Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фитохимическое исследование и совершенствование методов стандартизации цветков и травы календулы лекарственной (Calendula officinalis L.)

На правах рукописи

КАЩЕНКО НИНА ИГОРЕВНА

ЦР3*?'

ФОТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СТАНДАРТИЗАЦИИ ЦВЕТКОВ И ТРАВЫ КАЛЕНДУЛЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ {Calendula officinalis L.)

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

005548046

Улан-Удэ - 2014

005548046

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки "Институт общей и экспериментальной биологии" Сибирского отделения Российской академии наук.

Научный руководитель:

Оленников Даниил Николаевич - доктор фармацевтических наук Официальные оппоненты:

Мирович Вера Михайловна - доктор фармацевтических наук, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Иркутский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации / кафедра фармакогнозии и ботаники, заведующий

Каминский Илья Петрович - кандидат фармацевтических наук, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации / кафедра фармацевтической химии, старший преподаватель

Ведущая организация: Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» Россельхозакадемии

Защита состоится « 29 » мая 2014 г. в 1300 час. на заседании диссертационного совета ДМ 003.028.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки "Институт общей и экспериментальной биологии" СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Бурятского научного центра СО РАН по адресу: ул. Сахьяновой, 6,670047, г. Улан-Удэ.

Автореферат разослан «18 » апреля 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, доцент

В.Б. Хобракова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Calendula officinalis L. (календула лекарственная) - известное лекарственное растение семейства Asteraceae, имеющее более чем вековой опыт применения в официнальной медицине большинства стран мира. Данный растительный вид относится к числу многотоннажного культивируемого сырья, занимающего по площади выращивания второе место, уступая только ромашке аптечной (Куркин, 2012). Наукометрические исследования свидетельствуют о постоянно растущем интересе к изучению С. officinalis со стороны ученых различных отраслей науки - биологов, фармакологов, фитохимиков и др.

Анализ данных литературы о химическом составе данного вида свидетельствует о его разнообразии; известно о присутствии моно-, сескви- и тритерпеноидов и их гликозидов, стероидов, каротиноидов, простых фенолов, бензойных кислот, фенилпропаноидов, флавоноидов, кумаринов и алифатических соединений (Swiatek, Gora, 1978; Komissarenko et al., 1988; Vidal-Ollivier et al., 1989; Matysik et al., 2005). Несмотря на объем имеющейся химической информации, наблюдается тенденция в «однообразии» исследовательских работ, посвященных в большинстве случаев изучению тритерпеноидов, каротиноидов и эфирного масла; так, 74% из известных в С. officinalis соединений относятся к терпеновым производным и менее 8% - к фенольным соединениям, 3% из которых - это флавоноиды (12 соединений). Данные о фенольных соединениях листьев С. officinalis ограничены сведениями о присутствии в них изорамнетина, изорамнетин-3-O-P-D-глюкозида и нарциссина (Friedrich, 1962), что не отражает реальный химический профиль. Следует отметить, что, несмотря на объем имеющейся информации, сведения о фенольных соединениях С. officinalis, культивируемой в России, ограничены небольшим числом публикаций, а изучение С. officinalis, культивируемой в Бурятии, ранее не проводилось.

В России к числу разрешенных к использованию видов лекарственного сырья С. officinalis относятся "Ноготков цветки" (ГФ XI изд., ФС №5) и "Календулы трава" (ТУ 9375-090-04868244-98). Нормативные документы, принятые в XX в. либо не содержат разделов по качественной и количественной стандартизации сырья по действующим веществам ("Ноготков цветки"), либо включают устаревшие рекомендации ("Календулы трава"), которые не могут быть использованы для адекватного анализа сырья. Данные обстоятельства указывают на необходимость пересмотра разделов "Подлинность" и "Количественное определение".

Согласно современным требованиям надлежащей лабораторной практики (GLP) к лекарственным средствам, необходимым условием является разработка адекватной и правильной системы контроля качества растительного сырья и с применением высокоэффективных и чувствительных методов анализа. Опыт ряда ведущих мировых Фармакопей, а также частных исследований в области анализа сырья и готовых лекарственных форм из С. officinalis свидетельствует

об отсутствии правильных и селективных методов анализа фенольных соединений данного растительного вида.

Таким образом, углубленные химические исследования С. officinalis, а также разработка новых методов анализа данного официнального растительного вида являются актуальными в связи с необходимостью расширения фитохимическй информации, а также обусловлены современными требованиями фармацевтической науки и практики.

Целью исследования явилось химическое изучение фенольных соединений цветков и листьев календулы лекарственной, культивируемой в республике Бурятии, и совершенствование методов стандартизации сырья.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить состав фенольных соединений цветков и листьев С. officinalis, культивируемой в республике Бурятии.

2. Создать унифицированные методики определения флавоноидов и фенилпропаноидов в С. officinalis с применением методов микроколоночной ВЭЖХ и спектрофотометрии.

3. Определить оптимальные критерии качественной и количественной стандартизации сырья "Ноготков цветки" и "Календулы трава".

4. Изучить влияние различных факторов на накопление фенольных соединений в С. officinalis в условиях открытого грунта республики Бурятия.

Научная новизна. В результате химических исследований С. officinalis, культивируемой в Бурятии, было выделено и идентифицировано 63 вещества, из которых 33 впервые для данного вида, и три новых природных соединения, в т.ч. календизид I [изорамнетин-3-0-(2"-ацетил-)-р-£>-глюкопиранозид], календизид П [изорамнетин-3-0-(2", 6"-диацетил-)-р-£)-глюкопиранозид] и 6'-0-ванилош1-Р-1>-глюкопираноза. Впервые для С. officinalis установлено присутствие антоцианов, в составе которых выявлено 8 соединений гликозидной природы, производных цианидина, дельфинидина, мальвидина, пеонидина, пеларгонидина и петунидина. Изучены фенольные соединения пыльцы С. officinalis, и выявлено, что их состав близок к таковому краевых цветков, и отличается наличием 1,5-ди-О-ферулоилхинной кислоты, ранее полученной синтетическим путем и впервые выделенной из природного объекта. Впервые показана возможность разделения фенольных соединений с применением микроколоночной обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (МК-ВЭЖХ) с использованием мицеллярных подвижных фаз.

Практическая значимость. Разработана новая методика количественного анализа 14 соединений (5 фенилпропаноидов и 9 флавоноидов) в С. officinalis методом мицеллярной МК-ВЭЖХ с применением колонки ProntoSIL-120-5-C18 (2x75 мм) и градиентной элюентной системы [0.2 М L1CIO4 в 0.006 М HCIO4 -0.01 М додецилсульфат натрия в воде (1:1)]-ацетонитрил. Разработана новая методика количественного анализа суммарного содержания флавоноидов и фенилпропаноидов в С. officinalis с применением комбинированного метода твердофазной экстракции / спектрофотометрии. Разработана унифицированная

схема выбора маркерных групп соединений для стандартизации растительного сырья. В проект ФС "Ноготков цветки" предложено ввести новые разделы "Подлинность", "Количественное определение" и числовые показатели "суммарное содержание флавоноидов не менее 1.2%" и "суммарное содержание фенилпропаноидов не менее 0.2%". В проект ФС "Календулы трава" предложено ввести новый раздел "Подлинность" и числовые показатели "суммарное содержание флавоноидов не менее 0.5%" и "суммарное содержание фенилпропаноидов не менее 0.5%". С целью повышения содержания фенольных соединений при культивации С. officinalis в республике Бурятия рекомендовано сочетанное применение минерального (МбоР9оК^о) и органического удобрений (30 т/га).

Степень внедрения. Теоретические положения и результаты экспериментальных исследований, изложенные в диссертационной работе, используются в учебном процессе кафедры фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Бурятский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. На защиту выносятся:

1. Результаты исследования состава фенольных соединений цветков и листьев рода С. officinalis, культивируемой в республике Бурятии.

2. Характеристика новых природных соединений - календизидов I и П, и б'-О-ванилоил-р-О-глкжопиранозы, выделенных из С. officinalis.

3. Орган-специфичное распределение фенольных соединений в С. officinalis.

4. Методы количественного анализа флавоноидов и фенилпропаноидов с применением микроколоночной ВЭЖХ-УФ и твердофазной экстракции / спектрофотометрии.

