациллин проявлял антиапоптотическое действие как нормальных условиях, так и в условиях дексаметазон-индуцированш иммунодепрессии. Эффект «апоптоза минимальной концентрации» был мен< выражен, нежели на модели лимфобластов клеточной линии; по-видимому, э' объясняется присутствием в культуре нормальных лимфоцитов, не подвергших' бласттрансформации (таблица 16).

Таблица 16.

Влияние Пиперациллина на относительное содержание в культуре апоптотических гшмфобластов и лимфоцитов (%) (М ± т) нативной крови в нормальных условиях и

условиях индуцированной иммунодепрессии

Концентрации Пиперациллина 24 часа без Dex 24 часа с Dex 48 часов без Оех 48 часов с Dex 72 часа без Dex 72 часа с Dex 120 часов без Dex 120 часов с Dex

103 мкг/мл 17±0,6* 34±l,i* 33±1,4* 47±1,3* 53±0,4* 60±2,2* 57±0,3* 83±1,6*

206 мкг/мл 17±0,8* 27±1,2* 27±0,5* 36±1,5* 50±0,3* 61±1,7* 57±0,3* 73±1,3*

412 мкг/мл 15±0,5* 23 ±0,8* 25±0,4* 33±3,6» 41±0,2* 60±0,9* 39±0,8* 65±2,1*

824 мкг/мл 13±0,8* 16±0,6* 22±0,9* 22±1,4* 28±0,3» 43±1,3* 38±0,2* 45±2,2*

1650 мкг/мл 13±0,9* 14±1,3* 21±0,3* 23±2,0* 23±0,6* 34±0,7* 27±1,1* 41±1,5*

Контроль 21±1,0* 29±1,0* 29±0,4* 42±1,9* 30±1,1* 61±0,3* 42±1,6* 72±0,2*

р < 0,05

Эффекты стандартных разведений Цефотаксима были сопоставимы с >езультатами, полученными при культивировании клеток со стандартными введениями Пиперациллина; эффект «апоптоза минимальной концентрации» был [ыражен только при 120-часовом культивировании в нормальных условиях (таблица .7).

Таблица 17.

Влияние Цефотаксима на относительное содержание в культуре апоптотических лимфобластов и лимфоцитов (%) (М ± т) нативной крови в нормальных условиях и

условиях индуцированной иммунодепрессии

Концентрации Цефотаксима 24 часа без Dex 24 часа с Dex 48 часов без Оех 48 часов с Dex 72 часа без Dex 72 часа с Dex 120 часов без Dex 120 часов с Dex

53 мкг/мл 14±0,7» 27± 1,1* 26±0,3* 35±1,3* 35±0,2* 47 ±2,2* 47±0,5* 65±1,б*

107 мкг/мл 13±1,2* 24±1,2 * 26±0,9* 30 ±1,5* 35±0Д* 42±1,7* 42±0,9* 55±1,3*

214 мкг/мл 13±1,0* 22 ±0,8* 23±0,7* 27 ±1,6* 31 ±0,8* 37±0,9* 41±1,5* 51±2,1*

430 мкг/мл 15±0,4* 17±0,6* 20±0,5* 26 ±1,4* 29±0,4* 35±1,3* 34±0,5* 45±2,2*

860 мкг/мл 11 ±0,9* 17±1,3* 12±0,2* 23 ±2,0* 28±0,8* 29±0,7* 31±0,6* 34±1,5*

Контроль 23±0,7» 34± 2,0* 30±0,1* 44±1,2* 32±0,7* 57±2,4* 37±0,4* 74±1,1*

' р < 0,05

Особого внимания заслуживает апоптотропное действие Цефоперазона, ¡ыявленное на модели лимфобластов и лимфоцитов нативной крови при 72-часовом сультивировании без дексаметазона. Как видно из полученных результатов, фисутствует значительный эффект «апоптоза минимальной концентрации», однако фи этом Цефоперазон сохраняет способность дозозависимо отменять апоптоз в ;онцентрации 1000 мкг/мл по сравнению с контролем более чем в 3,8 раза, а в :равнении с показателем клеточной гибели в концентрации 63 мкг/мл - в 6,7 раз таблица 18).

