Автореферат и диссертация по медицине (14.04.01) на тему:Разработка технологии получения и изучение состава липофильных метаболитов плодов Calendula Officinalis (L.) и Echinacea Purpurea L.)

На правах рукописи

Дёмин Михаил Сергеевич

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ И ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА ЛИПОФИЛЬНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ПЛОДОВ CALENDULA OFFICINALIS (L.) И ECHINACEA PURPUREA (L.)

14.04.01-Технология получения лекарств Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

2 8 OKI 2010

Москва 2010

004611843

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН.

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук,

академик РАМН и РАСХН, профессор Быков Валерий Алексеевич Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук , профессор Л.П. Истранов

Кандидат фармацевтических наук, доцент С.Н. Суслина

Ведущее учреждение: НИИ Фармакологии РАН

Защита состоится «8» Ноября 2010 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 006.070.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН (117216, г. Москва, ул. Грина, 7) по адресу: 123056, г. Москва, ул. Красина, д.2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216, Москва, ул. Грина, д.7

Автореферат разослан «_»_2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 006.070.01

Доктор фармацевтических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Растительные масла человечество использует многие тысячелетия. В настоящее время это: пищевые продукты и биологически активные добавки к пище, предназначенные для ежедневного обеспечения жизнедеятельности организма; нативные лекарственные препараты, по активности и безопасности превосходящие многие синтетические; незаменимое сырье для производства средств эстетической медицины и косметики; наконец - вспомогательные фармацевтические ингредиенты в производстве лекарственных форм (эмульсий, линиментов, суппозиториев, желатиновых капсул и др.). Сегодня доказано, что биологически активные вещества (БАВ) липофильных комплексов растений являются активными участниками многих процессов метаболизма и способны осуществлять коррекцию гомеостаза при дисфункциях различных органов и заболеваниях - от простудных до онкологических.

Номенклатура растительных масел, представленных на рынке сырья, за последние годы возросла в десятки раз. В основном это наблюдается за счет импортных поставок. В России интерес ученых и производителей к маслам растений также растет, при этом очевидна необходимость проведения подробных исследований, требующих серьезных материальных затрат и использования специального технологического и аналитического оборудования.

Уровень развития науки настоящего времени дает большие возможности исследователям: использование арсенала современной аналитической базы позволяет детально охарактеризовать метаболический статус растений и их продуктов, а в результате применения высокотехнологичных способов переработки растительного сырья сегодня можно не только получать экстракционные препараты, но выделять концентрированные комплексы биологически значимых метаболитов.

Перспективность разработки современных технологий получения и идентификации липофильных комплексов биологически активных веществ (БАВ) растений, а также актуальность создания препаратов на основе этих комплексов очевидны. В этом аспекте представляет интерес изучение новых и традиционных для медицины видов лекарственного растительного сырья (JIPC) с использованием современных высокоселективных инструментальных аналитических методов и информационных баз.

Ценными и широко применяемыми в медицине и косметологии лекарственными растениями являются ноготки лекарственные {Calendula officinalis L.) и эхинацея пурпурная (Echinacea purpurea (L.) Moench). В качестве лекарственного сырья используют цветки ноготков (flores Calendulae), у эхинацеи - подземную и надземную часть. Широко применяются как самостоятельно, так и в составе лекарственных форм, средства, представляющие собой водные или спирто-водные извлечения этих видов сырья (настои, настойки, экстракты). В то же время, из данных научных публикаций известно, что оба растения содержат не только гидрофильные, но и ценные липофильные БАВ. Так, богатый липофильный комплекс цветков ноготков лекарственных обеспечивает эффективность медицинского использования аппликационных лекарственных форм с маслом календулы и масляными извлечениями из нее. Это обосновывает актуальность разработки новых интенсивных технологий выделения липофильной фракции из растения, детального изучения и создания препаратов средств на его основе.

Если липофильные извлечения из цветков ноготков лекарственных входят в состав ряда косметических и наружных средств, то препаратов на основе липофильного комплекса эхинацеи нет. За рубежом это направление разрабатывается, установлено, что липофильная фракция растений рода эхинацея обладает даже большим воздействием на иммунитет, чем их гидрофильная фракция. Поэтому представляет интерес выделение

липофильного комплекса эхинацеи, его исследование и изучение возможностей использования в медицине.

Известно, что наибольшее количество масел накапливается в семенах и плодах растений. Учитывая сказанное, именно плоды ноготков и эхинацеи являются перспективным сырьем для разработки технологий получения липофильных фракций этих растений.

Как уже было сказано, создание современных средств коррекции гомеостаза на основе растительных источников невозможно без использования высокотехнологичных методов производства и анализа. Развитие высокоэффективных способов выделения БАВ из растений, таких, например, как экстракция сжиженными газами, дает возможность решения этой проблемы.

Цель. Разработка технологии получения липофильных фракций плодов ноготков лекарственных (НЛПЛФ) и эхинацеи пурпурной (ЭППЛФ), их изучение, стандартизация и создание препаратов на их основе.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать технологию получения липофильной фракции плодов ноготков лекарственных и эхинацеи пурпурной методом экстракции сжиженным газом.

2. Провести фитохимическое изучение полученных липофильных комплексов ноготков лекарственных (НЛПЛФ) и эхинацеи пурпурной (ЭППЛФ) (газовой хроматографией с последующей масспектрометрией, высокоэффективной жидкостной хроматографией - ВЭЖХ и др).

3. Определить основные физико-химические показатели качества полученных экстрактов в процессе изготовления и хранения.

4. Разработать параметры стандартизации полученных экстрактов НЛПЛФ и ЭППЛФ.

5. Разработать препараты на основе полученных экстрактов НЛПЛФ и ЭППЛФ в форме раствора в растительном масле и мягких желатиновых капсул.

