Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармакогностическое изучение эхинацеи пурпурной, культивируемой в условиях Ставропольского края, и разработка на ее основе новых лекарственных средств

на правах рукописи

ЧЕЛОВА ЛАРИСА ВЛАДИМИРОВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭХИНАЦЕИ ПУРПУРНОЙ, КУЛЬТИВИРУЕМОЙ В УСЛОВИЯХ СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ И РАЗРАБОТКА НА ЕЁ ОСНОВЕ НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

15.00.02. фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Пятигорск- 2004

Диссертационная работа выполнена в Пятигорской государственной фармацевтической академии.

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук, профессор Денисенко Олег Николаевич

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор Муравьева Дарья Алексеевна Доктор медицинских наук, профессор Тюренков Иван Николаевич

Ведущая организация: Пермская государственная фармацевтическая академия.

Защита диссертации состоится "27" мая 2004 г. в 9 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.069.01 Пятигорской государственной фармацевтической академии (357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорской государственной фармацевтической академии.

Автореферат разослан «26» апреля 2004 г.

Учёный секретарь диссертационного комитета доктор фармацевтических наук, профессор

Актуальность проблемы. В настоящее время отмечается широкое распространение вторичных иммунодефицитов, приводящих к срывам в функционировании иммунной системы. Такие состояния нуждаются в имму-нокоррекции. Но, иногда, это трудно осуществимо из-за высокой ценовой стоимости препаратов и их возможных побочных эффектов. В этой связи актуальной проблемой является целенаправленный поиск лекарственных растений, обладающих иммуномодулирующим действием. Изучение химического состава и разработка оптимальных технологий получения на их основе доступных лечебных средств является не менее актуальной задачей современной фармацевтической науки. Известно, что биологически активные вещества, содержащиеся в растительном сырьё, по-разному влияют на иммунную систему. Некоторые из лекарственных растений, обладающие иммунотропным действием, оказывают стимулирующее влияние на иммунный статус, но большинство характеризуются как модуляторы.

Они могут быть использованы в практике иммуннореабилитации у лиц с вторичными иммуннодефицитными состояниями, в том числе в качестве терапии сопровождения химиотерапии инфекций, при онкологических и аутоиммунных заболеваниях.

К числу таких растений относятся представители рода Echinacea, которые издавна использовались в народной медицине.

Объектом наших исследований является Echinacea purpurea L. Moench семейства Asteraceae.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы явилось проведение комплексных фармакогностических, технологических и фармакологических исследований по введению в культуру E.purpurea в районе Кавказских Минеральных Вод (Ставропольский край), и разработка на её основе новых лекарственных средств.

В соответствии с целью были определены следующие задачи: 1. Провести интродукционные исследования E.purpurea в условиях ботанического сада Пятигорской государственной

2. Провести морфолого-анатомические исследования с целью установления основных диагностических признаков сырья и его стандартизации.

3. Изучить качественный и количественный состав основных биологически активных веществ надземной части культивируемого растения.

4. Разработать оптимальные условия производства экстракта из надземной части E.purpurea и сиропа на его основе.

5. Осуществить фармакологическую оценку предлагаемого лекарственного средства, определить эффективность его действия на клеточное и гуморальное звенья иммунной системы.

6. Разработать НД на тразу и сироп на основе экстракта из травы E.purpurea.

Научная новизна.

Впервые на основе интродукционных исследований показана возможность культуры E.purpurea в Ставропольском крае. Установлен качественный состав основных классов природных соединений культивируемого растения. Предложены критерии оценки качества и идентификации сырья по его основным морфологическим и анатомическим признакам. На основе разработанного экстракта концентрата из травы E.purpurea предложено оригинальное лекарственное средство - сироп "Иммунекс" с выраженным иммуномодули-рующим действием. Предложена методика количественного определения суммы оксикоричных кислот в пересчете на цикориевую кислоту в сиропе на основе экстракта концентрата из травы E.purpurea с использованием УФ-спектрофотометрии. Установлена специфическая фармакологическая активность сиропа "Иммунекс", подтвердившая правомерность его применения в качестве иммунотропного средства.

