Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Получение лиофилизированных субстратов для исследования активности плазменных прокоагулянтов

На правах рукописи

«Для служебного пользования» Экз.№ п

САВИНЫХ Екатерина Юрьевна

ПОЛУЧЕНИЕ ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ СУБСТРАТОВ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ АКТИВНОСТИ ПЛАЗМЕННЫХ ПРОКОАГУЛЯНТОВ

14.00.29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 1999

Работа выполнена в Кировском научно-исследовательском институте гематологии и переливания крови.

Научный руководитель - доктор биологических наук

Тарасова Людмила Николаевна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Л.П.Папаян Доктор медицинских наук, профессор Н.Н.Петрищев

Ведущая организация: Гематологический научный центр РАМН

Защита состоится

«22 » июня_1999г. в ¿3 час.

на заседании диссертационного совета Д 084.19.01 в Росси ском научно-исследовательском институте гематологии трансфузиологии МЗ РФ (193024, Санкт-Петербург, 2-я Сове екая ул., д.16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ро сийского НИИ гематологии и трансфузиологии.

Автореферат разослан «_ » е^ы с< <д_1999г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

В.С.Быков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы.

До настоящего времени стандартизация и унификация методов исследования коагуляционного звена гемостаза являются проблемой международного значения (Барроуклиф Т.В., 1995; Гаранина Е.Н. и савт.,1995; Тарасова Л.Н. и со-авт.,1996; Taberner D.A. et al., 1990; Gram J. et al.,1996). Одной из наиболее важных составляющих, обеспечивающих объективность результатов исследования гемостаза, является применение качественных лиофилизированных биологических диагностикумов с длительным сроком хранения (Andrew M. et al., 1995; Becker В. et al., 1994; Daka J.N. et al.,1989; Ts'ao C., Neofotistos D., 1994; Barrowcliffe T.W., Kirkwood T.B.L., 1980) . Использование приборов также требует включения в тест-системы коммерческих лиофилизированных реагентов высокого качества, имеющих длительный срок годности (D*Angelo A. et al., 1989,-Houbouyan L. et al.,1996; Poller L. et al.,1994).

Проведение противотромботической терапии опасно без лабораторного контроля, объективность которого зависит от качества и специфичности используемых методов исследования и тест-реагентов (Гаврилов О.К.,1981; Надь И., 1Э86; Кондратьева Т.Б. с соавт.,1995; Loeliger E.A.,Lewis S.M. 1981; Wagner H.E. et al-, 1986;Becker D. et al.,1993; Bophy M. et al.,1993). Основным методом контроля тер шии антикоагулянтами непрямого действия до сих пор остается тест Квика, выявляющий с тканевым (полным) тром-бопластином активность факторов лротромбинового комплекса (ПК), в том числе фактора V, который антикоагулянтами не угнетается (Banghman D.R.,Biggs R.,1973; Кудряшов Б.А.-, 1975). Более объективно степень изменения ПК при лечении антикоагулянтами отражает тест Оврена. Этот метод можно применять также при определении специфической активности концентрата факторов II+VII+IX+X (препарата PPSB) и как источник фибриногена при исследовании активности перечисленных прокоагулянтов в биологических жидкостях (Долгов В.В.с соавт.,1996; Тарасова Л.Н.,1986). Для воспроизведения метода в тест-систему включают субстрат, лишенный комплекса факторов II+VII+IX+X. Нередко используют натив-ные реагенты местного приготовления, хранящиеся в заг-юро-

женном состоянии не более 3 месяцев (Балуда В.П. с авт.,1980; Долгов В.В. с соавт.,1996).

Наличие коагулопатии может быть установлено лишь ': определении дефицита того или иного фактора. Для диффер цирования гемофилии А и В используют два типа методов i ределения антигемофильных факторов: одно- и двухстадийш В настоящее время предпочтение отдается одностадийным, < нованным на тесте АПТВ, который стандартизован по конта) ной и фосфолипидной фазам. В тест-системы одностадий! методов определения коагуляционной активности факто] VIII и IX (ф.ф.\ГШ:К и 1Х:К) необходимо включать соотв< ствующие субстраты, лишенные указанных прокоагулянтов содержащие избыток других. Оптимальным сырьем для полу* ния таких субстратов является плазма больных гемофилией и В (Barrowcliffe Т.W.,1990). В большинстве отечеств« ных лабораторий используют нативные субстраты, имеющие i продолжительный срок хранения в замороженном состоят нередко не тестированные на активность факторов и налт ингибиторов.

Из-за большого количества используемых реактивов и к тодов затруднительно сравнивать результаты исследовани проведенных не только в различных лабораториях, но неред - в разное время в одних и тех же (Левченко Л.В. с соавт 1989; Тарасова Л.Н., Платонова Г.К., 1988; Баркаг 3.С.1991)« В связи с этим в ряде стран с целью унификац и поьслления воспроизводимости методов проводили пересыо и сравнительное изучение их и реагентов. Подобные работы наиболее полном виде выполнены в Национальном институ биологических стандартов и контроля Великобритан (Barrowcliffe T.W., Kirk-wood T.B.L., 1978; Barrowclif Т.W.,1984; Bar-rowcliffe T.W. et al.,1983) и в Централен лаборатории службы Красного Креста в Нидерландах (Ov J.,1984).

