Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Реакция одиночных и контактирующих клеток культуры Hela на действие ионизирующего излучения

г

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК. ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ИМ. Н.Н.БЛОХИНА

На правах рукописи

ЕАЖУТОВА Галина Александровна.

РЕАКЦИЯ ОДИНОЧНЫХ VI КОНТАКТИРУЮЩИХ КЛЕТОК КУЛЬТУРЫ HELA НА ДЕЙСТВИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ.

(14.04.14. - онкология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Онкологическом центре им. Н.Н.Блохина Российской Академии медицинских наук.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор А.С.Ягубов доктор биологических наук, профессор Г.С.Календо

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Добрынин Я.В. кандидат биологических наук Пархоменко И.М.

Ведущая организация - Институт морфологии человека.

Зашита состоится " " 1996 г. в часов,

на заседании Специализированного совета К 001.17.01 Онкологичесокого центра им. Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 113476, г.Москва, Каширский проезд, д.24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Онкологического центра РАМН им. Н.Н.Блохина.

Автореферат разослан " " 1996 года.

Ученый секретарь специализированного совета

профессор Турусов B.C.

ОБЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Ионизирующее излучение является одним из основных способов терапии злокачественных новообразования. Поэтому представляется

V

актуальным изучение всего, что связано с пониманием механизма воздействия радиации на опухолевые клетки. Одним из наиболее важных факторов, определяющих реакцию клеток на ионизирующее излучение, являются межклеточные контакты и межклеточные взаимодействия. Известно, что изменения во взаимодействиях между клетками, способны инициировать перестройку в структурной организации цитоплаэматических мембран. Это, в свою очередь, влияет на такие значимые для клеток процессы, как пролиферация и диффе-ренцировка (Летучая, Кетлинский, I960).

Становление ткани - сложный многоэтапный процесс, в котором немаловажную роль играет формирование специализированных контактов. Возникновению этих контактов предшествуют определенные взаимодействия между клетками. Хорошо известно, что в условиях in vitro, культура клеток, даже при длительном пассировании, сохраняет элементы тканевой организации (Хлопин, 1940). Поэтому культура клеток является однсй из широко распространенных моделей для изучения различных биологических процессов. В радиобиологии многие закономерности были получены при облучении культуры клеток, находящейся в суспензионном состоянии.' В подобных условиях исключалось влияние сложившихся взаимодействия между клетками. В литературе существуют данные о том, что наличие или отсутствие межклеточных контактов может влиять на эффективность репаршии радиационных повреждений ДНК

и других восстановительных процессов. Учитывая вышеизложенное, мы решили провести систематическое сравнительное изучение реакции одиночных и контактирующих клеток культуры HeLa на облучение в одной и той же дозе, но в различных режимах: 5 Гр одномоментно и дробно 0,1 Гр + 3-х минутный интервал + 4,9 Гр. Применение последнего режима, где используется предварительное облучение малыми дозами радиации обусловлено двумя причинами. Малые дозы ионизирующего излучения такого порядка обладают радиомоди-фицируюшим (радиосенсибилиэируюшим| действием на клетки млекопитающих (Кузин, 1977) и этот эффект проявляется в условиях In vitro только в монослоиной культуре клеток (Календо, 1975). В суспензионных культурах клеток эффект радиосенсибилизации малыми дозами радиации не был получен .

В связи с изложенным нам казалось целесообразным расширить предстазления о реакции одиночных и контактирующих клеток культуры HeLa на воздействие одной и той же дозы радиации в разных режимах облучения

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилась оценка реакции контактирующих и одиночных опухолевых клеток культуры Не1.а на воздействие радиации в дозе 5 Гр в различных режимах.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить выживаемость клетпк НеЬа после облучения в дозе 5 Гр, находящихся в момент облучения в одиночном и контактирующем состояниях.

2. Провести сравнительное цитоморфологическое исследование культуры клеток НеЬа, находящейся, в момент облучения в доие

-35 Гр, в различном исходном состоянии.

3. Оценить реакцию одиночных и контактирующих клеток культуры Не1.а на радиомодифииируюшее действие малых доз радиации.

