Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Фотометрический НСТ-тест с нейтрофилами крови человека и его клинико-иммунологическая значимость у больных с травмой опорно-двигательного аппарата

На правах рукописи

ЗИНКИН ВЛАДИМИР ЮРЬЕВИЧ

ФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ НСТ-ТЕСТ С НЕЙТРОФИЛАМИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ЕГО КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ У БОЛЬНЫХ С ТРАВМОЙ ОПОРНО-ДВИГАТЕЛЬНОГО АППАРАТА

14.0036 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте скорой помощи им. Н.В.Склифосовского Департамента здравоохранения г.Москвы

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор В.Б. Хватов

доктор медицинских наук

И.Ю. Клюквин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Л.И. Краснопрошина

доктор медицинских наук,

профессор Л.В. Ковальчук

Ведущая организация: Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

диссертационного совета Д 001.035.01 при ГУ Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, Москва, Малый Казенный пер., д.5а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук И. В. Яковлева

Защита состоится «

часов на заседании

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одной из основных проблем современной медицины являются гнойно-септические осложнения (ГСО), развитие которых во многом определяется состоянием иммунной системы пострадавших. Нейтрофильные гранулоциты (НГ) служат основными эффекторами противоинфекционных механизмов иммунитета. Среди широкого спектра проявлений их функциональной активности особое место отводится кислородзависимому метаболизму (КЗМ), который резко возрастает в процессе клеточной активации и сопровождается увеличением продукции активных форм кислорода (АФК): супероксид аниона, пероксида водорода, гидроксил радикала и синглетного кислорода [АН.Маянский, ДЛМаянский, 1989; S.WJEdwards, 1994]. Кислородные радикалы являются не только основой антимикробного потенциала нейтрофилов, но и активными регуляторами тканевого метаболизма человека [Н.И.Бахов с соавт., 1988; И.И.Долгушин, О.В.Бухарин, 2001]. Показана высокая информационно-диагностическая значимость исследования КЗМ нейтрофилов при бактериальных и вирусных инфекциях [R.D.Feigin, LKPickering,' 1975], коллагенозах [М.М.Дейл, 1999], сердечно-сосудистых заболеваниях [S.Kausalya, J.Nath, 1998], деструктивном панкреатите [В.С.Тарасенко с соавт., 2000] и респираторном дистресс-синдроме [ГАРябов, 1994]. Однако, особенности метаболической активности НГ при травме опорно-двигательного аппарата изучены недостаточно.

В травматологической практике отмечается неуклонный рост количества медиальных переломов бедра, что связано с увеличением доли пожилых людей среди населения [H.Burger, 1999; C.E.DeLaet, HAPols, 2000]. Современным подходом к лечению таких больных является выполнение первичного эндопротезирования тазобедренного сустава [В.П.Охотский, И.Ю.Клюквин, 1999; Н.В.Корнилов, 2000; G.M.Robbins et al., 2001]. Проведение оперативного вмешательства у пациентов старших возрастных групп на фоне посттравматической и возрастной иммуносупрессии, большого числа

сопутствующих заболеваний, определяет иммунной системы, включая анализ активности

«Л^ШТ1

Ш10В.6И6ЛИОТЕКА J СПетерОур тТвГ*

оэ тд»*1//лу \

Одним го основных методов исследования функциональной активности НГ является тест с нитросиним тетразолием (НСТ). Он основан на способности бесцветного НСТ восстанавливаться кислородными радикалами в темно-синий диформазан (ДФ)- Результаты реакции регистрируют визуально или фотометрически. Визуальный учет НСТ-теста субъективен и не позволяет проводить количественной оценки активности НГ [B.H.Park et al., 1968; Б.СНагоев, Н.Г.Оразаев, 2000]. В большинстве фотометрических вариантов НСТ-теста используют токсические растворители, значительные объемы реагентов и отсутствует автоматическая регистрация результатов реакции [RX.Baenher, D.G.Nathan, 1968; ВХВагнер с соавт., 1989; MP.Richardson et al., 1998]. Автоматизированные варианты фотометрического НСТ-теста имеют недостатки и не апробированы в клинической практике [G.Virella et al., 1990; Е.П.Киселева и А.В.Полевщиков, 1994]. Исходя из вышеизложенного, актуальным является разработка высокопроизводительного и объективного метода исследования КЗМ НГ для клинической практики.

Цель исследования

Разработать фотометрический НСТ-тест с нейтрофилами крови человека и оценить его клинико-иммунологическую значимость у больных с травмой опорно-двигательного аппарата.

Задачи исследования

1. Оптимизировать процедуру выделения и количество нейтрофильных гранулоцитов крови человека, участвующих в реакции восстановления НСТ.

2. Усовершенствовать условия проведения НСТ-теста и способ фотометрической регистрации его результатов.

3. Провести сравнительную оценку кислородзависимого метаболизма нейтрофилов крови здоровых и пациентов с различной патологией.

4. Оценить клинико-иммунологическую значимость разработанного НСТ-теста у больных после первичного эндопротезирования тазобедренного сустава.

Научная новизна

Разработан способ диагностики функционального состояния нейтрофилов человека (патент Российской Федерации на изобретение № 2218567 от 24.12.2003), основанный на использовании высокоочищенного пула нейтрофилов крови человека при заданной концентрации и соотношении клетка/индуктор, а также двух-волновой регистрации продуктов реакции с помощью многоканального фотометра.

Обосновано использование заданной концентрации нейтрофилов (500000+50000 клеток/лунке),- опсонизированного и_ неопсонизированного зимозана в соотношении 20+2 частин/клетку в качестве индукторов кислородзависимого метаболизма НГ и 2-х волновой (тестовая Я=630 нм; референтная Я.=490 нм) регистрации продуктов реакции в НСТ-тесте.

Доказана высокая чувствительность разработанного варианта НСТ-теста для оценки активности процесса образования активных форм кислорода при воздействии ингибиторов кислородзависимого метаболизма нейтрофилов.

Показана высокая информационная значимость использования двух корпускулярных индукторов кислородзависимого метаболизма НГ (опсонизированный и неопсонизированный зимозан) для оценки дискретности клеточного ответа, опосредованного через различные рецепторы и внутриклеточные пути активации.

Практическая значимость

На разработанный способ, диагностики функционального состояния нейтрофилов человека оформлено рационализаторское предложение (№ 662, НИИ скорой помощи им. Н.В.Склифосовского) и с 1999 года метод используется в практической деятельности- лаборатории клинической иммунологии и диагностики СПИД.

Выявлено, что 47% больных со свежими медиальными переломами бедра имеют нарушения кислородзависимого метаболизма нейтрофилов и обосновано проведение у них профилактической иммунокоррекции с помощью препаратов,

обладающих целенаправленным воздействием на фагоцитарное звено иммунитета.

С помощью фотометрического НСТ-теста в травматологическую практику внедрен алгоритм- иммунологического пособия пациентам с медиальными переломами бедра, включающий приоритетное исследование в предоперационном периоде метаболической" активности нейтрофшюв, выявление иммунокомпромитированных пациентов и проведение иммунокоррекции в послеоперационном периоде у таких больных.

Апробация работы

Результаты работы доложены на. юбилейной - научной конференция «Современные технологии и перспективы развития военной травматологии и ортопедии» (Санкт-Петербург, 2000); городской научно-практической конференции «Первичное эндопротезирование тазобедренного сустава у больных пожилого и старческого возраста с медиальными переломами бедра» (Москва, 2001); всероссийской юбилейной научно-практической конференции «Лечение сочетанных травм и заболеваний конечностей» (Москва, 2003); межклинической конференции проблемно-плановой комиссии по неотложной травматологии НИИ скорой помощи им. Н. В. Склифосовского (Москва, 2003); 8 международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004); П всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2004).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 работ, получен патент РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций в практику и списка цитируемой литературы, состоящего из 83

отечественных и 130 зарубежных источников. Диссертация изложена на 129 страницах, иллюстрирована 10 таблицами, 17 рисунками.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанный фотометрический НСТ-тест, основанный на использовании высокоочищенного пула нейтрофилов крови человека, двух корпускулярных

. индукторов и двух-волнового способа регистрации продуктов реакции, обладает высокой клинико-иммунологической информативностью при оценке патологических состояний человека.

2. Подавление функциональной активности нейтрофилов является ведущим нарушением иммунной системы у больных со свежими медиальными переломами бедра, что обосновывает проведение у них профилактической иммунокоррекции препаратами, которые обладают целенаправленным воздействием на фагоцитарное звено иммунитета.

3. Применение иммунокоррекции у пациентов в ранние сроки после первичного эндопротезирования тазобедренного сустава позволяет улучшить результаты хирургического лечения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В качестве объекта исследования использовали венозную кровь человека, антикоагулянтом являлся гепарин в конечной концентрации 15 ЕД/мл; исследования, проводили в утренние часы в течение 1-2 часов после забора крови.