Вопросами унификации и стандартизации методов исслед вания антигемофильных факторов у больных гемофилией' и криопреципитате в нашей стране занималась проблемная ki миссия "Патология гемостаза" РАМН. Ее рабочая группа о< новными причинами ошибок при определении активности факт< ров VIII и IX признала длительное хранение образцов в ра: веденном виде и использование нестандартных реагентов кефалинов и субстратов (Баркаган З.С.,1991; Елыком(

В.А.,Цалихин А.Д.,1991). В связи с этим создание лиофилизированных субстратов, стандартизованных и имеющих длительный срок хранения, является актуальной задачей. Решение её позволит стандартизовать ряд основных методов исследования коагуляционного звена гемостаза, необходимых для практического здравоохранения. Цель исследования.

Разработка технологии получения субстратов, пригодных для выполнения методов исследования прокоагулянтов в тесте Оврена и одностадийных методах определения активности факторов VIII и IX.

Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать технологию получения субстратной плазмы без факторов II+VII+IX+X.

2. Изучить возможность использования плазмы крови больных гемофилией А и В, взятой при проведении лечебных процедур, в качестве сырья для изготовления субстратной плазмы без фактора VIII:K и без фактора 1Х:К.

3. Разработать технологию получения субстратной плазмы без фактора VIII:К.

4. Разработать технологию получения субстратной плазмы без фактора IX:К.

5. Изучить возможность использования субстратов без ф.ф.УШ:К и 1Х:К в одностадийных методах исследования активности этих прокоагулянтов.

Научная новизна.

Впервые разработана и запатентована технология получения лиофилизированной субстратной плазмы без факторов II+VII+X+IX для определения активности протромбинового комплекса в тесте Оврена (патент РФ N 2013778 от 30.05.1994г.).

Разработана технология получения лиофилизированных субстратов без ф^Ш:К и ф.1Х:К со сроком хранения до 2 лет; в качестве сырья использована кровь и плазма больных гемофилией А и В, полученная при проведении им лечебного кровопускания или плазмафереза. Впервые прослежено влияние консервирующих добавок на сохраняемость прокоагулянтов лиофилизированных субстратов при длительных сроках хранения.

Практическая значимость работы.

На основании полученных результатов составлена норм тивная документация:

"Типовой регламент производства плазмы субстратн без факторов II+VII+IX+X" и инструкция по применению, р комендованные к утверждению на комиссии по стандартизац ГНЦ РАМН (протокол N 3 от 25.11.94г.) и утверждены дире тором КНИИГПК 07.06.95г.

"Типовой регламент производства плазмы субстратной б фактора VIII:К (реактива)" и инструкция по применению, к торые рекомендованы к утверждению комиссией по стандарт; зации ГНЦ РАМН 25.11.94г., протокол N 3 и утверждены д: ректором института 07.06.95г.

"Лабораторный регламент производства плазмы субстра1 ной без фактора IX: К" и инструкция по применению, утве] жденные на Ученом совете КНИИГПК 19.07.97г., протокол N В стадии разработки и утверждения технические условия i реагент "Плазма субстратная для определения активное фактора. IX:К". На комиссии.по лабораторным реагентам Komi тета по' новой медицинской технике МЗ РФ принят проект ТУ определены базы медицинских испытаний (протокол N 2 < 30.03.1998г.).

Использование созданных лиофшшзированных субстрат« освобождает исследователей от необходимости получения н< тивных реагентов с меым сроком хранения и позволяет ста! дартизовать некоторые методы исследования коагуляционноз звена гемостаза.

Апробация работы. Материалы работы изложены на Всесоюзнс конференции "Физиология и патология гемостазг (г.Полтава,1991), научно-практической конференции "Клиш ческая лабораторная диагностика - состояние и перспект! вы"(г.С-Петербург,1996), III Всероссийском съезде гематс логов и трансфузиологов (г.С-Петербург, 1996), а тага итоговых научных конференциях Кировского НИИ гематологии переливания крови (1990-1998).

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ. Ва защиту выносятся следующие положения:

1. Технология получения субстратной плазмы без факте ров II+VII+IX+X для определения активности протромбиново1 комплекса в тесте Оврена.

2. Технология получения субстратной плазмы без факторе VIII:К и субстратной плазмы без фактора IX:К для дифференциальной диагностики гемофилии А и В.

3. Обоснование пригодности разработанных реагентов дл; стандартизации некоторых методов исследования коагуляци-онного звена гемостаза.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, указателя цитируемой литературы, который содержит 177 наименований работ, в тоь числе 76 отечественных и 101 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 30 таблицами и 2 графиками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ • Материалы и методы исследования. В данной работе применяли оборудование, оснащение и реактивы, используемые в коагу-лологических и клинических лабораториях, а также коагуло-метры фирмы "Organon teknika" "COAG-A-МАТЕ RA 4" и "COAG-А-МАТЕ ХМ". Эвтектическую температурную зону реагентов определяли на аппарате УОП ООО 001 опытного производства Харьковского института проблем криобиологии и криомедицины HAH Украины. Для этого реагент замораживали в парах жидкого азота, определяя состояние вещества по удельному сопротивлению материала. Лиофилизацию продуктов при получении реагентов проводили на сублимационном оборудовании марки LZ-9 фирмы "Frigera" производства Чехословакии. Использованные в работе реактивы, материалы, биологические диагностикумы и оборудование соответствовали требованиям ГОСТа.

