Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:РЕГЕНЕРАЦИЯ ПЕРИРУБЦОВОЙ ЗОНЫ МИОКАРДА ПРИ КОМБИНИРОВАННОЙ ЛАЗЕРНОЙ РЕВАСКУЛЯРИЗАЦИИ С ИМПЛАНТАЦИЕЙ АУТОЛОГИЧНЫХ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА НА МОДЕЛИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА (

На правах рукописи

□034Э05Э0

Бочарова Антонина Владимировна

Регенерация перирубцовой зоны миокарда при комбинированной лазерной реваскуляризации с имплантацией аутологичных мононуклеарных клеток костного мозга на модели хронической ишемнческой болезни сердца (экспериментальное исследование)

14.03тв3— патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 4 ЯНВ

Новосибирск - 2010

003490590

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени академика Е. Н. Мешалкина Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» (г. Новосибирск)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор кандидат медицинских наук

Ларионов Петр Михайлович

Майбородин Игорь Валентинович Потапова Оксана Валентиновна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Алтайский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (г. Барнаул)

Защита состоится «Ч^» ^ ^ 2010 г. в 10.00 час. на заседании диссертационного совета Д 208.062.05 при Новосибирском государственном медицинском университете (630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52; тел.: (383)229-10-83)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского государственного медицинского университета

Автореферат разослан « 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

А. В. Волков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Ишемическая болезнь сердца (ИБС) занимает одно из ведущих мест среди заболеваний, определяющих уровень смертности среди населения стран с постиндустриальным и индустриальным уровнем общественного развития.

Более того, последние достижения в области хирургии коронарных артерий сердца - это расширяющиеся возможности стентирования, увеличение числа повторных и множественных аорто-коронарных шунтирований.

В то же время именно эти факторы являются значимыми для формирования отряда пациентов, нуждающихся в непрямой реваскуляризации миокарда вследствие прогрессирования основного заболевания и невозможности выполнения прямых оперативных вмешательств на коронарных артериях (Бокерия JI. А., 1998; Salomon N. W. et al., 1990).

Другой важный фактор, ограничивающий возможности прямых методов реваскуляризации - это пациенты с первичным поражением дистального коронарного русла. Для таких пациентов методом выбора остаются варианты непрямой реваскуляризации миокарда, которые включают в себя лазерную реваскуляризацию, имплантацию клеток с ангиогенным потенциалом, а в последние годы приобретает все большее число сторонников метод комбинированной реваскуляризации - лазерной и интрамиокардиальной имплантации клеток (Klein Н. М. et al., 2004; Ларионов П. М. и др., 2004; Gowdak L. et al., 2005; Чернявский А. М. и др., 2007; Караськов А. М. и др., 2007; Gowdak L. Н. et al., 2008).

Эта группа авторов гипотетизирует, что синергизм ангиогенного потенциала клеток костномозгового происхождения и термического воздействия лазерного излучения на миокард может являться могучим инструментом непрямой реваскуляризации миокарда пациентов в конечной стадии ишемической болезни сердца.

Другая группа исследователей полагает, что синергизм воздействия на миокард комбинации «лазер плюс клетки» может реализовываться в плоскости лазерной стимуляции ангиогенеза с одной стороны и в восполнении клеточным материалом дефектного миокарда за счет имплантации в лазерные каналы аутологичных миобластных элементов с другой стороны (Esha 1. et al., 2007).

В то же время на сегодняшний день остается неясной возможность регенерации миокарда «взрослого сердца» вообще и в условиях улучшения

микроциркуляторного русла. Сейчас считается, что кардиомиоциты (КМЦ) сердца человека после года от момента рождения не способны к гиперпластической регенерации, возможна только внутриклеточная регенерация. Более того, рядом авторов было показано, что число кардиомиоцитов в течение жизни не меняется (Chien К. R., Olson Е. N., 2002; MacLellan W. R„ Schneider M. D., 2000).

Однако ряд экспериментальных исследований последних лет и клинических наблюдений в области трансплантологии позволили выдвинуть несколько гипотез клеточного обновления миокарда: 1) регенерация миокарда может происходить за счет пролиферации резидентных (эндогенных) стволовых клеток миокарда при его повреждении; 2) возможно «fusion» или слияние ядер клеток костного мозга (ККМ) с кардиомиоцитами; 3) показана возможность транедифференцировки клеток костномозгового происхождения в кардиоциты (Urbanek К. et al., 2005; Varma J. et al., 2005; Beltrami A. P. et al., 2001 ; Müller Patrick et al., 2002).

Вместе с тем в настоящее время сложилась ситуация, когда энтузиазм клинического применения клеточных технологий для непрямой реваскуляризации миокарда обогнал экспериментальное обоснование использования этих методов, что стало предметом бурных дискуссий в мировом научном сообществе и послужило поводом к обсуждению моратория на проведение новых клинических испытаний (Nadal-Ginard В., V. Fuster, 2007).

Цель экспериментальной работы. Дать комплексную морфологическую характеристику регенерации перирубцовой зоны миокарда в условиях комбинированного воздействия - лазерной реваскуляризации и имплантации мононуклеарных клеток костного мозга на модели хронической ишемической болезни сердца.

Задачи работы:

1. Дать макроскопическую и гистологическую характеристику миокарда перирубцовой зоны модели хронической ишемической болезни сердца у животных (собак);

2. Дать гистологическую характеристику изменений миокарда перирубцовой зоны модели хронической ишемической болезни сердца после лазерной реваскуляризации и имплантации мононуклеарных клеток костного мозга;

3. Оценить микроциркуляторное русло перирубцовой зоны миокарда на модели хронической ишемии без воздействия, а также после лазерной реваскулярнзации с имнлантацией мононуклеарных клеток костного мозга;

4. Оценить регенераторные возможности кардиомиоцитов перирубцовой зоны на модели хронической ишемии без воздействия, а также после лазерной реваскулярнзации с имплантацией мононуклеарных клеток костного мозга.

Научная новизна. Впервые представлена развернутая морфологическая картина изменений сосудистого русла миокарда перирубцовой зоны постннфарктной модели хронической ишемии, включающая особенности перестройки сосудистого русла: облитерацию интрамуральных артерий, перекалибровку венозного русла с уменьшением просветов или формированием многоствольных сосудов, появление в артсриолах «подушечек Конти» за счет эксцентричной пролиферации интимального и медиального слоев.

Также впервые показаны особенности формирования сосудов синусоидного типа перирубцовой зоны миокарда модели ХИБС после комбинированной лазерной реваскуляризации с имплантацией мононуклеарных клеток костного мозга, которые уменьшались в направлении от эпикарда к эндокарду с максимальным диаметром от 1200 мкм до 40 мкм.

Впервые были выявлены своеобразные очаговые инфильтраты из крупных клеток с гиперхромными ядрами неправильной формы, конденсированным хроматином, пенистой или оксифильной цитоплазмой, которые формировали структуры в виде цепочек в местах комбинированной реваскуляризации.

