Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Реактивность нейтрофилов на фоне зимозан-индуцированной дестабилизации крови

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ ИМ. С.В.МУРАШОВА

ЗАСЛАВСКАЯ Майя Исааковна

РЕАКТИВНОСТЬ НЕЙТРОШЮВ НА ФОНЕ ЗИМОЗАН-ИНДУШ1РОВАННОЙ ДЕСТАБИЖЗАЩО! КРОВИ

14.00.16 - патологическая физйология 14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

Работа выполнена в Нижегородском государственном медицинском институте. "

ф >

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор А.Н. Мзянский: .

£

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Рахматуллин И.М. кандидат медицинских наук, доцент Фаесахов P.C.

■ Ведущая организация - Российский медицинский университет им. Н.И.Пирогова.

Защита состоится Сииъ&Л^' 1994 г. в_ часов

на заседании специализированного совета Д 084.29.03 Казанского государственного медицинского института . им. С.В.Курашова по адресу: 420012, Казань, ул.Бутлерова, д.49.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского медицинского института ( Казань, ул. Бутлерова, Д.49Б ). •

Автореферат разослан

1994 Г.

Ученый секретарь специализированного совета, Д.М.Н., проф.

Хафиэьянова Р.Х.

Общая характеристика работы

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Нейтрофилы занимают одну из самых активных позиций в системе гуморально-клеточной кооперации крови и соединительной ткани ( Пигаревский В.Е.,1978; Маянс-кийА.Н., Гадиуллин А. Н., 1984; Берелная Н.М., 1988; Klebanoff S.; Clark R.,1978 ). Свои главные эффекторние функции полиморфноядерные лейкоциты ( ГШ ) реализуют через воспалительные реакции. Именно от реактивности этих клеток во многом зависят гомеостатические и патогенетические ресурсы острого воспаления, в частности его барьерная функция, которая ограничивает генерализацию повреждения. Эффекторный потенциал фагоцитов определяется суммой различных решений,

щ

большинство из которых изучено на модели нейтрофилов крови. Именно эти исследования составляют базис современных представлений о физиологии и патологии фагоцитов в проекции на механизмы развития ряда общепатолсгических процессов, в том числе воспаления. Медду тем, такой подход имеет свои ограничения, наиболее принципиальным из которых является то, что нейтрофилы экстравазальных ткачей могут отличаться от своих предшественников 'в крови ( Takairari К., Yamahita Т.,1980; Perianin A. et al., 1S85; BriheiM S. et al., 1938; Bonnet M. et al.,1992; Crocard A.D. et al.,1992 ). Сегодня этот априорный тезис имеет вполне реальное обоснование. Достаточно напомнить о такой функционально многоплановой системе как .активированный эндотелий, воздействию которого лейкоциты подвергаются перед выходом в очаги воспаления ( Ruoslahti Е., Pierschbacher M.D., 1987; Croiisteln B.N., Weissmann G., 1993 ). Кондиционирование нейтрофилоз продолжается и во Ене-сосудистоы пространстве, где они сталкиваются с широким спектром биологически активных продуктов, продуцируемых в зоне .воспалительной реакции. Отсюда, не умаляя значения исследо-.взний циркулирующих нейтрофилов, следует отметить важность изучения экссудагивных клеток, в том числе их функциональное сопряжение с состоянием внутрисосудистого гомеостаза.

Одним из типовых патологических процессов, широко расп-.ространенных в клинике, является синдром " внутрисосудистой активации ( дестабилизации > крови " ( Маянский А.Н., Маянс-кий Л.Н., 1S89 ). В ряде публикаций его называют " системным

воспалительный синдромом " ( American College of Chest Physicians, 1992 )„ или " воспалительным эвдотоксикозом " ( Ергаин И.А. и соавт.,1989 ). Синдром внутрисосудистой активации крови имеет разнообразные патогенетические последствия.- диссеми-нированное внутрисосудистое свертывание, респираторный дистресс-синдром, множественная органная недостаточность. Он возникает при септических состояниях, детерминируя патогенез сепсиса, который сегодня рассматривается как результат дестабилизации эндогенных медиаторно-эффекгорных систем. Источником дестабилизирующих начал при сепсисе служат первичные очаги инфекции, из которых в кровь ( в результате прорыва местного барьера защиты ) поступают бактерии, их продукты, биологически активные вещества. Обратная связь, т.е. влияние дестабилизации гуморально-клеточкого гомеостаза крови на эффек-хорные возможности очаговых воспалительных реакций, не изуче-НУ. Между тем, не исключена вероятность порочного круга: дестабилизация крови может отрицательно сказываться на формировании воспалительных реакций и их элиминационных ресурсах, тем самым создавая предпосылки для развития гипорезистентньи ( иммунодефицитных ) состояний, поддерживающих патологический процесс. Эта рабочая гипотеза послужила основой для нашей работы, суть которой составляет изучение нейтрофилов, мобилизуемых, в очаги-воспаления на фоне модельной реакции, имитирующей процесс внутрисосудистой активации крови.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - изучение функциональных параметров в системе нейтрофильного фагоцитоза и сопряженных с ним зффектор-ных ресурсов очага воспаления на фоне внутрисосудистой дестабилизации крови.