5. Унифицированная схема выбора маркерных групп соединений для стандартизации сырья на примере С. officinalis.

6. Результаты исследования влияния различных факторов на накопление фенольных соединений в С. officinalis в открытом грунте.

Апробация работы. Основные положения и результаты работы были представлены на: V Всероссийской конференции с международным участием "Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья" (Барнаул, 2012), VI Международной научной конференции "Traditional Medicine: Ways of Integration with Modern Health Care" (Ulan-Ude, 2013), УШ Всероссийской научной конференции "Химия и технология растительных веществ" (Калининград, 2013), X Международном симпозиуме "Chemistry of Natural Compounds" (Bukhara, 2013).

Связь задач исследования с проблемным планом Фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с программой и планом научно-исследовательских работ ФГБУН "Институт общей и экспериментальной биологии" СО РАН по проекту № 146 "Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы и реализация", утвержденным президиумом СО РАН.

Работа выполнена в рамках научно-исследовательских программ н при Финансовой поддержке гранта РФФИ №12-03-31547(мол_а)

"Структурно-функциональное исследование низкомолекулярных фенольных соединений растительного происхождения как перспективных антихолинэстеразных агентов" (2012-2013 гг.); гранта РГНФ №12-06-12026(в) "Создание АБД «Тибетская медицина» (информационно-аналитической структуры) как инструмента для комплексного изучения наследия тибетской медицины" (2012-2014 гг.); проекта СО РАН Центры новых медицинских технологий "Структурно-функциональное исследование низкомолекулярных фенольных соединений как антитирозиназных агентов" (2012-2013 гг.).

Личный вклад автора в получении научных результатов. Автором диссертационной работы проведен поиск и анализ данных по теме исследования, осуществлены планирование экспериментов, сбор данных; соискателем непосредственно проведены все химические и аналитические эксперименты. Согласно сформулированным задачам подготовлены доклады, тезисы и статьи, оформлена диссертация, автореферат, представленные к защите.

Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 8 научных работ, в том числе 4 статьи - в изданиях, рекомендованных ВАК МОиНРФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 223 печатных страницах, состоит из введения, обзора литературы, 5 глав экспериментальной части, заключения, списка цитируемой литературы, состоящего из 212 источников, в том числе 204 - на иностранных языках, и включает 32 рисунка, 46 таблиц и 2 приложения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

Во введении обозначены актуальность темы, цель и задачи исследований, научная новизна, практическая значимость исследований, сведения об апробации работы и основные положения, выносимые на защиту.

Глава 1. РОД КАЛЕНДУЛА {Calendula L.). ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

В главе представлен наукометрический анализ данных по степени изученности растительных видов рода Calendula L., обобщены сведения по хеморазнообразию экстрактивных веществ рода, представлены данные о фармакологической активности экстракционных препаратов и индивидуальных соединений С. officinalis, систематизирована информация по методам анализа терпеновых и фенольных соединений видов Calendula.

Глава 2. ФЕНОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ С. officinalis.

РЕВИЗИОННОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИЧЕСКОГО ПРОФИЛЯ

Для химического исследования экстрактивных веществ С. officinalis было проведено фракционирование и хроматографическое разделение спирторастворимых компонентов с применением жидкофазной экстракции, КХ

на нормально- (Si02) и обращенно-фазовом сштикагеле (0®-Si02), полиамиде, Сефадексе LH-20, твердофазной экстракции на полиамиде, препаративной ТСХ на Si02 и целлюлозе, флэш-хроматографии на Si02) препаративной ВЭЖХ на 00>-Si02.

2.1. Фенольные соединения цветков С officinalis. Экстракция и фракционирование. В результате хроматографического разделения экстрактивных веществ цветков С. officinalis сорта 'Big Orange' выделено 41 соединение, в т.ч. 39 известных вещества и два новых флавоноида 29 и 30. Известные соединения представлены такими классами веществ как бензойные кислоты - ванилиновая (1), сиреневая кислоты (2); фенилпропаноиды -коричная (3), и- (4), о-кумаровая (5), феруловая (6), изоферуловая (7), кофейная кислоты (10), 1 -О- (40), 3-0- (11), 4-О- (31), 5-0- (12), 1,3-ди-О- (13), 3,4-ди-О-(14), 3,5-ди-О- (15), 4,5-ди-О- (16), 1,3,5-три-О- (17), 3,4,5-три-О-кофеилхинные кислоты (18), З-О-и-кумароилхинная кислота (41), 5-0-ферулоилхинная кислота (19), 1-О-кофеилглюкоза (39); флавоноиды - кверцетин (8), изорамнетин (9), кверцитрин (20), изокверцитрин (21), кверцетин-3-0-(2"-ацетил-)-р-£>-глюкопиранозид (22), кверцетин-3-<9-(6"-ацетил-)-р-£>-глюкопиранозид (23), кверцетин-3-0-(2",6"-диацетил-)-Р-£>-глюкопиранозид (24), изорамнетин-З-О-р-В-глюкопиранозид (25), изорамнетин-3-O-a-Z,-рамнопиранозид (26), календофлазид (27), изорамнетин-3-0-(6"-ацетил-)-р-£>-глкжопиранозид (28), кверцетин-3-0-(2"-а-£-рамнопиранозил)-а-1,-рамнопиранозид (32), рутин (33), нарциссин (34), календофлавозид (35), календофлавобиозид (36), мангаслин (37), тифанеозид (38). Ранее в С. officinalis было выявлено присутствие 1, 2, 4, 6, 10-12, 20, 25, 27, 33-38 (Swiatek, Gora, 1978; Komissarenko et al„ 1988; Vidal-Ollivier et al., 1989; Matysik et al., 2005); соединения 5, 7, 9, 14-21, 23-26, 28, 30-32, 39-11 обнаружены в данном виде впервые.

2.2. Календизиды I и II - новые ацилированные гликозиды изорамнетина. Соединение 29 представляет собой желтый аморфный порошок. Согласно данным HR-ESI-MS соединению соответствует формула С24Н24О13 {от/г 543.421 ([M+Naf; расч. 543.441)}. ИК-спектр содержит полосы сложноэфирного карбонила (1725 см"'), что указывает на наличие ацилирования в молекуле 29. В продуктах кислотного гидролиза соединения идентифицированы изорамнетин и глюкоза, а щелочной гидролиз приводит к образованию изорамнетин-З-О-р-О-глюкопиранозида и ацетата, идентифицированного методом ВЭЖХ. После ферментативного гидролиза 29 с Р-глюкозидазой обнаружен изорамнетин, что свидетельствует о наличии ацетильной группы в углеводной части гликозида. Данные 'Н- и 13С-ЯМР спектроскопии подтверждают р-конфигурацию аномерного центра глюкопиранозы; 'Н-ЯМР спектр содержит сигнал аномерного протона глюкопиранозы в виде дуплета при 5.81 м.д. (1Н, J= 7.7 Гц), а С-ЯМР спектр - сигнал при 101.7 м.д. (табл. 1). Также в спектре 'Н-ЯМР присутствует синглет ацетильной группы при 1.59 м.д. Присутствие однопротонного двойного дуплета при 4.38 м.д. указывает на наличие ацетилирования при вторичном гидроксиле глюкопиранозы (С-2", С-3", С-4"), т.к. при

ацетил ировании первичной гидроксильной группы при С-6" сигнал наблюдался бы в более сильном поле, как в случае изорамнетин-3-0-(6"-ацетил-)-р-£>-глюкопиранозида (гарезосЬпауа е! а1., 1978). Согласно данным С-ЯМР спектроскопии для сигнала С-2" углеводного остатка 29 отмечается слабопольный сдвиг (+2.8 м.д.), что обусловлено наличием ацилирования по данному положению. В спектре НМВС сигнал карбонила ацетильной группы (170.2 м.д.) коррелирует с протоном Н-2" глюкопиранозного остатка (4.58 м.д.), подтверждая присутствие ацетила у С-2". Проведенные исследования позволили установить структуру соединения 29, как изорамнетин-3-0-(2"-ацетил-)-Р-1)-глюкопиранозида.