Таблица И

Влияние Цефоперазона на относительное содержание в культуре апоптотических лимфобластов и лимфоцитов (%) (М ± т) нативной крови в нормальных условиях и

условиях индуцированной иммунодепрессии

Концентра- 24 24 48 48 72 72 120 120

ции Цефоперазона часа часа часов часов часа часа часов часов

без Dex с Dex без Оех с Dex без Dex с Dex без Оех с Dex

63 мкг/мл 7±0,6* 24± 1,1* 30±0,3* 41 ±1,3* 54±0,4* 52±2,2* 37±0,4* 69 ±1,6*

125 мкг/мл 16±0,5* 22±1,2 * 27±0,9* 39±1,5* 51±0,8* 50±1,7* 36±0,5* 70 ±1,3*

250 мкг/мл 15±0,6* 19 ±0,8* 22±1,1* 38±1,6* 46±0,4* 47±0,9* 36±0,9* 68 ±2,1*

500 мкг/мл 15±1,0* 16 ±0,6* 17±0,4* 29±1,4* 20±0,6* 35±1,3* 34±0,3* 53 ±2,2*

1000 мкг/мл 13±1,1* 14 ±1,3* 19±0,5* 28±2,0* 8±1,6* 26±0,7* 23±0,7* 57 ±1,5*

Контроль 22±0,7* 31± 2,4* 30±0,4* 47±0,3* 31±0,8* 56±1,4* 40±0,3* 71±2,2*

* р < 0,05

Эффекты Цефепима и Меропенема на апоптоз лимфобластов и лимфоцито нативной крови представлены в таблицах 19 и 20. Общим для апоптотропног действия указанных препаратов является «апоптоз минимальной концентацию продемонстрированный как на модели в нормальных условиях, так и в условия индуцированной иммунодепрессии. В диапазоне концентраций от 40 до 163 мкг/м (для Цефепима) и от 33 до 450 мкг/мл (для Меропенема) при культивации в течени 72 и 120 часов препараты потенцировали проапоптотическое действи дексаметазона (таблицы 19 и 20).

Таблица И

Влияние Цефепима на относительное содержание в культуре апоптотических лимфобластов и лимфоцитов (%) (М ± т) нативной крови в нормальных условиях I условиях индуцированной иммунодепрессии

Концентрации Цефепима 24 часа без Dex 24 часа с Dex 48 часов без Оех 48 часов с Dex 72 часа без Dex 72 часа с Dex 120 часов без Dex 120 часов с Dex

40 мкг/мл 22±0,4* 23 ±1,4* 25±1,7* 47 ±1,8* 41 ±0,4* 74±2,6* 45±0,1* 81±1,8*

80 мкг/мл 19±0,б* 25 ±1,6* 24±1,3* 51 ±2,5* 35±1,9* 70±1,2* 43±0,8* 79±1,4*

163 мкг/мл 17±1,1* 15 ±0,9* 22±1,0* 38 ±1,6* 32±0,1* 66±0,6* 44±0Д* 75±1,1*

326 мкг/мл 15±0,1* 20 ±0,6* 22±0,9* 32 ±0,1* 29±1,6* 57±0,7* 35±0,9* 70±2,2*

650 мкг/мл 14±0,9* 21±1,3* 18±0,3* 27 ±2,1* 26±1,6* 59±0,3* 38±0,7* 72 ±1,5*

Контроль 23±0,5* 30± 1,5* 32±0,7* 45±1,7* 34±1,3* 59±2,4* 39±0,7* 65±1,3*

Таблица 20.

Влияние Меропенема на относительное содержание в культуре апоптотических ггимфобластов и лимфоцитов (%) (М ± ш) нативной крови в нормальных условиях и условиях индуцированной иммунодепрессии

Концентрации Меропенема 24 часа без Оех 24 часа с Оех 48 часов без Оех 48 часов с Оех 72 часа без Оех 72 часа с Оех 120 часов без Оех 120 часов с Оех