Для разработки технологий изготовления плазмы субстратной без ф.ф. II+VII+IX+X использовали кровь здоровых доноров, для субстратов без ф.ф. VIII:K и 1Х:К - кровь и плазму больных гемофилией А и В, взятую в стационарных условиях Центра по лечению больных гемофилией при проведении им лечебных кровопускания и плазмафереза. Использовали три консерванта: раствор натрия цитрата, глюгицир, ЦФДА-1 фирмы "Baxter", США.

Контроль качества субстратов проводили по следующим тестам и параметрам: растворимость, внешний вид после разведения, активность протромбинового комплекса в тесте Кви-ка, ф.ф. VII+X, V (В.П.Балуда и соавт., 1980), ф.УШ:К и

ф.1Х:К (Л.П.Папаян, П.В.Хролова, 1983), активированное пар циальное тромбопластиновое время (Л.П.Папаян, П.В.Хролова 1980) и концентрация фибриногена (Лабораторные методы ис следования в клинике,1987).

Для отработки технологии лиофилизированной субстратно плазмы без ф.ф.И+VII+IX+X изготовлен и проверен реактив серий. Высушенные образцы хранили при температуре 4-8°С н менее 1 года.

Для отработки технологии субстрата без ф.У1И:К изго товлено 10 серий "Плазмы субстратной без фактора VIII: (реактив)" с использованием консерванта натрия цитрат, 7 глюгицира, каждая в двух вариантах (первый вариант: натив ный субстрат разливали по 2 мл и после высушивания разво' дили до этого же объема дистиллированной водой; второй вариант: с целью концентрации факторов протромбинового комплекса нативный субстрат разливали по 2,4 мл, а разводили, как и в первом варианте, в 2-х мл) и 3 серии с консервантом ЦФДА-1, так же, как с глюгициром- в двух вариантах.

Для отработки технологии "Плазмы субстратной без фактора 1Х:К (реактив)" изготовлено 9 се-ий с использование» консерванта натрия цитрат, 4 - в двух вариантах - с глюгициром и 4 - в двух вариантах - с ЦФДА-1.

Субстраты без фактора VIII:К и IX:К хранили при температуре 4-8°С в течение 2 лет.

Для1 подтверждения специфичности плазмы субстратной бег факторов II+VII+IX+X проведены определения активности протромбинового комплекса плазмы по методам Квика и Оврена у 56 здоровых доноров и 38 больных, принимающих антикоагулянты непрямого действия. Параллельно у всех доноров и 20 больных определяли активность фактора V. Лиофилизированная субстратная плазма была также использована при исследовании активности комплекса факторов II+VII+IX+X препарата PPSB пяти серий.

Лиофилизированный субстрат без ф.Ш1:К использовали параллельно с нативным при определении активности ф-VIII 10 образцов плазмы больных гемофилией А с установленным диагнозом и 7 - криопреципитата, а лиофилизированный субстрат без ф.1Х:К -при определении активности ф.1Х 30 образцов лиофилизированной "Плазмы донорской (реактива)" и 63 образцов плазмы 4 больных гемофилией В.

Лиофилизированные субстраты, имеющие различный срок годности, параллельно использовали при определении ф,фЛШ:К и 1Х:К 15 образцов плазмы больных гемофилией А и 15 - гемофилией В с установленным диагнозом, а также 15 образцов плазмы крови доноров и 15 - "Плазмы донорской (реактива)".

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью принятых в биологии и медицине методов, изложенных в руководстве Е.В.Монцевичюте-Эрингене (1964) и . "Основах прикладной статистики" Мельник М.С. (1987).

Вычисление коэффициента детерминации (KD) проводили на коагулометре "COAG-A-MATE ХМ" фирмы "Organon teknika" (Нидерланды).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При разработке технологии получения субстратной плазмы без факторов II+VII+IX+X необходимо было подобрать методы обрэботки, при которых донорская плазма лишалась активности указанных факторов, но в достаточном количестве сохраняла другие, в частности, лабильные ф.ф. V и VIII:К, а также фибриноген. С этой целью была разработана схема производства, включающая обработку бария сульфатом и фильтрацию через асбестосодержащую стерильнофильтрующую пласт..ну. Чтобы предотвратить разрушение лабильных факторов, центрифугирование проводили при температуре до 0-5°С, а фильтрацию - при" охлаждении на ледяной бане.

Для получения реагента с длительным сроком хранения его лиофильно высушивали. Нативный субстрат замораживали при температуре не выше минус 35°С в котле сублиматора. За прототип взят ранее разработанный в лаборатории режим лио-филизации (Патент N 1592717 "Способ получения донорской стандарт-плазмы"). Его использование позволило получить диагностикум, остаточная влажность которого не превышала 2%.

Протромбиновое время лиофилизированного реагента всех серий было более 10 минут, то есть, активность факторов ПК лиофилизированного субстрата была близка к 0%. Вариабельность исходных показателей ф.ф. V и VIII:K между сериями (от 60 до 100%), вероятно, зависела от длительной и "жесткой" обработки сырья. Незначительно снижаясь в процессе хранения, эти факторы оставались в пределах, достаточных

для нормального формирования сгустка фибрина в тес системе. Концентрация фибриногена была не ниже 1,5 г/ Средние показатели исследованных прокоагулянтов предста лены в таблице 1.