Соединение 30 представляет собой желтый аморфный порошок с молекулярной формулой С26Н26014 {1Ж-Е51-М8 т/г 585.263 ([М+№]+; расч, 585.479)}.

Таблица 1. Спектры ЯМР 'Н (500 МГц) и 13С (125 Гц) соединений 29 и 30 (ДМСО-а«, 8, м.д,

Атом С БЕРТ 29 30

5н «с 8н 8с

Изорамнетин

2 С 156.4 156.4

3 С 133.9 134.0

4 С 178.3 178.2

5 С 161.0 161.2

6 СН 6.15 (Ш, Д. 7 = 2.2) 99.9 6.14 (1а Д, 7 = 2.2) 99.8

7 С 164.2 164.3

8 СН 633 (1Н, д,У= 2.2) 93.8 6.33(1Н,Д,7 = 2.2) 93.4

9 С 156.1 156.1

10 С 104.1 104.2

С 121.7 121.9

2' СН 7.86 (1Н, д,У= 2.0) 112.9 7.85 (1а Д, 7 = 2.0) 112.9

3' с 149.2 149.0

4' с 146.4 146.3

5' СН 6.89 (1Н,д,/= 9.0) 115.7 6.87 (1Н, д. 7 = 9.0) 115.9

6' СН 7.45 (1Н, дд, 7 = 9.0, 2.0) 122.5 7.44 (1Н. да, 7 =9.0, 2.0) 122.4

З'-ОСН, СН3 3.81 (ЗН, с) 55.2 3.82 (ЗН, с) 55.3

Р-О-Глкжопираноза

1" СН 5.81 (1а Д, 7 = 7.7 Гц) 101.7 5.83 (1а Д, 7 =7.7 Гц) 101.8

2" СН 4.58 (1Н, да, 7 = 8.1, 8.6 Гц) 75.9 4.60 (1Н, да,7= 8.1, 8.6 Гц) 76.0

3" СН 77.9 78.0

4" СН 3.11-3.35 (ЗН, м) 70.2 3.15-3.36 (ЗН, м) 70.2

5" СН 76.3 76.7

6" СН2 3.75 (1Н, м, На), 61.1 4.25 (1а ДД,7 = 2.0. 12.0 Гц, 63.9

3.51 (1Н, и, Нв) 1Ц), 4.09(1Н, м, Нв)

2"-СН3СО 1.59 (ЗН, с) 1.57 (За с) 19.7

2"-СН3СО сн3 19.6

2"-СН3СО С 170.2 170.2

6"-СНзСО 1.63 (За с) 20.3

6"-СН3СО СН3

6"-СН3СО С 171.0

Данные химических превращений, УФ-, ИК- и ЯМР спектроскопии близки к таковым 30 и изорамнетин-3-0-(6"-ацетил-)-Р-£-глюкопиранозида, за исключением того, что в спектре 'Н-ЯМР присутствуют два сигнала ацетильных групп - 1.57, 1.63 м.д., а в спектре 13С-ЯМР обнаружены

химические сдвиги карбонила при 170.2 и 171.0 м.д. и метальной группы при 19.7 и 20.3 м.д. (табл. 2). Данные факты свидетельствуют о присутствии двух ацетильных групп в структуре соединения. Согласно НМВС выявлены корреляции между карбонилами ацетильных групп при 170.2 и 171.0 м.д. и сигналами протонов Н-2" (4.60 м.д.) и Н-6" (4.09, 4.25 м.д.), соответственно, что позволяет установить положение ацетильных групп у С-2" и С-6" р-глюкопиранозы. Таким образом, для соединения 30 определено строение в виде изорамнетин-3-0-(2",6"-диацетил-)-Р-£>-глюкопиранозида.

Известно о существовании двух ацетилированных производных

изорамнетин-З-О-р-О-глюкозида -

изорамнетин-3 -(9-(6"-ацетил-)-р-£>-глюкопиранозид, выделенный из хвои Pinus silvestris L. (Pinaceae) (Zapesochnaya

et al., 1978) и изорамнетин-3-0-(2",3",4"-триацетил-)-Р-£)-глюкопиранозид из листьев Warburgia stuhlmanii Engl. (Canellaceae) (Manguro et al., 2003). Вещества 29 и 30 являются новыми природными соединениями.

2.3. Антоциановые гликозиды темно-окрашенных сортов С officinalis. В четырех сортах С. officinalis - 'Egypt Sun', 'Flame Dancer', 'Indian Prince', 'Red Black Centered', было выявлено присутствие антоцианов (0.79-3.12 мг/г). Хроматографическое исследование (ВЭЖХ) показало присутствие 8 соединений, идентифицированных как 3-0-глюкопиранозиды цианидина (42), дельфинидина (43), мальвидина (44), пеонидина (45), пеларгонидина (46) и петунидина (47), 3,5-ди-О-глюкопиранозиды цианидина (48) и пеларгонидина (49) и цианидин-3-О-рутинозид (50). Доминирующим соединением является цианидин-3-О-глюкопиранозид, содержание которого в трубчатых и краевых цветках составило 0.85-3.01 и 0.97-1.24 мг/г, соответственно. Трубчатые цветки являются основным местом локализации данной группы соединений, причем наибольшая концентрация была отмечена для сорта 'Flame Dancer' (12.61 мг/г). Наличие антоцианов установлено в С. officinalis впервые

2.4. Фенольные соединения листьев С officinalis. Экстракция и фракционирование. С применением методических подходов, описанных ранее для цветков проведено химическое исследование листьев С. officinalis. В результате было выделено 25 соединений - 1 новое (62) и 24 известных веществ, в т.ч. гликозиды бензойных кислот — 1'-О-и-гидроксибензоил-p-D-глюкопиранозид (51), 6'-0-и-гидроксибензоил-р-£>-глюкопиранозид (52), Y-0-протокатехоил-Р-/)-глюкопиранозид (53), 6'-0-протокатехоил-Р-£>-глюкопиранозид (54) и 1 '-О-ванилоил-р-О-глюкогшранозид (55), фенилпропаноиды - кофейная кислота, 3-0-, 3,5-di-O-, 1,5-ди-О- (56) и 4,5-ди-О-кофеилхинные кислоты; кумарины — умбеллиферон (57), эскулетин (58), эскулин (59), цихориин (60), скополетин (61); флавоноиды - кверцетин, изокверцитрин, кверцетин-3-0-(6"-ацетил)-Р-£)-глюкозид, рутин, изорамнетин, изорамнетин-3-0-р-£)-глюкозид, изорамнетин-3-0-(6"-ацетил)-р-Л-глюкозид,

нарциссин и тифанеозид. Соединения 51-61 обнаружены для С. officinalis впервые.

2.5.6'-0-Ваншюил-Р-1>-глюкопираноза - новый гликозид ванилиновой кислоты. Соединение 63 представляет собой белый аморфный порошок. Согласно данным FAB-MS соединению соответствует формула С14Н18О9 {miz 331 [М + Н]+. В 'Н-ЯМР спектре сигналы трех ароматических протонов наблюдались при £7.63 (1Н, да, 7= 8.0, 1.9 Гц), 7.52 (1Н, д, J= 1.9 Гц) и 6.80 (1Н, д,J= 8.0 Гц), которые характерны для 1,3,4-тризамещенных бензольных систем. Также 13С-ЯМР спектр показал наличие карбонильной группы (8166.7) и метоксильной группы (8 56.3). В НМВС спектре, углерод карбонильной группы (8 166.7) коррелирует с ароматическим протоном Н-6 при 8 7.63 и ароматическим углеродом при 8 147.5 (С-3), связанных с метоксильными протонами при 83.97 (рис. 2).