33 мкг/мл 21±0,5* 34 ±1,1* 37 ±0,2* 47 ±1,5* 48 ±0,2* 68±0,4* 59±0,2* 66± 1,1*

66 мкг/мл 18±0,2* 33 ±1,2* 31 ±0,9* 40 ± 1,1 * 41 ±0,8* 47±1,0* 55±0,2* 57± 1,0*

112 мкг/мл 16±0,4* 25 ±0,8* 29 ±1,1* 32 ±1,6* 39 ±0,5* 33±0,3* 47±0,8* 51± 1,1*

224 мкг/мл 14±1,1* 24±0,6* 17 ±1,3* 34 ±1,4* 43 ±0,2* 26±1,0* 42±0,2* 47 ±2,1*

450 мкг/мл 15±1,3* 21 ±1,3* 16 ±0,7* 20 ±1,0* 52 ±0,3* 29±0,2* 39±0,9* 34 ±0,6*

Контроль 19±0,2* 26 ±0,9* 29±0,3* 46 ±0,7* 31±0,5* 60±3,4* 43±0,4* 72±2,7*

р < 0,05

Таким образом, во влиянии бета-лактамных антибиотиков на апоптоз пре-В-имфобластов и нормальных лимфоцитов при 72-часовом культивировании ювторяется явление «апоптоза минимальной концентрации», наиболее выраженное ' Цефоперазона и Пиперациллина; кроме того, культивировании клеток с Деропенемом в концентрации 450 мкг/мл наблюдалось повторное повышение юказателя апоптоза (рисунок 11).

60 т 50 } 40 {

% апопто- I

тических 20 -1 клеток I

20 10 т

Контроль

С1 С 2 СЗ

Стандартные концентрации

С 4

-Цефолеразон •

-Пиперациллин

Цефотаксим •

-Цефепим •

-Меропенем !

60 50 -- 40 30 20 10

С 5

'исунок 11. Влияние бета-лактамных антибиотиков на апоптоз лимфобластов и лимфоцитов нативной крови при 72-часовом культивировании в нормальных условиях.

Что касается дексаметазон-индуцированного апоптоза клеточной модели пре-лимфобластов и лимфоцитов из нативной крови, то в данном случае бета-лактамш антибиотики действуют как антиапоптотические агенты; однако для Цефепима Меропенема эффект «апоптоза минимальной концентрации» повторяется, ч приводит к синергизму с дексаметазоном при культивации с минимальньн концентрациями препаратов (рисунок 12).

Стандартные концентрации |—И—Цефотаксим —•— Цефоперазон —Ж—Меропенем —А—Пиперациллин —Цефепим |

Рисунок 12. Влияние бета-лактамных антибиотиков на апоптоз лимфобластов и лимфоцитов (%) нативной крови при 72-часовом культивировании в условиях индуцированной иммунодепрессии.

Исходя из того, что апоптоз не ограничивается каким-либо одним суицид альнь механизмом, а также на основании полученных нами данных, - мож предположить, что в формировании эффекта бета-лактамных антибиотиков процесс программированной гибели клеток лимфоидного ряда принимают участ как минимум три основных механизма.

Как нам представляется, основное дозозависимое антиапоптотическое действ изученных бета-лактамных антибиотиков определяется их антиоксидантной антирадикальной активностями. С точки зрения зависимости «структура активность» объекты исследования отвечают ряду требований, определяющ наличие антиоксидантной и антирадикальной активностей

Это предположение согласуется с тем фактом, что оксидативный стресс являет одним из общих эффекторных механизмов апоптоза. В то же время, отсутств положительной динамики антиапоптотического действия при повышен концентрации препарата может быть связано с влиянием исследованн] антибиотиков на продукцию лимфоцитами определенных цитокинов (например, и ОМ-СБР), способных тормозить или отменять апоптоз клетки. Третий механи:

вязанный с предполагаемой способностью производных бета-лактама снижать лотность рецепторов к интерлейкину 2, мог бы объяснить результаты, выпадающие» из общей когорты.

По-видимому, вероятность доминирования того или иного механизма поптотропного действия антибиотиков на каждой конкретной модели при пределенных условиях культивирования и определяла результирующий эффект репарата, который был измерен методом проточной цитофлуориметрии и выражен проценте апоптотических клеток.

Предложенный нами алгоритм биологической оценки бета-лактамных нтибиотиков по показателю «апоптоз» на моделях клеток лимфоидного ряда ¡п кго с использованием метода проточной цитофлуориметрии представляет собой ледующее (рисунок 13):

Л. Определение концентрационного диапазона исследуемого антибиотика.

I

Б. Подготовка клеточной модели:

• зрелых лимфоцитов периферической крови; • чистой культуры пре-В-лимфобластов;

• пре-В-лимфобластов и лимфоцитов нативной крови. +

В. Культивирование клеток с добавлением исследуемого антибиотики в

выбранном диапазоне концентраций:

• зрелые лимфоциты в условиях активации (ФГА) в течении 4В, 72 часов в нормальных условиях и/или с добавлением дексаметазона в концентрации 10"3мг/мл; • пре-В-лимфобласты клеточной линии в течении 48, 72 и 120 часов в нормальных условиях и/или с добавлением дексаметазона в концентрации 10"3мг/мл; • пре-В-лимфобласты и лимфоциты нативной крови в течении 48, 72 и 120 часов в нормальных условиях и/или с добавлением дексаметазона в концентрации 10*3 мг/мл.