Хранение более 12 месяцев признано нецелесообразн ввиду дальнейшего снижения активности факторов.

С целью выявления зависимости результатов тестов Кв ка и Оврена от активности ф-V были проведены исследован плазмы 56 доноров и 20 больных, принимавших фенилин. Ст тистическая обработка результатов, полученных при исслед вании плазмы доноров пробирочными и аппаратными методам не выявила корреляционной зависимости. В таблице 2 пре, ставлены данные, полученные при исследовании плазмы ли; принимавших фенилин.

Сравнение результатов активности ф-V и ПК, полученн! в пробирочном воспроизведении методов Квика и Оврена, по, тверждает достоверность различий между ними, причем, бол( высокую - в методе Оврена. Коэффициенты корреляции меж: активностью ПК и фактора V, определенной пробирочными м< тодами, ' достаточно высокие, но между ф.У и ПК в тесте Oi рена - ниже , чем в тесте Квика . :

есть, зависимость результатов теста Оврена от активное. ф.У меньше, нежели теста Квика. Следовательно, результат теста Оврена, в котором использовали лиофилизированнь субстрат, .более объективно отражают уровень витамин-! зависимых факторов у больных, принимающих антикоагулянты.

Лиофилизированный субстрат 4х серий был применен такя при определении активности комплекса факторов II+VII+IXH препарата PPSB бти серий. Результаты показали минимальнь .колебания в определениях даже при использовании различнь контролей: пула свежей донорской плазмы и лиофилизироаь ного. Данные, полученные при исследовании препарата PPS представлены в таблице 3. Они также подтверждают специфич ность реактива при выявлении высокой активности комплекс факторов в препарате PPSB, следовательно, его пригодное? для методов определения специфической активности подобии концентрированных препаратов факторов свертывания.

Таблица 1

Активность прокоагулянтов плазмы субстратной без факторов 11+У11+1Х+Х в процессе хранения

№ Номер С р О К и х р а н е н и я (мес

п/ .серии 0 - 1 5 - 7 12 - 14

п ПК VII +х V VIII :к Фн ПК VII +х V VIII :К Фн ПК VII +х V VIII :к Фн

Мин % % % % % Мин % % % % % Мин % % % % %

1. 010289 >15 0 0 во 100 1,8 >15 0 0 73 100 - >15 0 0 40* 78 1,65

2. 020689 >15 0 0 95 100 18 >15 0 0 100 90 2,0 >15 0 0 64 65 1.0

3. 030190 >15 0 0 100 - 1,8 >15 0 0 78 68 2,0 >15 0 0 68 93 1,75

4. 040290 >15 0 0 95 - 2,0 >15 0 0 58 59 2,0 >15 0 0 92 91 1,5

5. 050390 >15 0 0 95 60 2,0 >15 0 0 58 59 2,0 >15 0 0 64 58 1,5

6. 060690 >15 0 0 68 60 2,0 >15 0 0 54 63 2,0 >15 0 0 53 50 1,5

7. 071290 >15 0 0 65 62 1,8 >15 0 0 60 63 1,5 >15 0 0 50 - 1,5

♦-показатель определен через 16 месяцев хранения

Таблица 2

Средние значения показателей ПК и ф.У в плазме лиц, принимавших антикоагулянты (М ± ш)

Методы ф.У {%) ПК (%)

Каик Оьрсн

Пробирочный Коэффициент корреляции 68,4 ±2,37 74,6 ±4,52 Р<0,04 0,8158 66,9 ±3,70 Р<0,004 0,7591

Полуавтомат 70,1 ±4,80 67,4 ±4,96

Автомат 68,0 ±5,58 66,2 ±5,45

Таблица 3

Время образования сгустка при определении специфической активности препарата РРЗВ (с)

Разведение Серии субстратной плазмы •

референта 010289 020689 030190 040290

21 21 21 25

1 : 1 21,5 20 26 26

26 24 20

-- 25 20 22

26 21

М ± ш - 24 ± 1,4 22 ± 1,3 23 ± 1,6

На основании проведенных исследований разработана технология получения лиофилизированной субстратной плазмы без факторов И+У11+1Х+Х для теста Оврена, включающая: подготовку лабораторной посуды, пенициллиновых флаконов, обработку их раствором силиконирующего вещества, приготовление и розлив консерванта, взятие "рови не менее, чем от 15 до-

плазмы от форменных элементов путем двухкратного центрифугирования (при 400-500д, 0-5°С в течение 10 минут и 2000-2200д и той же температуре в течение 30 минут), обработку плазмы бария сульфатом (из расчета 100 мг на 1 мл плазмы, в течение 20 минут перемешивают на магнитной мешалке и осаждают путем центрифугирования при 2000-2200д, 0-5°С в течение 20 минут), фильтрацию через асбестовый стерилизующий фильтр (скорость - 1-2 капли за 5с.), розлив по 1,0мл в пенициллиновые флаконы, лиофилизацию, укупорку резиновы-• ми пробками, завальцовку колпачков на флаконах, покрытие их пастой Унна или мастикой, контроль готовой продукции, бракераж, маркировку и хранение.