Таблица 2. Спектры ЯМР ]Н (500 МГц) и 13С (125 Гц) соеданения 62 (ДМСО-d«, 5, м.д., J/Гц)

Атом С DEPT 8н «с

1 С 120.3

2 СН 7.52 (1H, д, 1.9) 112.7

3 С 147.5

4 С 153.4

5 СН 6.80 (1Н, д, 8.0) 115.4

6 СН 7.63 (1Н, дд, 8.0, 1.9) 125.6

7 С 166.7

4-ОСНз сн3 3.97 (ЗН, с) 56.3

Г СН 4.56 (1Н.Д, 7.2) 983

2' СН 73.4

3' 4' СН СН 3.39-3.62 (4H, м) 78.7 70.3

5' СН 74.5

6' СН: 4.37 (1Н,дд, 11.9,2.0) 4.05 (1Н.ДД, 11.9,7.4) 64.2

Рис. 2. Некоторые корреляции в спектрах 'Н-'Н COSY (—) и НМВС (Н->С) соединения 62

В результате щелочного гидролиза соединения 62 с 1 М КОН образовалась ванилиновая кислота, которая была идентифицирована методами ВЭЖХ с аутентичным образцом и 13С-ЯМР. Эти данные предполагают наличие структуры ванилоила в соединении 62. Наличие в структуре D-глюкозы было подтверждено после кислотного гидролиза с последующим ВЭЖХ гидролизата Кроме того, присутствующие 6 углеродных сигналов в 13С-ЯМР спектре характерны для р-глюкозы. Связь остатка ванилоила и глюкозы была подтверждена анализом НМВС спектра. Углерод карбонильной группы (5 166.7) показал корреляцию с протоном при 8 4.05, предполагающую, что остаток ванилоила связан с атомом С-6' остатка глюкозы. Более того, результаты анализа 13С-ЯМР показали слабопольный сдвиг сигнала С-6' глюкозы, также как сильнопольный сдвиг С-5' в сравнении со свободной глюкозой. Отнесение сигналов протонов и углеродов было проведено по данным НМВС и 'Н-'Н COSY. Так как аномерная гидроксильная группа остатка глюкозы соединения 6 неацилирована, то имеется вероятность существования смеси аномеров (а- и p-форм). Полученные данные 13С-ЯМР показывают присутствие слабого сигнала в области 8 92.1, что указывает на а-форму соединения 62. Однако пики площадей для С-Г атомов а- (8 92.1) и Р-

форм 98.3) соотносятся 1:92. Таким образом, можно предположить, что доминирующим компонентом смеси является Р-формы (общее содержание а-формы не превышает 1.1%). Данные результаты позволяют идентифицировать соединение 62 как 6'-0-ванилоил-Р-£>-глкжопираноза

Фрагмент 62 ранее детектировался в различных соединениях, таких как глехлинозиды из Glehnia littoralis (Euphorbiaceae) (Yuan et al., 2002), 6'-O-ванилоил-сахароза из Saccharum officinarum (Poaceae) (Takara et al., 2002), 6'-O-ванилоил-икаризид B5 из Baccaurea ramiflora (Euphorbiaceae) (Yang et al., 2010), амбурозид G из Amburana cearensis (Fabaceae) (Canuto et al., 2010), сахарумозиды из Acer saccharum (Aceraceae) (Yuan et al., 2011) и Г-0-галлоил-б'-О-ванилонл-Р-О-глюкопираноза из Alchomea trewioides (Euphorbiaceae) (Quin et al., 2011). В данном случае 62 впервые выделяется как отдельное соединение.

2.6. Орган-специфичное распределение фенолькых соединений в С officinalis. Согласно сведениям ВЭЖХ наибольшее содержание флавоноидов характерно для краевых (36.66 мг/г) и трубчатых цветков С. officinalis (23.57 мг/г), причем доминирующими в данных морфологических группах являлись производные изорамнетина - нарциссин, тифанеозид и изорамнетин-3-0-(6"-ацетил-)-р-£)-глюкопиранозид; содержание гликозидов кверцетина составило не более 15% от суммы флавоноидов (табл. 3).

Таблица 3. Содержание фенольных соединений в морфологических группах С. officinalis, мг/г"

Соединение0, группа соединений Морфологическая группа

краев, цветки трубч. цветки обвертки семена листья стебли корни

Кофейная кислота 0.09 0.49 0.09 сл. 0.42 0.05 0.31

З-О-Кофеилхинная кислота 1.34 6.91 0.89 2.11 8.46 0.23 0.28

4-О-Кофеилхинная кислота - 0.31 0.13 - 0.77 0.03 0.83

5-О-Кофеилхинная кислота сл. сл. 0.10 сл. сл. 0.05 1.36

1,3-ди-О-Кофеилхинная кислота сл. сл. - 0.16 . - 0.12

3,5-ди-О-Кофеилхинная кислота 0.54 1.78 0.45 0.82 сл. 0.01 0.22

4,5-ди-О-Кофеилхинная кислота 0.07 0.46 0.11 0.21 - 0.02 3.34

Мангаслин 1.22 0.29 - - - 0.11 .

Календофлавобиозид 0.90 0.35 - - 1.42 0.65 -

Рутин 2.28 0.34 - - - 0.10 -

Кверцетян-3-0-(2''-Ю1а-)-Ю1а сл. 0.46 - - сл. .

Изокверцитрии сл. 0.24 - - 3.28 0.45 -

Кверцетин-3-СЦ6"-ацетш1)-01с 0.63 1.04 - - 3.04 0.11 -

Тифанеозид 8.95 7.85 0.06 сл. - 0.13 -

Кален дофл авозид 1.29 1.63 - 0.19

Нарциссин 14.62 4.53 - - ■ 0.05 -

Календофлазид 0.43 0.61 - . - -

Изорамнетин-З-О-Ис 1.71 2.14 - - 0.38 0.16 -

Изорамнет1Ш-3-0-(й"-апетнл}-01с 4.63 4.09 - - 1.04 0.04 -

Идентифицировано, в том числе 38.70 33.52 1.83 3.30 18.81 2.38 6.46

фенилпропаноиды 2.04 9.95 1.77 3.30 9.65 0.39 6.46

флавоноиды, в том числе 36.66 23.57 0.06 сл. 9.16 1.99 -

производные кверцетина 5.03 2.72 - - 7.74 1.42 -

производные изорамнетина 31.63 20.85 0.06 сл. 1.42 0.57 -

а сорт Big Orange; GIc - глюкоза, Rha - рамноза.

Для обверток и семян отмечены следовые концентрации флавоноидов. В составе флавоноидов листьев и стеблей преобладали дериваты кверцетина -

изокв ер цитрин, кверцетин-3-0-(2"-ацетил-)-р-£>-глюкопиранозид и

календофлавобиозид. В корнях присутствие данной группы соединений не выявлено. Фенилпропаноиды, представленные свободной кофейной кислотой, а также моно- и дикофеилхинными кислотами, обнаружены во всех морфологических группах. Особенностью надземных органов являлось доминирование монокофеилхинных кислот (1.34—9.23 мг/г) и 3 -О-кофеилхинной кислоты в качестве основного соединения (0.23-8.46 мг/г). В корнях выявлена высокая концентрация дикофеилхинных кислот (3.68 мг/г); доминирующий компонент - 4,5-ди-О-кофеилхинная кислота (3.34 мг/г).

2.7. Фенольные соединения пыльцы С officinalis. В результате химического исследования пыльцы С. officinalis было выделено 14 соединений, 13 из которых идентифицированы как 4-0-, З-О-кофеилхинные кислоты, кофейная кислота, мангаслин, календофлавобиозид, тифанеозид, рутин, изокверцитрин, календофлавозид, нарциссин, изорамнетин-3 -О-глюкозид, 4,5-ди-О-кофеилхинная кислота, изорамнетин-3-0-(6"-ацетил)-глюкозид и одно соединение (63), ранее не выявленное в С. officinalis.

2.8. 1,5-Ди-О-ферулоилхинная кислота из пыльцы С officinalis. Соединению 63 согласно данным HR-ESI-MS соответствует формула С27Н28О12 {m!z 567.411 ([M+Na]+; расч. 567.442)}. Характер УФ-спектра соединения указывает на его принадлежность к группе фенилпропаноидов, образованных феруловой/изоферуловой кислотои (Хдих, нмг 212 пл., 225, 297, 310). В спектрах ESI-MS/MS, снятых в негативном режиме, присутствуют пики молекулярного иона с mlz 544 [М-Н]", а также характеристический фрагмент остатка феруловой кислоты с mlz 193. Окончательная идентификация ацильного остатка была проведена после анализа продуктов щелочного гидролиза, в составе которых были обнаружены феруловая и хинная кислоты. Полученные сведения позволяют установить, что соединение 63 представляет собой ди-О-ферулоилхинную кислоту.