6. Разработать и утвердить в установленном порядке нормирующие документы на полученные экстракты НЛПЛФ и ЭППЛФ и на разработанные препараты в форме масляных растворов НЛПЛФ и ЭППЛФ и желатиновых капсул с масляными растворами НЛПЛФ и ЭППЛФ

Научная новизна.

- Проведено углубленное морфологическое изучение плодов ноготков и эхинацеи пурпурной.

- Методом экстракции сжиженным газом (хладоном 22) впервые выделены концентрированные экстракты липофильных фракций плодов ноготков лекарственных и эхинацеи пурпурной.

- Методом газовой хроматографии с последующей масспектрометрией установлены составы метаболитов липофильных комплексов плодов ноготков лекарственных и эхинацеи пурпурной, полученных экстракцией сжиженным газом (хладоном 22).

- Определены физико-химические характеристики разработанных экстрактов НЛПЛФ и ЭППЛФ в процессе получения и хранения.

Практическая значимость и уровень внедрения результатов.

Разработана технология выделения липофильных фракций плодов ноготков лекарственных и эхинацеи пурпурной с помощью хладоновой экстракции. На основе полученных продуктов, представляющих собой концентрированные извлечения липофильных БАВ, созданы препараты в форме масляных растворов и желатиновых капсул. Разработанные технологии апробированы в производственных условиях (ООО Фармпромсож), где показана возможность их масштабирования.

По результатам комплексных лабораторных и опытно-промышленных исследований разработана и утверждена в установленном порядке

государственными уполномоченными органами нормативная документация для организации серийного производства на:

«Масло плодов календулы, сырье для БАД», Свидетельство о государственной регистрации № 77.99.23.3.У.56.1.09 от 12.01.2009

- ТУ 9369-167-04868244-2009, ТИ 9369-167-04868244-2009 «Масло плодов календулы, сырье для БАД», Санитарно-эпидемиологическое заключение на документацию № 77.99.23.003.Т.000030.01.09 от 12.01.2009

- «Масло плодов эхинацеи, сырье для БАД», Свидетельство о государственной регистрации №77.99.11.3.У.9034.9.09 от 14.09.2009

- ТУ 9373-166-04868244-2009, ТИ 9373-166-04868244-2009 «Масло плодов эхинацеи, сырье для БАД», Санитарно-эпидемиологическое заключение на документацию №77.99.11.003.Т.002544.09.09 от 14.09.2009

- биологически активная добавка к пище «ВИЛАРИМ масло растительное с маслом плодов календулы» в форме раствора и желатиновых капсул свидетельство о государственной регистрации № 77.99.23.3.У.55.1.09 от 12.01.2009,

- ТУ 9373-169-04868244-2009, ТИ 9373-169-04868244-2009 на БАД к пище «ВИЛАРИМ масло растительное с маслом плодов календулы» в форме раствора и желатиновых капсул, санитарно-эпидемиологическое заключение на документацию №77.99.23.003.Т.000031.01.09 от 12.01.2009

- биологически активная добавка к пище «ВИЛАРИМ масло растительное с маслом плодов эхинацеи» в форме раствора и желатиновых капсул свидетельство о государственной регистрации №77.99.11.З.У.9038.9.09 от 15.09.2009

- ТУ 9369-168-04868244-2009, ТИ 9369-168-04868244-2009 на БАД к пище «ВИЛАРИМ масло растительное с маслом плодов эхинацеи» в форме раствора и желатиновых капсул, Санитарно-эпидемиологическое заключение № 77.99.11.003.Т.002545.09.09 от 15.09.2009.

На защиту выносятся:

- результаты разработки технологии экстракции сжиженным газом (хладоном 22) липофильных фракций плодов ноготков лекарственных и эхинацеи пурпурной,

результаты изучения составов метаболитов полученных липофильных комплексов плодов ноготков лекарственных и эхинацеи пурпурной,

данные по определению физико-химических показателей разработанных экстрактов НЛПЛФ и ЭППЛФ в процессе получения и хранения,

- экспериментальные результаты по разработке технологии получения препаратов в форме растворов и желатиновых капсул, содержащих выделенные экстракты НЛПЛФ и ЭППЛФ,

- показатели и нормы качества созданных препаратов (в форме масляных растворов и желатиновых капсул), содержащих выделенные экстракты НЛПЛФ и ЭППЛФ, после изготовления и в процессе хранения.

Апробация работы и публикации.

Основные положения диссертации представлены на научно-практической конференции Санкт-Петербургской ХФА «Фармация из века в век» (2008), Межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений в Санкт-Петербургской ХФА (2009), X международном конгрессе «Здоровье образование в XXI веке» «Инновационные технологии в биологии и медицине» РУДН(2009), Москва.

Опубликование основных результатов диссертации в научной печати. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения и 2 частей: 1 часть - обзор литературы; 2 часть - результаты и

обсуждение. 2 часть включает главу Материалы и методы и 2 главы собственных исследований, выводов.

Обзор литературы (глава 1 части 1) посвящен характеристике липофильных метаболитов лекарственного растительного сырья: их медицинскому значению, технологии получения, оценке качества и стандартизации. В главе рассмотрены биологически активные вещества растительных масел, аспекты применения в медицине объектов исследования - эхинацеи пурпурной и ноготков лекарственных, технологические способы выделения липофильных фракций растений, вопросы стандартизации препаратов на их основе с учетом анализа современных фармакопейных требований к жирным маслам и требований к пищевым продуктам на основе липофильных растительных комплексов.

Глава 1 экспериментальной части 2 содержит характеристики использованных материалов и методики исследований (аналитические и физико-химические), указаны использованные в работе для обработки экспериментальных данных математико-статистические методы.