4. Сравнить реакцию межклеточных коммуникаций методами сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии а монослоя-ной культуре на облучение в дозе 5 Гр в различных режимах.

Научная новизна работы ''

В результате проведенных исследований получен ряд новых данных о реакции контактирующих и одиночных клеток НеЬа на облучение в дозе 5 Гр в различных режимах.

Впервые обнаружено, что формирование клеточных комплексов в популяции клеток культуры НеЬа под влиянием облучения в дозе 5Гр нарушается при использовании предварительного облучения малыми дозами. При этом было показало, что модифицирующее действие малых доз радиации, по данному критерию, проявляется только при облучении монослойной культуры клеток; действие предварительного облучения в дозе 0,1 Гр (режим облучения 0,1 Гр + 3 мин. * 4,9 Гр) существенно снижает количество клеток, вовлеченных в процесс образования комплексов и уменьшает их размеры (число клеток в самих комплексах).

Впервые установлено, что облучение в дозе 5 Гр одномоментно и в режиме 0,1 Гр + 3 мин. + 4,9 Гр по-разному воздействуют на Формирование контактов в монослойной культуре клеток Не1.а. Под влиянием одномоментного воздействия дозы 5 Гр происходит сближение клеток; наряду с простыми контактами образуются и специализированные, в частности, плотные. Предварительное облучение клеток культуры Не1.а в дозе 0,1 Гр препятствует более тесному взаи-модейстию соприкасающиеся клеток и, в основном, выявляются простые контакты.

Научно-практические значение работы

Полученные данные дают возможность прогнозировать реакцию одиночных и контактирующих клеток на облучение в различных дозах. Результаты исследования являются важными для понимания ра-диомодифицирующего действия малых доз ионизирующего излучения.

Публикации и апробация работы

По теме диссертации опубликовано и находиться в печати 4 работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на международном симпозиуме ''Механизмы действия сверхмалых доз" (Москва, 1995), на научных конференциях отдела молекулярно-био-логических и радиоизотопных методов исследования ОНЦ РАМН.

Объем и структура диссертаций

Диссертационная работа изложена на 69 страницах машинописного текста, содержит 15 рисунков, одну таблицу, 16 фотографий.. Диссертация состоит из введения," обзора литературы (1 глава), главы "Материалы и методы исследования" (2 глава), изложения результатов собственного исследования (главы 3 - 6), их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (129 источников, из них 61 работа отечественных авторов и 47 зарубежных)

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культура клеток

Объектом исследования являлась культура опухолевых клеток HeLa (Gey et al., 1952). Клетки выращивали в питательной среде 199 с добавлением 10S сыворотки крупного рогатого скота, согласно стандартным методикам работы с клеточными штаммами (Новохатс кий, 1979). При росте без смены среды культура имела слудуишне характеристики: продолжительность лаг-периода •

-724-26 часов, от 2 до 7 суток длилась экспоненциальная фаза роста и с в по 11-14 сутки - стационарная. Затем начиналась массовая гибель и открепление клеток. Модель» контактирующих клеток служила культура в логорифмическоя фазе роста. В качестве модели одиночных клеток использовали суспензию клеток или клетки в ла-горифмическоя фазе роста спустя два-три часа после посева.

Облучение

Контактирующие и одиночные клетки культуры облучали на установке "Агат-Р" (Россия) с источником Со 60 мощностью 0,8 Гр/мин. Использовали дозы облучения: 0,1 Гр, 5 Гр, 7,5 Гр. Относительная ошибка не превышала 5% как для малых, так и для больших доз облучения.

Определение количество клеток, выживших после облучения.

1. Построение кривых роста. Монослойну» культуру и одиночные клетки облучали в дозах 5 Гр, 7,5 Гр. После чего помешали в термостат на 15-20 минут. Клетки, находящиеся в момент облучения в контактирующем состоянии, обрабатывали 0,02% раствором Версена для получения суспензии. Полученную взвесь в концентрации 5,0 х

4

10 кл/ыл по два мл разливали в сцинтилляционные флаконы. Инкуби-

л

ровали при температуре 37 С. Наблюдение и подсчет клеток велся в течение 14 суток". На каждую точку использовали по 3 флакона и по данным подсчета строили соответствующие кривые роста. Одиночные клетки облучали либо в суспензии в тех же концентрациях, либо готовили суспензию клеток и помещали ее в термостат на два-три часа для прикрепления к подложке, а затем облучали. Далее работали также как и с клетками, облученными в*состоянии монослоя. Облучение велось в одинаковых дозах одновременно с, лночных и контактирующих клеток.