В !Н-ЯМР спектре 63 присутствует 4 дуплета с величинами константы взаимодействия J = 16.1 Гц, обусловленных влиянием транс-олефиновых протонов Н-77Н-8' и Н-7'7Н-8" ("табл. 4). В области ароматических протонов наблюдаются сигналы от двух ароматических систем с 1,3,4-типом замещения (АВХ-тип): 7.10 (1Н, д, J= 1.9), 6.82 (1Н, д, J= 8.0), 7.05 м.д. (1Н, дц, /= 8.0, 1.9) и 7.14 (1Н, д,J = 1.9), 6.78 (1Н, д, J = 8.0), 7.00 м.д. (1Н, дд, / = 8.0, 1.9). Слабопольные сдвиги сигналов С-3' и С-3" (147.2 и 146.8 м.д.) в 13С-ЯМР спектре в сравнении с таковым 1,5-ди-О-кофеилхинной кислоты (147.0 и 146.6 м.д.) обусловлены влиянием метоксильной группы. Наличие корреляций в спектре НМВС между протонами метоксильных групп (3.88 и 3.86 м.д.) и атомами С-3' и С-3" (147.2 и 146.8 м.д., соответственно) подтверждает строение ацильных заместителей в виде остатков феруловой кислоты.

На присутствие хинной кислоты в 63 указывают характеристические сигналы в 13С-ЯМР спектре от трех оксиметиновых (69.7, 70.6, 72.8 м.д.) и двух метиленовых группировок (34.5, 35.4 м.д.), одного окисленного четвертичного углерода (80.9м.д.) и одной карбоксильной группы (174.7 м.д.), а также сигналы

в "Н-ЯМР спектре от трех оксиметиновых протонов (3.75, 4.27, 5.35 м.д.) и двух пар метиленовых протонов (Н2-2 и Н2-6). Сравнительный анализ 1 С-ЯМР спектров незамещенной хинной кислоты и 63 выявил наличие смещения сигналов С-1 и С-5 в слабое поле (75.4—+80.9 м.д. и 67.4—>70.6 м.д.), что характерно для 1,5-ацилхинных кислот и указывает на наличие замещения по данным положениям.

С-атом ОЕРТ 4 *

Хинная кислота

1 С 80.3

2 сн2 2.35-2.40 (2Н, м) 34.4

3 сн 4.24 (1Н, дад, 7 = 4.4,4.0,3.1) 69.4

4 сн 3.70(1Н,ЛУ-8.1, 3.3) 72.6

5 сн 5.35 (1Н, ддд, 3 = 9.0, 8.1, 3.9) 70.3

6 сн2 2.46 (1а м, НД 2.01 (1Н, д, 3 = 14.0, 8.9, Нв) 35.1

соон с 174.5

1-О-ферулоил

Г с 127.5

Т сн 7.02(1Н, д,7= 1.9) 109.7

У с 147.2

4' с 148.4

5' сн 6.92 (1Н, д,3= 8.0) 114.3

6' сн 7.10 (1Н,да,.7 = 8.0, 1.9) 122.7

Г сн 7.64 (1Н,д, 16.1) 144.0

8' сн 6.25 (1Н, д,16.1) 115.4

9' с 168.9

ОСН3 сн, 3.88 (ЗН, с) 55.9

5-О-ферулоил

1" с 127.3

2" сн 7.00 (1Н,д,^= 1.9) 109.4

3" с 146.8

4" с 148.0

5" сн 6.87 (1Н,д, .7=8.0) 113.7

6" сн 7.05 (Щ дд, 7=8.0, 1.9) 122.1

7" сн 7.52(1Н,дУ=16.1) 143.5

8" сн 6.22(1Н,д,У= 16.1) 114.9

9" с 167.1

ОСН3 СНз 3.86 (За с) 55.4

, 5, м.д., .Г/Гц)

Следует отметить, что, несмотря на близкие значения химических сдвигов сигналов протонов Н-3 и Н-5 хинной кислоты, положение второго ферулоильного остатка у С-5 доказывается сильным смещением сигнала Н-5 в слабое поле (4.10—>5.35 м.д.), а также существованием корреляций в спектре НМВС между сигналом протона Н-5 (5.35 м.д.) и сигналом углерода С-9" (167.9 м.д.).

Таким образом, проведенные исследования показали, что соединение 63 представляет собой 1,5-ди-0-ферулоилхинную кислоту (пне. 31. которая ранее была получена только синтетическим путем; сведений об обнаружении данного соединения в

растительных видах нами не обнаружено. Другие ди-замещенные конъюгаты

нсюсу^^рон

У"осн3 « он

Рис.3.

1,5-Ди-О-ферулоилхшшая кислота (63).

н3с<

феруловой и хинной кислот (di-O-FQA) ранее были выделены из Brachiaria ruziziensis Germ. & C.M.Evrard и В. decumbens Stapf (Poaceae) - 3,4-, 1,3-di-O-FQA (Wenzl et al., 2000), Coffea arbica L. (Rubiaceae) - 3,4-di-O-FQA (De Paulis et al., 2002), Scorzonera divaricata Turcz. (Asteraceae) - 3,5-di-O-FQA (Yang et al., 2013), Aster ageratoides Turcz. к Artemisia annua L. (Asteraceae) - 3,4-, 3,5- и 4,5-di-O-FQA (Clifford et al., 2006; Carbonara et al., 2012).

Согласно данным количественного анализа (ВЭЖХ) доминирующими соединениями пыльцы С. officinalis являются 1,5-ди-О-ферулоилхинная кислота (2.57-2.68%) и изорамнетин-3-0-(6"-ацетил)-глюкозид (1.86-1.94%). Суммарное содержание флавоноидов составило 3.23-3.51%, фенилпропаноидов - 2.86-3.09%. В составе флавоноидов преобладают производные изорамнетина, фенилпропаноидов - производные феруловой кислоты.

Глава 3. ПРИМЕНЕНИЕ МИКРОКОЛОНОЧНОЙ ВЭЖХ И ТВЕРДОФАЗНОЙ ЭКСТРАКЦИИ / СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА С. officinalis

3.1. Количественный анализ фенольных соединений в С. officinalis методом микроколоночной ВЭЖХ-УФ. Разработана методика количественного анализа 14 фенольных соединений методом микроколоночной обращенно-фазовой ВЭЖХ с двухволновым детектированием (330 и 360 нм) с применением колонки ProntoSIL-120-5-C18 (2x75 мм) и градиентной элюентной системы, включающей мицелярную подвижную фазу [0.2 М LiCKIU в 0.006 М НСЮ4 - 0.01 М додецилсульфат натрия в воде (1:1)] и ацетонитрил. Методика была применена для анализа С. officinalis и некоторых препаратов (настойка, экстракты, жидкий и сухой настой, отвар) (рис. 4).

Рис. 4. Хроматограммы (МК-ВЭЖХ) коммерческих препаратов С. officinalis.

а - настойка, б - экстракт жидкий, в - экстракт сухой, г - отвар. Условия-, элюент А [0.2 М LiClCX, в 0.006 М НСЮ4 - 0.01 М SDS (1:1)] элюе!ггВ [MeCN]; режим элюирования: 11-18% В (0-5 мин), 18% В (5-9 мин), 18-20% В (9-10 мин), 20% В (10-16 мин), 100% (16-20 мин); v 150 мкл/мин; детектор 330 (пунктир) и 360 нм (линия). Числами обозначено положение соединений: 1 - 4-CQA, 2 - 3-CQA, 3 - СА, 4 -О-З-СЮш^ХИс, 5 - Q-3-(Rha2)Glc, 6 - Ir-3-(Rha^Xrlc, 7 - Q-3-(Rha6)Glc, 8 - Q-3-Glc, 9 - Ir-3-(RhaJ)Glc, 10 - 1,3-dCQA, 11 - Ir-3-(Rba6)Glc, 12 - Ir-3-Glc, 12 - 4,5-dCQA, 13 - Ir-3-(Ac6)Glc.