При разработке технологии получения субстратов без J.VIII:K и ф.1Х:К была оценена возможность использования крови плазмы больных гемофилией после проведения им лечебных процедур, кровопускания и плазмафереза. Опытным путем подобраны режимы центрифугирования крови и плазмы и избран оптимальный объем продукта в одном флаконе, равный 2мл.

Применение консервантов глюгицир и ЦФДА вызвало необходимость определения эвтектических точек продукта. Они составили: температура замерзания связанной воды - минус 40°С, температура перехода связанной воды в жидкое состояние - минус 29°С. Полученные данные также подтвердили возможность использования в качестве прототипа для лиофилиза-ции субстратов режима сублимационной сушки, разработанного ранее. Несмотря на увеличение объема высушиваемой дозы до 2 и 2,4мл остаточная влажность реагентов не превышала 2%.

При разработке технологии получения лиофилизированной субстратной плазмы без ф. VIII:К изготовлено и исследовано: 10 серий реагента - кровь взята с натрия цитратом, 7 (в двух вариантах) - с глюгициром и 3 (также в двух вариантах) - с консервантом ЦФДА.

Средние значения активности протромбинового комплекса, ф.ф-VII+x и V в процессе хранения реагента, приготовленного с использованием в качестве консерванта натрия цитрата (обозначен в таблице как цитрат), двух вариантов субстрата, приготовленного с использованием глюгицира (в таблице - Гл/1 и Гл/2) и двух вариантов - ЦФДА-1 фирмы "Baxter" (в таблице - ЦФДА/1 и ЦФДА/2) представлены в таблице 4.

Таблиц.

Средние значения показателей коагуляции плазмы субстра ной без фактора VIII в процессе хранения (М ± ш)

Показатели, ед. измерения Консервант Сроки хранения (мес.)

1-3 5-7 11-13 17-19 23-25

ПК (%) Цитрат Гл/1 Гл/2 ЦФДА/1 ЦФДА/2 91,211,4 81.114.1 81,9±6,6 94.211.2 100±2,8 91,9±2,3 84.713.3 86.013.4 95,312,0 97,512,3 94,411,0 82,213,3 84,814,0 93,713,5 95,310,9 90,211,3 78,012,6 82.413.3 84,712,2 89.314.4 84,911,5 76,912,4 75,213,4 76,514,2 90,016,8

Ф.ф. У11+Х {*) Цитрат Гл/1 Гл/2 ЦФДА/1 ЦФДА/2 95.910.7 94,613,6 91,0±5,7 96.211.8 99,210,6 92,911,3 89,812,6 91,83,3 94,312,9 99,013,5 95,911,1 92.312.6 93.312.7 10413,7 10311,2 94,311,5 90.312.1 90,012,5 97,31х,6 99.712.2 95,911,8 94,012,4 92,312,2 96.611.7 97.014.8

Ф.У (%) Цитрат Гл/1 Гл/2 ЦФДА/1 ЦФДА/2 10011,8 97,4±5,2 98,7±4,б 95,711,0 10011,0 91.014.0 93.713.1 92,213,8 86110,7 92110,7 95,011,0 88,613,7 94,411,5 99,713,2 10012,0 91.613.7 87.715.8 87,115,1 92,712,1 95,211,6 96.311.5 93,212,2 92.911.6 98.712.7 10012,8

Фибри ноген (г/л) Цитрат Гл/1 Гл/2 ЦФДА/1 ЦФДА/2 2,710,24 2,710,24 2,910,26 2,0 2,3±0,10 2,4Ю,1 2,110,3 2,410,31 2,110,08 2,010,21 2,510,2 2,310,19 2,210,26 2,210,17 2,310,25 '¿,410,12 2,110,25 2,510,22 2,110,17 2,110,12 2,110,08 2,310,25 2,410,12 2,310,4 2,310,18

Индекс АПТВ Цитрат. Гл/1 Гл/2 ЦФДА/1 ЦФДА/2 2,7±0,2 3,510,1 3,1±0,3 3,1±0,5 3,2±0,5 3,110,2 4,010,43 4,110,54 3,310,25 3,510,23 3,410,21 4,210,34 4,310,34 4,010,49 4,310,6 2,410,11 3,310,34 3,610,16 2,210,25 2,310,16 3,210,14 4,110,4 4,710,48 3,510,12 3,610,01

Несмотря на то, что значения активности прокоагулянтс реагентов двух вариантов, приготовленных с применение глюгицира несколько ниже, чем в субстратах с натрия цитра том и ЦФДА, они достаточны для нормального образовани

сгустка в тест-системе. Различия между вариантами реагентов Гл/1 и Гл/2, так же, как двух вариантов ЦФДА/1 и ЦФДА/2, недостоверны (Р>0,05).

Реагент, изготовленный с использованием всех консервантов, на протяжении 2х лет сохранял свои исходные свойства: достаточный уровень факторов ПК, ф.У и концентрацию фибриногена. Активность ф.УШ субстрата всех вариантов на протяжении срока хранения была ниже 1%, активность фЛХ колебалась в пределах 52-120%. Сравнение Локазателей в процессе хранения выявило отсутствие значимых различий .(Р>0, 05) .