I

Г. Определение количественных показателей апоптоза методом проточной цитофлуориметрии с красителем пропидия йодидом (10 мкл на 1 млн клеток).

I

Д. Сравнением полученных показателей со стандартными показателями, полученными на аналогичных моделях.

I

Е. Выводы.

Рисунок 13. Алгоритм оценки бета-лактамных антибиотиков по показателю апоптоза клеток лимфоидного ряда in vitro.

выводы.

. Использованные модели апоптоза клеток лимфоидного ряда позволяет количественно оценивать программированную клеточную гибель лимфоцитов периферической крови здоровых доноров, пре-В-лимфобластов клеточной линии и мононуклеарных клеток больных пре-В-лейкозом под воздействием бета-лактамных антибиотиков с использованием метода проточной цитофлуориметрии.

.. Определены количественные показатели апоптоза выбранных клеточных моделей под воздействием четырех стандартных концентрацией Пиперациллина, Цефотаксима, Цефоперазона, Цефепима и Меропенема.

. Показано, что исследованные бета-лактамные антибиотики дозозависимо подавляют апоптоз лимфоцитов здоровых доноров при культивировании как в обычных условиях, так и в условиях дексаметазон-индуцированной иммунодепрессии. Наиболее показательный антиапоптотический эффект был продемонстрирован при 48- и 72-часовом культивировании с добавлением митогена (ФГА).

■. Установлено, что исследованные бета-лактамные антибиотики дозозависимо подавляют апоптоз пре-В-лимфобластов клеточной линии при культивировании как в обычных условиях, так и в условиях дексаметазон-индуцированной иммунодепрессии. Наиболее показательными явились результаты культивирования в течение 48, 72 и 120 часов. Выявлена закономерность («апоптоз минимальной концентрации»), заключающаяся в способности исследованных антибиотиков в минимальных концентрациях увеличивать показатель апоптоза пре-В-лимфобластов.

1. Доказано, что исследованные бета-лактамные антибиотики дозозависимо подавляют апоптоз лимфоидных клеток крови больных пре-В-лейкозом при культивировании как в обычных условиях, так и в условиях индуцированной иммунодепрессии, наиболее показательно при 48-, 72- и 120-часовом культивировании. Антиапоптотическое действие бета-лактамных антибиотиков на модели лимфоидных клеток крови больных пре-В-лейкозом сопровождается явлением «апоптоза минимальной концентрации».

). Предложен алгоритм биологической оценки иммунотропной активности бета-лактамных антибиотиков, который может быть использован в доклинических исследованиях указанной фармакотерапевтической группы в целях определения нежелательного апоптотропного действия как одного из параметров безопасности лекарственного вещества.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Решетников С.И., Лоскутова Е.Е., Дорофеева В.В. Возможность использован! фармакоэкономического анализа для оценки методов доклиническо! исследования токсичности антибиотиков/ В сб.: IV Российский национальна конгресс «Человек и лекарство». Тез. докл. - М., 1999. - С. 523.

2. Решетников С.И., Щигленко H.A., Бронин Г.О. Изучения влияния бет лактамных антибиотиков на апоптоз клеток лимфоидного ряда in vitro методо проточной цитофлуориметрии/ В сб.: Материалы II Российской конференщ молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные nayi и прогресс клинической медицины». Тез. докл. - М., 2001. - С. 291.

3. Решетников С.И., Щигленко H.A., Аляутдин Р.Н. Биологическая оценка бет лактамных антибиотиков по показателю апоптоза клеток лимфоидно] человека in vitro// Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2001 №4.-С. 68-71.

4. Решетников С.И., Щигленко H.A. Изучение влияния цефалоспоринов I поколения на программированную клеточную гибель лимфоцитов человека укго//Антибиотики и химиотерапия. - 2001. - № 6.

Актуальность проблемы.

Инфекционные процессы, развивающиеся на фоне иммунодефицита, встречаются в медицинской практике довольно часто [10, 13, 39, 40, 49]. Известно, что больные с нарушениями иммунного статуса при различных заболеваниях (опухоли, сахарный диабет, муковисцидоз, ожоговая болезнь и т.д.) более восприимчивы к инфекции [49]. Исходя из этого, помимо этиотропной или патогенетической терапии, направленной на лечение основного заболевания, необходимым является назначение многоплановой сопроводительной терапии, к которой относится, в том числе, антибактериальная терапия, применяемая с целью профилактики и лечения инфекционных осложнений [20].