К числу наиболее обогащенных лекарственных форм относятся сухой и жидкий экстракты, содержащие 5.59 и 0.45% фенольных соединений, соответственно, в т.ч. флавоноидов / фенилпропаноидов — 3.39/1.39 и 0.32/0.12%, соответственно. Настойки, настои и отвары представляют собой лекарственные формы, полученные по малоэкстенсивной технологии, что отражается на качестве готового продукта. Так, суммарное содержание

флавоноидов в изученных партиях настоек не превышало 0.06%, что почти в 5.5 раз меньше такового в жидком экстракте и более чем в 70 раз меньше, чем в сухом экстракте. Следует отметить, что ранние сведения о количественном содержании флавоноидов в препарате "Настойка календулы" около 0.2-0.3%, завышены. Одной из вероятных причин является то, что метод, используемый для анализа (дифференциальная спектрофотометрия), не позволяет проводить селективное определение группы флавоноидов.

Сравнительный анализ количественных показателей настоек и водных галеновых форм (настои и отвары) из цветков С. officinalis показал, что последние не уступают, а в ряде случаев превосходят по качеству спиртовые формы. Например, содержание флавоноидов / фенилпропаноидов в галеновых формах составило 0.05-0.06/0.02-0.03%, соответственно, что близко к таковым показателям настоек (0.04-0.06/0.01-0.03%, соответственно). Полученные результаты свидетельствуют о возможности проведения адекватной замены настоек отварами или настоями, при неосуществимости применения последних (детский возраст, аллергия на этанол и др.).

3.2. Применение ТФЭ-СФМ для одновременного анализа флавоноидов и фенилпропаноидов в С. officinalis. Количественный анализ действующих веществ с применением метода ВЭЖХ обоснован в ходе производства готового продукта. Вместе с тем для экспресс-анализа сырья было бы уместно применение более доступных методов анализа, таких как спектрофотометрия. Нами рассмотрена возможность создания удобного метода, позволяющего проводить правильное определение количественных показателей для данного вида растительного сырья. В качестве альтернативного подхода для решения данной проблемы предлагается известный методический подход, объединяющий сорбционный метод разделения классов фенольных соединений, в качестве которого выбрана твердофазная экстракция на полиамидном патроне, и спектрофотометрический метод детектирования, объединенные под общим названием твердофазная экстракции / спектрофотометрия (ТФЭ/СФМ) (рис. 5).

Рис. 5. а. Спектры поглощения элюатов после ТФЭ (1-3) и растворов веществ сравнения (4, 5). Элюент: 1 - вода, 2-95% этанол, 3 - 0.5% раствор NH3 в 95% этаноле. Соединения: 4 - нарциссин, 5 - 3-О-кофгилхшшая кислота, б. Хроматограммы (ВЭЖХ) спиртового извлечения из цветков С. officinalis (I) и элюатов после ТФЭ (П - 95% этанол, Ш - 0.5% раствор NH3 в 95% этаноле).

Дополнение к рис. 5. Числами обозначено положение соединений: 1 - Q-3-(Rhai,6)01o, 2 - Q-3-(Rha*)GIc, 3 - Ir-3-(Rha1,6)Glc, 4 - Q-3-<Rha6)Glc, 5 - Q-3-Glc, 6 - 1г-3-(Ш1аг)0!с, 7 - Ir-S-CRha^Glo, 8 - Ir-3-Gic, 9 - Ir-3-(Acs)GIc, 10 - 3-CQA, 11 - CA, 12 - 3,5-dCQA, 13 - 1,3-dCQA, 14 - 4,5-dCQA

Общая процедура ТФЭ заключается в нанесении пробы на полиамидный патрон, предварительно прекондиционированный этанолом и водой, и последующей элюцией фракций последовательно водой, 95% этанолом и 0.5% раствором NH3 в 95% этаноле. Вода позволяет удалить несорбируемые компоненты, такие как углеводы, аминокислоты и другие водорастворимые компоненты, ухудшающие качество последующего анализа. В результате элюции 95% этанолом и 0.5% раствором NH3 в 95% этаноле можно получить фракции, содержащие флавоноиды (агликоны и гликозиды) и фенилпропаноиды, соответственно.

Данные анализа элюатов свидетельствуют о количественном определении групп флавоноидов и фенилпропаноидов. Ошибка определения в сравнении с методом ВЭЖХ составила для флавоноидов -0.76 - +2.03%, фенилпропаноидов - -0.34 - +1.45%, что свидетельствует об удовлетворительной правильности метода

Глава 4. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СТАНДАРТИЗАЦИИ СЫРЬЯ "НОГОТКОВ ЦВЕТКИ" И "КАЛЕНДУЛЫ ТРАВА"

4.1. Обоснование выбора маркерных групп соединений для стандартизации сырья С. officinalis. Растительное сырье является сложной системой (фитоматрицей), содержащей различные группы соединений. Проблема выбора маркерных групп для стандартизации растительного сырья заключается в адекватном выборе веществ, аналитический контроль которых позволит правильно охарактеризовать фитоматрицу. Особенно сложен выбор в случаях с растительным сырьем, для которого не наблюдается накопления одной группы действующих веществ.

Согласно сведениям литературы в число основных групп биологически активных соединений С. officinalis следует отнести 6 классов веществ, в т.ч. эфирные масла, тритерпеноиды, каротиноиды, фенольные соединения, алифатические соединения и полисахариды. Для определения маркерных групп соединений необходимо проведение многофакторного анализа имеющейся информации, включающей данные о количественном содержании, биологической активности и возможности аналитического контроля. В этой связи нами разработана схема выбора маркерных групп, пригодных для целей стандартизации: (1) Выбор диапазона маркерных групп соединений —> (2) Определение «носителей» биологической активности суммарных препаратов из исследуемого вида —* (3) Определение количественного содержания действующих групп соединений —> (4) Определение стабильности действующих групп соединений —» (5) Определение возможности применения доступных аналитических методов. Последовательность выбора маркерных групп для проведения стандартизации С. officinalis представлена на рис. 6. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в раздел "Подлинность"

рекомендуется включение анализа методами ВЭТСХ и ВЭЖХ для выявления присутствия тритерпеноидов и фенольных соединений, соответственно. Количественное определение предлагается проводить для группы фенольных соединений.

Calendula ojjieinalis

1. Спектр соединений

т

эфирное

т г тритерпеноиды

масло

2.1. Носителя активности

фенолъные соединения

I

полисахариды

каротиноиды

алифатические соединения

нет да

х <

2.2. Спектр активности

Да

V

да

V

нет х

широкий широкий

V <

3.1. Количественное содержание_

5-8% 1-5%

< V

3.2. Возможность анализа

да л/

4. Стабильность

Да ч/

узкий

стабильны

стабильны

V

5.1. Метод количественного анализа

1

труднодоступный

X

5.2. Метод качественного анализа

доступный

доступный л/

1

доступный

"Количественные показатели": содержание флавоновдов и феннлпропаноидов

"Подлинность": ВЭТСХ - тритерпеноиды ВЭЖХ - гликознды изорамнетнна

Рис. 6. Схема выбора маркерных групп соединений для стандартизации сырья С. officinalis.

В результате проведенных исследований пересмотрены некоторые разделы ФС "Ноготков цветки" (ГФ XI изд., ФС №5) и выявлены недостатки, требующие внесения корректив. Предложена новая редакция разделов "Подлинность" и "Количественное определение". В раздел "Подлинность" предлагается включение метода высокоэффективной тонкослойной хроматографии и метод микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения гликозидов изорамнетнна Предлагается включение раздела "Количественное определение", отсутствующего ранее, и рекомендуется методика определения суммарного содержания флавоновдов и феннлпропаноидов методом твердофазной экстракции / спектрофотометрии. Рекомендуемые показатели содержания действующих групп соединений: флавоноиды - не менее 1.2%, фенилпропаноиды - не менее 0.2%. Пересмотрены некоторые разделы ТУ "Календулы трава" (ТУ 9375-090-

04868244-98) и выявлены недостатки, требующие внесения корректив. Предложена новая редакция разделов "Подлинность" и "Количественное определение". Предлагается включение раздела "Подлинность", в т.ч. метода высокоэффективной тонкослойной хроматографии для определения тритерпеновых гликозидов и метода микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения гликозидов кверцетина. В раздел "Количественное определение" предлагается включение методики определения суммарного содержания флавоноидов и фенилпропаноидов методом твердофазной экстракции / спектрофотометрии. Рекомендуемые показатели содержания действующих групп соединений: флавоноиды - не менее 0.5%, фенилпропаноиды - не менее 0.5%.