-82. Подсчет клеток на фиксированных препаратах (определение плотности клеток в ограниченной поле зрения). На фиксированных и окрашенных гематоксилин-эозином препаратах под световым микроскопом определяли плотность клеток в поле зрения.- Поле зрения светооптического микроскот, ограничивалось размерами 0,5 х 0,5 мм специальной рамкой, вставленной в окуляр. Данный размер рамки обусловлен тем, то наряду с подсчетом одиночных клеток, определялось количество клеток в многоклеточных комплексах. Учет велся на 5 тыс. клеток в каждом препарате. На каждые случая приходилось 5-7 стекол.

Морфологические методы.

1. Гистологический метод. Клетки выращивали на покровных стеклах в сцинтилляционных флаконах. Материал фиксировали смесью Карнуа и окрашивали гематоксилин-эбэином по общепринятой методике. Препараты использовали для анализа процесса образования клеточных комплексов популяци:.

2.Электронноиикроскопическия метод.

Для получения качественной картины о состоянии межклеточных коммуникация в культуре использовался метод электронной микроскопии. Монослояну» культуру облучали в двух вышеуказанных режимах и рассевали на покровные стекла в сцинтилляционные флаконы. Далее ьа определенный срок (б-б-ые сутки после облучения и посева) клетки монослоя изучали с помощью трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии.

рансмиссионная электронная микроскопия. Для трансмиссионной электронной микроскопии фиксацию и дальнейшую обработка материала производили по общепринятой методике (Уикли, 1975) с небольшой модификацией. Было сокращено время прохождения препартов с клетками всех этапов обработки.

Покровные стекла отделяли от клеток, пропитанных смолой, жидким азотом. Монослой клеток подвергали плоско-параллельной резке на ультратоме LKB-III. Материал просматривали в электронных микроскопах JEM-100C (Япония) и Philips 400М (Голландия).

Для сканирующей электронной микроскопии материал обрабатывали по принятым для данного исследования методикам (Ровенский, ,1979). Материал просматривали в электронном микроскопе Philips 5013 (Голландия).

Статистическая обработка

Полученные данные обработаны методом вариационной статистики с уровнем достоверности 0,95.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выживаемость одиночных и контактирующих клеток культуры HeLa после облучения в дозах 3 Гр и 7.5 Гр. Анализ резуль атов кривых роста клеток

Количество выживших во флаконах клеток подсчитывали ежесуточно в течение 14 дней. На рис.1 представлены кривые роста клеток, находящихся в момент облучения в дозе 5 Гр, в одиночном и контактирующем состояниях. Видно, что с б по 11 день наблюдения, количество выживших клеток, облученных в одиночном состоянии меньше в 1,5-2 раза, чем тех же клеток, но облученных в состоянии контакта. Снижение количества клеток популяции к 11 дню во всех исследуемых группах связано с особенностями ведения культуры. Поэтому сравнение результатов проводилось только с 4-х по 6-е сутки. При облучении тех же клеток, но в дозе 7,5 Гр, сохраняется аналогичная закономерность роста.

оуткл

Рис.1. Кривив роста культуры клеток Не1.а после облучения о дозе 5 Гр

1 — необлученные клетки (контроль)

2 — клетки, облученные а монослое

3 - клетки, облученный о суспензии.

По оси абсцисс - время после посева и облучения (сутки). По оси ординат - количества выживших клеток после облучения (N1.

Таблица 1. Количество выжившим клеток в ограниченном поле

зрения (X к контролю) после облучения в дозе 5 Гр.

Врёия после ■облучения (сутки) Количество клеток в ограниченном поле зрения

Контроль (относит.ед.) Монослой С/Л Суспензия (У.)