ЗАДАЧИ работы:

_ . 1. Разработать методические подходы для изучения функциональных последствий внутрисосудистой дестабилизации крови в системе нейтрофильного фагоцитоза.

2. Изучить количественные и качественные параметры нейтрофилов циркулирующего пула на фоне внутрисосудистой дестабилизации крови.

3. Охарактеризовать динамику реакции и функциональные параметры экссудативных нейтрофилов в процессе гомеостаз-дес-табилизируювдх воздействий.

4. Оценить эффекторные ресурсы воспалительной реакции,

связанные с лейтрофилами. в условиях внутрисосудистой дестабилизации крови.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые изучен нейтрофил-олосредованный потенциал очага воспаления на фоне внутрисосудистой дестабилизации крови. Обнаружен феномен острой мобилизационной блокады нейтрофилов, проявляющийся в снижении миграции ПМЛ в зону воспаления в условиях, имитирующих состояние эндотоксикоза (внутрисосудистой дестабилизации крови). Установлено снижение функционального резерва очага воспаления, связанное с уменьшением притока нейтрофилов в зону повреждения. Мобилизационную блокаду нейтрофилов не удалось связать с уменьшением числа ПМЛ циркулирующего пула, ослаблением адгезивной и миграционной активности нейтрофилов и снижением реактивности рези- ' дентных макрофагов. Выявлено временное ослабление эффекторно-го потенциала нейтрофилов крови по данным кислород-зависимых реакций на фоне десгабидизационнш воздействий. Показана неоднородность СЗЬ-опосредованных реакций нейтрофилов человека и крысы в аллогенных и ксеногенных системах.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Разработана мо дель для изучения функционального потенциала экссудативных нейтрофилов на фоне внутрисосудистой дестабилизации крови-. Получена информация о механизмах снижения эффекгорного потенциала очага воспаления в процессе гомеостаз-дестабилизирующих воздействий. Предложен способ " импульсной стимуляции " нейтрофилов при оценке индуцированной хемилюминесценции. Изучены особенности и СЗЬ- опосредованных реакции нейтрофилов в системах с аллогенными и ксеногеннымк лягандами.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Внутрисосудистая дестабилизация крови сопровождается снижением эффекторного потенциала месипяс острых воспалительных реакций, что обусловлено мобилизационной блокадой нейтрофилов крови.

2. Мобилизационная блокада проявляется в торможении миграции нейтрофилов в очаги воспаления и не связана с уменьшением числа ПМЛ в крови,„ ослаблением их миграционной и адгезивной активности, а также снижением реактивности резидентных макрофагов.

3. Гс- и СИ- зависимые реакции нейтрофилов имеют особенности в системах с аллогенными я ксеногенными дигандами.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научной конференции молодых ученых " Актуальные вопросы медицины " ( Горький, 1990 ), на XI республиканской конференции " Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях " ( Челябинск, 1992 ), на IY Всесоюзном совещании " Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение " ( Москва, 1992 ), на I съезде иммунологов России ( Новосибирск, 1992 ).

ПУБЛИКАЦИИ. ПО материалам исследования опубликовано 6 печатных работ. Список приведен в конце автореферата.

ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков, 2 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 24 отечественных и 107 иностранных источников.

Содержание работы

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Эксперименты проводились на белых беспородных крысах-самцах весом 170-210г, взятых из питомника " Моховая " ( Московок, обл.). Все манипуляции с животными проводили с применением эфирного наркоза. В работе исследованы йейтрофилы и макрофаги 523 кркс, нейтрофи-лы.21 здорового человека. Проведено 1017 анализов люминолза-висшой хемилюминесценции лейкоцитов, 195 опытов по изучению специфической и неспецифической адгезии ШЛ, в 20 экспериментах изучена спонтанная миграция нейтрофилов. Получено по 3 серии очищенного иммуноглобулина IgG человека и крысы для конъюгации с сефарозой 4В; 2 серии клеточных стенок Staphylococcus aureus С штамм ССМ 885 ) для внутрибрюшинного введения.

Животным внутривенно вводили суспензию зимозана ( 30 иг/ мл ) в забумеренном стерильном физиологическом растворе (ЗФР) из расчета 50 мг/кг массы тела.