Однако практика показывает, что широкое применение антибактериальных средств приводит к развитию нежелательных побочных явлений, одним из которых является собственное влияние антибиотиков на состояние иммунной системы [24, 25, 44]. Большинство исследователей приходит к выводу о неоднозначности действия антибиотиков различных групп на иммунекомпетентные клетки [144].

Таким образом, изучение влияния антибиотиков на показатели иммунного статуса является особенно актуальным, поскольку эти средства часто назначаются на фоне уже имеющегося иммунодефицита [20, 27, 51, 58]. С другой стороны, применение антибиотиков в тех случаях, когда стимуляция иммуногенеза нежелательно (например, при гемобластозах), требует определения влияния препарата как на клоны нормальных, так и бласттрансформированных клеток иммунной системы. Проведение подобных исследований также целесообразно для обоснованного выбора антибактериального средства с наиболее подходящими иммуномодулирующими свойствами с учетом иммунного статуса, а также принимая во внимание прочие лекарственные назначения в конкретном клиническом случае [21].

Как известно, центральную роль в специфическом адаптивном иммунном ответе играют лимфоциты, активно участвующие в процессе поддержания гомеостаза, поэтому на всем протяжении жизненного цикла имеет место интенсивное обновление клеточного лимфоцитарного пула [39, 40]. В основе обновления лежат два противоположных процесса: деление клеток и их гибель [13]. В нормальных условиях пролиферация и гибель лимфоцитов обычно взаимно уравновешены, вследствие чего сохраняется постоянство клеточного состава. Гибель клеток, в свою очередь, может быть реализовано либо путем некроза, либо апоптоза [32]. Некроз клетки является результатом прямого цитотоксического действия на нее внешних повреждающих факторов, приводящих к острому клеточному повреждению и лизису клетки. Апоптоз, или программированная клеточная гибель, является реализацией заложенных в геноме клеток суицидальных механизмов, активным и строго контролируемым процессом самоуничтожения клетки [16, 30, 31, 32, 46, 80, 87]. Апоптоз играет ключевую роль в нормальном обновлении тканей и по-видимому, несет ответственность за прекращение иммунных реакций, в том числе, опосредуемых лимфоцитами [46]. Различные физические и химические агенты, включая лекарственные вещества различных фармакологических групп, могут индуцировать или, напротив, отменять процесс апоптоза клеток лимфоидного ряда, причем апоптотропное действие может быть реализовано как в отношении зрелого лимфоцита, так и более ранних предшественников [21, 32, 56].

Таким образом, широкое применение антибактериальных средства, а также прогресс в области создания и внедрения новых лекарственных субстанций с подобным действием требует разработки методических систем, позволяющих оценить различные аспекты иммунотропного потенциала антибиотика как на этапе доклинической оценки, так в клинической практике в условиях in vitro.

С учетом вышеизложенного, разработка системы биологической оценки бета-лактамных антибиотиков по показателю апоптоза клеток лимфоидного ряда весьма актуальна в качестве одного из обязательных параметров безопасности JIB.

Разработка подобной системы оценки бета-лактамных антибиотиков соответствуют содержанию проекта федеральной программы по созданию и применению комплекса стандартных биотест-систем для научно-исследовательских целей и контроля качества медицинских препаратов. Программа базируется на основных положениях Закона Российской Федерации «О сертификации продукции и услуг» (№ 5151-1 от 10 июня 1993 года) и направлена на гарантированное обеспечение биологической безопасности населения [37].

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилась разработка системы биологической оценки бета-лактамных антибиотиков по показателю апоптоза клеток лимфоидного ряда человека in vitro в обычных условиях и условиях индуцированной иммунодепрессии.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выбрать биологические модели, позволяющие изучить и оценить влияние бета-лактамных антибиотиков на апоптоз клеток лимфоидного ряда человека in vitro.

2. Выбрать метод для количественного анализа апоптоза клеток лимфоидного ряда человека in vitro и разработать оптимальные условия количественного анализа с помощью выбранного метода.

3. Определить количественные показатели и дозозависимость апоптоза моделей клеток лимфоидного ряда человека in vitro под влиянием бета-лактамных антибиотиков в норме и условиях индуцированной иммунодепрессии.

4. Провести сравнительный анализ модулирующего влияния исследуемых бета-лактамных антибиотиков на апоптоз моделей клеток лимфоидного ряда в нормальных условиях и условиях индуцированной иммунодепрессии.