При разработке технологии получения лиофилизированной субстратной плазмы без ф.1Х:К изготовлено и исследовано: 9 серий реагента с использованием натрия цитрата, 4 (в двух вариантах) - с консервантом глюгицир и 4 (также в двух вариантах) - с консервантом ЦФДА.

Средние значения результатов исследования активности протромбинового комплекса, факторов УИ+Х и фактора V в процессе хранения реагенчов представлены в таблице 5. Основное требование, предъявляемое к субстратам отсутствие или выраженное (менее 5%) снижение в них активности фактора IX. Субстраты всех вариантов, изученные в течение наблюдаемого срока, соответствовали этим требованиям. В большинстве исследований получен уровень фактора 1Х:К менее х%. Самые высокие значения его, в пределах 2,7-3,3, выявлены сразу после сублимации. Активность ПК,, ф.У и концентрация фибриногена были достаточны для нормального формирования сгустка фибрина в тест-системе. Активность ф.УШ на протяжении срока хранения варьировала в пределах 58-120%. Различия между вариантами реагентов, изготовленных с использованием глюгицира и ЦФДА, были недостоверны (Р>0,05). Сравнение активности прокоагулянтов в процессе хранения на протяжении двух лет показало незначимость изменений, что подтвердило возможность использования реагента в течение указанного срока.

Таблиц

Средние значения показателей коагуляции плазмы

субстратной без ф.1Х:К в процессе хранения __(М ± ш)_

Пока-' зате-ли, ед. измерения Консервант Сроки хранения (мес.)

1-3 5-7 11-13 17-19 23-25

ПК (%) Цитрат Гл/1 Гл/2 ЦФДА/1 ЦФДА/2 79,0±1,9 67.013.3 68.213.4 80,3±3,1 81,3±3,5 82,3±2,0 72,5±2,3 76,1±1,1 82,5±3,3 84,011,9 80,4±2,1 67,614,4 74,0±4,7 73,311,9 76,313,0 77,312,1 75,813,3 78,315,7 74,412,6 79,511,9 75.113.2 64,813,1 68,411,7 65,515,7 70.314.3

Ф.ф. У11+Х (%) Цитрат Гл/1 Гл/2 ЦФДА/1 ЦФДА/Г 82,0±1,7 89,0±1,5 76,2±2,9 8б,3±2,6 88,3±2,1 88,011,9 90,911,6 85,0±4,1 90,0±1,1 91,5±1,2 87,911,5 95,612,5 83,612,7 89,610,7 93,912,3 83,311,0 91.012.5 84,513,8 87.812.6 89.011.7 89,911,5 96.512.2 86,112,8 88.813.3 90,312,5

«.V (%) Цитрат Гп/1 Гл/2 ЦФДА/1 ЦФДА/2 76,3±4,1 82,2±1,9 84,0±1,0 90,5±2,4 83,0±6,8 82,1±2,9 88,311,6 89,7±3,1 94,013,0 96,012,8 81,812,0 90,912,4 93,113,9 97,311,9 10012,1 82,013,9 95,813,3 96,112,2 93,016,1 87,713,7 85,812,1 92,811,9 92,111,1 99,012,0 98,511,8

ФЛХ: К (%) Цитрат Гл/1 Гл/2 ЦФДА/1 ЦФДА/2 2,7±0,9 3,2±1,02 3,310,88 3,310,3 3,3±0,3 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 1,210,8 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1 2,310,6 2,310,6 < 1 < 1 < 1 < 1 < 1

Фибри ноген (г/л) Цитрат Гл/1 Гл/2 ЦФДА/1 ЦФДА/2 2,210,07 2,2±0,17 2, 61:0,08 1,9±0,0б 2,НО, 13 2,2±0,18 2,2±0,12 2,210,24 2,1±0,07 2,3±0,12 2,210,08 1,910,09 2,110,15 2,110,21 2,310,12 2,110,12 2,010,18 2,110,16 2,110,13 2,210,12 2,610,09 2,210,12 2,410,16 2,5 2,710,12

Индекс АПТВ Цитрат ГпЦ Гл/2 ЦФДА/1 ЦФДА/2 2,4±0,19 2,710,43 3,0±0,31 2,610,15 2,310,14 2,910,26 3,1±0,4 3,5±0,58 3,310,24 2,9±0,27 3,010,24 4,010,47 4,410,4 3,210,37 3,210,37 3,510,23 3.610.37 4.310.25 3.010.38 3.210.26 2,810,36 4,510,92 4,110,59 2.510.26 2.210.27

На основании приведенных результатов была разработана технология получения субстратов без ф.УШ:К и без ф.1Х:К. Поскольку технологический процесс изготовления субстратов сходен, мы сочли возможным сделать единое описание, включающее: подготовку посуды и вспомогательных материалов, отделение плазмы от форменных элементов, розлив продукта, сублимационную сушку нативного продукта, укупорку флаконов с сухим реактивом резиновыми пробками, завальцовку колпачков на флаконах, покрытие их пастой УнНа или мастикой, контроль готовой продукции, бракераж, маркировку и хранение. Так как сырье было получено разными способами (путем проведения лечебного кровопускания и плазмафереза), технология приготовления субстрата имела различия. В первом случае - приготовление консерванта на начальном этапе, во втором - введение протекторов и буферных веществ в плазму крови перед розливом реагента.