В главе 2 части 2 изложены результаты определения показателей качества и анатомо-морфологического изучения растительного сырья, разработки технологии выделения липофильных фракций плодов эхинацеи пурпурной и ноготков лекарственных, приведены экспериментальные данные изучения составов метаболитов растений в полученных экстрактах, их физико-химических показателей и стабильности.

В 3 главе части 2 представлены результаты разработки желатиновых капсул и масляных растворов с экстрактами НЛПЛФ и ЭППЛФ. Приведено описание их получения, технологические схемы и результаты определения показателей качества разработанных препаратов в процессе получения и хранения.

Список публикаций включает 78 источников отечественной литературы и 72 источника зарубежной литературы. Работа изложена на 150 страницах компьютерного текста, включает 35 рисунков и 36 таблиц.

Основное содержание работы

Объектами исследования служили плоды эхинацеи пурпурной и ноготков лекарственных, собранные в фазу массового плодоношения в 20062007 гг.

На первом этапе работы в соответствии с требованиями нормирующей документации проведена оценка растительного сырья - плодов эхинацеи пурпурной и ноготков лекарственных - по показателям: внешние признаки, влажность, микробиологическая чистота. Определены содержание: золы общей, других частей растения, примесей (органических и минеральных), количества масла. Полученные результаты показали соответствие сырья действующей в настоящее время нормативной документации, а определение внешних и признаков позволило детализировать описание сырья. В результате анатомо-морфологического изучения сырья установлено наличие диагностических признаков плодов (наличие тканей перикарпия и др.), что может быть использовано для анализа подлинности сырья. Способом циркуляционной экстракции низкокипящим петролейным эфиром в аппарате Сокслета установлено, что выход масла растет по мере уменьшения размеров частиц сырья. Максимальный съем масла при экстрагировании сырья с дисперсностью менее 500 мкм составил для плодов ноготков, % - 14,92±1,90, эхинацеи пурпурной -11,0±2,23.

Разработка технологии выделения липофильных фракций плодов эхинацеи пурпурной и ноготков лекарственных

Для выделения липофильной фракции плодов ноготков лекарственных и эхинацеи пурпурной использовали низкотемпературную экстракцию сжиженным газом на установке стандартной комплектации.

Из данных научных публикаций известно, что экстракты, полученные этим способом, являются уникальными продуктами, в состав которых входят

жирные масла, жирорастворимые витамины и провитамины, эфиромасличные и другие неполярные соединения растительного сырья.

Экстрагентом служил сжиженный фреон-22, относящийся к ряду метанов и содержащий в своем составе наименьшее количество атомов хлора (один), что обеспечивает его экологическую безопасность. Использование хладонов в качестве извлекателей позволяет проводить процесс в оптимальном температурном диапазоне - от 18° до 22 °С. Экстрагируя сырье различными хладонами можно получать экстракты различных составов, например, обогащенные отдельной группой биологически активных веществ, поскольку эти экстрагенты обладают избирательной растворимостью. Хладоны не извлекают водорастворимые вещества (полисахариды, белки и др.), поэтому шрот после обработки сжиженным газом можно экстрагировать полярными растворителями в рамках комплексной схемы переработки сырья. Хладон-22, используемый в работе, применяется для экстракции различных видов растительного сырья. В ряду различных марок хладонов, известных в качестве экстрагентов, он обладает наименьшей молекулярной массой (86,48), минимальным значением динамической вязкости (0,238 Пас) и поверхностного натяжения (3,0 х 10'3 Н/м при 25 °С). Согласно теоретическим аспектам экстрагирования, эти свойства способствуют лучшему смачиванию частиц сырья, быстрому проникновению экстрагента в клетки, более интенсивному массообмену.

Все вышесказанное обосновывает использование хладона 22 в настоящей работе и определяет ее место в качестве фрагмента комплексной схемы переработки сырья - ноготков лекарственных и эхинацеи пурпурной плодов.

Важным технологическим аспектом достижения высокой эффективности сжиженными газами является подготовка сырья. К числу значимых факторов, влияющих на процесс, относятся: измельченность сырья и способ измельчения, время экстракции, влажность сырья.

На склад

готовой

продукции

Рис. 1 .Технологическая схема выделения липофильной фракции плодов растительного сырья

Согласно полученным предварительно данным, влажность использованного сырья составляла 6,86 - 7,33%, что соответствовало рекомендуемым величинам.

При подготовке сырья к экстрагированию, его измельчали с помощью криогенной мельницы, устроенной по типу дезинтегратора, при температуре - 175 °С. Это позволило повысить хрупкость сырья, добиться высокой степени измельчения, при сохранении активности нативных биологически активных веществ. На рис. 1 приведена технологическая схема процесса.

Технологический процесс экстракции заключался в следующем: измельченное растительное сырье экстрагировали в течение 5 ч при температуре 18 - 25 °С под давлением 5 ат в типовой установке для экстрагирования сжиженным газом с рециркуляцией экстрагента в замкнутом цикле. Выход масла из плодов ноготков составил 13,6+/-0,62% , из плодов эхинацеи пурпурной - 11,5+/-0,47%.

Исследование состава метаболитов выделенных липофильных фракций плодов эхинацеи пурпурной и ноготков лекарственных.

Накопление как можно большего объема информации о биохимическом составе необходимо для детального понимания молекулярной организации биологических материалов. Важные характеристики объектов, такие как качество, пищевая ценность, фармакологическая активность, вкус, запах, токсичность, аллергенность и устойчивость к заболеваниям - все напрямую связаны с присутствием или отсутствием определенной комбинации метаболитов в растениях и продуктах их переработки.

Для профилирования метаболитов проводили исследования полученных экстрактов с помощью газовой хроматографии с последующей масс-спектрометрией (ГХ-МС).