Глава 5. ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ НА НАКОПЛЕНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В С. officinalis В ОТКРЫТОМ ГРУНТЕ

5.1. Влияние уровней минерального питания на накопление фенольных соединений. С. officinalis входит в десятку самых популярных лекарственных растений, возделываемых в Европе, и занимает второе место по площади выращивания. Однако интродукция данного вида в условиях Центрального Забайкалья до сих пор не была проведена Экспериментальная работа была выполнена в 3 районах Центрального Забайкалья - Мухоршибирском, Заиграевском и пригороде г. Улан-Удэ. Были изучены четыре уровня минерального питания в присутствии органического удобрения (30 т/га): без минеральных удобрений; низкий уровень (N30P60K30); средний уровень (NioPsoKio); высокий (N90P120К90).

В результате установлено, что применение указанных комбинаций минерального и органического удобрений приводило к повышению содержания фенольных соединений в сырье, однако наибольшее стимулирующее влияние на синтез флавоноидов и фенилпропаноидов оказывало совместное введение ЫбоРдаКго и органического удобрения, повышавших концентрацию данных классов соединений в среднем на 8.7 и 11.4 % соответственно (табл. 5).

Таблица 5. Химический состав цветков С. officinalis, выращенных при разных уровнях минерального питания, мг/г__

Группа соединений Уровень минерального питания

Без минеральных удобрений Низкий уровень, NmP«,K,„ Средний уровень, >J«P»k«, Высокий уровень, N90P1.0K90

'Big Orange'

Флавоноиды Фенилпропаноиды 26.79±0.41 2.26±0.04 26.95±0.49 2.39*0.04 29.03±0.52 2.51±0.05 28.б1±0.51 2.47±0.04

'Radio'

Флавоноиды Фенилпропаноиды 25.18±0.43 1.77±0.03 2б.03±0.44 1.85±0.04 27.51±0.55 1.98±0.03 26.93±0.54 1.90±0.04

'Indian Prince'

Флавоноиды Фенилпропаноиды 25.53±0.4б 1.Х7±0.03 26.02±0.47 1.93±0.03 27.75±0.47 2.08±0.04 27.09±0.49 2.05±0.03

5.2. Влияние предпосевной обработки семян на накопление фенольных соединений. Проведенные исследования показали, что количественное содержание фенольных соединений изменяется незначительно, что

свидетельствует о нецелесообразности использования данной процедуры в процессе культивирования.

5J, Влияние постпосевной обработки сеянцев микроэлементами на накопление фенольных соединений в открытом грунте. Параллельно с экспериментом по предпосевной обработке семян С. officinalis проводилось изучение влияния внесения в почву микроэлементов в фазу бутонизации С. officinalis. В результате химического изучения образцов сырья было выявлено, что содержание флавоноидов изменяется незначительно, в отличие от фенилпропаноидов, концентрация которых может повышаться в 4-5 раз в сравнении с контролем (табл. 6V

Таблица 6. Содержание фенольных соединений в цветках С. officinalis при постпосевной обработке растворами микроэлементов, мг/г_____

Элемент Флаводовды Фегшшропаноиды Суммарное содержание

Al 25.55±0.46 6.14±0.12 31.69

В 27.0Ш.51 8.37±0.15 35.38

Ва 25.11±0.43 5.01±0.10 30.12

Cd 2б.45±0.50 5.26±0.08 31.71

Со 28.32±0.48 11.21±0.18 39.53

Сг 26.97±0.39 5.59±0.11 32.56

Си 27,02±0.41 б.04±0.09 33.06

Fe 26.59±0.40 5.03±0.09 31.62

Mg 26.34±0.53 4.09±0.08 30.43

Mn 26.23±0.42 4.98±0.07 31.21

Mo 26.01±0.52 4.29±0.07 30.30

Zn 26.69±0.47 5.18±0.09 31.87

Контроль 26.03±0.49 2.79±0.04 28.82

Особенно выраженное изменение наблюдается для групп растений, обработанных соединениями Со, В, Си и Сг. Данные по содержанию указанных элементов в сырье после обработки свидетельствуют о том, что доя С. officinalis характерна гиперконцентрация Со и В (превышение показателя адекватного суточного применения в 5-14 и 3-5 раз, соответственно), чего не наблюдается для Си и Сг. В этой связи микроэлементные добавки с Си и Сг могут бьггь рекомендованы для улучшения качества сырья.

Глава 6. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Образцы семян С. officinalis (сорта 'Big Orange', 'Egypt Sun', 'Flame Dancer', 'Geisha Girl', 'Indian Prince', 'Radio', 'Red Black Centered', 'Dragon', 'Golden Prince', 'Lemon Juice') были получены из Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН (Москва, Россия). ВЭТСХ проводили на пластинах с силикагелем Сорбфил ГГГСХ-АФ и ПТСХ-АФ-В (Имид Ltd.), препаративную ТСХ - на пластинах с силикагелем (Имид Ltd.), КХ - на силикагеле 100/400 (Woelm), полиамиде (Sigma), гель-хроматографию - на Sephadex LH-20 (Farmacia), Sephacryl 300-HR (Sigma-Aldrich). Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре СФ-2000 (ОКБ Спектр). Оптическое вращение определяли на поляриметре СМ-3 (Загорский оптико-

механический завод). ИК-спектры регистрировали на ИК-Фурье спектрометре ФТ-801 (Симекс). ГХ-МС анализ проводили на хромато-масс-спектрометре 6890N, соединенным с масс-квадрупольным детектором 5973N с использованием капиллярной колоноки HP-Innowax (Agilent Technologies; 30 мхО.25 ммхО.50 мкм; неподвижная фаза - полиэтиленгликоль). МС-анапиз проводили на масс-спектрометре высокого разрешения МАТ 8200 (Finnigan). Спектры 'Н- и 13С-ЯМР регистрировали на ЯМР-спектрометре VXR 500S (Varian). ВЭЖХ проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе Милихром А-02 (Эконова). Элементный состав определяли на масс-спектрометре с индуктивно связанной плазмой Elan-DRC П (Perkin-EImer). Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ Statistica MS Excel.

ВЫВОДЫ

1. В результате химических исследований С. officinalis, культивируемой в Бурятии, было выделено и идентифицировано 62 соединения, из которых 33 -впервые обнаружены в данном виде, а три являются новыми природными соединениями. Из цветков С. officinalis выделено 2 новых флавоноида -гликозида изорамнетина, в т.ч. календизид I [= изорамнетин-3-0-(2"-ацетил-)-р-D-глюкопиранозид] и календизид П [изорамнетин-3-0-(2", 6"-диацетил-)-Р-£>-глюкопиранозид]. Из листьев С. officinalis выделен новый гликозид ванилиновой кислоты - 6'-0-ванилоил-р-£>-глюкопираноза. Впервые для С. officinalis установлено присутствие антоцианов, в составе которых выявлено 8 соединений гликозидной природы, производных цианидина, дельфинидина, мальвидина, пеонидина, пеларгонидина и петунидина. В ходе исследования орган-специфичного распределения фенольных соединений в С. officinalis выявлено, что каждый орган характеризуется специфическим химическим профилем. Впервые изучен состав фенольных соединений пыльцы С. officinalis, и выявлено, что он близок к таковому краевых цветков, однако отличается наличием уникального соединения - 1,5-ди-£?-ферулоилхинной кислоты, ранее полученной синтетическим путем и впервые выделенной из природного объекта

2. Впервые показана возможность разделения фенольных соединений с применением микроколоночной обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (МК-ВЭЖХ) с использованием мицеллярных подвижных фаз. Разработана новая методика количественного анализа 14 соединений (5 фенилпропаноидов и 9 флавоноидов) в С. officinalis методом мицеллярной МК-ВЭЖХ с применением колонки ProntoSIL-120-5-C18 (2x75 мм) и градиентной элюентной системы [0.2 М LiC104 в 0.006 М НС104 - 0.01 М додецилсульфат натрия в воде (1:1)]-ацетонитрил. В ходе ревизионного исследования существующих спектрофотометрических методов анализа С. officinalis выявлена их несостоятельность и невозможность получения адекватных результатов. Разработана новая методика количественного анализа суммарного содержания флавоноидов и фенилпропаноидов в С. officinalis с

применением комбинированного метода твердофазной экстракции / спектрофотометрии. Разработанные методики были применены для анализа сырья С. officinalis и некоторых препаратов (настойка, экстракты, жидкий и сухой настой, отвар). Валидационные исследования показали, что разработанные методики соответствует критериям приемлемости и могут быть использованы для аналитических целей.