Перитонеальный экссудат крыс с максимальным удержанием нейтрофилов получали через 4ч после введения животным 5мл 10% стерильного изотонического раствора пептона. В ряде опытов для внутрибрюшинного введения применяли взвесь лиофидизиро-

ванных клеточных стенок Staphylococcus aureus штамм ССМ 885 в ЗФР ( 5мг/мл ; 5 мл ). Перед употреблением препарат гомогенизировали ультразвуком ( 20кГц; 20мА; 20с ). В экспериментах использовали суспензию клеток, подученную путем промывания брюшной полости- декапитированных животных 20 мл ЗФР. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева. Для 'морфологического анализа из полученного злгата готовили мазки, которые окрашивали по Романовскому-Гимзе С дифференциация мононуклеа-ров и сегментоядерньм лейкоцитоз ) и на неспецифическую эсте-разу ( маркер макрофагов ).

Нейтрофилы человека. получали из крови на двойном градиенте плотности фиколл-верографина ( 1,115 и 1,07? г/см3 1, Нейтрофилы крысы выделяли из лейковзвеси, полученной после инкубации крови.с декстраном Т-500 ( 4°С, 1ч ), на специально подобранном .градиенте плотности фиколл-верографина ( 1,095 и 1,077 г/см3 ). Чистота нейтрофильной фракции составляла более 98Х, жизнеспособность- более 96%.

Хемилгаинесценцию ( ХЛ ) нейтрофилов крови и экссудата, а также резидентных макрофагов измеряли в имп/мин на жидкост-но-стинцшшщионном счетчике " Бета-2 ". Для изучения спонтанной ХЛ ( без дополнительной стимуляции in vitro ) в сили-конированных флаконах смешивали 1 мл перитонеальногс экссудата или 1 мл клеточной взвеси ( 5 • ^мЗГ1) и 0,1 мл люминола ( начальная концентрация-10" 2М ). Для измерения индуцированной ХЛ в тест-систему добавляли дополнительно 0,1 мл стимулятора. В качестве стимуляторов использовали латекс ( диаметр частиц 1,77 мкм; концентрация 3 -108 частиц/ыл ), форбол-миристагацетат ( ША ) ( 10~2М ), опсонизирсванный зимозак ( 10 мг/мл ). Зимозан опсонизировали пулом крысиных сывороток (.30 мин; 37°С ) с последующим удалением нековапентно связанных компонентов путем инкубации ( 100°С; 15 мин) с 2М NaC).. Измерение ХЛ проводили в течение б с через каждые 5 мин, и заканчивали через 15-20 мин после прохождения максимального уровня.

Фракцию IgG получали путем хроматографии на ДЗАЭ-тойопо-ле 650 М ("Toyo Soda", Япония ) ( Брок И.,1979) из коммерческого иммуноглобулина человека и из глобулиновой фракции сыворотки крысы, полученной высаливанием при добавлении насыщенного раствора сульфата аммония ( Коньшев В.А., 1367 ). Чисто-

б

ту препарата контролировали иммуноэлектрофоретически, содержание белка определяли по методу Лоури.

Конъюгацию агрегированного ( 63°С ; 30 мин ) IgG с CNBr-сефароаой 4В проводили согласно рекомендациям фирмы-изготовителя ( "Pharmacia",Швеция >. СЗЬ-зависимую адгезию исследовали в реакциях с сефадексом G-25, Fine ( "Farmacia"» Швеция ), обработанным пулом сывороток человека и крысы в условиях, обеспечивающих избирательное связывание с СЗЬ-фактором комплемента.

Для изучения рецепторзависимой адгезии нейтрофилы, взвешенные в растворе Хенкса ( 2 -10бмл ~1 ), смешивали в равных объемах ( по 0,2 мл ) с гранулами IgG-сефарозы или СЗЬ-сефа-декса ( 2 "104 ад-1) и инкубировали 30 мин при 37°Ü. Подсчитывали процент адгезированных нейтрофилов по разнице количества клеток в супернатантах опытных и контрольных проб: loo/.- — к юох . 5

КОНТРОЛЬ

Дополнительно определяли процент позитивных гранул - гранулы с тремя и более закрепившимися нейтрофилаыи.

Для исследования неспецифической адгезии к 0»2 мл нейтрофилов ( 2 • 106мл~х ) добавляли 0,2 мл взвеси гранул поли-метклмэтакрилата ( ШМА ) ( 4 •103мл-1 ). Постановка реакции и критерии оценки,были такими же, как в системах со специфическими сорбентами.

Способность нейтрофилов связывать адлогенный и ксеноген-ный IgG определяли методом непрямой флуоресценции.

Кнтраплантарную воспалительную реакцию индуцировали введением в подушечку передней лапки крысы 0,04 мл ( 10 мг/мл ) агрегированного ( 63°С, ЗОмин ) препарата коммерческого иммуноглобулина человека. В противоположную лапку вводили аналогичную дозу неагрегированного препарата. Через 5 ч животному давали летальную дозу эфирного наркоза, лапки отсекали на уровне сустава, результат реакции учитывали по разьице веса, лапок Смг).

Спонтанную миграцию нейтрофилов оценивали по пл^-с-ди миграции клеток из капилляров после 24-х часовой инкубации при 37°С. Площадь зоны миграции определяли планиметрически.