Практическая значимость. Результаты, полученные в процессе фар-макогностических, технологических, фармакологических исследований позволили показать возможность интродукции Е. purpurea в условиях Ставропольского края, разработать Фармакопейную статью на траву E.purpurea и предложить из нее лекарственную форму в виде сиропа на основе густого экстракта- "Иммунекс", обладающего иммунотропным действием.

Внедрение результатов исследования. На основании результатов исследований разработаны и внедрены в производство ОАО "АИ СИ ЭН Лек-средство" г. Курск технологическая инструкция, лабораторно-производствен-ный регламент и ФСП на экстракт и сироп из травы E.purpurea. Материалы на препарат "Иммунекс" - сироп из травы E.purpurea получили положительную оценку Фармакологического комитета, и направлены для дальнейших клинических испытаний (письмо 40001.5/2843 от 6.10.03 ОАО "АИ СИ ЭН Лек-средство"; акт сдачи-приёмки научно-технической продукции по договору №199 от 6 мая 1999г.).

Проект ФСП принят на экспертизу в Фармацевтический Государственный комитет (письмо № 425 от 17.12.2002 г.)

Апробация полученных результатов. Основные результаты исследований доложены на научных конференциях Пятигорской государственной фармацевтической академии (1998-2004 г.г.). Диссертационная работа доложена на межкафедральной < конференции Пятигорской государственной фармацевтической академии (Пятигорск, 2003г.)

По материалам диссертации опубликовано 10 работ. Основные положения, выносимые на защиту.

- Опыт введения в культуру E.purpurea в условиях Кавказских Минеральных Вод Ставропольского края.

- Данные по изучению химического состава биологически-активных веществ интродуцируемой E.purpurea.

- Обоснование условий получения сиропа на основе густого экстракта из травы E.purpurea.

Результаты исследования сиропа E.purpurea - "Иммунекс" в качестве им-мунотропного средства, характеризующегося стимулирующим эффектом на процессы фагоцитоза, а также на адаптационные резервы фагоцитов. Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтиче-

ской академии (номер государственной регистрации № 01200112164) в рамках проблемы "Фармация? секция № 38 Ученого совета МЗ РФ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 181 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 6 глав, отражающих собственные экспериментальные данные, списка литературы, включающего 212 источников (в том числе 111 иностранных авторов) и приложений; диссертация иллюстрирована 37 рисунками и 62 таблицами.

Основное содержание работы

1. Изучение возможности культуры E.purpurea

Объектом исследования явилась эхинацея пурпурная - Echinacea purpurea L. Moench семейства Asteraceae, многолетнее травянистое растение флоры Северной Америки. Исследования по интродукции E.purpurea в Ставропольском крае проводилось в условиях интродукционного питомника, созданного на территории ботанического сада ПятГФА Немаловажным является тот факт, что район интродукции E.purpurea находится на той же широте, что и типичный район произрастания этого растения. При разработке условий интродукции особое значение имеет семенная репродукция растения. В связи с этим нами проанализирована такая важная особенность, как массовость прорастания семян растения. Выявлено, что максимальный прирост ежедневной всхожести для изучаемого вида приходится в основном на 5 день от начала прорастания семян.

Статистический анализ показал, что средняя арифметическая времени прорастания семян E.purpurea — 5,13 дня. Установлено, что осенний посев более благоприятен, так как позволяет развиваться проросткам в условиях увлажненности и оптимального температурного режима. Выявлена высокая зимостойкость растений. При вегетативном размножении происходит увеличение числа особей в результате клонирования.

Снятие характеристик проводили во все фазы вегетационного процесса с каждого участка с 5 образцов растений.

В период с 1998 г. и по 2000 г. включительно, нами проводились фенологические наблюдения над тремя возрастными группами. Во всех случаях мы придерживались общепринятых методик.

Рисунок 1-Фенологические спектры развития растений в течение 3 лет

При этом фиксировали начало и окончание отдельных фаз развития, и проводили соответствующие замеры растений, характеризующие биологическую особенность каждого возрастного экземпляра.