Проведено 88 серий исследований, посвященных: оптимизации условий выделения нейтрофильных гранулоцитов (20 серий), количеству участвующих в реакции восстановления НСТ нейтрофилов (13 серий), отработке спектра и концентрации индукторов КЗМ НГ (30 серий), времени инкубации (5 серий), процедуре экстрагирования и растворения диформазана (10 серий), а также способам его фотометрической регистрации (10 серий).

В работе использовали следующие индукторы КЗМ НГ: корпускулярные - опсонизированный и неопсонизированный зимозан (о/з, н/з); растворимые -формиловый пептид (fMLP), поликомпонентную вакцину «Пиопол», представляющую собой комплекс очищенных концентрированных протективных антигенов условно-патогенных микроорганизмов (анатоксин синегнойной палочки, стафилококковый анатоксин, цитоплазматический* антиген стафилококка, протейный поливалентный антиген), иммуномодулятор «Полиоксидоний» и адсорбированную коклюшно-дифтерийно-столбнячную вакцину (АКДС), для которой показано стимулирующее влияние на КЗМ лейкоцитов крови [Дорохина Н.А. с соавт., 2001].

С помощью разработанного фотометрического НСТ-теста исследованы образцы венозной крови.392 человек, из которых 136 практически здоровых людей и 256 больных хирургического и травматологического профиля, с химической и термической травмой, находившихся на лечении в НИИ скорой помощи им. Н.В.Склифосовского в период с 1998 по 2002 годы.

Обследованы пациенты с распространенным перитонитом в 1-3 сутки после поступления в институт, пострадавшие с термической травмой 15-30% поверхности тела в стадии септикотоксемии, больные с медиальными переломами бедра в 1-3 сутки после поступления, больные с экзогенным отравлением психотропными препаратами (лепонекс, амитриптилин) в период гипоксический нарушений.

Оценка клинико-иммунологической значимости разработанного фотометрического НСТ-теста в травматологической практике проведена у 128 больных с медиальными переломами бедра, которые в зависимости от тактики лечения разделены на 4 группы: 1-я группа (п=30) - консервативная, П-я группа (п=28) - остеосинтез бедренной кости, Ш-я группа (п=41) - первичное эндопротезирование тазобедренного сустава и IV группа (п=29) - первичное эндопротезирование тазобедренного сустава в сочетании с иммунокоррекцией «Полиоксидонием». Оперативное вмешательство во II, III и IV группах осуществляли на 7-е сутки от момента поступления в стационар. Это позволило синхронизировать иммунологическое обследование пациентов и выделить 2

этапа наблюдения: 1-й - первая неделя с момента поступления в I группе и за семь дней до операции во II, III и IV группах; 2-й - вторая неделя после поступления в 1-ой группе и вторая неделя после операции во II, III и IV группах. -

В процессе иммуномониторинга определяли абсолютное и относительное количество CD3+ и С020+лимфоцитов методом непрямой флюоресцентной микроскопии с помощью моноклональных антител (000 «Сорбент»), концентрацию сывороточных иммуноглобулинов классов А, М и G методом радиальной иммунодиффузии в геле по G. Mancini et al. (1965), циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) различных величин методом преципитации с полиэтиленгликолем [Горячева Н.В. с соавт., 1997], фагоцитарную и метаболическую активность нейтрофилов крови человека с помощью латекс-теста и микроскопического варианта НСТ-теста [Бумагина Т.К., Шмелев Е.И., 1981], а также с помощью разработанного фотометрического варианта НСТ-теста.

Для статистической обработки полученных результатов использовали дисперсионный анализ, параметрические и непараметрические методы множественного сравнения (критерии Стьюдента, Крускала-Уоллиса и Данна) с помощью программы «Биостатистика» [Гланц С, 1999]. Расчеты производились на IBM-совместимом персональном компьютере.

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка способа количественной оценки кислородзависимого метаболизма нейтрофилов крови человека.

Оптимизация условий выделения и количества НГ при постановке реакции восстановления НСТ.

В качестве метода выделения НГ использовали ступенчатое центрифугирование на двойном градиенте плотности смеси фиколл-урографин (1,114 г/мл и 1,076 г/мл) в течение 15 мин при 250 g. Для деконтаминации выделенных НГ использовали гипотонический лизис эритроцитов, что позволило существенно снизить временные затраты и добиться чистоты

выделения клеток в среднем 97% нейтрофилов с высоким индексом жизнеспособности - 97-98%.

При определении оптимальной концентрации нейтрофилов, участвующих в реакции восстановления НСТ, установлено, что в диапазоне от 200 до 750 тыс. клеток в лунке планшета изменение оптической плотности раствора диформазана носит линейный характер как в спонтанном, так и в индуцированном тестах (рис.1). Из этой зоны оптимума выбрана концентрация 5ОО±5О тыс. нейтрофилов в лунке планшета, что связано с низким «выходом» НГ из крови больных при патологических состояниях, сопровождающихся лейкопенией. Использование более низкой концентрации нейтрофилов увеличивает погрешность метода.

Рис. 1 Зависимость параметров НСТ-теста от количества НГ.

Обозначения: треугольники - средние значения индуцированного теста по результатам 13 серий исследований; кружочки - средние значения спонтанного теста по результатам 13 серий исследований.

Разработка условий проведения НСТ-теста и способа фотометрической регистрации его результатов.

Функциональное состояние нейтрофилов оценивали по- уровням спонтанной и индуцированной активности, для чего в лунки планшета вносили: раствор НСТ и суспензию нейтрофилов - спонтанный тест; раствор НСТ, суспензию нейтрофилов и индуктор - индуцированный тест. После внесения всех реагентов планшет инкубировали 20 мин при 37 °С. В качестве органического растворителя для образовавшегося ДФ, использовали недорогой, легкодоступный и нетоксичный официнальный препарат «Димексид».

Существенно повысить специфичность разработанной методики на этапе регистрации результатов реакции восстановления НСТ позволило применение 2-х волнового способа фотометрии (многоканальный фотометр Dinatech MR 7000, Германия). Максимум специфического поглощения для раствора ДФ выявлен при длине волны - 630 нм (тестовая), а значение референтной (неспецифической) длины волны установлено при 490 нм. В этой связи, нами предложено оценивать концентрацию ДФ по разнице значений оптических плотностей. Использование автоматического учета результатов реакции с помощью многоканального планшетного фотометра, позволило существенно повысить производительность и объективность данной методики: временные затраты на обработку 50 образцов крови не превышают 10 минут, в то время как продолжительность этого этапа при визуальном учете составляет более 3 часов.

Оптимизация спектра и концентрации индукторов КЗМ НГ.

При использовании корпускулярных индукторов КЗМ НГ в диапазоне соотношений от 320 до 1 частицы/клетку отмечено линейное нарастание оптической плотности раствора ДФ. Оптимальное соотношение индуктор/клетка - 20:1 обосновано серией экспериментов, в результате которых удалось выявить, что, начиная с данного соотношения, достигается максимальный уровень дискретности клеточной активности в ответ на стимуляцию двумя разновидностями зимозана.

Дозозависимое увеличение метаболической активности нейтрофилов установлено при использовании 1МЬР в концентрации от 0.1 до 1000 нмоль/л, когда значения индуцированного теста достигали максимума (470 шОБ), что в среднем на 49% меньше в сравнении с клеточным ответом на зимозан (700 шОБ). Дальнейшее повышение концентрации ШЬР приводило к относительному угнетению КЗМ НГ.

В процессе оценки воздействия нативных вакцин «Пиопол» и АКДС отмечено значительное (до 85%) подавление метаболической активности нейтрофилов, в то время как в диапазоне разведений от 1:25 до 1:3125 не выявлено их значимого влияния на КЗМ НГ (рис. 2).

Рис. 2 Влияние различных концентраций вакцин на КЗМ НГ.

По оси абсцисс - кратность разведения вакцин, по оси ординат - отклонение

значений НСТ-теста относительно контроля (в %).

Обозначения: (1) - сНСТ с «Пиополом»; (2) - о/зНСТ с «Пиополом»;

(3) - сНСТ с АКДС; (4) - о/зНСТ с АКДС.

После проверки предположений о возможной чрезмерной антигенной нагрузке концентрированных комплексных препаратов и/или присутствии в вакцинах токсических примесей «неантигенной» природы, удалось выявить, что ингибирующим воздействием на метаболическую активность нейтрофилов обладает минорная добавка - мертиолят. Последний является ингибитором

тканевого - дыхания и используется-в качестве консерванта. Полученные результаты демонстрируют, что разработанный метод способен регистрировать как активацию, так и подавление метаболической активности нейтрофилов, что важно для оценки состояния фагоцитарного звена иммунитета в клинической практике. Кроме того, показано, что фотометрический НСТ-тест является высокочувствительным; методом для оценки специфичности реакций, сопровождающихся продукцией АФК, а оптимальными по степени активации и вовлечения различных рецепторных структур нейтрофила индукторами КЗМ -опсонизированный и неопсонизированный зимозан.