Ноготки лекарственные. Изучение состава метаболитов хладонового экстракта плодов ноготков лекарственных методом газовой хроматографии с

последующей масс-спектроскопией показало, что он представляет собой концентрат липофильных биологически активных компонентов растения, содержащий жирные кислоты, летучие вещества эфирных масел, фитостерины, витамины и др. соединения.

Состав жирных кислот является одним из важных факторов биологической активности масла. Для получения полной картины спектра жирнокислотного состава экстракта ноготков лекарственных плодов липофильной фракции (НЛПЛФ) проведено изучение структурных компонентов сложных липидов, образующихся в процессе трансэтерификации триглицеридов, в ходе которого происходит их расщепление с одновременным образованием летучих метиловых или триметилсилиловых производных.

В ходе анализа на хроматограмме показано 62 пика, из них 16 - не идентифицировано.

В НЛПЛФ основным липофильным продуктом трансметилирования липидов является линолевая кислота. Однако сразу же после пика метилового эфира нонадеканоевой кислоты при 29,42 мин (внутренний стандарт), обнаружено большое число интенсивных пиков метиловых эфиров жирных кислот, специфичных для календулы. Главным из них в количественном отношении является пик кал ендовой кислоты (8Е,10Е,122-октадекатриеновая). Кроме календовой кислоты идентифициованы а-элеостеариновая и пуниковая кислоты, а также целый ряд изомеров октадекатриеновой кислоты (рис. 2 и 3).

Отличие календовой и других октадекатриеновых кислот масла календулы от широко распространенных линолевой и линоленовой кислот заключается в присутствии трех конъюгированных (сопряженных) двойных связей, не разделенных метиленовой группой (-СН2-). Установлено, что наличие подобных связей в молекуле значительно повышает биологическую

Рис.2. Структура календовой (А), а-элеостеариновой (Б) и пуниковой (В) жирных кислот, обнаруженных в масле календулы.

активность жирных кислот. По данным научных публикаций, обнаружен их положительный эффект на рак, атеросклероз, диабет, функцию иммунной системы [Chardigny]. Кроме того, известно, что жирные кислоты с конъюгированными двойными связями снижают содержание жира в организме различных видов животных: мышей, крыс, цыплят и свиней [MacDonald, H.B, Lee, К., Park, Y.]. На рис. 2 представлена также структура пуниковой кислоты, которая является сильнейшим антиоксидантом, препятствует воспалительным процессам, обладает эффективной защитой от свободных радикалов, снижает уровень сахара в крови, замедляет процесс развития раковых опухолей и запускает механизм самоуничтожения раковых клеток, понижает уровень холестерина в организме.

Наряду с октадекатриеновыми кислотами в масле календулы обнаружена группа из 7 изомеров откадекатетраеновой кислоты, имеющих очень близкие масс-спектры и характерный молекулярный ион [М]+ при m/z 290 (рис. 3). Достоверно идентифицирована только паринаровая (9Z,11E, 13Е,152-октадекатетраеновая) кислота. Известно, что паринаровая кислота, как и конъюгированные октадекатетраеновые кислоты, обладает высокой биологической активностью по отношению, например, к раковым клеткам [Boucaud-Maitre Y, 1р, С.].

Рис.3. ГХ-МС профиль всех ионов масла календулы и m/z фрагментов 292 и 290, являющихся молекулярным ионом [М]+ октадекатриеноевых и, соответственно, октадекатетраеноевых кислот. Показан диапазон хроматограммы от 28 до 33 минут

Летучие соединения эфирных масел. В ходе хроматографического анализа установлено наличие в экстракте летучих соединений, общее содержание которых составило 15,4%. Основными компонентами являются 2,4-декадиеналь, (его содержание составляет 77,1% суммы эфиромасличных соединений), изолонгифолена ацетат (19,1%) и 10-ундециновая кислота (2,6%).

Фитостерины. Хроматографическое исследование выделенной НЛПЛФ позволило выявить наличие фитостеринов, их количество составляет 9,365%. Идентифицированы: кампестерол (С58), стигмастерол (С59), альфа-ситостерол (С60), содержание этих компонентов составляет 0,46%, 2,53% и 4,73% соответственно. Из числа фитостеринов не идентифицированы 3 (пики С54, С63, С67), их количество в сумме составляет 1,62%.

Витамины. При анализе обнаружены минорные количества никотиновой (С4) и тионикотиновой кислоты (С7). Содержание этих соединений составило 0,08 и 0,19% соответственно. В проанализированных

образцах полученного экстракта методом газовой хроматографии установлено наличие а-токоферола в количестве от 41,2 до 54,6 мг%. Спектрофотометрически обнаружен р-каротин (4,53± 0,22 мг%)

Результаты определения физико-химических показателей для НЛПЛФ приведены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты анализа НЛПЛФ

Показатели качества Серия масла

0107

ПНЖК %, не менее 55,0± 2,10

Каротиноиды, мг% 4,53± 0,22

Токоферол, мг% 43,8± 2,37

Показатель преломления 1,4701 ±0,003

Относительная плотность при 20 °С, г/см3 0,9374±0,022

Кислотное число, мг КОН 4,4±0,12

Содержание неомыляемых веществ, % 12,2±1,5

Перекисное число, моль активного кислорода/кг 1,85±0,11

Йодное число г Д /ЮОг 133,8±0,44

Омыления число, мг КОН 182,9±1,9

Эхинацея пурпурная. Для получения полной картины спектра жирнокислотного состава ЭППЛФ изучали структурные компоненты сложных липидов, образующихся в процессе трансэтерификации. Основными соединениями ЭППЛФ являются мононенасыщенная олеиновая и полиненасыщенная линолевая кислоты, их содержание составляет 25,82 и 60,82 % соответственно. Обнаружены также пальмитиновая (5,97%) и стеариновая кислоты (2,95%).