При статистической обработке результатов использовали рекомендации Полякова ».В., Соколовой Н.С. ( 1975 ). Различия

считали достоверными при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ. На предварительном этапе изучали нейтрофил-дестабилизирующую активность зимозана в крови in vitro и время, необходимое для ее максимального проявления. При выборе зимозана в качестве индуктора внутрисосудистой активации крови ориентировались на данные литературы ( Ерюхин И.А. исоавт., 1989 ; Williams T.J., Jose P.J., 1981 ) о том, что его введение в кровь сопровождается острыми дестабилиза-ционными процессами на уровне медиаторно-эффекторных систем-плазмы с последующим вовлечением в реакцию клеток крови, прежде всего, нейтрофильных гранулоцитов. О реактивных изменениях нейтрофилов судили по показателям метаболической перестройки клеток, фиксируемой методом люминолзависимой ХЛ. Наш разработан оригинальный методический подход (*" импульсная " стимуляция ) при региотрацли ХЛ в цельной крови. Принцип метода сводился к следующему. Зимозан ( 10 мг/мл ) смешивали в равных объемах с термостатированной (37°С; 30 мин) ге-' паринизированной кровью, инкубировали 1-15 мин ( 37°С ), разводили в 20 pas раствором Хенска, содержащим люминол (10_3М ) и тотчас же начинали регистрацию ХЛ. Измерения проводили на протяжении 60 лмн. Параллельно исследовали кровь, предварительно ( перед добавлением зимозана и люминола ) разведенную 1:20. Конечные концентрации зимозана и люминола в обеих пробах были одинаковы. В экспериментах с предварительно разведенной кровью зимозан-индуцированная ХЛ развивалась медленно с пиком на 20-й минуте. В то же время при импульсной стимуляции крови наступление максимального уровня ХЛ не зависело от времени экспозиции с зимозаном и наблюдалось всегда в начале регистрации (1 мин). В дальнейшем уровень ХЛ снижался, но сохранялся на повышенном уровне на протяжении 40-60 минут.

Быстрое развитие реакций при импульсной стимуляции не было связано с увеличением скорости опсонизации и продукцией нейтрофил-стимулирушак факторов в неразведенной крови. На основании наших наблюдений можно лишь констатировать, что темп активации нейтрофилов зимозаном в цельной крови значительно быстрее, чем в разведенной, и для осуществления реакции, достаточно одноминутного контакта с зимозаном. Эти данные были приняты за основу при анализе результатов, полученных в опытах in vivo.

В серии экспериментов изучали острые ( в течение суток.) проявления дестабилизирующей активности зимозана In vivo. Зи-мозан вводили крысам внутривенно. В контроле использовали равное количество ЗФР.

Было отмечено резкое снижение спонтанной ХЛ через 1 и 5 мин после инъекции зиыозана. Это коррелировало с падением количества нейтрофилов в кровяном русле: уже через 1 мин после внутривенного введения зимозана нейтрофилы практически полностью исчезали из циркуляции. Полученный феномен можно связать с секвестрацией гиперактивированных 1Ш в микроциркуля-торном русле, пределе всего, легких ( 0'Flaherty J.Т., Ward P.A.,1978 ; Hoffman Т. et al., 1987 ). Феномен сохранялся на протяжении 5 мин, после чего начиналось восстановление циркулирующего пула, которое завершалось к 15-й мин. Начиная С этого момента спонтанная ХЛ опытных и контрольных животных не различалась.Отсутствие различий между опытом и контролем требует дополнительного комментария, так как, согласно описанным вале экспериментам in vitro, следовало ожидать усиления ХЛ по крайней мере на протяжении 40-60 мин. Это можно объяснить тем, что гашение возбуждения нейтрофилов в сосудистом русле происходит быстрее, чем в искусственных системах in vitro, что совпадает с нормализацией функциональных параметров ПМЯ, в частности, их адгезивных свойств. Нельзя исключить и вероятности компенсаторного выхода неактивированных клеток из костного ыовга, которые, попадая в среду, освобожденную от дестабилизирующих факторов ( зимозан быстро элиминируется из циркуляции ретикуло-эндотелиальнрй системой остаются в покоящемся состоянии.

Индуцированная ХЛ нейтрофилов крови ( стимуляция латексом ) через 1-15 мин после инъекции зимозана была существенно ниже, чем в контроле. Это было неудивительно, так как в этот период количество циркулирующих нейтрофилов было резко снижено. Однако, даже через 30 мин после введения зимозана, т.е. на фоне полного восстановления количества циркулирующих ГШ, результаты в опыте ( 4,8 *104 ± 0,4 •104 имл/мин У были существенно ниже-, чем в контроле (12,6 -104 i 2,5 • 104имп/мия). Различия между контролем и опытом сохранялись на протяжении 1 ч и нивелировались к 4 ч после внутривенной инъекции зимозана. Ослабление нндуцированой XI не могло быть связано с ис-

тощ.ением эффекторного потенциала плазмы, поскольку известно, что латекс активирует нейтрофиды через прямые, опсонин-неза-висимые контакты ( Маянский А.Н., Маянский Д. Н., 1989 ). По-видимому, причиной было негативное кондиционирование самих ПМЛ в процессе внутрисосудистой активации крови, что вызывало временное снижение их реактивного потенциала.