Таким образом, на основании проведенных исследований предложена следующая технология постановки фотометрического варианта НСТ-теста с выделенными нейтрофилами крови человека, алгоритм которой отражен на рисунке 3.

Повышение информативности получаемых результатов достигается за счет интегральной оценки всех параметров разработанного НСТ-теста: уровней спонтанной (сНСТ) и индуцированной (н/зНСТ, о/зНСТ) активности нейтрофилов, резервных возможностей функциональной активности клеток (КАо и КАн), степени дискретности клеточной активности на различные стимулы (КО).

Соблюдение разработанных принципов проведения фотометрического НСТ-теста позволило достичь высокой воспроизводимости (коэффициент вариации 10-15%) и чувствительности метода: пороговая концентрация клеток в спонтанном тесте составляет 50 тыс. клеток/лунке.

Рис. 3 Алгоритм проведения фотометрического НСТ-теста.

I: Объект исследования

Венозная кровь

II. Стандартизация выделенных НГ

III. Постановка НСГ-тесга

о о о о о о о о о о о о о о оо о о о о о о о о о о о о

IV. Регистрация1 и учет

результатов -НСГ-тесга

Спонтанный тесп

НГ - 100 мкд НСГ - 50мкл ИС - 50мкл

Гепарин-15 Ер/мл Разведение-3 мл крови + 5 мл 0,85% р-ра NaCI

Градиентное центрифугирование (1,114 и 1,076 г/мл смеси фикалл-урографина) - 250 g 15'

Гипотонический лизис эритроцитов 30-40"

"Выход" НГ 95-97% (3 - 4 млн.)

Жизнеспособность (трипановый тест) 97-98%

Подсчет количества НГ в камере Горяева

Стандартизация концентрации с помощью ИС - 5 х 10° кл/мкл

[НГ] - 500 тыс. клеток /лунке Концентрация НСГ -4 мг /мл Соотношение индуктор/клетка -20:1

Индуцированный тесп

НГ - 100мкл НСГ- 50мкл Зимозан - 50 мкп

Инкубация - при 37 "С 20'

Остановка реакции - центрифугирование при 250g 15' Фиксация - 200мкяабс. этанола + 5'при 500g Отмывание - 200мкл 0,85%NaO + 5'при 500g ЭкстракцияДФ- 130мкпДМС020' прибО°С + 70мкл2МКОН

Двухволновое измерение продуктов реакции на мультискане

Учет результатов реакции в mOD -

ТЕСТОВАЯ X - 630 нм РЕФЕРЕНТНАЯ X -490 НМ

Спонтанный тест сНСТ Индуцированный о/зНСТ

тест н/зНСГ Коэффициенты КАо активации КАн

Клиническая апробация способа количественной оценки кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов.

Важным этапом работы явилась разработка референтных значений фотометрического НСТ-теста. В основном, вычисление референтного интервала производится с помощью параметрического метода статистического анализа в диапазоне ±1,5-2,0 стандартных отклонений (а) от средней величины при выполнении условия нормальности распределения измеряемого признака. [Демидова Н.В., 1987].

Обследовали совокупность практически здоровых людей: 61 кадрового донора плазмы, 44 медработника и 31 первичного донора крови, допущенного к кроводаче. Распределение по полу составило 63 (46%) женщины и 73 (54%) мужчины, по возрасту - от 19 до 60 лет (в среднем 43,4+12,1 года). Установлено, что спонтанная клеточная активность в выбранной популяции здоровых людей не подчиняется нормальному распределению - выявлено три пула клеточной активности. Осуществление детальной оценки влияния каждой • подгруппы здоровых лиц на характер распределения- всей совокупности позволило установить, что между ними имеются-достаточно выраженные различия по активности КЗМ НГ. Для доноров плазмы и медработников характерным оказался «двугорбый» профиль активности, в то время как распределение значений сНСТ среди первичных доноров крови имело «колоколоподобный» нормальный характер. После обработки данных, полученных в индуцированных тестах по группам, установлено, что распределение параметров о/зНСТ и н/зНСТ у доноров плазмы характеризовалось резким сдвигом в область низких значений, что может быть связано с влиянием регулярных сеансов плазмафереза (в среднем - 24), осуществляемых в течение длительного промежутка времени. Медработники, напротив, имели тенденцию к повышению активности КЗМ нейтрофилов в ответ на дополнительную стимуляцию двумя разновидностями зимозана, что можно расценивать как ответную реакцию организма на тесный контакт с инфекционными агентами. Нормальный характер распределения активности НГ установлен только среди первичных доноров крови.

Для расчета референтного интервала использовали рекомендуемое для гематологических показателей отклонение в ±1,5 о от средней величины [Воробьев А.И., 1985], а полученные референтные значения параметров НСТ-теста отражены в таблице 1.

Таблица 1

Референтные значения фотометрического НСТ-теста

Стат-ие параметры сНСТ, тСЮ о/зНСТ, тСЮ КАо н/зНСТ, шОБ КАн КО Лей-ты, тыс./мкл

X 194 1059 5,7 713 3,8 1,5 6,7

. медиана 195 1059 5,3 700 3,6 1,5 6,8

ш 6 32 0,3 24 0,2 0,05 0,3

1а 35 176 1,7 134 1,1 0,3 1,6

1,5 о 52 264 2.5 202 1,6 0,4 2,4

Х-1,5 а 142 795 3,2 511 2,2 1,1 4,2

Х+ 1,5 о 246 1323 8,2 914 5,4 1,9 9,1

Референтный интервал 140-250 800-1300 3,2-8,2 500-900 2 Д - 5,4 1,1-1,9 4-9

Примечание: Х- среднее арифметическое, m - стандартная ошибка средней, а - стандартное отклонение.

Полученные результаты (с учетом подтверждения референтного интервала для количества лейкоцитов) отражают адекватность указанного подхода для разработки референтных значений фотометрического НСТ-теста и позволяет расценивать первичных доноров крови в качестве наиболее репрезентативных представителей здоровой популяции людей.

Следующим этапом клинической апробации явилась сравнительная оценка КЗМ НГ больных с различной патологией с использованием визуального и фотометрического вариантов НСТ-теста (табл. 2).

Таблица 2

Сравнительная характеристика кислородзависимого метаболизма НГ доноров и пациентов с различной патологией

ГРУППЫ п фотометрический НСТ-тест, тСШ визуальный НСТ-тест, %

сНСТ Д о/зНСТ Д н/зНСТ Д спНСТ Д лНСТ Д

Доноры крови 31 194±35 - 1059±176 - 713±134 - 10±3,3 - 30±6,7 -

Больные с перитонитом 24 356±76* 84 1129±270 7 855±217* 20 29±13,2* 190 30±4,5 0

Больные с термической травмой 25 327±76* 69 1429±360* 35 990±216* 39 27±16,1* 170 28±10,5 -7

Больные с переломами бедра 34 156±74* -20 637±342* -40 453±284* -36 20±13,2* 100 28±10,1 -7

Больные с экзогенным отравлением 16 80±53* -59 293±139* -72 138±72* -81 17±12,6* 70 25±Е* -17

Примечание: приведены выборочные средние и стандартные отклонения; Д - относительное отклонение от группы доноров (в %); * - р<0,05.

Установлено, что на фоне обширного гаойно-воспалительного процесса -распространенный перитонит, ожоговая травма - происходит достоверное увеличение на 69—190% спонтанной клеточной активности, регистрируемое обеими модификациями НСТ-теста. В начальной фазе (1-3 сутки) массивной антигенной нагрузки мобилизация фагоцитарного звена иммунитета идет по пути увеличения количества активированных нейтрофилов, а также повышения их удельной активности. Аналогичные изменения регистрировались визуальным НСТ-тестом у травматологических и токсикологических больных, однако, с помощью разработанной методики удалось выявить статистически значимое угнетение КЗМ НГ на 20 и 59% соответственно, что указывает на способность фотометрического НСТ-теста выявлять снижение суммарного бактерицидного потенциала фагоцитов. Угнетение спонтанной активности у больных с экзотоксикозом сопровождались выраженным подавлением клеточного ответа на дополнительную стимуляцию на 72-81% в фотометрическом НСТ-тесте, и лишь на 17% в его визуальном варианте. В этой связи подчеркнем, что

достоверное снижение (р<0,05) значений индуцированных тестов у больных с медиальными переломами бедра выявлено только в разработанном фотометрическом НСТ-тесте. Также отметим, что у ожоговых больных и пациентов с распространенным перитонитом процент активированных латексом НГ практически не отличался от нормы. Напротив, лейкоциты пациентов данных групп в ответ на стимуляцию зимозаном отвечали достоверным повышением продукции активных форм кислорода.