4 6 11 107.О - 5.6 146.0 - 5.2 165.0 - 6.3 130.0 - 4.1 96.0 - 4.7 88.2 1 6.6 77.5 - 6.4 63.8 - 2.2 56.6 1 3.2 32.6 - 2.3 53.3 - 3.1 63.0 ± 3.1

Определение плотности клеток в ограниченном поле зрения

В таблице представлены результаты подсчета одиночных и контактирующих клеток после облучения в дозе 5 Гр. К б-му дню наблюдения в монослойной культуре выживших клеток оказалось 86,2* (по отношению к контролю). Приблизительно столько жн их сохранилось и к 8-м суткам. В то же время, у клеток, облученных в одиночном состоянии, выживаемость упала до 32,6Z и 53,3« соответственно. _Независимо от метода подсчета выживших после облучения клеток их количество на б-е сутки наблюдения почти одинаково в процентном соотношении. При подсчете плотности клеток (в поле зрения) их отмечелось 88,2« (табл.) и, приблизительно, столько же - 85* - выросло во флаконах на б день г.осле облучения моно- ■ слойной культуры по отношению к контролю (рис.1, кривые 1,2).

Таким образом, результаты экспериментов говорят о том, что выживаемость контактирующих клеток после облучения в дозе 5,0 Гр оказалась выше, чем одиночных.

Сравнительное цитоморфологическое исследование клеток культуры HeLa, находящихся в момент облучения в дозе 5 Гр, в различном исходном состоянии..

Состоянии популяции клеток в логарифмической,и стационарной .фазах роста после облучения в дозе 5 Гр оценивали по способности клеток образовывать комплексы. Клеточные комплексы представляют собой совокупность клеток, где вокруг центральной клетки располагаются периферические. На протяжении всей логарифмической и стационарной фаз роста (4-11 сутки) у необлученных клеток HeLa наблюдается тканеподобная организация популяции с выявлением клеточных комплексов. Динамика этиго процесса после облучения иная. На 4-6 сутки после посева и облучения часть клеток группи-

руется возле одной клетки. Эта клетка является центральной клеткой комплекса и имеет более правильную форму.Периферические клетки обладают горизонтальной анизотропией .

На 8-ые сутки после облучения, увеличивается количество клеток, вовлеченных в протсс образования комплексов. Периферические клетки теряют свою поляризованность. На 11 сутки в популяции клеток прослеживается тенденция к уменьшению контактов между клетками в комплексах. Аналогичная картина прослеживается и в контроле. Разница заключается в динамике 1.овлечения клеток в комплексы.

Помимо'цитоморфологических параметров на этих препаратах подсчитывали как количество клеток, вовлеченных в вышеуказанный проц.сс (рис 2), так и число клеток в самих комплексах (рис.За-в). В контроле количество клеток, участвующих в образовании комплексов, на протяжении всего срока наблюдения держится, практически, на одном уровне ~ 302 от общего числа клеток в поле зрения.

Основное отличие суспензионной культуры от монослойноя заключается в динамике образования клеточных комплексов (рис.2, кривая 3). Если в монослойноя культуре на сутки после облучения количество клеток в комплексах максимально, то у культуры, облученной в суспензионном состоянии их количество не меняется и в 1,5 раза меньше, чем для популяции, облученной в состоянии монослоя и все точки кривой 3 ниже точек контрольной кривой.

При определении процентного количества комплексов' с данным числс . клеток в них после облучения в дозе 5 Гр обеих культур (рис.За-в). установлено: тенденция их образования во всех трех случаях (в контрольной культуре, культуре, облученной в состоянии монослоя и культуре, облученной в состоянии суспенгмгй > одинакова. Преобладают комплексы со средним числом 5-8 клеток в

сутки

10 11 13

Рис.2. Обкее количество клеток HeLa, организованных в клеточм»" комплексы, находящихся в момент облучения в дозе ЗГр в одиночном и контактирующем состояния.

1 — контроль

2 — монослойная культура

3 - суспензионная культура. По оси абсцисс — время после посева и облучения (сутки)« По оси ординат - количество клеток, организованных в комплексы(X). % 100 Y! : <Х~

Рис.З

6 8 11 сутки

•Количество клеточных комплексов с определенным клеток в них. а — контроль

клеточные комплексы с числом клеток 3-4

клеточные комплексы с числом клеток 5-Е)

клеточные комплексы с числом клеток 9 и более.