5. Разработать алгоритм системы биологической оценки бета-лактамных антибиотиков по показателю апоптоза на моделях клеток лимфоидного ряда человека in vitro с помощью количественного анализа методом проточной цитофлу ориметрии.

Научная новизна проведенных исследований.

1. Впервые предложен алгоритм системы биологической оценки бета-лактамных антибиотиков по показателю «апоптоз» на моделях клеток лимфоидного ряда in vitro методом проточной цитофлуориметрии.

2. Впервые изучено влияние различных концентраций бета-лактамных антибиотиков на апоптоз клеток лимфоидного ряда человека in vitro методом проточной цитофлуориметрии в обычных условиях.

3. Впервые изучено влияние различных концентраций бета-лактамных антибиотиков на апоптоз клеток лимфоидного ряда in vitro методом проточной цитофлуориметрии в условиях дексаметазон-индуцированной иммунодепрессии.

4. Впервые проведен сравнительный анализ апоптотропного действия исследованных бета-лактамных антибиотиков на моделях клеток лимфоидного ряда.

Практическая значимость.

Предложенная система биологической оценки на модели апоптоза клеток лимфоидного ряда человека in vitro методом проточной цитофлуориметрии может служить основой для изучения апоптотропного действия как уже применяемых бета-лактамных антибиотиков, так и новых препаратов данной группы, находящихся на стадии доклинических исследований.

Разработанная система может быть использована для обоснованного выбора бета-лактамного антибиотика с учетом состояния лимфоцитов и их ранних предшественников в конкретном клиническом случае.

С помощью предложенной системы биологической оценки возможно оценить и спрогнозировать апоптоз клеток лимфоидного ряда человека под воздействием бета-лактамных антибиотиков при различном режиме дозирования и с учетом остальных лекарственных назначений.

Разработанная система отличается высокой чувствительностью, точностью, воспроизводимостью результатов.

Связь целей и задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармакологии фармацевтического факультета «Разработка биологической и хронофармакологической оценки положительного и отрицательного влияния J1C, напитков, пищевых добавок на одноклеточные модели и модели экспериментальных животных». Номер госрегистрации 01970007165.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 13 рисунками и 20 таблицами. Библиографический указатель включает 152 источника, из них 92 -иностранные.

выводы.

1. Использованные модели апоптоза клеток лимфоидного ряда позволяет количественно оценивать программированную клеточную гибель лимфоцитов периферической крови здоровых доноров, пре-В-лимфобластов клеточной линии и мононуклеарных клеток больных пре-В-лейкозом под воздействием бета-лактамных антибиотиков с использованием метода проточной цитофлуориметрии.

2. Определены количественные показатели апоптоза выбранных клеточных моделей под воздействием четырех стандартных концентрацией Пиперациллина, Цефотаксима, Цефоперазона, Цефепима и Меропенема.

3. Показано, что исследованные бета-лактамные антибиотики дозозависимо подавляют апоптоз лимфоцитов здоровых доноров при культивировании как в обычных условиях, так и в условиях дексаметазон-индуцированной иммунодепрессии. Наиболее показательный антиапоптотический эффект был продемонстрирован при 48- и 72-часовом культивировании с добавлением митогена (ФГА).

4. Установлено, что исследованные бета-лактамные антибиотики дозозависимо подавляют апоптоз пре-В-лимфобластов клеточной линии при культивировании как в обычных условиях, так и в условиях дексаметазон-индуцированной иммунодепрессии. Наиболее показательными явились результаты культивирования в течение 48, 72 и 120 часов. Выявлена закономерность («апоптоз минимальной концентрации»), заключающаяся в способности исследованных антибиотиков в минимальных концентрациях увеличивать показатель апоптоза пре-В-лимфобластов.

5. Доказано, что исследованные бета-лактамные антибиотики дозозависимо подавляют апоптоз лимфоидных клеток крови больных пре-В-лейкозом при культивировании как в обычных условиях, так и в условиях индуцированной иммунодепрессии, наиболее показательно при 48-, 72- и 120-часовом культивировании. Антиапоптотическое действие бета-лактамных антибиотиков на модели лимфоидных клеток крови больных пре-В-лейкозом сопровождается явлением «апоптоза минимальной концентрации».

6. Предложен алгоритм биологической оценки иммунотропной активности бета-лактамных антибиотиков, который может быть использован в доклинических исследованиях указанной фармакотерапевтцчгеской группы в целях определения нежелательного апоптотропного действия как одного из параметров безопасности лекарственного вещества.