У больных с перитонитом выявлено разнонаправленное изменение функциональной активности клеток: достоверное повышение активности в н/зНСТ сочеталось с практически неизменным ответом на о/з. Такую клеточную реакцию мы связываем с рецепторной перестройкой НГ, возникающей в силу целого ряда причин. Во-первых, - выраженная воспалительная реакция сопровождается выбросом из костномозгового депо большого количества юных форм нейтрофилов, обладающих незрелым рецепторным аппаратом [Edwards S.W., 1994]. Во-вторых, - в связи с процессами интернализации и/или «шеддинга» рецепторов к Fc фрагментам иммуноглобулинов класса G (в частности FcyRII, FcyRHI), происходящими при активации НГ [Middelhoven PJ. et al., 2001]. В-третьих, - возможна опосредованная через интегрины (осуществляют рецепцию н/з) негативная регуляция КЗМ нейтрофилов в ответ на стимуляцию о/з что, связано с вовлечением конкурентных путей клеточной активации, использующих общие вторичные мессенджеры (тирозин- и фосфатидилинозитол-киназы) [Yan S.R., Novak M.J., 1999].

Таким образом, предложенное использование о/з и н/з позволяет выявлять случаи функциональной дискретности нейтрофилов в ответ на стимуляцию, опосредованную через различные рецепторные структуры и пути активации. Так, анализ распределения больных с медиальными переломами бедра показал, что в 47% наблюдений выявлено подавление КЗМ НГ в обоих индуцированных тестах, селективное подавление активации на о/з в 23% случаев и лишь 29% пациентов имели адекватный ответ на оба стимула.

Клиническая значимость фотометрического НСТ-теста при оценке эффективности иммунокоррекции у больных с первичным эндопротезированием тазобедренного сустава.

По данным иммунологического исследования крови на 1-м этапе наблюдения иммунная система пациентов с медиальными переломами бедра характеризовалась достоверным повышением уровня лейкоцитов в среднем на 21% в сочетании со снижением относительного количества лимфоцитов в среднем на 28%, преимущественно за счет относительного и абсолютного дефицита В-лимфоцитов. На фоне неизмененного уровня IgM и IgG отмечалось достоверное повышение в среднем на 46% уровня сывороточного IgA, суммарного количества ЦИК на 23% относительно нормы. Данные изменения сопровождались подавлением индуцированной активности в о/зНСТ и н/зНСТ на 26%, что приводило к истощению резервов • метаболической активности нейтрофилов: КАо был снижен в среднем на 23%, КАн - на 25%. С учетом выявленных отклонений в комплекс лечебно-профилактических мероприятий 29 пациентам после первичного эндопротезирования тазобедренного сустава был включен иммуномодулятор «Полиоксидоний», который назначали по 6 мг/сут внутримышечно в течение пяти дней после операции.

Иммунологический мониторинг пациентов на 2-м этапе наблюдения выявил, что основные отличия по группам регистрировались в фагоцитарном звене иммунитета (рис. 4). По результатам фотометрического НСТ-теста выявлен разнонаправленный характер изменений активности КЗМ НГ по группам: при оперативном лечении (П и III группы) наблюдали отрицательную динамику значений индуцированных тестов: подавление исходно сниженных о/зНСТ и н/зНСТ во II группе достигало 40 и 41%, в III группе - 40 и 33% соответственно. Больные I группы имели достоверное угнетение КЗМ НГ в среднем на 28% лишь в н/зНСТ, что мы связываем с отсутствием иммуносупрессивного воздействия оперативного вмешательства.

Рис. 4 Динамика параметров индуцированного НСТ-теста по группам.

Обозначения:*-р<0,05

Включение в схему послеоперационного ведения больных с первичным эндопротезированием тазобедренного сустава иммуномодулятора «Полиоксидония» (IV группа) позволило избежать углубления иммуносупрессии. Так, метаболическая активность нейтрофилов больных данной группы в о/зНСТ достоверно увеличивалась по сравнению с предоперационным периодом в среднем на 29%, а в н/зНСТ - на 36%.

Положительная лабораторная динамика сопровождалась неосложненным течением послеоперационного периода у данных больных: отсутствовали осложнения гшюстатического характера, заживление ран происходило первичным натяжением. Напротив, у 2 (4,9%) больных из 41 больного III группы в области послеоперационной раны было отмечено поверхностное нагноение мягких тканей.

Таким образом, выявленные изменения в иммунной системе пациентов с медиальными переломами бедра, в основном, касаются КЗМ НГ. Оперативное вмешательство вне зависимости от методики его выполнения (остеосинтез

бедренной кости или первичное эндопротезирование тазобедренного сустава) обладает супрессивным воздействием на продукцию кислородных метаболитов пулом нейтрофилов крови больных. Одним из методов коррекции иммунодефицитного состояния у таких пациентов может служить применение в комплексе лечебно-профилактических мероприятий иммуномодулятора «Полиоксидоний». Использование высокочувствительного фотометрического НСТ-теста позволяет оценивать влияние выбранной тактики лечения на иммунную систему больных с медиальными переломами бедра, а также осуществлять контроль эффективности проводимой иммунокоррекции.

Выводы

1. Разработан чувствительный количественный фотометрический НСТ-тест, основанный на использовании высокоочищенного (97%) пула нейтрофилов крови человека при заданной концентрации и соотношении клетка/индуктор и двух-волновой регистрации продуктов реакции.

2. Стандартизованы условия проведения НСТ-теста, включающие использование нейтрофилов (500±50 тыс. клеток в лунке), индукторов опсонизированного и неопсонизированного зимозана (20±2 частиц на клетку) с тестовой (при 630 нм) и референтной (при 490 нм) фотометрией конечного продукта в лунке планшета, обеспечивающие высокую воспроизводимость результатов исследования.

3. Определены референтные значения фотометрического НСТ-теста нейтрофильных гранулоцитов на основе обследования первичных доноров крови и регламентированы нормативные параметры для их использования в клинико-иммунологических лабораториях.

4. Клинической апробацией доказана высокая эффективность предложенного НСТ-теста для оценки патологических состояний человека, сопровождающихся как активацией кислородзависимого метаболизма нейтрофилов, так и его подавлением.

5. Показана высокая информационная значимость применения двух корпускулярных индукторов кислородзависимого метаболизма нейтрофилов для оценки дискретности клеточного ответа, опосредованного через различные рецепторы и внутриклеточные пути активации.

6. Выявлено значимое подавление кислородзависимого метаболизма нейтрофилов у 47% больных со свежими медиальными переломами бедра и обосновано проведение у них профилактической иммунокоррекции «Полиоксидонием» в раннем послеоперационном периоде.

7. Использование «Полиоксидония» у больных, пожилого возраста с хирургическим лечением травмы опорно-двигательного аппарата способствует коррекции фагоцитарного звена иммунитета, ранней активизации пациентов и снижению количества гнойных осложнений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Клюквин И.Ю., Охотский В.П., Лапшин В.П., Годков М.А., Чукина Е.А., Ларионов К.С., Зинкин В.Ю., Антонов В.В. Комплексное восстановительное лечение больных на раннем госпитальном этапе после эндопротезирования тазобедренного сустава. // Материалы юбилейной научной конференция «Современные технологии и перспективы развития военной травматологии и ортопедии».- Санкт-Петербург, 2000- С.232-233.

2. Годков М.А., Зинкин В.Ю., Клюквин И.Ю., Мазуров Д.В:, Пинегин Б.В., Антонов В.В. Эффективность профилактического применения полиоксидония у больных с травмой опорно-двигательного аппарата. // Материалы 7 Российского национального конгресса «Человек и лекарство».- М., 2000.- С.238.

3. Зинкин В.Ю., Годков М.А., Антонов В.В. Состояние иммунной системы пациентов старших возрастных групп в зависимости от тактики лечения медиальных переломов бедра. // Материалы городской научно-

практической конференции «Первичное эндопротезирование тазобедренного сустава у больных пожилого и старческого возраста с медиальными переломами бедра».-М., 2001.- С.33-38.

4. Зинкин В.Ю., Годков М.А., Клюквин И.Ю., Мазуров Д.В., Климова СВ., Антонов BJB. Опьн профилактического использования полиоксидония у больных с травмой опорно-двигательного аппарата в послеоперационном. • периоде. // Иммунология. - 2001.- №5.- С.42-44.

5. Годков М.А., Зинкин В.Ю. Способ диагностики функционального» состояния нейтрофилов человека. / Патент Российской Федерации на изобретение № 2218567 от 24.12.2003.

6. Клюквин И.Ю., Антонов В.В., Зинкин В.Ю., Сахарова Е.А., Чукина Е.А., Ларионов К.С. Комплексная профилактика воспалительных осложнений после эндопротезирования тазобедренного сустава у больных с переломами шейки бедра. // Материалы всероссийской юбилейной научно-практической- конференции «Лечение сочетанных травм и заболеваний конечностей».-М., 2003.- С. 162-163.