В следуащей серии экспериментов исследовали количественные и функциональные показатели нейтрофилов перитонеального экссудата на фоне внутривенного введения зимозана. В качестве индуктора местного воспаления использовали 10% изотонический раствор пептона. Как показали предварительные опыты, максимальное накопление нейтрофилов в брюшной полости наблюдалось через 4 ч после интраперитонеальной инъекции пептона. В связи ■с этим, в экспериментах изучали нейтрофилы 4-часового экссудата, рекрутированные з брюшную полость через 0,5-1-4-24 ч после внутривенной, инъекции зимозана С опыт ) или ЗФР ( контроль ). Наиболее общим наблюдением, сделанным нами в этих исследованиях, было обнаружение феномена острой мобилизационной блокады нейтрофилов, который проявлялся в уменьшении фло-гоген-индуцированной миграции ГШ в очаг воспаления на фоне внутрисосудистой дестабилизации крови. Через 0,5 ч после инъекции зимозана отмечалось снижение количества нейтрофилов в перитонеалыгом экссудате, индуцированном пептоном. Абсолютное количество ПШГ в опыте было 0,5 ЧО6 ±.0,2 - 10й мл1", в контроле - 2,3 -10е ±0,5 • 106наЧПроцент нейтрофилов от общего количества клеток в экссудате составил в опыте 28,2 ± 4.92, тогда как в контроле этот показатель достигал 82,7 ± 1,97.. Такая закономерность сохранялась на протяжении 1 ч после внутривенного введения зимозана. Через 4 ч количество нейтрофилов и их процентное содержание не отличалось от контроля ( рис. 1А.).

Для изучения закономерностей этого явления представлялось целесообразным выяснить, по крайней мере два обстоятельства:

1) влияет ли на данный феномен природа индуктора местного воспаления;

2) является ли мобилизационная блокада системной реакцией, или она носит избирательный характер и зависит от локализации очага воспаления.

Для выяснения первого предположения в качестве дспоаяяк

Рис.1. Количественные л функциональные показатели иейтро-Филов перитонеального экссудата через разные сроки после внутривенного введения эиысзана ( ■■ ) или Э№ ( СЬ ).

Do оси абсцисс - время после инъекции (ч). А - абсолютное количество нейтрофасо: > 1 мл экссудата.

Б - уровень спонтанной хешшоминесценции (ими/мин). Б - уровень латекс-индушрованной хемилшинесцендии щмп/мин>.

* - достоверность различий при р < 0,05.

и

тельного ирританта ( флогогена ) были использованы клеточные стенки Staphylococcus aureus, штамм ССМ 885. Так же как и при инъекции пептона, наблюдали существенное снижение количества нейтрофилов, эмигрировавших в брюшную полость через 0.S ч ■после внутривенного введения зимозана: 6,5 -105 ±0,2 -105 (опыт) и 57,2 -ю5 ± 17,2 '105 (контроль). Процент нейтрофи-лов в опыте был значительно ниже, чем в контроле.- 38,2 ± 2,4% и 80,3 ± 4,2Z соответствено ( р < 0,05). Это указывало на то, что, подобно пептону, клеточные стенки стафилококка не обеспечивали полноценной мобилизации нейтрофилов на фоне внутрисосудистой дестабилизации крови.

Для проверки второго предположения С системности мобили* зационой блокады ) в серии опытов изучали миграционную активность НМЛ на модели острой воспалительной реакции, индуцируе-. мой в подушечках лап через 0,5 ч после внутривенного введения зимозана (опыт) или ЗФР (контроль). 8 качестве ирританта использовали агрегированный иммуноглобулин человека.В опыте была выявлена более слабая реакция, чем в контроле: 54,4 t 14,5 мг и 79,3 ± 28,3 мг соответственно. Это указывало на общую тенденцию к снижению мобилизационных ресурсов нейтрофилов в системе острого воспаления на фоне внутрисосудистой дестабилизации крови. Вместе с тем, различия в этой серии опытов были недостоверно выражены* несмотря на достаточно репрезентативную группу исследованных животных ( 23 крысы в опыте и 20 в контроле). Это позволяет думать об особенностях проявления мобилизационной блокады нейтрофилов а условиях различной тканевой экологии, хотя и не исключает других объяснений.