Впервые продемонстрировано, что в местах комбинированной реваскуляризации вместе с увеличением перфузии, плотности артериол и капилляров наблюдается достоверное усиление процессов регенерации кардиоцитов. Это подтверждалось увеличением численной плотности ядер, показателей суммарной площади ядер, процента площади ядер по отношению к миокарду, площади ядра и его «идеального» диаметра, а также увеличением экспрессии РСЫА позитивных кардиоцитов.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в процессе исследования результаты развивают существующие представления о принципиальной возможности регенерации кардиомиоцитов миокарда крупных млекопитающих. Создание и комплексный морфологический анализ модели ХИБС с длительной экспланацией ишемии может послужить фундаментом последующего изучения механизмов регенерации кардиоцитов крупных

млекопитающах с переносом полученных знаний на проявления репарации человеческого сердца в условиях хронической ишемии. В этом смысле нами выявлен важнейший фактор, устраняющий блокаду регенерации кардиоцитов, -устранение циркуляторной гипоксемии за счет комбинированной реваскуляризации миокарда - сочеганного лазерного воздействия и имплантации собственных клеток костного мозга. Комбинированный метод непрямой реваскуляризации миокарда с использованием полупроводникового лазера и аутологичных клеток костного мозга выполняется в рамках ограниченного клинического испытания в хирургической практике Новосибирского НИИ патологии кровообращения имени академика Е. Н. Мешалкина (г. Новосибирск).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Модель ХИБС с формированием постинфарктного рубца 3-х и более месяцев у собаки является адекватным объектом для последующего изучения эффектов реваскуляризации и регенерации миокарда перирубцовой зоны.

2. Лазерная реваскуляризация миокарда в комбинации с имплантацией мононуклеарных клеток костного мозга оказывает акцентированное аугментационное влияние на перестройку сосудистого русла в целом, а в большей степени на микроциркуляторное звено.

3. Наблюдаемое усиление плотности сосудов микроциркуляторного русла в местах проведения комбинированного воздействия - лазерной реваскуляризации миокарда в сочетании с имплантацией мононуклеарных клеток костного мозга - приводит к активации регенераторных процессов в кардиомиоцитах перирубцовой зоны.

Апробация работы. Основные положения, выводы и практические рекомендации доложены на XIII Международной конференции по аэрофизическим методам исследования (Новосибирск, 2007), на Международной научно-практической конференции «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития», посвященной 50-летию НИИ проблем биологической безопасности Национального центра биотехнологий Министерства образования и науки Республики Казахстан (Алматы, 2008), на открытом заседании Ученого совета Новосибирского НИИ патологии кровообращения имени академика Е. Н. Мешалкина (Новосибирск, 2008), на объединенном заседании кафедр анатомии человека, гистологии и эмбриологии, топографической анатомии, патологической анатомии

Новосибирского государственного медицинского университета (Новосибирск. 2009).

Внелрснне результатов исследования. Результаты диссертационной работы и метод оценки регенерации пернрубцовой зоны миокарда на модели хронической ишемической болезни сердца внедрены в практическую деятельность Центра лазерной хирургии и новых технологий Новосибирского научно-исследовательского института патологии кровообращения имени академика Е. Н. Мешалкпна Федерального агентства но высокотехнологичной медицинской помощи.

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, из них 3 - в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК для публикаций основных результатов исследования.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описаний методик исследования и полученных результатов, обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 33 рисунками и 7 таблицами. Список литературы включает 251 источник (31 отечественных и 220 зарубежных авторов).

Личный вклад автора. Весь материал, представленный в диссертации, собран, обработан и проанализирован лично автором.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика материала. В качестве экспериментальных животных были выбраны беспродные собаки (п = 14) массой от 11 до 14 кг, которые содержались в стационарных условиях вивария. Содержание, кормление, уход и выведение из эксперимента животных осуществляли в соответствии с требованиями «Санитарных правил по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (утверждены Главным государственным санитарным врачом СССР от 06.04.73 №1045-73) и приказа № 755 от 12.08.1977 Министерства Здравоохранения СССР «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных».

Общая схема эксперимента: 1) Моделирование острого инфаркта миокарда (ИМ) (п = 14). 2) Спустя три месяца после моделирования острого ИМ выполнялась операция непрямой лазерной реваскуляризации миокарда с

имплантацией МК в сформированные лазерные каналы (п = 9). 3) Выведение 5 животных из эксперимента проводилось через 3 месяца после операции моделирования острого инфаркта миокарда для контрольной группы (п = 5) и через 7 недель после операции реваскудяризации «лазер плюс клетки» (п = 9). На этих этапах осуществлялся забор материала для морфологического анализа.

Методика выполнения моделирования острого инфаркта миокарда, который спустя 3 месяца расценивался в качестве модели хронической ишемическон болезни сердца. Всем животным было проведено моделирование острого инфаркта миокарда, путем перевязки передней межжелудочковой коронарной артерии в средней трети и коллатеральных ветвей первой диагональной артерии в условиях интубационного наркоза. Премедикация осуществлялась внутримышечным введением калипсола 10мг/кг, атропина 0,1 % - 0,1 мг/кг, димедрола 1%-2,0мл, дроперидола 0,8 мг/кг. Затем после утраты болевой чувствительности и наступления сна животное фиксировалось на операционном столе в положении на правом боку. Для исключения гипоксических осложнений во всех случаях проводилась интубация трахеи и последующая искусственная вентиляция легких атмосферным воздухом. Управляемое дыхание осуществлялось с помощью аппарата РО-6. Основной наркоз - калилсол 15 мг/кг в час, дроперидол 0,3 мг/кг в час - вводился вместе с кристаллоидными расстворами (5 % раствор глюкозы, 0,9 % раствор хлорида натрия) путем внутривенных капельных инфузий. Перевязка коронарных артерий выполнялась из левостороннего торакотомного доступа.

Формирование инфаркта миокарда подтверждалось

электрокардиографически и визуально по изменению цвета ишемизированного участка - верхушки левого желудочка, его передней стенки и частично боковой. После моделирования инфаркта выполнялся гемостаз и послойное ушивание раны с оставлением дренажа для эвакуации воздуха. Воздух удалялся после окончания действия наркоза. По окончании вмешательства животные выводились из наркоза. При адекватном самостоятельном дыхании -экстубировались и помешались в клетку с последующим уходом (кормление, прогулки, уборка помещения). Все собаки получали анальгетики и антибактериальную терапию в течение 3 недель после операции.

Особенности оперативного вмешательства при выполнении воздействия трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации с имплантацией аутологичных клеток. При проведении непрямой

реваскуляризации выполнялось стандартное анестезиологическое обеспечение. Специальной подготовки в предоперационном периоде не проводилось, за исключением голодной диеты накануне операции. Премедикация осуществлялась внутримышечным введением калипсола 10мг/кг, атропина 0,1 %- 0,1 мг/кг, димедрола 1%-2,0мл, дроперидола 0,8 мг/кг. Затем после утраты болевой чувствительности и наступления сна животное фиксировалось на операционном столе в положении на правом боку. Для исключения гипоксических осложнений во всех случаях проводилась интубация трахеи и последующая искусственная вентиляция легких атмосферным воздухом. Управляемое дыхание осуществлялось с помощью аппарата РО-6. Основной наркоз - калипсол 15 мг/кг в час, дроперидол 0,3 мг/кг в час - вводился вместе с кристаллоидными растворами (5 % раствор глюкозы, 0,9 % раствор хлорида натрия) путем внутривенных капельных инфузий.