7. Антонов В.В., Зинкин В.Ю., Ларионов К.С. Профилактика воспалительных осложнений у больных пожилого и старческого возраста после эндопротезирования тазобедренного сустава. // Материалы республиканской научно-практической конференции «Реабилитация больных с повреждениями и заболеваниями костей таза: Новые технологии в лечении повреждений и заболеваний опорно-двигательной системы».-Екатеринбург-Ревда, 2003.- С.30-35.

8. Зинкин В.Ю., Михайлова- Н.А., Хватов В.Б. Эффект подавления кислородзависимого метаболизма* нейтрофильных гранулоцитов мертиолятом, используемым в качестве консерванта вакцин. // ЖМЭИ.-2003.-№4.-С.107-109.

9. Зинкин В.Ю. Состояние и перспективы оценки кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранул оцитов человека. // Новое в трансфузиологии.- 2003.-№35.- С.33-45.

Ю.Михайлова НА, Хватов В.Б., Биткова Е.Е., Зинкин В.Ю. Оценка безопасности, реактогенности и антигенной активности вакцины «пиопол» на ограниченной группе лиц. // Материалы всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке».- Пермь, 2003.- С.46-49.

ll.Zinkin VJ. Influence of tactics immunocorrection on oxygendependent metabolism neutrophils activity patients after hip arthroplasty. // Int. J. Immunorehabilit. - 2004. - Vol.6 (2).- P.269.

Заказ №163. Объем 1 пл. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петрорут». Г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

1 кЬЬЪ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ.

Нейтрофильные гранулоциты (НГ) являются основными эффекторами противоинфекционных механизмов иммунитета. Среди широкого спектра проявлений функциональной активности нейтрофилов особое место отводится кислородзависимому метаболизму - уникальной системе немитохондри-ального дыхания клетки, которое резко возрастает в процессе клеточной активации и потому носит название «респираторного взрыва». Этот процесс сопровождается повышенным потреблением глюкозы и кислорода, а также увеличением продукции активных форм кислорода (АФК): супероксид аниона, пероксида водорода, гидроксил радикала и синглетного кислорода (А.Н. Ма-янский, Д.Н. Маянский, 1989; S.W. Edwards, 1994). Кислородные радикалы являются не только основой антимикробного потенциала нейтрофилов, но и активными регуляторами тканевого метаболизма человека (Н.И. Бахов с со-авт., 1988; И.И. Долгушин, О.В. Бухарин, 2001). Показана высокая информационно-диагностическая значимость исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофилов при бактериальных и вирусных инфекциях (R.D. Feigin, L.K. Pickering, 1975), коллагенозах (М.М. Дейл, 1999), сердечно-сосудистых заболеваниях (S. Kausalya, J. Nath, 1998), респираторном дистресс-синдроме (Г.А. Рябов, 1994) и деструктивном панкреатите (B.C. Тарасенко с соавт., 2000). Однако, особенности метаболической активности НГ при травме опорно-двигательного аппарата изучены недостаточно.

Заболевания и травма крупных суставов занимают одно из ведущих мест среди причин временной нетрудоспособности и инвалидизации больных (О.Ш. Буачидзе с соавт., 2001). Отмечается неуклонный рост количества медиальных переломов бедра, что связано с увеличением доли пожилых людей среди населения (G.H. Anderson et al., 1993; Н. Burger, 1999; С.Е. DeLaet, Н.А. Pols, 2000). Современным подходом к решению этого вопроса является выполнение первичного эндопротезирог-ания тазобедренного сустава (В.П. Охотский, И.Ю. Клюквин, 1999; Н.В. Корнилов, 2000; G.M. Robbins et al., 2001). Проведение оперативного вмешательства у пациентов старших возрастных групп на фоне посттравматической и возрастной иммуносупрессии, большого числа сопутствующих заболеваний, определяет необходимость оценки состояния иммунной системы, включая изучение функциональной активности нейтрофилов. Так, показана прогностическая значимость показателей гуморального звена иммунитета (уровень циркулирующих иммунных комплексов и интерлейкина-1) у пациентов с дегенеративно-дистрофическими заболеваниями тазобедренного сустава, подвергнутых эндопротезированию (А.В. Костюшко, 2000). Предложены схемы иммунодиагностики осложнений при эндопротезировании суставов, включающие определение уровня иммуноглобулинов классов М w G, активности NK-клеток, содержания малонового диальдегида, скорости и реакции торможения миграции лимфоцитов (Г.Л. Плоткин с соавт., 2001). Однако, целенаправленная оценка функциональной активности НГ, а также иммунокоррегирующая терапия не проводилась.

Одним из основных методов исследования функциональной активности НГ является тест с нитросиним тетразолием (НСТ). Метод основан на способности практически бесцветного НСТ восстанавливаться кислородными радикалами в темно-синий диформазан (ДФ). Наибольшее распространение в клинической практике получили варианты визуального учета НСТ-теста, основанные на микроскопическом подсчете процента нейтрофилов, содержащих в цитоплазме гранулы ДФ (В.Н. Park, S.M. Fikrig, Е.М. Smithwick, 1968; Т.К. Бумагина, Е.И. Шмелев, 1981; В.И. Щербаков, 1989; Б.С. Нагоев, Н.Г. Ораза-ев, 2000).

Основными недостатками такого подхода является отсутствие количественной регистрации кислородных радикалов, генерированных пулом нейтрофилов, а также субъективность учета результатов реакции. Для объективизации оценки результатов исследования предложены различные варианты фотометрического учета НСТ-теста (R.L. Baenher, D.G. Nathan, 1968; В.К. Вагнер с соавт., 1989; B.EL Мельников, 1991; М.Р. Richardson et al., 1998; М.В. Че-решнева с соавт., 2000). Эти методики подразделяются по способу экстрагирования восстановленного НСТ и регистрации оптической плотности полученного раствора. Экстракцию ДФ осуществляют органическими растворителями (диоксан, пиридин, диметилформамид) на кипящей водяной бане, а оптическую плотность регистрируют с помощью спектрофотометра (A.JI. Не-вмятуллин с соавт., 1985; В.К. Вагнер с соавт., 1989; М.Р. Richardson et al., 1998; М.В. Черешнева с соавт., 2000). Однако использование кипящих токсических растворителей, больших объемов реагентов и отсутствие автоматизированной регистрации результатов реакции существенно ограничивают производительность и значительно повышают трудоемкость исследования функциональной активности НГ в клинико-лабораторной практике. В этой связи, ряд исследователей (G. Virella et al., 1990; Е.П. Киселева и А.В. Полевщиков, 1994; А.А. Капралов с соавт., 1997) предлагают регистрировать результаты НСТ-теста с помощью многоканальных фотометров в 96 луночных иммунологических планшетах. Однако использование реактивов, изменяющих функциональное состояние клеток, незначительный диапазон получаемых результатов, отсутствие контролей на реагенты, ограничивают их широкое использование.

Таким образом, до настоящего времени отсутствуют доступные и объективные методы количественного исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофилов; не представлена характеристика функциональной активности лейкоцитов у пациентов с травмой опорно-двигательного аппарата; не изучена динамика кислородного метаболизма НГ в зависимости от выбранной тактики лечения медиальных переломов бедра; не обосновано проведение иммунокоррекции у больных после первичного эндопротезирования тазобедренного сустава.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Разработать фотометрический НСТ-тест с нейтрофилами крови человека и оценить его клинико-иммунологическую значимость у больных с травмой опорно-двигательного аппарата.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Оптимизировать процедуру выделения и количество нейтрофильных гранулоцитов крови человека, участвующих в реакции восстановления НСТ.

2. Усовершенствовать условия проведения НСТ-теста и способ фотометрической регистрации его результатов.

3. Провести сравнительную оценку кислородзависимого метаболизма нейтрофилов крови здоровых и пациентов с различной патологией.

4. Оценить клинико-иммунологкческую значимость разработанного НСТ-теста для оценки эффективности иммунокоррекции у больных после первичного эндопротезирования тазобедренного сустава.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

Разработан способ диагностики функционального состояния нейтрофилов человека (патент Российской Федерации на изобретение № 2218567 от 24.12.2003), основанный на использовании высокоочищенного пула нейтрофилов крови человека при заданной концентрации и соотношении клетка/индуктор, а также двух-волновой регистрации продуктов реакции с помощью многоканального фотометра.

Обосновано использование заданной концентрации нейтрофилов (50 0000±50 ООО клеток/лунке), опсонизированного и неопсонизированного зимо-зана в соотношении 20±2 частиц/клетку в качестве индукторов кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов, а также 2-х волновой (тестовая А,=630 нм; референтная А.=490 нм) регистрации продуктов реакции в НСТ-тесте.

Доказана высокая чувствительность разработанного варианта НСТ-теста для оценки активности процесса образования активных форм кислорода при воздействии ингибиторов кислородзависимого метаболизма нейтрофилов.