3. Разработана унифицированная схема выбора маркерных групп соединений для стандартизации растительного сырья. На примере С. officinalis показана перспективность ее применения для решения сложных задач аналитической фитофармации. Пересмотрены некоторые разделы ФС "Ноготков цветки" и "Календулы трава" и выявлены недостатки, требующие внесения корректив. Предложена новая редакция разделов "Подлинность" и "Количественное определение". Рекомендуемые показатели содержания действующих групп соединений: ФС "Ноготков цветки" флавоноиды - не менее 1.2%, фенилпропаноиды - не менее 0.2%; ФС "Календулы трава" флавоноиды - не менее 0.5%, фенилпропаноиды - не менее 0.5%.

4. Применение комбинаций минерального и органического удобрений приводит к повышению содержания фенольных соединений в сырье, однако наибольшее стимулирующее влияние на синтез флавоноидов и фенилпропаноидов оказывало совместное введение NeoPgoK^o и органического удобрения, повышавших концентрацию данных классов соединений в среднем на 8.7 и 11.4 % соответственно. В качестве оптимального уровня рекомендуется сочетанное применение минерального (NeoP^Iv») и органического удобрений (30 т/га) для получения лекарственного сырья с повышенным содержанием фенольных соединений. Выявлена неэффективность предпосевной обработки семян С. officinalis, не приводящей к увеличению продуктивности и не приводящей к изменениям в химическом составе сырья. Применение постпосевной обработки сеянцев С. officinalis растворами микроэлементов приводит к изменениям в химическом составе сырья, заключающимся в возрастании содержания фенилпропаноидов в 4-5 раза. Выраженных изменений в продуктивности не отмечено.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кащенко. Н.И. Фенольные соединения и полисахариды соцветий Calendula officinalis / Н.И. Кащенко, Л.М. Танхаева, Д.Н. Олейников // "Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья": V Всероссийск. конф. с международн. участ., Барнаул, 24-26 апреля 2012 г. -С. 262-263.

2. Kashchenko. N.I. Phenolic compounds of Calendula officinalis flowers cultivated in Buryatia / N.I. Kashchenko, D.N. Olennikov // "Traditional Medicine: Ways of Integration with Modern Health Care": Vi* Int. Sei. Conf., Ulan-Ude, August, 15-17, 2013.-P. 33-34.

3. Кащенко, Н.И. Антихолинэстеразная активность фенольных соединений Calendula officinalis, Tagetes erecta и Т. patula / Н.И. Кащенко, Д.Н.

Олейников // "Химия и технология растительных веществ": VIII Всероссийск. научн. конф., Калининград, 7-10 октября 2013 г. - С. 105.

4. Olennikov, D.N. New isorhamnetin glucosides and other phenolic compounds from Calendula officinalis / D.N. Olennikov, N.I. Kashchenko // Chemistry of Natural Compounds. - 2013. - Vol. 49. - No 5. - P. 717-729.

5. Kashchenko. N.I. New rhamnoglucosides of quercetin and isorhamnetin from Calendula officinalis flowers / N.L Kashchenko, D.N. Olennikov // "Chemistry of Natural Compounds": Xth Int. Symp., Bukhara, November, 21-23, 2013. -P. 366.

6. Кашенко. Н.И. Количественный анализ фенольных соединений в цветках календулы лекарственной (Calendula officinalis L.) методом микроколоночной ВЭЖХ / Н.И. Кащенко, Д.Н. Олейников // Бутлеровские сообщения. - 2013. - Т. 36. - № и. - С. 66-74.

7. Olennikov, D.N. Componential profile and amylase inhibiting activity of phenolic compounds from Calendula officinalis L. leaves / D.N. Olennikov, N.I. Kashchenko // The Scientific World Journal. - 2014. - Vol. 2014. - art. ID 654193.

8. Кашенко. Н.И. Спектр ©фотометрический анализ фенольных соединений календулы лекарственной ОCalendula officinalis L.). Ревизионное исследование существующих методов / Н.И. Кащенко, Д.Н. Олейников // Бутлеровские сообщения.-2014. - Т. 37.-№ 1.-С. 146-155.

Автор выражает глубокую признательность за помощь при выполнении работы д.фарм.н., проф. Т.А. Асеевой, к.фарм.н. Г. В. Чехировой, к.фарм.н. Т.М. Шишмаревой, к.б.н. В.М. Шишмареву (ИОЭБ СО РАН, Улан-Удэ), к.фарм.н. Н.К Чириковой (ЯГУ, Якутск). Особую благодарность автор выражает к.фарм.н. Л.М. Танхаевой (ИОЭБ СО РАН, Улан-Удэ) за постоянную поддержку, ценные советы и помощь в выполнении диссертационной работы.

Список сокращений и аббревиатур: вэтсх - высокоэффективная тонкослойная хроматография, ДМСО - диметилсульфоксид, ИК - инфракрасный, КХ - колоночная хроматография, МК-ВЭЖХ - микроколоночная высокоэффективная жидкостная хроматография, ОФ-ЭЮг -обращено-фазовый силикагель, СФМ - спектрофотометрия, ТСХ - тонкослойная хроматография, ТФЭ - твердофазная экстракция, УФ - ультрафиолетовый, ЯМР - ядерный магнитный резонанс, Ас -ацетил, С1с - глюкоза, МеСН - ацетонитрил, С> - кверцегин, Ши - рамноза, БОЭ - натрия додецилсульфат; фенилпропаноиды: 3-С<2А - 3-0-кофеилхинная кислота, 4-СС>А - 4-О-кофеилхинная кислота, 5-С(}А - 5-О-кофеилхинная кислота, 1,5ч1С<ЗА - 1,5-да-О-кофеилхинкая кислота, 3,5-<1СС}А - 3,5-ди-(3-кофеилхинная кислота, 4,5ч1СС>А - 4,5-ди-О-кофеилхинная кислота, СА - кофейная кислота, К^А - ферулоктхинная кислота; производные кверцетина'. <3 - кверцетин, О-З-Яс -кверцетин-З-О-глюкозид (изокверщприн), О-З-КЬа - кверцешн-З-О-рамнозид (кверцщрин), 0-3-(Ас6)С1с - кверцетшг-3-0-(б"-ацетил)глюкоз11д, 0-3-(Ш1а2)О1с - кверцетга1-3-0-(2"-рамнозил)глюкозид (календофлавобиозид), О-З-СМш'ХИс - кверцеткн-3-0-(6"-рам10зил)глюкозид (рутин), 0-3-(11Ьа2)КЬа - кверцетин-3-ОЧ2"-рамнозил)рамнозид, 0-3-(К1а2,б)О1с - кверцетин-3-0-(ди-2",б"-рамнозил)глюкозид (мангаслин); производные изорамнетина: 1г - изорамнетин, 1г-3-01с -изорамнетин-З-О-глюкозид, 1г-3-(Ас6Х31с - изорамнетин-3-0-(6"-аце1ял)глюкозид, 1г-3-(Ш1а2)01с -изорамнеттт-3-0-<2"-рамнозил)глюкозид (календофлавозкд), 1г-3-(КЬаб)01с - изо-рамнетин-3-0-(6"-рамнозил)глюкозид (нарциссин), 1г-3-(ЯЬа2)КЬа - изорамнетин-3-0-(2"-рамнозил)рамнозид (календофлазид), 1г-3-(ЯЬа2'6)01с - изорамнетин-3-0-(ди-2",6"-рамнозил)-глюкозид (тафанеозид).

Подписано в печать 15.04.2014 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Объем 1,4 печ. л. Тираж 100. Заказ № 16.

Отпечатано в типографии Изд-ва БНЦ СО РАН 670047 г. Улан-Удэ ул. Сахьяновой, 6.