Доступ к сердцу осуществлялся путем левосторонней торакотомии в 4-м межреберье. Производилась перикардиотомия. При помощи полупроводникового лазера «ИРЭ-ПОЛЮС-1,56 мкм» перифокально области постинфарктного рубца переднебоковой стенки левого желудочка (ЛЖ) создавались 8-12 слепых (не проникающих в полость ЛЖ) косонаправленных лазерных каналов. Лазерное излучение подводилось через кварцевый световод в непрерывном режиме мощностью 8 Вт. В образованные каналы иглой 220 вводилась суспензия аутологичных клеток костного мозга в объеме 1,5-2 мл (5 х 10б кл/мл). Эпикардиальное отверстие канала ушивалось предварительно наложенным узловым швом.

Рана грудной клетки ушивалась наглухо с оставлением дренажа для эвакуации из плевральной полости воздуха, который удалялся после окончания операции. Во время операции проводилось постоянное ЭКГ-мониторирование, в случае возникновения фибрилляции желудочков производилась дефибрилляция аппаратом «ДКИ Н-02». Послеоперационный период у всех животных протекал гладко. По окончании вмешательства животные выводились из наркоза. При адекватном самостоятельном дыхании -эксгумировались и помещались в клетку с последующим уходом (кормление, прогулки, уборка помещения). Общее состояние собак оценивалось как удовлетворительное. После экстубации сохранялись адекватное самостоятельное дыхание и стабильная гемодинамика. Не наблюдалось расхождений краев или нагноений послеоперационной раны, а также других

осложнений. Все собаки получали антибактериальную терапию: бициллин-3 600000 ЕД внутримышечно 3 раза в сутки в течение 3 дней после операции.

Получение и диагностика мононуклеариой фракции клеток костного мозга. Для выделения стволовых клеток производили пункцию задней части гребней подвздошной кости. Полученный аспират костного мозга разводили физиологическим раствором (ФР) в соотношении 1:3с добавлением гепарина (из расчета 20 ME гепарина на 1 мл) и центрифугировали в градиенте плотности фиколл-урографин (плотность 1,077) при 400 g в течение 30 мин. Полученную мононуклеарную фракцию костного мозга дважды отмывали в среде RPMI-1640, центрифугируя суспензию при 400 g в течение 5 мин для осаждения клеток и ресуспендировали в среде RPMI-1640 в концентрации 5 х 106 кл/мл. Далее следовала 30-минутная инкубация на пластике с целью изоляции быстроприлипающей фракции мононуклеарных клеток костного мозга. Оставшиеся в суспензии клетки отмывали и ресуспендировали в ФР в концентрации 5 х 106 кл/мл в объеме 1,5-2 мл для последующей имплантации. Суммарное время выделения составляло 2 часа от момента начала пункции подвздошных костей.

В каждом случае выполнялось контрольное окрашивание клеток для определения жизнеспособности клеток в полученной фракции костного мозга. При окрашивании трипановым синим жизнеспособность суспензии превышала 98 % при подсчете 400 клеток.

Rhodamin 123 использовался для определения доли стволовых клеток в суспензии. Окрашивание Rhodamin 123 с концентрацией в растворе 5 цО/мл выявляло 25 -35 % негативных клеток. Время окрашивания 15 минут при комнатной температуре с однократной отмывкой в физиологическом растворе.

Протокол окрашивания Rodamin 123: Инкубационная среда -200 мМ фосфатный буфер (pH 7,4), 2% альбумин, 100 мкМ Rho 123, ЮмкМ верапамила гидрохлорид. Клетки ресуспендировались в 100 мкл инкубационной среды с концентрацией 1 х 106 кл/мл, инкубация при t = 37 °С в течение 150 мин, двукратная отмывка ФР.

Визуализация клеток, окрашенных Rhodamin 123, проводилась с использованием блока стандартных фильтров, возбуждение 450 - 490 nm, регистрация на 515, filter set 09, Carl Zeiss.

Оценка перфузии миокарда с использованием 99тТс. Исследование проводилось в два этапа. Первый этап исследования - оценка перфузии миокарда после перевязки передней нисходящей артерии на фоне хронической

ишемии сердца (исходная перфузия) 3 месяца спустя после моделирования. Изучено 3 животных. Второй этап исследования - оценка перфузии спустя 7 недель после выполнения непрямой реваскуляризацни «лазер плюс клетки». Изучено 1 животное.

Исследование перфузии миокарда до и после операции выполнено на гамма-камере «DIACAM» (Siemens, Германия) в пленарном режиме. В качестве перфузионного агента применялся 99mTc-MIBI, который вводился внутривенно в покое, с активностью 400 - 500 МБк. Запись сцинтиграмм начинали через 30 - 45 минут после введения препарата. Использованы передняя прямая и левая боковая проекции. Время записи одной проекции составляло 3 минуты (на 1 проекцию около 1,5 млн импульсов).

Морфологические методы. При вскрытии животных извлекалось сердце, делались два разреза вдоль межжелудочковой перегородки: один - от верхушки ЛЖ к фиброзному кольцу аортального клапана и фиброзному кольцу митрального клапана, другой - от верхушки правого желудочка к фиброзному кольцу легочного ствола и фиброзному кольцу трикуспидального клапана. Сердца отмывались в воде, фиксировались в 4-процентном нейтральном растворе формалина. После фиксации сердца взвешивались, оценивалось состояние рубца, особенности формирования аневризм ЛЖ, их размеры.

Из препаратов сердец вырезались участки миокарда по заранее оставленным шовным меткам области выполнения лазерных каналов с имплантацией клеток. В среднем на одно сердце забиралось по 12 тканевых фрагментов, из которых изготавливались криостатные серийные срезы толщиной 7 мкм, в количестве от 10 до 15. В среднем на стекло монтировалось 4 среза, для последующего окрашивания гематоксилином-эозином и по методу Ван-Гизон, с последующей обзорной микроскопией. Срезы монтировались на подготовленные предметные стекла с нанесенной на них 2-процентной желатиной. Для приготовления гистологических образцов был использован криостат «Microm» НМ-550, Carl Zeiss, Германия.

Морфологическая оценка плотности артериол и капилляров. Использовано по 4 тканевых фрагмента миокарда левых желудочков, размерами 0,5 х 0,5х 0,4 (см) от каждого из анализируемых сердец, всего 56 фрагментов. Следует отметить, что фрагменты миокарда перирубцовой области иссекались не далее 10 мм от края рубца так же, как и готовились пробы из тканей сердец при использовании комбинированной реваскуляризацни - «лазер плюс клетки». Из каждого фрагмента

изготавливалось от 8 до 12 срезов. Срезы монтировались на подготовленные предметные стекла с нанесенным на них L-polylisin (Sigma).

Для оценки плотности артериол использовалась реакция на выявление щелочной фосфатазы. Среда для демонстрации щелочной фосфатазы - 25 мг нафтола AS-B1 фосфата растворяли в 0,5 мл N.N-диметилформамида, затем добавляли 50 мл 0,1 M трис-HCl буфера pH 9,2. Реакцию оценивали визуально, среднее время проведения реакции 1,5 часа. Затем следовала отмывка в 3 порциях дистиллированной воды, ядра докрашивались гематоксилином. Готовились постоянные препараты.