Показана высокая информационная значимость использования двух корпускулярных индукторов кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов (опсонизированный и неопсонизированный зимозан) для оценки дискретности клеточного ответа, опосредованного через различные рецепторы и внутриклеточные пути активации.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ:

На разработанный способ диагностики функционального состояния нейтрофилов человека оформлено рационализаторское предложение (№ 662, НИИ скорой помощи им. Н.В.Склифосовского) и с 1999 года метод используется в практической деятельности лаборатории клинической иммунологии и диагностики СПИД.

Выявлено, что 47% больных со свежими медиальными переломами бедра имеют нарушения кислородзависимого метаболизма нейтрофилов и обосновано проведение у них профилактической иммунокоррекции с помощью препаратов, обладающих выраженным эффектом в отношении фагоцитарного звена иммунитета.

С помощью фотометрического НСТ-теста в травматологическую практику внедрен алгоритм иммунологического пособия пациентам с медиальными переломами бедра, заключающийся в приоритетном исследовании в предоперационном периоде метаболической активности нейтрофилов, выявлении им-мунокомпромитированных пациентов и включении в схему послеоперационного ведения таких больных иммунокорректоров.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Результаты работы доложены на юбилейной научной конференция «Современные технологии и перспективы развития военной травматологии и ортопедии» (Санкт-Петербург, 2000); городской научно-практической конференции «Первичное эндопротезирование тазобедренного сустава у больных пожилого и старческого возраста с медиальными переломами бедра» (Москва, 2001); всероссийской юбилейной научно-практической конференции «Лечение сочетанных травм и заболеваний конечностей» (Москва, 2003); межклинической конференции проблемно-плановой комиссии по неотложной травматологии НИИ скорой помощи им. Н. В. Склифосовского (Москва, 2003).

ПУБЛИКАЦИИ.

По теме диссертации опубликовано 11 работ, получен патент РФ на изобретение.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций в практику и списка цитируемой литературы, состоящего из 83 отечественных и 130 зарубежных источников. Диссертация изложена на 129 страницах, содержит 10 таблиц, 17 рисунков.

выводы.

1. Разработан чувствительный количественный фотометрический НСТ-тест, основанный на использовании высокоочищенного (98%) пула нейтрофилов крови человека при заданной концентрации и соотношении клетка/индуктор и двух-волновой регистрации продуктов реакции.

2. Стандартизованы условия проведения НСТ-теста, включающие использование нейтрофилов (500±50 тыс. клеток в лунке), индукторов опсонизиро-ванного и неопсонизированного зимозана (20±2 частиц на клетку) с тестовой (при 630 нм) и референтной (при 490 нм) фотометрией конечного продукта в лунке планшета, обеспечивающие высокую воспроизводимость результатов исследования.

3. Определены референтные значения фотометрического НСТ-теста нейтро-фильных гранулоцитов первичных доноров крови и регламентированы нормативные параметры для их использования в клинико-иммунологических лабораториях.

4. Клинической апробацией доказана высокая эффективность предложенного НСТ-теста для оценки патологических состояний человека, сопровождающихся как активацией кислородзависимого метаболизма нейтрофилов, так и его подавлением.

5. Показана высокая информационная значимость применения двух корпускулярных индукторов кислородзависимого метаболизма нейтрофилов для оценки дискретности клеточного ответа, опосредованного через различные рецепторы и внутриклеточные пути активации.

6. Выявлено значимое подавление кислородзависимого метаболизма нейтрофилов у 47% больных со свежими медиальными переломами бедра и обосновано проведение у них профилактической иммунокоррекции «Полиок-сидонием» в раннем послеоперационном периоде.

7. Использование «Полиоксидония» у больных пожилого возраста с хирургическим лечением травмы опорно-двигательного аппарата способствует коррекции фагоцитарного звена иммунитета, ранней активизации пациентов и снижению количества гнойных осложнений.

РЕКОМЕНДАЦИИ В ПРАКТИКУ.

1. Для получения «чистой» популяции НГ (95-97%) со средним выходом 3-4 млн и жизнеспособностью 97-98 % в тесте с 1% раствором трипанового синего следует применять метод центрифугирования в ступенчатом градиенте плотности смеси фиколл - урографин (1,114 г/мл и 1,076 г/мл) в режиме 15 мин при 250 g с последующим гипотоническим лизисом примеси эритроцитов.

2. Наиболее полную оценку состояния рецепторного аппарата НГ обеспечивает использование расширенного набора корпускулярных индукторов (неопсонизированный и опсонизированный зимозан) в соотношение индуктор/клетка - 20 : 1.

3. С целью повышения специфичности регистрации продуктов реакции восстановления НСТ целесообразно использование двухволнового метода измерения. Применение микропланшетных многоканальных фотометров и микрообъемов реагентов повысит производительность и экономичность способа количественной оценки КЗМ нейтрофилов крови человека.

4. Исследование функциональной активности нейтрофилов с помощью фотометрического НСТ-теста является приоритетным при оценке иммунного статуса больных с медиальными переломами бедра. В 47 % случаев у таких пациентов выявляются нарушения в фагоцитарном звене иммунитета, что требует проведения профилактической иммунокоррекции.

5. Включение в комплекс лечебно-профилактических мероприятий имму-номодулятора «Полиоксидоний» в течение пяти дней по 6 мкг/сут внутримышечно позволит избежать развития гнойных осложнений у больных после первичного эндопротезирования тазобедренного сустава.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Нейтрофильные гранулоциты являются одними из основных и самыми многочисленными представителями фагоцитарного звена иммунитета, а также количественно доминирующим типом белых клеток крови человека. Это делает их важнейшими участниками воспалительного процесса, в котором они занимают передовую линию клеточной защиты от внедрившихся патогенов. В нейтрофиле существует две системы бактерицидности: кислороднезависимая и кислородзависимая. Нарушения кислородзависимого метаболизма нейтрофилов приводят к росту инфекционной заболеваемости и повышению количества осложнений гнойно-септического характера, в связи с чем, исследование функциональной активности НГ и последующая целенаправленная иммуно-коррекция представляется важным и актуальным разделом современной медицины.

В этой связи, перед нами стояла цель разработать и внедрить в клиническую практику способ количественной оценки кислородзависимого метаболизма нейтрофилов человека. На настоящий момент данным требованиям в наибольшей степени отвечают разновидности хемилюминесцентного анализа и фотометрические варианты теста восстановления нитросинего тетразолия. Широкое использование метода хемилюминесценции ограничивается необходимостью применения достаточно дорогостоящих люминометров, а также отсутствие стандартов на условия проведения анализа, что не позволяет корректно оценивать данные, полученные независимыми лабораториями. Предлагаемые варианты визуального учета НСТ-теста основаны на методике, предложенной Park В.Н., Fikrig S.M. и Smithwick Е.М. в 1968 году и не позволяют проводить количественной оценки активности продукции кислородных радикалов пулом нейтрофилов, а также не лишены субъективности при учете результатов реакции. В большинстве фотометрических вариантов НСТ-теста, включая впервые предложенную Baehner R.L. и Nathan D.G. (1968) методику количественного учета НСТ-теста, используются токсические растворители (диоксана, пиридина, диметилформамида), большие объемы реагентов, а также отсутствует автоматическая регистрация результатов реакции. Среди предложенных автоматизированных вариантов фотометрического НСТ-теста заслуживают внимания методики, предложенные G. Virella с соавторами (1990) и Е.П. Киселевой, А.В. Полевщиковым (1994).

В первом случае, авторы осуществляли кинетическую колориметрию суспензии НСТ-содержащих нейтрофилов проинкубированных с так называемыми «опсонизированными иммуносферами» (IgG-coated immunobeads), что позволило им не проводить экстрагирование внутриклеточно образовавшегося ДФ. Однако, основным недостатком такого подхода является ограничение по спектру используемых индукторов: возможна работа лишь с растворимыми веществами, так как использование корпускул (зимозан, латекс) не позволяет корректно регистрировать кинетику восстановления НСТ без его экстрагирования.

Е.П. Киселева и А.В. Полевщиков предложили метод автоматизированного учета НСТ-теста, основанный на использовании для постановки реакции 96-луночных плоскодонных планшетов и последующего учета результатов на многоканальном спектрофотометре. Тест проводится с выделенными нейтро-филами крови в концентрации 1*106 клеток/мл, в присутствии раствора НСТ (4 мг/мл), буферного раствора (спонтанный вариант) или определенного разведения индуктора (продигиозан или опсонизированный комплементом морской свинки зимозан) - индуцированный вариант. Образовавшийся внутриклеточно ДФ экстрагируется смесью 2М КОН и диметилсульфокси-да/димексида, а оптическая плотность полученного раствора регистрируется при длине волны 620 нм.

Существенным недостатком вышеуказанного способа, при принципиально правильных методологических подходах, явился незначительный динамический диапазон определяемой клеточной активности. По-видимому, это связано с использованием в процессе выделения нейтрофилов хлористого аммония, модифицирующего клеточную активность, либо с недостаточной концентрацией индуктора и/или его антигенными свойствами (в качестве опсо-нина использовали комплемент морской свинки). Кроме того, используется одноволновой принцип фотометрии и отсутствуют результаты использования метода в клинической практике.