Индуцированное снижение эмиграционной активности клеток-эффекторов воспаления в условиях наших опытов могло быть связано со следующими причинами:

1) Снижение числа циркулирующих нейтрофилов на фоне внутрисосудистой дестабилизации крови, и соответственно этому, уменьшение резерва клеток, готовых к экстравазальному рекрутированию. Однако, согласно налим данным, количество циркулирующих нейтрофилов полностью восстаназадось к 30-й мин, т.е. к моменту внутрибрхшшнсй инъекции флогогеков.

2) Ослабление мобильности нейтрофилов и связаннее с этим снижение скорости миграции ГШ в очаг воспаления. При из-/че-нии данного предположения мы определяли споссбяссть ПУЛ ^сви

■

к спонтанной миграции через 0,5 ч после внутривенной инъекции зимозана (пик мобилизационного блока ). Результаты учитывали по изменение площади миграции. По способности к спонтанной миграции нейтрофилы контрольной ( 19,1 ± 2,7 услов. ед.) а опытной {18,6 ± 3,0 услов.ед.) групп не отличались друг от друга (р > 0.05). Это указывало да сохранение комплекса свойств, обеспечивающих миграцию ПМЛ.

3) Можно было думать о снижении адгезивности нейтрофи-лов, обеспечивающей их реакции в системе с эндотелием. Это предположение противоречит данным, полученным в экспериментах, где изучалась способность нейтрофилов прикрепляться к объектам, несущим специфические лнганды (¡¡гО-, СЗЬ-), а также к сорбентам, фиксирующим клетки через гидрофобные контакты (ШМА). Исследования показали, что адгезивные реакции нейтрофилов крови в этих системах на пике мобилизационного блока ( 0,5 ч после внутривенного введения вимозана ) не отличались от контроля.

4) Изменение реактивности резидентных макрофагов и связанной с ними продукции ( прямой или опосредованной ) нейтро-фильных хемоаттрактантов. Наш изучен ряд параметров, характеризующих состояние резидентных макрофагов брюшной полости на пике мобилизационного блока X 0,5 ч после инъекции зимозана ). Наш эксперименты не показали существенных сдвигов в количестве резидентных макрофагов в брюшной полости на фоне внутривенной инъекции зимозана. В пересчете на 1 .мл элюата оно составило 4,6 -105 ±0,5 •105 клеток в' опытной группе животных и 5,2 -105 ±0,6 -105 клеток в контрольной. Показатели спонтанной ХЛ макрофагов достигали в опыте 4,9 ■105 ±1,0 • -105 иыпУмин, что было несколько выше, чем в контроле: 3,1 -•10э ±0,8 -105 имп/мин ( р > 0,05 ). Показатели индуцирован-лой ХЛ макрофагов в опыте были выше ( но недостоверно )„ чем 1 контроле, как при стимуляции клеток опсонизированным зимо-занок" ( £.2 -10б ± 1,5 -10б.имп/мин и 3,5 *106 ± 0,8 ЧО6 имп/мин), так и в экспериментах с 4МА ( 6,0 -10б ± 0,7 -10б яма/мин к 2,8 • 106 ± 0,3 '105 имп/мин ).Эти данные указывают ла то. что дестабилизация крови ве снижала функционального реьерва резидентных макрофагов и даже несколько усиливала их реактивность по данным кислород-зависимых реакций.

Гаким образом, полученные результаты не позволили нам -связать мобилизационную блокаду нейтрофилов со снижением количества. 1МЯ циркулирующего пула, ослаблением их двигательной активности, адгезивных реакций, а так же со снижением реактивности резидентных макрофагов. Можно предложить несколько направлений для дальнейшего исследования данного феномена:

1. Изучение- кондиционирования адгезивных молекул, обеспечивающих взаимодействие нейтрофилов с зндотелиоцитами, а таете матриксными белками соединительной ткани.

2. Определение чувствительности нейгрофилов к хемоаттра-ктантам, продуцируемым в очаге воспаления.

3. Более детальная функциональная характеристика рези-■ дентных клеток ( макрофаги, тучные клетки ) на этапе ийдуквди воспаления, в частности, выявление rix способности к образованию нейтрофильных хемоагтракгантов.