На микроскопе Axioskop FL-40 с камерой AxioCam MRc, Carl Zeiss, готовились изображения с использованием объектива A-Plan хЮ конечное увеличение 130 крат, затем с помощью программного пакета AxioVision 3.1 и модуля полуавтоматических измерений выполнялся анализ.

Для оценки микроциркуляторного русла криоетагные срезы окрашивались изолектином GS-IB4, меченным флюорофором AlexaFluor 594 (Invitrogen Lot. 404250) в концентрации 1 : 100 на 0,1 % МФСБ с использованием Multi-Shaker PSU-20 на протяжении 11 часов при комнатной температуре, затем следовала отмывка в 4 сменах 0,1 % МФСБ по 10 минут, в качестве среды для заключения под покровное стекло использовался раствор: 1 часть глицерина и 9 частей 0,1 % МФСБ. К особенностям подсчета капилляров миокарда на полученных имиджах относилось следующее: учитывались волокна миокарда с поперечным профилем, которые включались в анализируемые площади при их выделении. Затем другим инструментом -маркером - в выделенной площади отмечались позитивно окрашиваемые капилляры. После выделения зон интереса их площади вычислялись автоматически в микронах. Для анализа изображений использовали программно-аппаратный комплекс на базе микроскопа Axioskop FL-40 с камерой AxioCam MRc, Carl Zeiss, программный пакет Axio Vision 3.1, его программные модули ручных измерений и для получения изображений, модуль MultiChannel, объектив Plan-Neofluar х40 с конечным увеличением 460 крат, блоками фильтров (filter set 00 BR 530-585, FT 600, LP615 и filter set 09 BR 450490, FT 510, LP515 Carl Zeiss).

Флюоресцентная кариометрия миокарда в зонах комбинированной реваскуляризации и у животных с моделью ХИБС. Использовано по 2 тканевых фрагмента миокарда левых желудочков, размерами 0,5 х 0,5х 0,4 (см) от каждого из анализируемых сердец, всего 28 фрагментов.

Фрагменты миокарда перирубцовой области иссекались не далее 10 мм от края рубца так же, как готовились пробы из тканей сердец при использовании комбинированной реваскуляризации - «лазер плюс клетки». Из каждого фрагмента изготавливалось от 8 до 12 срезов. Срезы монтировались на подготовленные предметные стекла с нанесенным на них L-polylisin (Sigma). Окрашивались в водном растворе, содержащем lO^G/mL elhidium bromide (флюоресцентного ядерного красителя), продолжительность окрашивания 9 минут при комнатной температуре.Затем 4 отмывки в дистиллированной воде но 4 минуты в каждой порции, монтировались покровные стекла. Для монтирования использовалась водосодержащая среда на основе поливинила.

Карио-денситометрический флюоресцентный анализ выполнен с использованием модуля автоматических измерений. Программа модуля готовилась с активацией маск-фильтров Sigma, Treshold, Size, Sharpening, Segmentation (для исключения или включения объектов при анализе). Использован однофазный режим. Были заданы следующие аналитические параметры: средняя численная плотность ядер на тестовую площадь (М± ш), средняя сумма площадей ядер на тестовую площадь (М ± т, мкм2), средний процент площади ядер на 100% тестовой площади миокарда (М ± т, %), средняя площадь ядра (М ± т, мкм2), средний «идеальный» диаметр ядра, исходя из средней площади миокарда (М ± т, мкм2), денситометрический максимум ядер кардиоцитов в DensitometrcUnit, денситометрический минимум ядер кардиоцитов в DensitometrcUnit. Аналитическое увеличение 630 крат, тестовая площадь одного изображения 39437 мкм2.

Для получения изображений и их последующего анализа флюоресценции ядер миокарда использовался микроскоп М200 с камерой AxioCam HRc, Carl Zeiss, программный пакет AxioVision 4.7, его программный модуль полуавтоматических измерений, объектив Neofluar хбЗ с конечным увеличением 640 крат, блоком фильтров (filter set 00 BR 530-585, FT 600, LP615).

Иммуногнстохимическая реакция на определение ядерного протеина (PCNA) в зонах комбинированной реваскуляризации и с моделью

ХИБС. Также проведена иммуногнстохимическая реакция на определение ядерного протеина (PCNA) методом двойного мечения. В соотношении 1 : 90 готовился окрашивающий раствор антител против PCNA (Rb.pol.Ab, Lot.473985, Ab.2426-1) с инкубацией в течение ночи при температуре +4 °С, затем после отмывок следовало окрашивание со вторыми антителами (Goat

pAb to Rb IgG меченных FITC, Lot.459401, ab.6717-1) в концентрации 1 : 200 2 часа при комнатной температуре с использованием орбитального шейкера, после отмывок выполнено контрокрашивание ядер водным раствором DAPY (Sigma) 50 (iG/mL, в течение 30 минут, после отмывки - заключение под покровные стекла.

Готовились 2-канальные изображения с использованием программного модуля Multichenal Zeiss с блоками фильтров (filter set 38 BR470-40, FT495, BR525-50 - для канала F1TC; filter set 49 G 365, FT 395, BR 445-50 - для канала DAPY). Объектив Neofluar хбЗ, блоком фильтров (filter set 00 BR 530-585, FT 600, LP615).

Статистические методы исследования. Статистический анализ результатов выполнен с помощью программных пакетов Microsoft Excel и OriginPro 7.0 с использованием критериев ANOVA в доверительном интервале Р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Макроскопический анализ сердец. Масса сердец в контрольной группе модели ХИБС (п = 5) варьировала в пределах от 38 до 50 граммов, в группе с воздействием на перирубцовую область миокарда от 34 до 56 граммов. В 3 из 5 наблюдений контрольной группы и в 6 наблюдениях из 9 группы с воздействием на перирубцовую область выявлялись аневризмы ЛЖ с максимальными размерами 4 х 4,5 (см) и минимальными 2,5 х 2,5 (см), где первая величина - длинник, ориентированный от верхушки к базальной части сердца, и второй размер - поперечник, перпендикулярно ориентированный длиннику. Аневризмы всегда распространялись на переднюю стенку и верхушку с вовлечением боковой стенки ЛЖ. Во всех других наблюдениях, если аневризма не определялась, обнаруживался грубый трансмуральный рубец, сопровождавшийся склерозом эндокарда и эпикарда в его проекции.

Завершая макроскопический анализ, можно с уверенностью говорить о том, что модель ХИБС сопровождалась грубыми изменениями миокарда ЛЖ с захватом верхушки, передней и боковой стенок, что не могло не сказываться на контрактилыюй функции сердца; нарушение в этих областях перфузии, вероятнее всего, и приводило к сердечной недостаточности.

Гистологическая характеристика миокарда перирубцовой зоны модели ХИБС. Главной морфологической чертой, характеризующей изменения миокарда в нашем эксперименте, были обширные рубцовые поля,

распространяющиеся от субэпикардиального слоя миокарда через все слои к эндокарду. Наряду с этим наблюдалось своеобразное «запустевание» сосудистого русла как крупных артериальных и венозных сосудов, так и мелких артериол и венул.