В этой связи, для достижения поставленной цели основными задачами данного исследования явились: оптимизация условий выделения и количества нейтрофильных гранулоцитов при проведения НСТ-теста, разработка условий и способа фотометрической регистрации его результатов, а также определение референтных значений и клиническая апробация разработанного способа количественной оценки КЗМ НГ человека.

В качестве объекта изучения наиболее предпочтительным является использование выделенных нейтрофилов венозной гепаринизированной крови человека, что позволяет проводить селективную оценку их функциональной активности. В качестве метода выделения оптимальным является использование ступенчатого центрифугирования на двойном градиенте плотности смеси фиколл - урографин (1,114 г/мл и 1,076 г/мл) в течение 15 мин при 250 g. Использование с целью деконтаминации выделенных НГ процедуры гипотонического лизиса эритроцитов позволяет существенно снизить временные и материальные затраты и добиться чистоты выделения жизнеспособных (97 - 98 %) нейтрофилов на уровне 95-97 %. Эти подходы и были использованы в нашей работе.

Важным этапом на пути стандартизации условий проведения реакции восстановления НСТ явилось определение оптимального соотношения вносимого в реакционную лунку количества клеток и индуктора. Установлено, что при использовании количества нейтрофилов в диапазоне от 200 до 750 тысяч в лунке изменения оптической плотности раствора диформазана носят линейный характер как в спонтанном, так и в индуцированном тестах. Выбор из этой зоны оптимума концентрации 500 ± 50 тысяч нейтрофилов в лунке был обусловлен тем, что достаточно частым осложнением ургентной патологии (массивная кровопотеря, гиповолемия) является лейкопения, а использование более низкой концентрации приводит к росту погрешности метода.

При использовании корпускулярных индукторов КЗМ НГ (н/з, о/з, латекс) в соотношениях от 320 частиц/клетку до 1:1 отмечено линейное нарастание оптической плотности во всем отмеченном диапазоне концентраций. Сравнительный анализ использованных корпускулярных индукторов выявил, что максимальную степень клеточной активации вызывает опсонизированный зимозан. Начиная с соотношения 20:1 он в 1,5 раза сильнее стимулирует выработку кислородных радикалов в сравнении с неопсонизированным зимоза-ном. Использование в аналогичной концентрации латексных частиц вызывало незначительное увеличение метаболической активности нейтрофилов, которое не превышало 30 % от уровня спонтанной клеточной активности. По всей видимости, это связано с тем, что под воздействием вносимого в свободный объем лунки латекса (по сути полистироловых шариков) активируется не более 30 % активного пула нейтрофилов, большая часть которого уже вступила в гидрофобные контакты с пластиковой поверхностью лунок планшета.

В процессе исследования влияния растворимых индукторов КЗМ НГ был использован широко используемый формиловый пептид, обладающий рецепторопосредованным механизмом действия. Установлено дозозависимое увеличение метаболической активности нейтрофилов при использовании концентрации от 0.1 до 1000 нмоль/л, когда значения индуцированного теста достигали максимума, но были в среднем на 50 % меньше в сравнении с клеточным ответом на зимозан. Дальнейшее повышение концентрации fMLP приводило к относительному угнетению КЗМ НГ.

При выборе подходящего растворимого индуктора КЗМ НГ также использовали новый вакцинный препарат «Пиопол», представляющий собой комплекс очищенных концентрированных протективных антигенов условно-патогенных микроорганизмов и иммуномодулятора «Полиоксидоний». В качестве объекта сравнения использовали адсорбированную коклюшно-дифтерийно-столбнячную вакцину, для которой ранее установлено стимулирующее влияние на КЗМ лейкоцитов крови [33].

В нашей работе вакцины «Пиопол» и АКДС продемонстрировали отсутствие как прямого, так и костимулирующего (усиление индуцированного теста) воздействия на КЗМ НГ. Кроме того, под воздействием нативных или слабо разведенных вакцин отмечалось значительное (до 85%) подавление метаболической активности нейтрофилов. После проверки предположений о возможной чрезмерной антигенной нагрузке концентрированных комплексных препаратов и/или присутствии в вакцинах токсических примесей «неантигенной» природы, удалось выявить, что ингибирующим воздействием на метаболическую активность нейтрофилов обладает минорная добавка - мертиолят. Последний является ингибитором тканевого дыхания и используется в качестве консерванта.

Таким образом, проведенные исследования позволяют рассматривать фотометрический НСТ-тест как высокочувствительный метод оценки специфичности реакций, сопровождающихся продукцией АФК, а оптимальными по степени активации и вовлечения различных рецепторных структур нейтрофи-ла индукторами КЗМ - опсонизированннй и неопсонизированный зимозан.

Существенно повысить специфичность разработанной методики на этапе регистрации результатов реакции восстановления НСТ позволило использование 2-х волнового метода измерения. Максимум специфического поглощения для раствора ДФ был выявлен на длине волны - 630 нм (тестовая), а значение референтной длины волны - 490 нм. В этой связи, нами предложено оценивать концентрацию ДФ по разнице значений оптических плотностей, получаемых с использованием указанных светофильтров. Необходимые расчеты большинство современных многоканальных фотометров производят в автоматическом режиме, а также позволяют представлять полученные результаты в удобных единицах измерения (в частности в mOD) и при необходимости экспортировать их в лабораторную информационную систему. Повышение информативности получаемых результатов достигается за счет интегральной оценки всех параметров разработанного НСТ-теста: уровней спонтанной (сНСТ) и индуцированной (н/зНСТ, о/зНСТ) активности нейтрофилов, резервных возможностей функциональной активности клеток (КАо и КАн), степени дискретности клеточной активности на различные стимулы (КО).

Таким образом, соблюдение разработанных принципов проведения фотометрического НСТ-теста, а именно: использование концентрации НГ в лунке планшета 500 ± 50 тыс. клеток, применение корпускулярных индукторов (н/з и о/з) в концентрации 20±5 частиц на клетку и 2-х волновое* измерение продуктов реакции (тестовая X = 630 нм; референтная X = 490 нм), позволило достичь высокой воспроизводимости (коэффициент вариации 10-15%) и чувствительности метода: пороговая концентрация клеток в спонтанном тесте составляет 50 тыс. клеток/лунке.

Заключительным этапом перед клинической апробацией метода явилась разработка референтных значений фотометрического НСТ-теста. При выполнении данного раздела было протестировано несколько категорий условно здоровых людей: кадровые доноры плазмы, медработники и первичные доноры крови, допущенные к кроводаче. Установлено, что спонтанная клеточная активность в выбранной совокупности здоровых людей не подчиняется нормальному распределению - вместо одного «колоколоподобного» пика отмечено три пика клеточной активности. Осуществление детальной оценки влияния каждой подгруппы здоровых лиц на характер распределения всей совокупности позволило выявить, что между ними имеются достаточно выраженные различия по активности КЗМ НГ. Для доноров плазмы и медработниками характерным оказался «двугорбый» профиль активности, в то время как распределение значений сНСТ среди первичных доноров крови имело характер нормального.

После аналогичной обработки данных, полученных в индуцированных тестах, было установлено, что распределение параметров у доноров плазмы характеризовалось резким сдвигом в область низких значений. Медработники, напротив, имели тенденцию к повышению активности КЗМ нейтрофилов в ответ на дополнительную стимуляцию двумя разновидностями зимозана. Промежуточное положение и нормальный характер распределения клеточной активности также отмечался среди первичных доноров крови. Выявленную разнохарактерность в этих группах можно объяснить следующими причинами: систематические процедуры плазмафереза (среднее количество сеансов -24), осуществляемые в течение длительного промежутка времени, по-видимому, способны снижать АФК-продуцирующий потенциал нейтрофилов кадровых доноров. До настоящего исследования, приведенные в литературе данные о влиянии стажа донорства на показатели иммунного ответа затрагивали изменение титров антител и процента иммуноактивных лиц среди доноров [24]. Повышение КЗМ среди медработников можно расценивать как ответную реакцию организма на тесный контакт с инфекционными агентами.

Таким образом, подученные характеристики каждой группы здоровых людей позволили считать первичных доноров крови оптимальным выбором для расчета референтных значений разработанного теста. В основном, вычисление референтного интервала производится с помощью параметрического метода статистического анализа в диапазоне отклонений ±1,5-2,0 ст от средней величины [24]. Однако, использование параметрического метода возможно лишь при выполнении условия нормальности распределения измеряемого признака [18]. Таким образом, доказав нормальный характер распределения метаболической активности нейтрофилов первичных доноров крови и учитывая то, что по данным А.И.Воробьева (1985) для гематологических показателей наиболее приемлемым является референтный интервал, отграниченный отклонениями ±1,5 а от средней величины, мы применили данный подход в нашей работе. Полученные результаты отражают адекватность указанного подхода для разработки референтных значений фотометрического НСТ-теста и позволяет расценивать первичных доноров крови в качестве наиболее репрезентативных представителей здоровой популяции.