Для оценки эффекторннх ресурсов воспалительной реакции на фоне внутрисосудистой дестабилизации крови изучали функциональный резерв экссудативных нейтрофилов в адгезивных и кислород-зависимых реакциях. Эксперименты проводились на пике мобилизационного блока ( 0,5 ч после внутривенной инъекции зимозана). Учитывали процент нейтрофилов, способных к закреплению на гранулах трех сорбентов: СЗЬ-сефадексе, IgG-сефа-розе, ПММА. Число ПМЛ, закрепившихся на СЗЬ-сефадексе составило 50,0 ± 5,77. в omnfe-и 47,4 ± 4,2£ в контроле (р > 0,05). Для IgG-сефарозы: 44,4 ± 3,4%. и 45,3 ± 4,9% соответственно (р > 0,05). Неспецифическая адгезия ( взаимодействие с ПММА ) в опыте также существенно на отличалась от контроля: 49,6 t ± 7,3% и 55,9 ± 4.3% ( р > 0,05 ). Таким образом, внутрисосу-дистая дестабилизация крови не сопровождалась изменениями функциональных параметров рецепторов для СЗЬ-фактора комплемента, иммуноглобулина IgG, а также элементов плазматической мембраны, обеспечивающих общую ( неспецифическую ) адгезив-ность клеток. Способность нейтрофилов к. кислородзависимым реакциям оценивали в тестах спонтанной и латекс-индуцированной УЛ. Спонтанную Ю1 перитонеального экссудата изучали в разные интервалы времени после внутривенного введения зимозана (Рис. 1Б.). Брюшную полость промывали 20 мл 24P и 1 мл клеточной взвеси тестировали в реакциях люминал-зависимой УЛ. На п»рнся сроке наблюдения (0.5 ч) было отмечено значительное снижен»?

показателей:^,3 • Ю4 ± 1,4 -104 имп/мин в опыте и 74,Б -10^ ± 6,8 -104 имя/мин в контроле. Однако, уже к первому часу после введения зимозана различия сглаживались и на более поздних сроках ( 4; 24 ч ) результаты в опытных и контрольных группах достоверно не отличались (р > 0.05 ). Расчеты показали , что интенсивность ХЛ в пересчете на один нейгрофил в опыте не отличалась от контроля и была практически одинакова на всех сроках наблюдения. То же самое можно сказать и об.индуцированной ХЛ, которую изучали в реакциях с латексом в те же временные интервалы, что и спонтанную ( Рис. 1В.). Через 0.5 ч после инъекции зимозана показатели составляли 16,5 • •105 ± 2,5 -105 ими/мин в опыте и 59,7 -105 ± 4,3 -105 иып/ мин в контроле. Существенное ослабление индуцированной ХЛ пе-ритонеального экссудата наблюдалось на протяжении 1 ч. Затем, как и в спонтанном тесте, наступало выравнивание показателей в опыте и контроле. Уменьшение латекс-индуцированной ХЛ пери-тонеального экссудата соответствовало снижению числа нейтрофилов, рекрутированных в -брюшную полость на фоне внутрисосу-дистой дестабилизации крови . Снижение удельной активности НМД ( пересчет показателей ХЛ на один нейтрофил ) в.опыте не наблюдалось. В целом, следует отметить, -что снижение спонтанной и индуцированной ХЛ экссудата соответствовало уменьшению количества нейтрофилов, мигрировавших в брюшную полость, т.е. являлось одним из проявлений феномена острой мобилизационной блокады нейтрофилов на фоне внутрисосудистбй дестабилизации крови.

Заслуживают специального комментария наблюдения, сделанные нами в ходе отработки моделей для изучения адгезивных реакций нейтрофилов крысы. Мы имели возможность сравнить собственные результаты с данными, полученными ранее в нашей лаборатории на моделях с лейгрофилами человека ( Чеботарь И.В., Конышкина Т.М. ,1989 ) В ходе эксперимента нас заинтересовали особенности видовой специфичности СЗЬ~ и 1ей- зависимой адгезии человека л крысы в системах с аллогевньаш и ксеногешшми днгандами. Показатели -адгезии учитывали по проценту позитивных гранул. Различия были наиболее ярко выражены в системах 1еО- зависимой адгезии ( Рис. 2 ). Нейтрофилы крысы не сорбировались на сефарозе, коныогированной с ДО человека ( ксено-гсыпан система ), тогда как при взаимодействии с сефарсзой,

А

50-

I / /) л.

и

Рис. 2. Адгезия нейтрофилов человека (А) и крысы (Б) на 1вв-сефарозе (1) и СЗЬ- сефадексе (2) в аллогенных (СЗ ) и ксеногенных (223) системах.

По оси ординат - процент позитивных гранул. * - достоверность различии при р < 0.05.