Ьи' щ | Л

По оси абсцисс - время после посева и облучения (сутки) . По оси ординат — количество клеточных комплексов с определенный числом клетог вних {'/.).

X во

70 -

X 80

Рис.3

в в 11

сутки

Количество клеточным комплексов с определенным числом

- клеток а них после облучения в доэеЗ Гр 6 — монослойная культура в — суспензионная культура

клеточные комплексы с числом клеток 3-4

клеточные комплексы с числом клеток 5-В

клеточные комплексы с числом клеток 9 и более.

абсцисс - время после посева и облучения (сутки), орлинат — количество клеточных комплексов с определенным числом кде-ток вних (7.).

них. Разница прослеживается только на 11 сутки, когда в моносло-йной культуре, как и в контроле, несколько уменьшается количество средних комплексов. Таким образом, реорганизация популяции клеток HeLa после облучения в дозе 5 Гр монослойной и суспенэио-ной культур различается по динамике этого процесса.

Реакция одиночных и контактирующих клеток HeLa на модифицирующее действие малых доз ионизирующиего излучения.

В данной серии эксперимента изучена реакция одиночных и контактирующих клеток популяции на модифицирующее действие малых доз pax (ации. Использовали два параметра: выживаемость клеток и комплексобраэование пос^е облучения.

На рис. 4,5 представлены результаты подсчета количества клеток, выживших после облучения в дозе 5 Гр и в той же дозе, но в режиме 0,1 Гр + 3 мин. + 4,9 Гр. Оказалось, что воздействие на монослойную культуру предварительной дозой 0,1 Гр приводит к большей гибели клеток по сравнению с одноразовым облучением в дозе 5 Гр (рис.4): все точки кривой 3 лежат ниже точек кривой 2. В то же время, малые дозы радиации на культуру, облученную в состоянии суспензии радиосенсибилиэируюшего действия не оказывают (рис.51. При сравнении кривой 3 (рис.4) и кривых 2,3 (рис.5) видно,что их значения близки.

Отсюда можно заключить, что предварительное облучение в дозе'0,1 Гр оказывает радиосенсибилиэируюшее действие только на монослойную культуру; снимает при этом преимущество монослояноя культуры и переводит ее к состоянию суспензионной культуры (по данному критерию).

Результаты изучения количество клеток, участвующих в образовании клеточных комплексов представлены на рис 6,7.

суткп

Рис. и. Количество клеток Не!_а в ограниченном поле зрения после облучения в дозе Э Гр монослойной культуры.

с ттап

Рис.3. Количество Палок НеЦа в ограниченном поле арония после облучения в дозе 5 Гр суспензионной культуры.

1 - контроль

2 - 5 Гр

3 - 0,1 Гр + 3 мин. + 4,9 Гр.

По оси абсцисс - время после посева и облучения (сутки). По оси ординат - среднее количество клеток в поле зрения (N1.

сутк и

Рис.б. Об*ее количество клеток НеСа, организованных о комплексы, после облучения в дозе 3 Гр монослойной культуры.

Рис.7. Обвее количество клеток, организованных в комплексы, после облучения в дозе Э Гр суспензионной культуры.

1 - контроль

2 - 3 Гр

3 - 0,1 Гр + 3 мин. + 4,9 Гр.

По оси абсцисс - время после посева и облучения (сутки). По оси ординат — количество клеток, организое «ных в комплексы.

<Х>.

100

Рис. 2

По оси По оси

8 11 сутхп

.Количество К/ точных комплексов с определенным числом клеток в них после облучения в режиме О.1Гр+Змин.+4.9Гр а.— монослойная культура, б — суспензионная культура, клеточные комплексы с числом клеток 3-4

клеточные комплексы с числом клеток 5-8

клеточные комплексы с числом клеток 9 и более.

абсцисс - время после посева и облучения (сутки), ординат - количестно клеточных комплексов с определенным

ЧИСЛ )М К.1Е!ТОК Е1НИХ (У.).