Летучие соединения эфирных масел. Содержание летучих соединений эфирных масел в изучаемом экстракте ЭППЛФ достигает 8,78%, идентифицированные соединения и их содержание приведены в табл. 2.

Помимо указанных в табл. 2 соединений, при прямом анализе обнаружены: 2,4-ундекадиеналь, 6,10-диметил-5,9-ундекадиенин-1 -ин, тетрадеканаль. Из данных научных публикаций известно, что цветки эхинацеи содержат от 0,1 до 0,6% эфирных масел, среди которых основными

Таблица 2. Идентифицированные летучие соединения эфирных масел и

их содержание в экстракте ЭППЛФ.

№ пика Соединение Содержание, % Доля в эфирном масле, %

С4 ^)-2-деценаль 0,164 1,88

СЮ 2,4-декадиеналь 1,485 16,89

С11 2,4-декадиеналь 3,503 39,85

С15 (Е)-2-октеналь 0,220 2,51

С19 кариофиллен 1,128 12,83

С31 кариофиллена оксид 1,081 12,30

С38 4,5-дегидроизолонгифолен 0,469 5,33

С41 8,9-дегидроциклоизолонгифолен 0,405 4,24

С42 8,9-дегидроциклоизолонгифолен 0,331 3,76

Сумма компонентов эфирных масел 8,786 100

компонентами являются сесквитерпены, кариофиллен и фарнезен. Таким образом, полученный экстракт ЭППЛФ представляет собой концентрированный по летучим соединениям продукт, что обеспечивается технологией его выделения из растительного сырья.

Фитостерины Хроматографическое исследование экстракта ЭППЛФ позволило установить наличие большого количества фитостеринов, их содержание в сумме достигает 33,68%, среди них идентифицированы: кампестерол (С84), стигмастерол (С85), бета-ситостерол (С86), их суммарное количество составляет 29,71% суммарной доли фитостеринов. Не идентифицированы четыре компонента (С90, С93, С94, С95).

Обнаруженное количество токоферола составляет 17,98± 0,86 мг%

Результаты определения физико-химических показателей ЭППЛФ приведены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты анализа физико-химических показателей ЭППЛФ

Показатели качества Серия масла 0107

ПНЖК, % 53,0±1,8

Токоферол, мг % 17,98± 0,86

Показатель преломления 1,466 ±0,005

Относительная плотность при 20 °С, г/см3 0,9323 ± 0,007

Кислотное число, мг КОН 2,033 ± 0,05

Йодное число, мг I 103,3 ±4,9

Омыления число, мг КОН 194,6 ±2,3

Перекисное число моль активного кислорода/кг, не более 2,24 ± 0,28

При изучении стабильности образцы трех серий экстрактов хранили в стеклянных флаконах из светозащитного стекла, укупоренных пластмассовыми пробками с навинчивающимися крышками в защищенном от света месте без доступа воздуха в условиях холодильника при температуре +8 °С. На основании полученных экспериментальных результатов установлены сроки годности масляных растворов и капсулированных препаратов НЛПЛФ и ЭППЛФ - 1 год. За время хранения у НЛПЛФ (серия 0107) кислотное число изменилось с 4,4±0,12 до 5,6 ±0,31; перекисное число - с 1,85±0,11 до 2,24±0,19. Для ЭППЛФ эти показатели составили после приготовления 2,033 ± 0,05 и 2,24 ± 0,28, после года хранения - 3,2± 0,11 , до 3,53± 0,42 соответственно.

Разработка препаратов, содержащих НЛПЛФ и ЭППЛФ

На основании полученных экспериментальных данных по содержанию основных биологически активных веществ разработанных экстрактов и по согласованию с рекомендациями экспертов института Питания РАМН для создания готовых препаратов проводили купажирование выделенных

липофильных фракций в подсолнечном масле. Составы полученных продуктов приведены в табл. 4.

Таблица 4. Рецептура растворов НЛПЛФ и ЭППЛФ в подсолнечном масле.

препарат состав НД на ингредиенты

Масло подсолнечное с НЛПЛФ масло подсолнечное рафинированное 74% ГОСТ 52465-2005 ТУ 9373-169-04868244-2009 ФС 42-2495-87

НЛПЛФ Альфа-токоферол 25% 1%

Масло подсолнечное с ЭППЛФ масло подсолнечное рафинированное 80% ГОСТ 52465-2005 ТУ 9369-168-04868244-2009 ФС 42-2495-87

ЭППЛФ Альфа-токоферол 20% 1%

С позиции биофармацевтической концепции фармацевтической технологии в качестве лекарственных форм выбраны масляный раствор и желатиновые капсулы, как правило, обладающие высокими показателями биодоступности. Важно также, что технологии этих лекарственных форм в настоящее время автоматизированы и могут быть внедрены в производство.

Изложение разработанных технологий получения препаратов на основе НЛПЛФ и ЭППЛФ представлено далее в работе во взаимосвязи, поскольку производство раствора полученных экстрактов в растительном масле можно рассматривать как самостоятельную технологию, так и в рамках технологической схемы получения желатиновых капсул, наполненных этим раствором (рис. 4).

Для получения капсул использовали желатин производства Weishardt International s.r.o. Словакия. Желатиновую массу готовили с предварительным набуханием, ее качество контролировали по величине вязкости, которая при температуре 60 °С составила 550 м2/с. Капсулы получали на стандартной автоматической линии, состоящей из двух частей: автомата для изготовления желатиновых капсул и барабанной сушилки, в

Рис.4. Технологическая схема получения желатиновых капсул, содержащих липофильный экстракт плодов растительного сырья (ноготков лекарственных или эхинацеи пурпурной)

которой осуществлялась предварительная сушка капсул. Досушивание капсул проводили в сушильном шкафу при температуре 21-25% до влажности около 30%.