Сам процесс «запустевания» мог реализовываться в облитерации просветов за счет интимальной и даже в большей степени пролиферации медиального слоев в сочетании с адвентициальным фиброзом, хотя можно было наблюдать процесс, который больше напоминал организацию тромботических масс в просветах коронарных артерий. В артериолах изменения часто напоминали формирование подушечек Конти. Подобные изменения обнаруживались чаще в рубцовой зоне или участках, непосредственно примыкающих к ней. Кроме того, другим механизмом сосудистого морфогенеза, наблюдаемого в миокарде модели хронической ишемической болезни сердца, была перекалибровка сосудов и/или формирование многоствольных сосудов.

К постоянным морфологическим симптомам, также появляющимся в подавляющем числе наблюдений, относится жировое замещение миокарда преимущественно субэпикардиального слоя и распространяющегося до среднего слоя. При подобном развитии событий можно было наблюдать крупные группы мышечных волокон, окруженных клегчаткой. К другим вспомогательным симптомам, характеризующим модель ХИБС, мы относили выраженный отек миокарда, присутствие в рубцовой и перирубцовой зонах очаговых лимфоцитарных инфильтратов и значительную гипертрофию отдельных мышечных волокон.

Гистологическая характеристика миокарда перирубцовой зоны модели ХИБС при комбинированной реваскуляризации. При обзорной микроскопии мест проведения комбинированного воздействия «лазер плюс клетки» можно выделить ряд постоянных морфологических черт. Формирование своеобразного участка склеротической ткани с высокой степенью неоваскуляризации (своеобразие заключалось в продольной упорядоченности фиброзированных волокон и поперечной ориентации просветов мелких от 15 до 40 мкм в диаметре кровенаполненных сосудов). Кроме того, можно утверждать, что другим важнейшим морфологическим признаком было формирование крупных, более 1000 мкм, тонкостенных, синусоидального типа, часто кровенаполненных сосудов, местами сливавшихся между собой и ориентированных на границу рубцовой зоны или

располагающихся непосредственно в зоне рубца. Кроме того, к постоянным гистологическим «симптомам» можно отнести образование тонкостенных сосудов синусоидного типа, меньших диаметром, от 40 до 500 мкм, которые всегда ориентированы на зону воздействия. Нами была выявлена определенная закономерность: синусоидальные сосуды уменьшались в направлении от эпикарда к эндокарду. Следующим по значимости и постоянно встречающимся гистологическим симптомом было явление интрамиокардиального ангиоматоза. Наблюдалось характерное для ангиоматоза формирование ангиальных структур по типу «сосуда в сосуде», которые также выявлялись в зоне воздействия. И последней постоянной морфологической чертой мест воздействия на миокард являлось присутствие очаговых инфильтратов из крупных клеток с гиперхромными, неправильной формы ядрами, пенистой или оксифильной цитоплазмой с пролиферативной активностью, частью многоядерных. Эти гиперхромные клетки с преобладанием цитоплазмы или ядра часто формировали своеобразные цепочки.

Анализ микроциркуляции миокарда по данным сцинтиграфии при моделировании ХИБС и комбинированной реваскулярнзации. У всех трех животных с моделью ХИБС выявлены распространенные дефекты перфузии в области передней стенки ЛЖ, частично боковой стенки ЛЖ, которые захватывали всю верхушку.

Результаты комбинированной реваскулярнзации на миокард показали, что воздействие на периинфарктную область комбинированного метода привело к увеличению перфузии на 50 % в верхушечном сегменте и полному исчезновению дефекта перфузии по боковой стенке левого желудочка в сопоставлении с исходным дефектом перфузии 100 % модели ХИБС.

Результаты оценки микроциркуляции перирубцовой зоны при моделировании ХИБС и комбинированной реваскулярнзации по выявлению в эндотелии сосудов (артериол) щелочной фосфатазы. Анализировались только поперечные контуры позитивно окрашиваемых сосудов, от темно-коричневого до черного цвета. Если встречались косо-продольные или продольные контуры сосудов, они не учитывались при морфометрическом анализе. В таблице 1 представлены материалы, послужившие предметом изучения, суммарное количество анализируемых артериол и сумма анализируемых площадей по группам (мкм2). Из данных, представленных в таблице 1, видно, что плотность сосудов миокарда в зоне воздействия «лазер плюс клетки» достоверно выше.

Таблица 1

Суммарная площадь анализируемого миокарда, общее количество анализируемых артернол, средняя численная плотность артериол_

Миокард Суммарная площадь . Общее количество ! Средняя численная

перирубцовой анализируемого , анализируемых | плопкмпь артериол на 1,

области ; миокарда (мм2) I артериол (п) ! (мм!), М ± т

Контроль ХИБС |_92.57

8832 : 95,4 ±0.4 |

13728 ! 124,3 = 4,7* !

Реваскуляризация |_110.44

* Р < 0,05 при сравнешш данных контроля с воздействием «лазер плюс клетки» по критериям Л NOVA one way

Результаты морфо.метрическоп оценки микроциркуляции перирубцовой зоны модели ХИБС и при комбинированной реваскуляризацни при окрашивании нзолектином В4. В таблице 2 представлены материалы, послужившие предметом изучения, суммарное количество анализируемых капилляров и сумма анализируемых площадей по группам (мкм2).

Таблица 2

Суммарная площадь анализируемого миокарда, общее количество анализируемых капилляров миокарда

Миокард перирубцовой области Суммарная площадь анализируемого миокарда (мкм2) Общее количество анализируемых капилляров миокарда (п)

Контроль ХИБС 1218236,8 2612

Реваскуляризация 3402319 9998

Последующий статистический анализ показал достаточность этого объема наблюдений для установления закономерности изменений микроциркуляторного русла миокарда постинфарктной перирубцовой области без воздействия и при комбинированной реваскуляризацни.

В таблице 3 представлена численная плотность капилляров и капиллярно-паренхиматозного соотношения, показывающие особенности

микроциркуляторного русла.

Таблица 3

Средняя численная плотность капилляров и средняя площадь миокарда , приходящаяся на 1 капилляр

Миокард перирубцовой области Средняя численная плотность капилляров на 1 (мм2), М ± m Средняя площадь миокарда в мкм2, приходящаяся на 1 капилляр (капиллярно-паренхиматозное соотношение), М ± ш

Контроль ХИБС 2144 ±93,6 466,4 ± 19,1

Реваскуляризация 2938 ±68,8* 340,3 ± 8,77*

* Р < 0,05 при сравнении данных контроля с воздействием «лазер плюс клетки» по критериям ANOVA one way

Анализ результатов, представленных в таблице 4, показывает значимое увеличение численной плотности ядер кардиоцитов в группе с воздействием на миокард «лазер плюс клетки» при сравнении с численной плотностью ядер кардиоцитов нерирубцовой зоны миокарда модели постинфарктного рубца. В то же время суммарная площадь изучаемых объектов и количество изученных ядер оказались достаточными для проведения статистического анализа.