Из Рис б следует, что предварительное облучение з дозе 0,1 Гр монослойноя культуры существенно снижает процесс образования комплексов на протязшнии всего срока наблюдения (кривая 3, рис.б). В культуре, облученной в данном режиме н суспензионном состоянии, количество клеток, участвующих в этом процессе, практически, не отличается от такового при одноразовом облучении з дозе 5 Гр.(рис.7, кривые 2, 3).

Таким образом, и по данному критерию модифицирующее действие малых доз радиации порядка 0,1 Гр проявляется только при облучении мснослоянол культуры.

Количество клеточных комплексов с определена« числом клеток в них представлены на рис 8а-б. На гистограмме "а"-"б" представлены данные о количестве клеточных комплексов с определенным числом клеток в них г.олее облучения в режиме 0,1 Гр - 3 мин. * 4,9 Гр клеток, находящихся в момент облучения в одиночном и контактирующем состоянии. В контроле на протяже"Чи ьсего срока наблюдения преобладают комплексы со средним числом клеток в них 15-31 (рис За). Количество мелких '3- 4 клетки) и крупных (9 и более) комплексов на б-З сутки приблизительно одинаково. На Л день отмечается значительное уменьшение количества комплексов с-числом клеток 3-4. При сравнении гистограмм 8а и бб видим, что в случае облучения гуспеьзион.чой культуры сохраняется та же закономерность образования комплексов по «иолу, клеток в них, что и у необлученноя культуры и при од:;ократяом воздействии дозы 5 Гр. Гистограмма ба отличается от вышеуказанных. Преобладают мелкие комплексы. Крупные комплексы отсутствуют на протяжении всего срока исследования. Видно, что и по этому параметру влияние предварительного облучения в дозе С.1 Гр проявляется только г:ри воздействии на менее .-юлнур культуру.

Таким образом, в зависимости от исходного состояния в

момент облучения дина"ика реорганизации популяции различна.

На основании полученных результатов можно заключить, что облучение малыми дозами радиации (0,1 Гр) значительно снижает количество клеток, вовлеченных в процесс образования комплексов. При этом уменьшается как количество клеток, участвующих в формировании комплексов, так и их число в самих комплексах. Данный модифицирующий эффект малых доз радиации проявляется только при облучении ыонослойной культуры.

Состояние межклеточных коммуникация в монослое клеток культуры HeLa после облучения в дозе 5 Гр в двух режимах нами исследовано с помощью метода электронной микроскопии.

Растровая электронная шкроскопия. В настоящее время распространено мнение, что межклеточные контакты являются результатом псевдоподиального прикрепления соседних клеток друг к другу (Васильев и др., 1961). У трансформированных клеток, к которым относятся клетки HeLa, часто нарушаются эти реакции прикрепления и, следовательно, образование контактов между клетками (Васильев и др. 19С8) . Данные о влиянии ионоэирующего излучения на этот процесс не известны.

При наблюдении за возможным образованием псевдоподий между соседними клетками после облучении в дезе 5 Гр однократно и режиме 0,1 Гр + 3 мин. + 4,9 Гр установлено: у необлученной культуры между соприкасающимися клетками довольно широкое межклеточное пространство. Несмотря на большое количество псевдоподия, четко прослеживаются границы между клетками. При облучении в дозе 5 Гр однократно расстояние между близ лежащими клетками зат метно уменьшается, в отдельных случаях клетки наползают друг на на друг. Псевдоподии укорачиваются и утолщаются, их количество

уменыаается. Клетки устанавливают более тесный контанкт яруг с другом. В препаратах, подвергнутых предварительному облучению в дозе 0,1 Гр, картина мало чем отличается от таковоя у необлу-ченоя культуры.

Таким образом, и по данному критерию (изменение поверхности микрорельефа клеток) предварительное облучение малыми дозами радиации порядка 0,1 Гр меняет реакцию клеток на последующее облучение в основной дозе: препятствует тесному сближений соседних клеток, которое наблюдается при однократном воздействии 3 Гр.

Трансмиссионная электронная микроскопия. Культуру клеток HeLa следует отнести к линии, сохраняющей способность образовывать отлосительно прочные эпителиальные пласты, подобно нормальному эпителию (Welnsteli. et al., 1975). Однако для них характерна деффектность целевых контактов (Eckert et. al, 1993).