У полученных масляных растворов и желатиновых капсул определяли показатели качества в соответствии с фармакопейными требованиями, а также требованиями ТУ 9369-168-04868244-2009 и ТУ 9373-169-048682442009. Для установления сроков годности образцы трех серий препаратов хранили в стеклянных флаконах из светозащитного стекла, укупоренных пластмассовыми пробками с навинчивающимися крышками в защищенном от света месте без доступа воздуха в условиях холодильника при температуре +8 °С. На основании полученных экспериментальных результатов определны сроки годности масляных растворов и капсулированных препаратов НЛПЛФ и ЭППЛФ, которые к настоящему времени (время наблюдения) составили 1 год.

выводы

1. На основании анализа данных научных публикаций обоснована актуальность разработки технологии выделения с помощью хладоновой экстракции липофильных экстрактов плодов ноготков лекарственных и эхинацеи пурпурной и целесообразность изучения состава входящих в него биологически активных метаболитов

2. Методом экстракции сжиженным газом (хладоном) впервые выделены концентрированные экстракты липофильных фракций плодов ноготков лекарственных и эхинацеи пурпурной. В ходе оптимизации разработанной технологии обоснована целесообразность предварительного криогенного измельчения растительного сырья до частиц размерами менее 500 мкм и использования в качестве экстрагента хладона 22. Технология выделения ЭППЛФ и НЛПЛФ апробирована в промышленных условиях.

3. В результате изучения составов полученных хладоновых экстрактов с использованием инструментальных методов (ГХ-МС, спектрофотометрия) показано наличие значительных количеств эфиромасличных соединений и фитостеринов, а также токоферолов, каротиноидов (в НЛПЛФ).

4. Определены составы жирных кислот полученных экстрактов. В НЛПЛФ обнаружено большое количество ПНЖК, специфичных для растения: календовая, альфа-элеостеариновая и пуниковая, имеющие в структуре три конъюгированные двойные связи; ряд изомеров октадекатриеновой и семь изомеров октадекатетраеновой кислот. В ЭППЛФ основными по содержанию являются ненасыщенные - олеиновая и линолевая кислоты.

5. Установлены основные физико-химические показатели качества ЭППЛФ и НЛПЛФ в процессе изготовления и хранения. Полученные экспериментальные данные легли в основу разработки параметров стандартизации экстрактов и позволили установить срок годности - 1 год. По результатам проведенных исследований разработаны и утверждены

23

государственными уполномоченными органами в установленном порядке нормативные документы на экстракты и технологию их получения.

6. На основе выделенных экстрактов получены препараты (Масло подсолнечное с маслом календулы и масло подсолнечное с маслом эхинацеи) в форме растворов и мягких желатиновых капсул, проведена их стандартизация.

7. Проведены исследования стабильности разработанных препаратов в форме масляных растворов и медицинских желатиновых капсул в процессе хранения. Установлено, что все контролируемые показатели остаются в пределах норм допустимых отклонений в течение срока годности (1 год).

8. Полученные в ходе исследования экспериментальные данные послужили основой для создания нормативной документации на разработанные продукты и технологии их получения. Разработана необходимая для организации серийного производства документация, которая утверждена в установленном порядке уполномоченными государственными органами.

Список работ:

1. Дёмин М.С., Сокольская Т.А./Полиненасыщенные жирные кислоты: источники и эффективность.// Сырье и упаковка для парфюмерии, косметики и бытовой химии. - 2008. - с. 15-17.

2. Дёмин М.С., Булгаков Т.В.. /Растительные масла - источники полиненасыщенных жирных кислот и гамма-линоленовой кислоты.//-в сб. Фармация из века в век. Ч. 111 Анализ и стандартизация лекарственных средств,- Труды научно-практической конференции Санкт-Петербургской ХФА. - 2008. - стр. 29-32.

3. Дёмин М.С., Быков В.А. /Использование современных технологий для выделения липофильного комплекса эхинацеи пурпурной.//- в сб. научных трудов X международного конгресса «Здоровье образование в XXI веке» «Инновационные технологии в биологии и медицине» 9-12 декабря 2009 г. -РУДН. - Москва

4. Дёмин М.С., Сосипатрова A.A., Салим-Хусам, Раджаби М.Х.. /Оптимизация процесса смешивания сухих, вязких и вязко-пластичных материалов.//-тез. Докл. Межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений. - Санкт-Петербургская ХФА, 23-24 апреля 2009 г. - с. 148.

5. Дёмин М.С., Осипов В.И., Демина Н.Б., Быков В.А. / Состав метаболитов липофильной фракции ноготков лекарственных плодов.// Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -№3. - с. 3-6.-2010.

6. Дёмин М.С., Осипов В.И., Демина Н.Б., Быков В.А. / Жирнокислотный состав хладонового экстракта ноготков лекарственных плодов.// Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - №4. - с. 52-56. -2010.

7. Дёмин М.С., Осипов В.И., Демина Н.Б., Булгаков Т.В., Быков В.А. //Метаболиты липофильной фракции эхинацеи пурпурной плодов.// Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - №5. - с. 52-56. -2010.

Заказ № 183-а/09/10 Подписано в печать 27.09.2010 Тираж 50 экз. Усл. п.л. 1,2

> ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

\ www.cfr.rii; е-таИ: info@cfr.ru

Номенклатура растительных масел, представленных на рынке сырья, за последние годы возросла в десятки раз. В основном это наблюдается за счет импортных поставок. В России интерес ученых и производителей к маслам растений также растет, при этом очевидна необходимость использования специального технологического и аналитического оборудования, а так же проведения подробных исследований, требующих серьезных материальных затрат.