Таблица 4

Суммарная площадь анализируемого миокарда, общее количество анализируемых ядер миокарда, средняя численная плотность ядер

Миокард перирубцовой области Суммарная площадь ан&пизируемого миокарда (мкм2) Общее количество анализируемых ядер миокарда(п) Средняя численная плотность ядер на тестовую площадь 39437 мкм2 М ± m

ХИБС 3432811 1915 22.0 ± 1,52

Реваскуляризация 2755278 2075 29,7 ± 1,32*

* Р < 0,05 при сравнении данных контроля с воздействием «лазер плюс клетки» по

критериям ANOVA one way

Абсолютные показатели суммарной площади ядер кардиоцитов на тестовую площадь 39437мкм2, представленные в таблице 5, относительные показатели среднего процента площади ядер кардиоцитов, уровень экспрессии ядерного пролиферативного антигена значимо и достоверно возрастают при комбинированной реваскуляризации прерирубцовой области миокарда.

Таблица 5

Средняя сумма площади ядер на тестовую площадь, средняя численная плотность позитивных PCNA ядер и средний процент площади ядер на 100 % тестовой площади.

Миокард перирубцовой области Средняя сумма площадей ядер на тестовую площадь (39437 мкм2) М ± m Средняя численная плотность позитивных PCNA ядер на тестовую площадь (39437 мкм2) М ± m Средний процент площади ядер на 100% тестовой площади миокарда (%) М ± т

ХИБС 465,6 ±37,1 3,66 ±0,23 1,18 ±0,094

Реваскуляризация 972,3 ±98,2* 5,83 ± 0,36* 2,19 ± 0,122*

* Р < 0,05 при сравнении данных контроля с воздействием «лазер плюс клетки» по критериям ANOVA one way

Продолжая тему кариометрии кардиоцитов, в таблице 6 представлены результаты, показывающие общее увеличение средних абсолютных размеров

самого ядра, его площади и «идеального» диаметра при комбинированной реваскуляризации в сравнении с контролем - моделью ХИБС.

Таблица 6

Средняя площадь ядра кардиоцига, средний «идеальным» диаметр ядра исходя из предварительных расчетов средней площади ядра кардиоцита

Миокард перирубцовой области Средняя площадь ядра (мкм2), МтЩ Средний «идеальный» диаметр ядра, исходя из его средней площади (мкм2), М ± m

Контроль ХИБС 21,0 ±0,38 5,02 ±0,04

Реваскулярнзация 32,6 ±0,64* 6,04 x 0,04*

* Р < 0,05 при сравнении данных контроля с воздействием «лазер плюс клетки» по критериям ANOVA one way

В таблице 7 представленные денситометрические результаты показывают, что нет различий в максимальном и минимальном уровне флюоресценции, что, в свою очередь, отражает однородность ядер и, как следствие этого, однородность состояний анализируемых групп кадиоциов из контроля ХИБС и после комбинированной реваскуляризации.

Таблица 7

Денситометрические показатели

Денситометрические показатели ядер кардиоцитов в красном спектре, оценка в Оепвкоте^сипи миокард перирубцовой зоны Денситометрический максимум ядер кардиоцитов DensitometrcUnit Денситометрический минимум ядер кардиоцитов DensitometrcUnit

Контроль ХИБС 5896.4 ± 15,8 3460,6 ± 2,06

Реваскулярнзация 5866,9 ± 11,8 3433,7 ±1,52

ВЫВОДЫ

1. Модель хронической ишемической болезни сердца характеризуется развитием трансмиокардиального постинфарктного рубца с формированием в 2/3 наблюдений аневризм ЛЖ, захватывающих верхушку, переднюю и частично боковую стенки. К гистологическим особенностям, кроме трансмурального фиброза и жирового замещения субэпикардиального слоя миокарда, необходимо отнести перестройку сосудистого русла. Перестройка реализовывается в облитерации интрамуральных артерий, перекалибровке венозного русла с уменьшением просвета сосудов или формировании многоствольных сосудов, в артериолах и венулах миокарда определялись

«подушечки Конти» за счет эксцентричной пролиферации интимального и медиального слоев; кроме того, всегда определялся отек стромы миокарда.

2. Гистологические изменения миокарда перирубцовой зоны модели ХИБС после лазерной реваскуляризации и имплантации мононуклеарных клеток костного мозга характеризовались появлением крупных и средне-мелких тонкостенных сосудов синусоидного типа, уменьшающихся в направлении эндокарда, диаметром от 1200 мкм до 40 мкм, очаговым умеренным ангиоматозом, присутствием очаговых инфильтратов из крупных клеток с гиперхромными ядрами неправильной формы, конденсированным хроматином, пенистой или оксифильной цитоплазмой, часто формирующих цепочки.

3. Микроциркуляторное русло перирубцовой зоны миокарда модели ХИБС после комбинированной реваскуляризации характеризовалось увеличением перфузии, по данным сцинтиграфии, от 50% до 100 % в местах ранее существовавших дефектов перфузии, а также достоверным увеличением средней численной плотности капилляров - 2938 на 1 мм2 против 2144 на 1 мм2 в модели ХИБС без реваскуляризации, артиериол - 124,3 на 1 мм2 против 95,4 на 1 мм2 (Р < 0,05). Капиллярно-паренхиматозное соотношение показывало достоверное (Р < 0,05) уменьшение площади миокарда, приходящейся на 1 капилляр, в группе животных с комбинированной реваскуляризацией 340,3 мкм2 против 466,4 мкм2 при сравнении с моделью ХИБС без реваскуляризации.

4. Найдено усиление регенерации кардиомиоцитов при комбинированной реваскуляризации перирубцовой зоны миокарда против модели ХИБС без реваскуляризации, что достоверно (Р < 0,05) подтверждалось увеличением численной плотности ядер кардиомиоцитов, показателей суммарной площади ядер, процента площади ядер по отношению ко всему миокарду, площади ядра и его «идеального» диаметра, а также увеличение РС!ЧА позитивных ядер кардиомиоцитов.

5. Увеличение перфузии миокарда и аугментационные изменения микрососудистого русла при комбинированной реваскуляризации перирубцовой зоны сочетаются с усилением процессов регенерации кардиомиоцитов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В практической и исследовательской работе патологоанатома, для оценки репаративного потенциала кардиомиоцитов, мы можем рекомендовать

иммуногистохимичсский анализ с использованием антител против PCNA, а так же флгооримегрические показатели ядер кардиомиоцигов увеличением численной плотности ядер кардиомиоцитов, показателей суммарной площади ядер, процента площади ядер по отношению ко всему миокарду, площади ядра и его «идеального» диаметра.

2. Полученные результаты позволяют рекомендовать в качестве обьекта реваскуляризации сердца крупных животных (собак) с постинфарктной моделью и сроком от момента моделирования инфаркта миокарда не менее 12 недель.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Морфофункциональная и молекулярно-гснетическая оценка экспериментальных результатов вариантов непрямой реваскуляризации с использованием различных клеток костномозгового происхождения / А. М. Ка-раськов, П. М. Ларионов, А. М. Чернявский, Д. В. Субботин, Д. С. Сергеевичев,

A. В. Фомичев, А. В. Бочарова, В. Ю. Бондарь, М. А. Чернявский, И. В. Терехов, В. С. Холодкин // Патология кровообращения и кардиохирургия. - 2007. - № 4. - С. 75 - 81.