В

О

коньгагированной с 1е& крысы ( аллогенная система ) локазатель адгезии достигал 78,4 ± 2,8% позитивных гранул. В то же время, для нейтрофилов человека в аллогенной и ксеногенных 1д&-системах были зарегистрированы сходные результаты: 74,0 ± ± 3,72 и 69,1 ± 8,1% соответственно. Различия в СЗЬ-зависимых реакциях также проявлялись только у крысы, но были выражены слабее,чем в 1£&-зависимых системах: 68,4 1 2,82 ъ аллогенной и 45,9 ±5,32 в ксеногенной ( р < 0.05 ). Однако, неспособность нейтрофилов крысы закрепляться-на иммобилизованных ксеногенных лигандах (сефароза, коньюгированная с человека) еще не доказывает отсутствия у них соответствующих рецепторов. Причиной негативного результата может быть то, что связывание диганда не обеспечивает активации кле-ток, которая необходима для проявления их функционального потенциала в конкретных реакциях. Для выяснения этого вопроса мы изучили взаимодействие нейтрофилов крысы с агрегированным человека, меченным изотиоцианатом флкюресцеина. Параллельно анализировали связывание аллогенного меченного Аналогичные исследования проводили с нейтрофилами человека.. Нейтрофилы крысы значительно интенсивнее фиксировали аллогенный ( 60,2 ± ± £,12 ), чем ксеногенный (-4,5 ± 1,32 ) ( р < 0,05 ). Напротив, в опытах с нейтрофилами человека результаты с ксено-генным 1ее не устурали по- интенсивности реакциям с адлоген-ным лигандом: 28,6 ± 3,72 и 36,0 ± 5,42 соответственно ( Р > 0,05 ). Эти данные соответствуют- приведенным выше результатами адгезивных реакций нейтрофилов, позволяя утверждать» что различие во взаимодействии нейтрофилов крысы с ал-догенныш -и ксеногенными происходило на уровне рецепторов плазматической мембраны, а не на этапах пострецепторной эволюции стимулирующего сигнала. В целом, полученные результаты могут служить доказательством того, что иммунные рецепторы клеток ( СК, Рс1? ) способны дифференциировать видовые особенности функционально однотипных лигандов, однако, эта способность не универсальна и отличается у разных видов животных. Эти особенности необходимо учитывать при изучении рецептор-опосредованных взаимодействий с использоваки-.ч.: ксеногенных ощгандов, чем нередко пренебрегают в иммунологических исследованиях.

выводы

1. Внутрисосудистая дестабилизация крови, вызванная внутривенной инъекцией зимозана; вызывает обратимую нейтропению, сопровождающуюся временным ( в течение часа ) снижением'функционального потенциала нейтрофилов крови в реакциях кислород-завис>шого метаболизма.

2. Внутрисосудистая дестабилизация крови вызывает острую мобилизационную блокаду нейтрофилов, проявляющуюся в снижении флогоген-индуцированной миграции ПУЛ в очаги воспаления.

3. Мобилизационная блокада нейтрофилов не зависит от природы Флогогена, индуцирующего местную воспалительную реакцию и носит системный характер.

4. Мобилизационная блокада не связана с уменьшением числа галл в крови, ослаблением миграционной активности и адгезивных свойств нейтрофилов циркулирующего пуда, а такхе со снижением реактивности резидентных макрофагов.

5. Ослабление эффекторного потенциала острой воспалительной реакции на фоне знутрисосудистой дестабилизации крови обусловлено блокадой миграции нейтрофилов в зону воспаления.

6. Обнаружены различия IgG - и СЗЬ - зависимых реакций нейтрофилов крысы и человека в системах с аллогенными и ксе-ногенными лигандами. В отличие от нейтрофилов человека, нейт-рофилы крыса способны дифференцировать видовые особенности IgS-иммуноглобулинов. Видовые особенности СЗЬ- зависимых реакций выражены слабее. .

■ СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО TBE ДИССЕРТАЦИИ:

1. Заславская М.И., Коньшгагаа Т.М. Сравнительная характеристика СЗЬ-зависимой адгезии нейтрофилов периферической крови и перитонеального экссудата крыс // Тез. докладов конференции молодых ученых.- Горький.- 1990.- С.53.

2. IgG- и СЗЬ- зависимая адгезия нейтроскилсв в системах с аллогенными и ксеногеннкми лигандами / Чеботарь И.З.. Заславская М.И., Конышкина Т.М., Маянский А.Н. •// Бэл. эксп. биол. и мед.- 1991.-N.10.- С.403-404.

3.' Заславская М.И., Маянский А.Н. Влияние виутрисосудис-той дестабилизации крови на реактивность нейтрофилов в очаге-

острого воспаления // Тез. докладов XI республиканской конференции " Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях ". - Челябинск. - 1992.- С.38.

4. Люминолаависимая хемилюминесценция в оценке эволюции и эффекторных возможностей воспалительного процесса / Маянс-кий А.Н., Заславская М.И., Невыятуллин А.Л., Конышкина Т.М. // Тез. докладов IV всесоюзного совещания " Ломинесцентный анализ в медицине и . биологии и его аппаратурное обеспечение".- М.- 1992.-'ВЫП.4.- С.74-75. '

5. Леютшзависимое кондиционирование в системе ^-опосредованных реакции нейтрофила / Чеботарь И.В., Заславская Ы. И., Соловьев К.Ю.", Челшев И.В., Маянский А.Н. //Тез.докладов 1-го съезда иммунологов России.- Новосибирск.- 1992.- С.526.

" 6. Заславская М.И., Маянский А.Н. Особенности нейтрофил-зависимой воспалительной реакции на фоне внутрисосудистой активации крови // Нижегород. мед. журнал.- 1992.- 'N.4.-С.29-33.

Формат 60 X 80/16 Тираж 300 экз.