Уровень развития науки ' настоящего времени дает большие возможности исследователям: использование арсенала современной аналитической базы позволяет детально охарактеризовать метаболический статус растений и их продуктов, а в результате применения высокотехнологичных способов переработки растительного сырья сегодня можно не только получать экстракционные препараты, но выделять концентрированные комплексы биологически значимых метаболитов.

Перспективность разработки современных технологий получения и идентификации липофильных комплексов биологически активных веществ (БАВ) растений, а также актуальность создания оздоровительных средств на основе этих комплексов очевидны. В этом аспекте представляет интерес изучение новых и традиционных для медицины видов лекарственного растительного сырья (JIPC) с использованием современных высокоселективных инструментальных аналитических- методов и информационных баз.

Ценными и широко применяемыми в медицине и косметологии лекарственными растениями являются ноготки лекарственные (Calendula officinalis L.) и эхинацея пурпурная (Echinacea purpurea (L.) Moench). В качестве лекарственного сырья используют цветки ноготков (flores Calendulae), у эхинацеи - подземную и надземную часть. Широко применяются как самостоятельно, так и в составе лекарственных форм, средства, представляющие собой водные или спирто-водные извлечения этих видов сырья. В то же время, из * научных публикаций известно, что оба растения содержат не только гидрофильные, но и ценные липофильные БАВ. Богатый липофильный комплекс цветков ноготков лекарственных обеспечивает эффективность медицинского использования аппликационных лекарственных форм с масляными извлечениями и обосновывает актуальность разработки интенсивных технологий его выделения из растения, детального изучения и создания оздоровительных средств на его основе.

Если липофильные извлечения из цветков ноготков лекарственных входят в состав ряда косметических и наружных средств, то препаратов на основе липофильного комплекса эхинацеи нет. За рубежом это направление разрабатывается. Так, установлено, что липофильная фракция растений рода эхинацея обладает даже большим воздействием на иммунитет, чем их гидрофильная фракция.- Поэтому представляет интерес выделение липофильного комплекса эхинацеи, его исследование и изучение возможностей использования в медицине.

Известно, что наибольшее количество масел накапливается в семенах и плодах растений. Учитывая сказанное, именно плоды ноготков и эхинацеи являются перспективным сырьем для разработки технологий получения липофильных фракций этих растений с целью разработки препаратов на их основе.

Как уже было сказано, создание современных средств коррекции гомеостаза на основе растительных источников невозможно без использования высокотехнологичных методов производства и анализа. ч

Развитие высокоэффективных способов выделения БАВ из растений, таких, например, как экстракция сжиженными газами, дает возможность решения этой проблемы.

Цель. Разработка технологии получения липофильных фракций плодов ноготков лекарственных (НЛПЛФ) и эхинацеи пурпурной (ЭППЛФ), их изучение, стандартизация и создание препаратов на их основе.

Для реализации поставленной цели необходимо было выполнить следующие задачи:

1. Разработать технологию получения липофильной фракции плодов ноготков лекарственных и эхинацеи пурпурной методом экстракции сжиженным газом.

2. Провести фитохимическое изучение полученных липофильных комплексов ноготков лекарственных (НЛПЛФ) и эхинацеи пурпурной (ЭППЛФ) (газовой хроматографией с последующей масспектрометрией, ВЭЖХ и др).

3. Определить основные физико-химические показатели качества полученных экстрактов в процессе изготовления и хранения.

4. Разработать параметры стандартизации полученных экстрактов НЛПЛФ и ЭППЛФ.

5. Разработать препараты на основе полученных экстрактов НЛПЛФ и ЭППЛФ в форме раствора в растительном масле и мягких желатиновых капсул.

6. Разработать и утвердить в установленном порядке нормирующие Ц документы на полученные экстракты НЛПЛФ и ЭППЛФ и на разработанные препараты в форме масляных растворов НЛПЛФ и ЭППЛФ и желатиновых капсул с масляными растворами НЛПЛФ и ЭППЛФ

Научная новизна.

- Проведено углубленное морфологическое изучение плодов ноготков и эхинацеи пурпурной.

- Методом экстракции сжиженным газом (фреоном) впервые выделены концентрированные экстракты липофильных фракций плодов ноготков лекарственных и эхинацеи пурпурной.

- Методом газовой хроматографии с последующей масспектрометрией установлены составы метаболитов липофильных комплексов плодов ноготков лекарственных и эхинацеи пурпурной, полученных экстракцией сжиженным газом (хладоном 22).

- Определены физико-химические характеристики разработанных экстрактов НЛПЛФ и ЭППЛФ в процессе получения и хранения.

Практическая значимость и уровень внедрения результатов.

Разработана технология выделения липофильных фракций плодов ноготков лекарственных и эхинацеи пурпурной с помощью хладоновой экстракции. На основе полученн)ых продуктов, представляющих собой концентрированные извлечения липофильных БАВ, созданы препараты в форме масляных растворов и желатиновых капсул. Разработанные технологии апробированы в производственных условиях (ООО Фармпромсож), где показана возможность их масштабирования

По результатам комплексных лабораторных и опытно-промышленных исследований разработана и утверждена в установленном порядке государственными уполномоченными органами нормативная документация для организации серийного производства на:

Масло плодов календулы, сырье для БАД», Свидетельство о государственной регистрации № 77.99.23.3.У.56.1.09 от 12.01.2009

- ТУ 9369-167-04868244-2009, ТИ 9369-167-04868244-2009 «Масло плодов календулы, сырье для БАД», Санитарно-эпидемиологическое заключение на документацию № 77.99.23.003.Т.000030.01.09 от 12.01.2009

- «Масло плодов эхинацеи, сырье для БАД», Свидетельство о государственной регистрации №77.99.11.3.У.9034.9.09 от 14.09.2009