2. Регенерация перирубцовой зоны миокарда при комбинированной реваскуляризации (лазер плюс клетки) на модели хронической ишемической болезни сердца / П. М. Ларионов, А. М. Чернявский, В. И. Бондарь, А. В. Бочарова, Д, В. Субботин, Д. С. Сергеевичев, Р. Б. Наврузов, А. М. Караськов // Патология кровообращения и кардиохирургия. - 2009. - № 3. С. 83 - 85.

3. Регенерация кардиомиоцитов перирубцовой зоны миокарда при лазерном тоннелировании и имплантации мононуклеарных клеток костного мозга / П. М Ларионов, А. М. Чернявский, И. В. Кузнецова, Е. Л. Лушникова,

B. Ю. Бондарь, Е. В. Углова, А. В. Бочарова, О. А. Субботина, Л. М. Непомнящих, А. М. Караськов // Клеточные технологии в биологии и медицине. -2009,-№4.-С. 201 -205.

4. Сравнительная морфо-функциональная оценка различных методов непрямой реваскуляризации миокарда в эксперименте / А. М. Чернявский, П. М. Ларионов, А. В. Фомичев, М. А. Чернявский, Д. В. Субботин, Д. С. Сергеевичев, В. Ю. Бондарь А. В. Бочарова // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2007. - № 6. - С. 30 - 36.

5. Directed angiovascular genesis / P. M. Larionov, A. M. Chernyavsky, V. U. Bondar, U. A. Boyarskih, M. M. Potapenko, D. V. Subbotin, D. S. Sergeye-

vichev, I. N. Terehov, A. V. Fomichev, A. V. Bocharova, A. M. Karaskov // XIII International conference on the Methods of Aerophysical research. -Novosibirsk, 2007. - P. 98 - 102.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИМ - инфаркт миокарда

ККМ - клеток костного мозга

КМЦ - кардиомиоцит

ЛЖ - левый желудочек

МФСБ - молекулярный фосфатно-солевой буфер

РСЫА - клеточный пролиферативный ядерный протеин

ФР - физиологический раствор

ХИБС - хроническая ишемическая болезнь сердца

Подписано в печать Бумага офсетная. Гарнитура Тайме Нью Роман Заказ 948. Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии ООО «Азбука» г. Барнаул, пр. Красноармейский, 98а тел. 62-91-03, 62-77-25 E-mail: azbuka@dsmail.ru

Актуальность исследования

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) занимает одно из ведущих мест среди заболеваний, определяющих уровень смертности среди населения стран с постиндустриальным и индустриальным уровнем общественного развития.

Более того, последние достижения в области хирургии коронарных артерий сердца - это расширяющиеся возможности стентирования, увеличение числа повторных и множественных аорто-коронарных шунтирований.

В то же время именно эти факторы являются значимыми для формирования отряда пациентов, нуждающихся в непрямой реваскуляризации миокарда вследствие прогрессирования основного заболевания и невозможности выполнения прямых оперативных вмешательствах на коронарных артериях (Бокерия J1.A., 1998; Salomon N. W. et al., 1990).

Другой важный фактор, ограничивающий возможности прямых методов реваскуляризации - это пациенты с первичным поражением дистального коронарного русла. Для таких пациентов методом выбора остаются варианты непрямой реваскуляризации миокарда, которые включают лазерную реваскуляризацию, имплантацию клеток с ангиогенным потенциалом, а в последние годы приобретает все большее число сторонников метод комбинированной реваскуляризации - лазерной и интрамиокардиальной имплантации клеток (Klein Н.М. et al., 2004; Ларионов П.М. и др., 2004; Gowdak L. et al., 2005; Чернявский A.M. и др., 2007; Караськов A.M. и др., 2007; Gowdak L.H. et al., 2008).

Эта группа авторов гипотетизирует, что синергизм ангиогенного потенциала клеток костномозгового происхождения и термического воздействия лазерного излучения на миокард может являться могучим инструментом непрямой реваскуляризации миокарда пациентов в конечной стадии ишемической болезни сердца.

Другая группа исследователей полагает, что синергизм воздействия на миокард комбинации «лазер плюс клетки» может реализовываться в плоскости лазерной стимуляции ангиогенеза с одной стороны и восполнении клеточным материалом дефектного миокарда за счет имплантации в лазерные каналы аутологичных миобластных элементов (Esha I. et al., 2007).

В то же время на сегодняшний день остается неясной возможность регенерации миокарда «взрослого сердца» вообще и в условиях улучшения микроциркуляторного русла. Сейчас считается, что кардиомиоциты (КМЦ) сердца человека после года от момента рождения не способны к ги перил астической регенерации, возможна только внутриклеточная регенерация. Более того, рядом авторов было показано, что число кардиомиоцитов в течение жизни не меняется (Chien K.R., Olson E.N., 2002; MacLellan W.R., Schneider M.D., 2000).

Однако ряд экспериментальных исследований последних лет и клинических наблюдений в области трансплантологии позволили выдвинуть несколько гипотез клеточного обновления миокарда:

- регенерация миокарда может происходить за счет пролиферации резидентных (эндогенных) стволовых клеток миокарда при его повреждении;

- возможно «fusion» или слияние ядер клеток костного мозга (ККМ) с кардиомиоцитами;

- возможна транедифференцировка клеток костномозгового происхождения в кардиомиоциты (Urbanek К. et al., 2005; Vanna J. et al., 2005; Beltrami A.P., et al. 2001; Müller Patrick et al., 2002).

Вместе с тем в настоящее время сложилась ситуация, когда энтузиазм клинического применения клеточных технологий для непрямой реваскуляризации миокарда обогнал экспериментальное обоснование использования этих методов, что стало предметом бурных дискуссий в мировом научном сообществе и послужило поводом к обсуждению моратория на проведение новых клинических испытаний (Тч[ас1а1-Отагс1 В., V. Р^ег, 2007).

Цель экспериментальной работы. Дать комплексную морфологическую характеристику регенерации перирубцовой зоны миокарда в условиях комбинированного воздействия - лазерной реваскуляризации и имплантации мононуклеарных клеток костного мозга на модели хронической ишемической болезни сердца.

Задачи работы:

1. Дать макроскопическую и гистологическую характеристику миокарда перирубцовой зоны модели хронической ишемической болезни сердца у животных (собак);

2. Дать гистологическую характеристику изменений миокарда перирубцовой зоны модели хронической ишемической болезни сердца после лазерной реваскуляризации и имплантации мононуклеарных клеток костного мозга;

3. Оценить микроциркуляторное русло перирубцовой зоны миокарда на модели хронической ишемии без воздействия, а так же после лазерной реваскуляризации с имплантацией мононуклеарных клеток костного мозга;

4. Оценить регенераторные возможности кардиомиоцитов перирубцовой зоны на модели хронической ишемии без воздействия, а так же после лазерной реваскуляризации с имплантацией мононуклеарных клеток костного мозга.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Модель ХИБС с формированием постинфарктного рубца 3-х и более месяцев у собаки является адекватным объектом для последующего изучения эффектов реваскуляризации и регенерации миокарда перирубцовой зоны.

2. Лазерная реваскуляризация миокарда в комбинации с имплантацией мононуклеарньгх клеток костного мозга оказывает акцентированное аугмептационное влияние на перестройку сосудистого русла в целом, а в большей степени на микроциркуляторное звено.