Одностадийные методы определения ф.ф.УШ:К и IX:К предусматривают построение калибровочного графика для расчета их активности. Линейность графика можно охарактеризовать с помощью коэффициента определения или детерминации (KD). При идеальном расположении точек этот показатель равен 1; чем выше "разброс" показателей, тем ниже KD. Для построения брали пять разведений контроля, соответствующих 100, 50, 25, 12,5 и 6,25% активности рассчитываемого фактора.

Анализ KD калибровочных графиков иллюстрировал линейность кривых, построенных с использованием полученных реагентов как в пробирочных, так и аппаратных методах (таблица 6). Он подтвердил пригодность субстратов для применения при исследовании активности факторов VIII и IX не только в пробирочном, но и аппаратном исполнении одностадийных тестов, проведенном на коагулометре "Coag-A-Mate ХМ" фирмы "Organon teknika", Голландия. При сравнении KD графиков, полученных с применением нашего и фирменного субстратов, также не выявлено значимых различий (Р>0,05).

Табли!

Коэффициенты определения при пробирочном и аппаратном исполнении тестов с использованием __разных субстратов (М ± ш)_

ф

А Стати- Пробирочный «Coag-A-Mate ХМ»

К стиче- метод

Т ские

О пока- Субстрат Субстрат Субстрат Субстрат

Р затели КНИИГПК Org.Tekn КНИИГПК Org.Tekn

М 0,9763 0,9571 0,982 0,9781

VIII ±

ш 0,004 0,008 0,006 0,005

п 11 8 14 9

Р >0, 05 >0, 05

М 0,9605 0,9607 0,977 0,968

±

IX ш 0,008 0,018 0,015 0,01

п 10 5 6 6

Р >0, 05 >0, 05

С целью оценки пригодности разработанных субстратов применяли в одностадийных методах определения факте VIII:К и 1Х:К. Первый использовали в тест-системе при ределе'нии ф.VIII:К плазмы больных гемофилией А и криоп ципитата параллельно с применением нативного субстр (таблица 7).Бьши получены сходные результаты как низком уровне фактора VIII (от 0 до 3, 6% ) у больных ге филией, так и высоком (от 4,9 до 10,8ед/мл, или 490 1080%) в криопреципитате.

Субстраты без факторов VIII:К и IX:К, имеющие раз личный срок годности, использовали для определения указ; ных факторов в образцах плазмы с различными их уровня» (по 15 образцов) : около 100% - в плазме доноров и лиофю зированном контроле и сниженными - в плазме больных гемс филией А и В с установленным диагнозом. Полученные pe3yj таты, представлены в таблице 8.

Таблица 7

Активность фактора VIII больных гемофилией А и криопреципитата ( % и ед/мл ) исследованная с

Статисти- Плазма больных Криопреципитат

ческие Лиофили- Нативный Лиофили- Нативный

показате- зир. субстрат зир. субстрат

ли реагент реагент

М 2,2 2,5 5,2 5,6

± ш 0,4 0,5 1,0 1,2

п 10 10 7 7

Р > 0 ,05 > 0 ,05

Таблица 8

Активность факторов VIII и IX (%) _разных образцов плазмы_

N Образцы плазмы

Доноры Лиофилизир. Больные гемофилией

п/ контроль А В

п ф.УШ Ф.хх ф.1Х ф.VIII ф.1Х ф.УШ Ф.1Х

1 95 145 99 110 <1 53 110 <1

2 97 100 120 105 <1 76 102 5

3 100 100 108 100 8 140 85 5

4 100 95 125 111 8 92 152 <1

5 125 90 118 • 100 6,5 95 88 <1

6 115 100 94 100 <1 92 90 1,4

7 77 110 92 105 2,5 95 93 <1

8 100 100 108 112 1,5 84 95 <1

9 95 105 125 122 2,4 120 120 <1

10 90 130 120 106 1,5 155 150 <1

11 102 97 106 86 2,5 120 87 5,7

12 95 85 100 97 8 84 110 <1

13 100 102 107 115 1,0 120 78 <1

14 130 100 99 90 2,6 155 80 3,8.

15 120 80 95 88 1,0 120 80 1

Исследования подтвердили специфичность разработанных нами лиофилизированных субстратов при использовании в соответствующих тест-системах, следовательно, их пригодность для дифференциальной диагностики гемофилии А и В и определения указанных факторов у здоровых лиц.

ВЫВОДЫ

1. Проведен подбор способов обработки донорской т мы, позволивший получить субстрат с близкой к 0% эктие стью факторов протромбинового комплекса при сохранении тивности лабильных ф-V и ф. VIII: К, а также уровня фибр у. гена, на основании которого разработана технология полу ния лиофилизированной субстратной плазмы без факте II+VII+IX+X, имеющей срок годности 1 год. Обоснована е можность её использования в тест-системе метода Оврена выявления комплекса указанных факторов как при высоком уровне (в гемостатических препаратах), так и сниженном лиц, получающих антикоагулянты непрямого действия).

2. Изучена возможность использования плазмы кр больных гемофилией А и В, взятой при проведении им леч ных процедур, кровопускания и плазмафереза, в качестве рья для изготовления субстратов без фактора VIII:К и IX Применены различные консерванты крови: натрия цитрат, г гицир и ЦФД..-1 фирмы "Baxter", США; проведен подГор спо бов обработки крови.