- ТУ 9373-166-04868244-2009, ТИ 9373-166-04868244-2009 «Масло плодов эхинацеи, сырье для БАД», Санитарно-эпидемиологическое заключение на документацию №77.99.11.003.Т.002544.09.09 от 14.09.2009

- биологически активная добавка к пище «ВИЛАРИМ масло растительное с маслом плодов календулы» в форме раствора и желатиновых капсул свидетельство о государственной регистрации № 77.99.23.3.У.55.1.09 от 12.01.2009,

- ТУ 9373-169-04868244-2009, ТИ 9373-169-04868244-2009 на БАД к пище «ВИЛАРИМ масло растительное с маслом плодов календулы» в форме раствора и желатиновых капсул, санитарно-эпидемиологическое заключение на документацию №77.99.23.003.Т.000031.01.09 от 12.01.2009

- биологически активная добавка к пище «ВИЛАРИМ масло растительное с маслом плодов эхинацеи» в форме раствора и желатиновых капсул свидетельство о государственной регистрации №77.99.11.3.У.9038.9.09 от 15.09.2009

- ТУ 9369-168-04868244-2009, ТИ 9369-168-04868244-2009 на БАД к пище «ВИЛАРИМ масло растительное с маслом плодов эхинацеи» в форме раствора и желатиновых капсул, Санитарно-эпидемиологическое заключение № 77.99.11.003.Т.002545.09.09 от 15.09.2009.

На защиту выносятся:

- результаты разработки технологии экстракции сжиженным газом

S •. хладоном 22) липофильных фракций плодов ноготков лекарственных и эхинацеи пурпурной, результаты изучения составов метаболитов полученных липофильных комплексов плодов ноготков лекарственных и эхинацеи пурпурной, данные по определению физико-химических показателей разработанных экстрактов НЛПЛФ и ЭППЛФ в процессе получения и хранения,

- экспериментальные результаты по разработке технологии получения препаратов в форме растворов . и желатиновых капсул, содержащих выделенные экстракты НЛПЛФ и ЭППЛФ,

- показатели и нормы качества созданных препаратов (в форме масляных растворов и желатиновых капсул), содержащих выделенные экстракты НЛПЛФ и ЭППЛФ, после изготовления и в процессе хранения.

Апробация работы и публикации.

Основные положения диссертации представлены на научно-практической конференции Санкт-Петербургской ХФА «Фармация из века в век» (2008), Межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений в Санкт-Петербургской ХФА (2009), X международном конгрессе «Здоровье образование в XXI веке» «Инновационные технологии в биологии и медицине» РУДН(2009), Москва. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы и трех глав собственных исследований. Список публикаций включает 78 источников отечественной литературы и 72 источника зарубежной литературы. Работа изложена на 150 страницах компьютерного текста, включает 35'рисунков и 36 таблиц.

выводы

1. На основании анализа данных научных публикаций обоснована актуальность разработки технологии выделения с помощью хладоновой экстракции липофильных экстрактов плодов ноготков лекарственных и эхинацеи пурпурной и целесообразность изучения состава входящих в него биологически активных метаболитов

2. Методом экстракции сжиженным газом (хладоном) впервые выделены концентрированные экстракты липофильных фракций плодов ноготков лекарственных и эхинацеи пурпурной. В ходе оптимизации разработанной технологии обоснована целесообразность предварительного криогенного измельчения растительного сырья до частиц размерами менее 500 мкм и использования в качестве экстрагента хладона 22. Технология выделения ЭППЛФ и НЛПЛФ апробирована в промышленных условиях.

3. В результате изучения составов полученных хладоновых экстрактов с использованием инструментальных методов (ГХ-МС, спектрофотометрия) показано наличие значительных количеств эфиромасличных соединений и фитостеринов, а также токоферолов, каротиноидов (в НЛПЛФ). (

4. Определены составы жирных кислот полученных экстрактов. В НЛПЛФ обнаружено большое количество ПНЖК, специфичных для растения: календовая, а-элеостеариновая и пуниковая, имеющие в структуре три конъюгированные двойные связи; ряд изомеров октадекатриеновой и семь изомеров октадекатетраеновой кислот. В ЭППЛФ основными по содержанию являются ненасыщенные - олеиновая и линолевая кислоты.

5. Установлены основные физико-химические показатели качества ЭППЛФ и НЛПЛФ в процессе изготовления и хранения. Полученные экспериментальные данные легЛи в основу разработки параметров стандартизации экстрактов и позволили установить срок годности - 1 год. По результатам проведенных исследований разработаны и утверждены государственными уполномоченными органами в установленном порядке нормативные документы на экстракты и технологию их получения.

6. На основе выделенных экстрактов получены препараты (Масло к растительное с маслом календулы и масло растительное с маслом эхинацеи) в форме растворов и мягких желатиновых капсул, проведена их стандартизация.

7. Проведены исследования стабильности разработанных препаратов в форме масляных растворов и медицинских желатиновых капсул в процессе хранения. Установлено, что все контролируемые показатели остаются в пределах норм допустимых отклонений в течение срока годности (1год).

8. Полученные в ходе исследования экспериментальные данные послужили основой для создания нормативной документации на разработанные продукты и технологии их получения. Разработана необходимая для организации серийного производства документация, которая утверждена в установленном порядке уполномоченными государственными органами.

Заключение

Полученные препараты выделенных липофильных экстрактов плодов ноготков лекарственных и эхинацеи пурпурной в форме масляного раствора и медицинских капсул соответствуют требованиям Государственных Фарма-копей.

Рис.3.1. Технологическая схема получения медицинских желатиновых капсул, содержащих липофильный экстракт плодов растительного сырья (ноготков лекарственных или эхинацеи пурпурной)