3. Наблюдаемое усиление плотности сосудов микроциркуляторного русла в местах проведения комбинированного воздействия - лазерной реваскуляризации миокарда в сочетании с имплантацией мононуклеарных клеток костного мозга - приводит к активации регенераторных процессов в кардиомиоцитах перирубцовой зоны.

Научная новизна.

Впервые представлена развернутая морфологическая картина изменений сосудистого русла миокарда перирубцовой зоны постинфарктной модели хронической ишемии, включающая особенности перестройки сосудистого русла: облитерацию интрамуральных артерий, перекалибровку венозного русла с уменьшением просветов или формированием многоствольных сосудов, появление в артериолах «подушечек Конти» за счет эксцентричной пролиферации интимального и медиального слоев.

Так же впервые показаны особенности формирования сосудов синусоидного тина перирубцовой зоны миокарда модели ХИБС после комбинированной лазерной реваскуляризации с имплантацией мононуклеарных клеток костного мозга, которые уменьшались в направлении от эпикарда к эндокарду с максимальным диаметром от 1200мкм до 40мкм.

Впервые были выявлены своеобразные очаговые инфильтраты из крупных клеток с гиперхомными ядрами неправильной формы, конденсированным хроматином, пенистой или оксифильной цитоплазмой, которые формировали структуры в виде цепочек в местах комбинированной реваскуляризации.

Впервые продемонстрировано, что в местах комбинированной реваскуляризации вместе с увеличением перфузии, плотности артериол и капилляров наблюдается достоверное усиление процессов регенерации кардиомиоцитов. Это подтверждалось увеличением численной плотности ядер, показателей суммарной площади ядер, процента площади ядер по отношению к миокарду, площади ядра и его «идеального» диаметра, а так же увеличением PCNA позитивных кардиомиоцитов.

Теоретическая и практическая значимость.

Полученные в процессе исследования результаты развивают существующие представления о принципиальной возможности регенерации кардиомиоцитов миокарда крупных млекопитающих. Создание и комплексный морфологический анализ модели ХИБС с длительной экспланацией ишемии может послужить фундаментом последующего изучения механизмов регенерации кардиоцитов крупных млекопитающих с переносом полученных знаний на проявления репарации человеческого сердца в условиях хронической ишемии. В этом смысле нами выявлен важнейший фактор, устраняющий блокаду регенерации кардиоцитов -устранение циркуляторной гипоксемии за счет комбинированной реваскуляризации миокарда - сочетанного лазерного воздействия и имплантации собственных клеток костного мозга. Комбинированный метод непрямой реваскуляризации миокарда с использованием полупроводникового лазера и аутологичных клеток костного мозга выполняется в рамках ограниченного клинического испытания в хирургической практике Новосибирского НИИ патологии кровообращения имени академика E.H. Мешалкина (г.Новосибирск).

Апробация работы. Основные положения, выводы и практические рекомендации доложены: на XIII Международной конференции по аэрофизическим методам исследования (Новосибирск,2007), на Международной научно-практическая конференции «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития», посвященной 50-летию НИИ проблем биологической безопасности Национального центра биотехнологий Министерства образования и науки Республики Казахстан (Алматы, 2008), на открытом заседании Учёного совета Новосибирского ННИ патологии кровообращения имени академика Е.Н.Мешалкина (Новосибирск, 2008), на объединенном заседании кафедр анатомии человека, гистологии и эмбриологии, топографической анатомии, патологической анатомии Новосибирского государственного медицинского университета (Новосибирск, 2009).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описаний методик исследования и полученных результатов, обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 33 рисунками и 7 таблицами. Список литературы включает 251 источник ( 31 отечественных и 220 зарубежных авторов). Личный вклад автора. Весь материал, представленный в диссертации, собран, обработан и проанализирован лично автором.

Выводы:

1. Модель хронической ишемической болезни сердца характеризуется развитием трансмиокардиального постинфарктного рубца с формированием в 2/3 наблюдений аневризм ЛЖ, захватывающих верхушку, переднюю и частично боковую стенки. К гистологическим особенностям, кроме грансмурального фиброза и жирового замещения субэпикардиального слоя миокарда, необходимо отнести перестройку сосудистого русла. Перестройка реализовывается в облитерации интрамуральных артерий, перекалибровке венозного русла с уменьшением просвета сосудов или формировании многоствольных сосудов; в артериолах и венулах миокарда определялись «подушечки Конти» за счет эксцентричной пролиферации интимального и медиального слоев, кроме того, всегда определялся отек стромы миокарда;

2. Гистологические изменения миокарда перирубцовой зоны модели ХИБС после лазерной реваскуляризации и имплантации мононуклеарных клеток костного мозга характеризовались: появлением крупных и средне-мелких тонкое генных сосудов синусоидного типа, уменьшающихся в направлении эндокарда, диаметром от 1200мкм до 40мкм, очаговым умеренным ангиоматозом, присутствием очаговых инфильтратов из крупных клеток с гиперхомными ядрами неправильной формы, конденсированным хроматином, пенистой или оксифильной цитоплазмой, часто формирующих цепочки;

3. Микроциркуляторное русло перирубцовой зоны миокарда модели ХИБС после комбинированной реваскуляризации характеризовалось увеличением перфузии, по данным сцинтиграфии, от 50% до 100% в местах ранее существовавших дефектов перфузии, а так же достоверным увеличением средней численной плотности капилляров - 2938 на 1 мм2 против 2144 на 1 мм2 в модели ХИБС без реваскуляризации, артиериол 124 на 1 мм2, против 95 на 1 мм2, (Р<0,05). Капиллярно - паренхиматозное соотношение показывало достоверное (Р<0,05) уменьшение площади миокарда, приходящейся на 1 капилляр, в группе животных с комбинированной реваскуляризацией 340,3 мкм2 против 466,4 мкм2 при сравнении с моделью ХИБС без реваскуляризации.

4. Найдено усиление регенерации кардиомиоцитов при комбинированной реваскуляризации перирубцовой зоны миокарда против модели ХИБС без реваскуляризации, что достоверно (Р<0,05) подтверждалось увеличением численной плотности ядер кардиомиоцитов, показателей суммарной площади ядер, процента площади ядер по отношению ко всему миокарду, площади ядра и его «идеального» диаметра, а так же увеличением РСЫА позитивных ядер кардиомиоцитов.

5. Увеличение перфузии миокарда и аугментационные изменения микрососудистого русла при комбинированной реваскуляризации перирубцовой зоны сочетаются с усилением процессов регенерации кардиомиоцитов.

Практические рекомендации.

1.В практической и исследовательской работе патологоанатома, для оценки репаративного потенциала кардиомиоцитов, мы можем рекомендовать иммуногистохимический анализ с использованием антител против РСИА, а также флюориметрические показатели ядер кардиомиоцитов с увеличением численной плотности ядер кардиомиоцитов, показателей суммарной площади ядер, плроцента площади ядер по отношению ко всему миокарду, площади ядра и его «идеального» диаметра.

2.Полученные результаты позволяют рекомендовать в качестве объекта реваскуляризации сердца крупных животных (собак) с постинфарктной моделью и сроком от момента моделирования инфаркта миокарда не менее 12 недель.