Ультраструктурное изучение реакции контактирующих клеток HeLa, облученных в дозе 5 Гр в различных режимах показало, что оно качественно отличается у всех исследуемых групп. У необлу-ченных клеток межклеточное пространство широкое. На уплощенных цитоплаэматических выростах образуются простые контакты (типа плоско-параллельных). При облучении в дозе 5 Гр одномоментно отмечается уплотнение примеыбранного слоя, а также продукты шед-динга клеточных мембран. В результате повышается адгезивная способность клеток и они формируют специализированные контакты типа плотных. Межклеточное пространство узкое. Контактирующие клетки, облученные в режиме 0,1 Гр ♦ З.мин. ♦ 4,9 Гр , взаимодействуют, в основном, благодаря простым контактам", которые несколько протяженнее, чем у необлученных клеток. Межклеточное пространство почти такое яе как и в случае кс гроля.

Таким образом, одномоментное облучение в дозе 5 Гр способствует становлению более прочных, специализированных контактов

между соседними клетками. Малые дозы радиации (С,1 Гр ) препятс твуют процессу сближения соприкасающихся клеток и образованию специализированных контактоз.-

ВЫВОДЫ

1. На модели культуры опухолевых клеток Не1.а с использованием количественных методов радиобиологии и морфологии показано, что клетки, находящиеся в контакте друг с другом и те же клетки, но лишенные контактов, по-разному реагируют на ионизирующее, излучение и модифицирующий фактор.

2. Установлено, что количество выливших клеток Ка1.а после обпучения монослойноя культуры в 1,5-2 раза больше, чем тех же клеток, но облученных в состоянии суспензии.

3. Процесс становления конослоя клеток НеЬа имеет некоторые морфологические признаки формирования тке.неподобных структур, образование клеточных комплексов. Показано, что в зависимости от исходного состояния клеток в момент облучения процесс форыьрова ния клеточных комплексов отличается по динамике вовлечения клеток в этот процесс: системная реакция клеток, облу ченных в одиночном состоянии, сходна с таковой в контроле; у клеток, облученных в состоянии контакта, отмечается постепенная активизация данного процесса с максимумом на 8 сутки.

4. Выявлено, что модифицирующее действие малых доз радиации проявляется только при облучении клеток НеЬа, находящихся в состоянии контакта. При этом предварительное облучение в дозе 0,1 Гр (режим облучения 0,1 Гр + 3-х минутный интервал + 4,9 Гр) в 2 раза снижает количество клеток, вовлечнных в процесс образования комплексов и уменьшает их размеры (число клеток в самих комплексах).

-235. С помощью сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии показано, что под влиянием дозы 5Г'р происходит сближение-клеток - наряду с простыми контактами образуются специализированное контактные структуры типа плотных. Пред варительное облучение клеток в дозе 0,1 Гр (режим облучению

0.1 Гр + 3 мин. +.4,9 Гр) препятствует сближению клеток и образованию подобных структур.

б. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что состояние межклеточных взаимодействия в момент облучения является одним из существенных факторов, определяющих конечный эффект этого воздействия

Список работ по теме диссертации

1, Бажутова Г.А., Календо Г.С., Ягубов A.C. Реакция одиночных и контактирующих клеток HeLa на модифицирующее действие малых доз ионизирующего излучения. Международный сиупоэиум "Механизмы действия сверхмалых доз", Тезисы докладов, Москва, 1995, с.6-9.

2. Бажутова Г.А., Календо Г.С., Ягубов A.C. Влияние Y-облучения в различных режимах на образование клеточных комплексов в популяции клеток.HeLa. Бюллетень экспериментальной медицины и биологии. В печати.

3. Бажутова Г.А., Календо r.Q., Ягубов A.C. Влияние Y-облучения в дозе 5 Гр на одиночные и контактирующие клетки HeLa. Вестник ОНЦ АМН России. 1996, N3, стр. 9-12.

4. Бажутова Г.А., Календо Г.С., Ягубов.А.С. Влияние Y-облучения

в различных режимах на одиночные и контактирующие клетки культуры HeLa. Радиационная биология. Радиоэкология. 1996, т.36, в.З,

e i р '.г,о Ю6 .