Первым этапом клинической апробации явилась сравнительная оценка КЗМ НГ больных с различной патологией с использованием визуального и фотометрического вариантов НСТ-теста. Установлено, что на фоне обширного гнойно-воспалительного процесса - распространенный перитонит, ожоговая травма - происходит достоверное увеличение спонтанной клеточной активности, регистрируемое обеими модификациями теста. Данные изменения могут указывать на то, что в начальной фазе (до 3-х суток) массивной антигенной нагрузки мобилизация фагоцитарного звена иммунитета идет по пути увеличения количества активированных нейтрофилов, а также повышения их удельной активности. Аналогичные изменения регистрировались визуальным НСТ-тестом у пациентов с медиальными переломами бедра и с отравлением психотропными препаратами. С помощью разработанной методики, удалось выявить значимое угнетение КЗМ НГ у этих больных, что указывает на способность фотометрического НСТ-теста выявлять также снижение суммарного бактерицидного потенциала фагоцитов. Указанные изменения спонтанного уровня активации у токсикологических больных также сопровождались выраженным подавлением клеточного ответа на дополнительную стимуляцию корпускулярными индукторами как в фотометрическом, так и в визуальном вариантах НСТ-теста. Достоверное снижение значений индуцированных тестов у пациентов с медиальными переломами бедра было отмечено только в фотометрическом НСТ-тесте. У ожоговых больных и пациентов с распространенным перитонитом процент активированных латексом НГ практически не отличался от нормы. Напротив, лейкоциты пациентов данных групп в ответ на стимуляцию зимозаном отвечали достоверным повышением продукции активных форм кислорода. Кроме того, у больных с перитонитом было отмечено разнонаправленное изменение функциональной активности клеток: достоверное повышение активности в н/зНСТ сочеталось с практически неизменным ответом на о/з. По всей видимости, такая клеточная реакция (в первую очередь) зависит от рецепторной перестройки НГ, возникающей в силу целого ряда причин. Во-первых, - выраженная воспалительная реакция сопровождается выбросом из костномозгового депо большого количества юных форм нейтрофилов, обладающих незрелым рецеп-торным аппаратом [111]. Во-вторых, - в связи с процессами интернализации и/или «шеддинга» рецепторов к Fc фрагментам иммуноглобулинов класса G (в частности FcyRII, FcyRIII), происходящими при активации НГ [108]. В-третьих, -возможна опосредованная через интегрины (осуществляют рецепцию н/з) негативная регуляция КЗМ нейтрофилов в ответ на стимуляцию о/з что, по-видимому, связано с вовлечением конкурентных путей клеточной активации, использующих общие вторичные мессенд,^еры (тирозин- и фосфатидилинозитол-киназы) [213]. Таким образом, предложенное использование о/з и н/з позволяет выявлять случаи функциональной дискретности нейтрофилов в ответ на стимуляцию, опосредованную через различные рецепторные структуры и пути активации. Так, анализ распределения больных с медиальными переломами бедра показал, что в 47 % наблюдений выявлено подавление метаболической активности нейтрофилов в обоих индуцированных тестах, селективное подавление активации на о/з в 23 % случаев и лишь 29 % пациентов имели адекватный ответ на оба стимула.

На следующем этапе клинической апробации оценивали клинико-иммунологическую значимость разработанного теста для оценки эффективности проводимой иммунокоррекции у больных с медиальными переломами бедра. Этот вид травмы характерен для пациентов старших возрастных групп, что является закономерным результатом сосудисто-дистрофических и эндокринных нарушений, и сопровождается большим числом сопутствующих заболеваний. Это приводит к длительному течению репаративных процессов и существенно повышает риск развития гнойных осложнений и летальных исходов, что у части пациентов является противопоказанием к проведению оперативного вмешательства. Остеосинтез бедра и первичное эндопротезирование тазобедренного сустава являются операциями выбора у другой части пациентов. Последний способ является наиболее эффективным и, вместе с тем, одним из наиболее травматичных в современной ортопедии. Таким образом, наличие вторичного иммунодефицита (возрастного, посттравматического, послеоперационного) в условиях длительного контакта с агрессивной, антибио-тикорезистентной микрофлорой диктует необходимость проведения иммуно-мониторинга у пациентов с медиальными переломами бедра.

По данным иммунологического исследования крови на 1-м этапе наблюдения (первая неделя после поступления) иммунная система пациентов характеризовалась достоверным повышением уровня лейкоцитов на 21 % в сочетании со снижением относительного количества лимфоцитов на 28 %, преимущественно за счет относительного и абсолютного дефицита В-лимфоцитов на 23 и 30 % соответственно. На фоне неизмененного уровня IgM и IgG отмечалось достоверное повышение уровня сывороточного IgA на 46 %, суммарного количества ЦИК на 23 %. Изменения в фагоцитарном звене иммунитета характеризовались следующим образом: по данным визуального НСТ-теста отмечался рост количества только спонтанно активированных нейтрофилов (на 91 %), что сопровождалось достоверным снижением К А на 32 %. Истощение резервов метаболической активности в ответ на дополнительную стимуляцию также зарегистрировано с помощью разработанного теста: КАо был снижен на 23 %, КАн - на 25 %. Однако данные изменения были обусловлены подавлением индуцированной активности в о/зНСТ и н/зНСТ на 26 %. Уровень спонтанной клеточной активности в сНСТ, а также процент фагоцитирующих латекс нейтрофилов не изменялись. С учетом выявленных отклонений в комплекс лечебно-профилактических мероприятий 29 пациентам после первичного эндопротезирования тазобедренного сустава был включен иммуномодулятор «Полиоксидоний», который назначали в течение пяти дней после операции по 6 мкг/сут внутримышечно.

Иммунологический мониторинг пациентов на 2-м этапе наблюдения (вторая неделя после поступления в группе с консервативной тактикой лечения и вторая неделя после операции в других группах) позволили выявить, что вне зависимости от выбранной тактики лечения у всех пациентов с медиальными переломами бедра отмечалась тенденция к сохранению повышенного количества лейкоцитов и относительной лимфопении на фоне стойкого достоверного повышения гывороточного уровня IgA в среднем на 52 %.

Основные отличия по группам были выявлены в фагоцитарном звене иммунитета. Параметры визуального НСТ-теста у пациентов, не получавших иммунокоррекцию, характеризовались сохранением достоверно повышенного уровня спонтанной клеточной активности, отсутствием активации в ответ на латекс и снижением резервов функциональной активности НГ. В группе больных с иммунокоррекцией отмечалась нормализация всех параметров теста.

По результатам фотометрического НСТ-теста КЗМ НГ характеризовался наличием разнонаправленных изменений по группам больных с медиальными переломами бедра. Так при оперативном лечении (остеосинтез бедра и ЭТС) регистрировалось подавление исходно сниженных значений индуцированных тестов. У больных, лечившихся консервативно, отмечено достоверное угнетение КЗМ лишь в ответ на дополнительную стимуляцию н/з, что, по всей видимости, обусловлено отсутствием иммуносупрессивного воздействия оперативного вмешательства. Включение в схему послеоперационного ведения больных после первичного эндопротезирования тазобедренного сустава им-муномодулятора «Полиоксидоний» позволило избежать углубления иммуно-супрессии и достичь нормализации всех параметров фотометрического НСТ-теста. Положительная лаоораторная динамика сопровождалась неосложнен-ным течением послеоперационного периода у данных больных: отсутствовали осложнения гипостатического характера, заживление ран происходило первичным натяжением.

Таким образом, выявленные изменения в иммунной системе пациентов с медиальными переломами бедра, в основном, касаются КЗМ НГ. Оперативное вмешательство вне зависимости от методики его выполнения (остеосинтез бедренной кости или первичное эндопротезирование тазобедренного сустава) обладает супрессивным воздействием на продукцию кислородных метаболитов пулом нейтрофилов в ответ на бактериальную стимуляцию. Одним из методов коррекции иммунодефицитного состояния у таких пациентов может служить применение в комплексе лечебно-профилактических мероприятий иммуномодулятора «Полиоксидоний». Использование фотометрического НСТ-теста позволяет осуществлять контроль эффективности проводимой им-мунокорригирующей терапии.

Разработанный способ количественной оценки КЗМ НГ отвечает современным требованиям к методам лабораторной диагностики иммунодефицит-ных состояний и имеет высокую диагностическую значимость при состояниях, сопровождающихся как активацией (перитонит, ожоговая болезнь), так и подавлением клеточной активности (отравление психотропными препаратами, медиальные переломы бедра). Это позволяет рассматривать фотометрический НСТ-тест в качестве эффективного метода в диагностическом арсенале современных клинико-диагностических и иммунологических лабораторий.