3. Разработана технология получения плазмы субстрат без фактора VIII:К. Проведены исследования активности п коагулянтов субстрата, приготовленного с разными коне вантами, при длительном хранении, позволившие обоснов срок годности, равный 2 годам.

4. Разработана технология получения плазмы субстрат; без фактора IX:К. Проведены исследованния активности nj коагулянтов субстрата, приготовленного с разными коно вантами, при длительном хранении, позволившие обоснов, срок годности, равный 2 годам.

5. Доказана возможность использования субстратов ( факторов VIII:К и IX:К в одностадийных методах определе] активности указанных факторов. Специфичность подтвержд* как при низких значениях (у больных гемофилией) активно« ф.ф-Vlll и IX, так и высоких (в гемостатических npenaj тах).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тарасова Л.Н., Старкова Е.В., Савиных Е.Ю. Оценка одностадийных методов исследования активности фактора VIII //Лаб.дело.-1990.-N 8.- С.39-42.

2. Старкова Е.В., Тарасова Л.Н., Савиных Е.Ю. О стандартизации одностадийных методов исследования активности фактора VIII //Новое в гематологии и трансфузиологии: Тез. докл. III съезда гематологов и трансфузиологов Узбекистана (Ташкент, 26-28 апреля 1990г.).- Ташкент,1990.- С.107-108.

3. Тарасова Л.Н., Платонова Г.К., Савиных Е.Ю. Лиофилизи-рованные диагностикумы для исследования коагуляциолнного гемостаза //Физиология и патология гемостаза: Тез. Всесоюзной конф. (Полтава, 20-23 ноября 1991г.).- Полта-ва,1991.- С.239-240.

4. Тарасова Л.Н., Платонова Г.К., Савиных Е.Ю. Лиофилизи-рованная субстратная плазма для методов определения $.VIII:K (VIII:С)//Совершенствование методов диагностики, лечения и диспансеиизации больных гемофилией и болезнью Виллебранда: Мат-лы Всесоюзного совещания (Барнаул, 11-12 сентября 1991г.).- Барнаул, 1991.-С.125-126.

5. Тарасова Л.Н., Савиных Е.Ю. Способ получения диагности-кума для контроля антикоагулянтной терапии//Патент РФ N 2013778 от 30.05.1994г.

6. Савиных Е.Ю., Тарасова Л.Н., Платонова Г.К. Субстратные плазмы в методах исследования коагуляционного гемостаза //Препараты крови и кровезаменители, производство, контроль, применение.- Киров, 1995.- С.41-43.

7. Тарасова Л.Н., Платонова Г.К. Савиных Е.Ю. О стандартизации показателей активности протромбинового комплекса //Клиническая лабораторная диагностика - состояние и перспективы: Мат-лы науч.-практ. конф.(г.С.-Петербург, 4-7 июня 1996г.).- С-Пб., 1996.-С.73-74.

8. Савиных Е.Ю., Тарасова Л.Н., Платонова Г.К. Отечественные реактивы для диагностики гемофилии А и В //Клиническая лабораторная диагностика - состояние и перспективы: Мат-лы науч.-практ. конф. (г.С.-Петербург, 4-7 июня 1996г.).- С-Пб., 1996.-С.204-205.

9. Тарасова Л.Н., Платонова Г.К., Савиных Е.Ю. Наборы для исследования показателей коагуляционного гемостаза // Ак-

туальные вопросы гематологии и трансфузиологии: Тез. доь III Всероссийского съезда гематологов и трансфузиолог (г.С-Петербург, 26-28 ноября 1996г.).- С-Пб.,199б.- с.59

10. Тарасова Л.Н., Савиных Е.Ю., Платонова Г.К. Субстра в ручных и аппаратных методах исследования коагуляи //Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: Те докл. III Всероссийского съезда гематологов и трансфузи логов (г.С-Петербург, 26-28 ноября 1996г.).- С-Пб.,1996 С.59.

11.Тарасова JI.H., Платонова Г.К., Савиных Е.Ю., Гонин Л. Диагностикумы и условия стандартизации методов определен протромбинового комплекса// Вестник службы крови.- 1997. 1.- С.33-37.

12. Савиных Е.Ю., Тарасова Л.Н., Платонова Г.К., Ситник С.А. Субстраты для исследования антигемофильных фактор^ //Трансфузиология и служба крови: Тез. докл. ко» (г.Москва,17-19 ноября 1998г.).-М., 1988. -С.210.

13. Тарасова Л.Н., Савиных Е.Ю./ Владимирова С.Г., Плат« нова Г.К. Оценка показателей качества методов Квика и АГ' в ручном и аппаратном исполнении //Диагностика, лечение профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнолс гия. Ветеринария: Мат-лы юбилейной науч. конф., посвяще! ной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (г.Киров, 30 ноябр» 1 декабря 1998г.)-Киров,1998. -С.230-231.

14. СавЬшых Е.Ю., Тарасова Л.Н., Платонова Г.К. Влияю консервантов на качество субстратов при длительном хране нии //Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекцк онных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария: Мат-лы юби лейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ ыик робиологии МО РФ (г.Киров,30 ноября -1 декабря 1998г.) Киров,-1998.-С.232-233.