Таблица 1 - Урожайность надземной части и семян E.purpurea по возрасту растений

Возраст растения Урожайность, ц/га Масса 1000 семянок, г. Всхожесть, % Энергия прорастания^

Травы Плодов

Однолетнее 24,5*0,7 ОД 1 ±0,01 4,26*0,17 87,6 68,3

Двулетнее 64,7±1,5 2,28*0,01 4,02*0,25 82,4 65,1

Трёхлетнее 72,4*1,7 3,05*0,01 3,91 ±0,22 79,8 62,4

В процессе интродукционных исследований нами изучалась урожайность культивируемых растений в зависимости от их возраста и фазы вегетации. Установлено, что наибольшая урожайность травы характерна для растений третьего года вегетации (табл. №1).

Известно, что одним из показателей иммунологической оценки растительного сырья является содержание в нем полисахаридов, оксикоричных кислот и фенольных соединений. Для установления оптимальных сроков заготовки сырья, мы определяли динамику накопления основных биологически активных веществ - полисахаридов, оксикоричных кислот в пересчёте на ци-кориевую кислоту и флавоноидов в надземных частях растений 1, 2 и 3 года

развитая в различные фазы вегетации. Максимальное содержание полисахаридов, флавоноидов и оксикоричных кислот в сырье характерно для растений второго года вегетации. Общая оценка сырьевой массы и содержания действующих веществ позволяет рекомендовать заготовку сырья на втором году развития растений в фазу цветения.

2. Морфолого-анатомнческая диагностика Е.ригригеа

Исследования с целью установления морфолого-анатомических диагностических признаков травы растения проводили с помощью общепринятых методик. Некоторые результаты представлены на рис 2-5.

Рисунок 2- Клетки нижней

эпидермы листа (в поляризованном свете)

Рисунок 3- Трихомы прикорневого листа

Рисунок 4- Млечники в мезофиле листа,

Рисунок 5- 4-клеточный волосок на язычковом

лепестке

сопровождающие жилку

Проведенные морфолого-анатомические исследования позволили установить, что диагностическое значение для идентификации сырья имеют:

Лист. Характерно дорсовентральное строение. Клетки эпидермы с слегка извилистыми почти прямыми боковыми стенками (верхняя эпидерма) и с глубоко извилистыми боковыми стенками (нижняя эпидерма), устьица овальные, почти круглые, окружены 2 (реже) или 4-6 околоустьичными клет-

ками (аномоцитный тип). Волоски четырех типов: четырехклеточные толстостенные по жилкам листа; двухклеточные грубобородавчатые щетинистые; простые одноклеточные; редко встречаются железистые волоски. При основании волосков клетки образуют розетку. Вдоль жилок листа видны млечники, содержимое которых, окрашивается раствором азотнокислого серебра в серый цвет.

Стебель. Характерно пучковое строение стебля. Наличие открытых коллатеральных проводящих пучков, ксилема которых представлена трахеи-дами и сосудами с лестничными, сетчатыми и спиральными утолщениями стенок.

Клетки эпидермы у язычковых цветков со слабоизвилистыми, почти прямыми боковыми стенками, устьица погруженные, аномоцитного типа (2 (реже) 4-6 околоустьичных клеток), остроконечные 2-3 клеточные грубобородавчатые волоски (по жилкам), железки, состоящие из 10-12 выделительных клеток, расположенных в 2 ряда и несколько ярусов.

Складчатость кутикулы на листочках обвертки; стереиды и склерен-химные волокна в паренхиме кроющих листьев трубчатого цветка.

3. Фотохимическое изучение E.purpurea

Дальнейшие исследования посвящены изучению биологически активных веществ этого растения, ответственных за иммунную активность. В этой связи нами изучен полисахаридный, полифенольный и микроэлементный состав.

С целью установления качественного состава и количественного содержания основных компонентов биологически активных веществ исследовали высушенную и измельченную надземную часть растения.

Выделение и очистку отдельных фракций и индивидуальных полифе-нольных соединений осуществляли по схеме, представленной на рисунке 6.

Были получены вещества Ф-1, Ф-Н, Ф-Ш, Ф-1У, Х-1, Х-11. Вещества Х-1 и Х-Н, полученные элюированием колонки с силикагелем Ь50/40, изучались методом бумажной хроматографии в системе бутанол: уксусная кислота: вода (БУВ) (4:1 2), с

последующей обработкой хроматограмм хромогенными реактивами. Полученные результаты свидетельствуют о наличии фенолокислот во фракциях. Установление конкретной структуры выделенных веществ проводили физико-химическим методом анализа, а окончательным доказательством структуры служило отсутствие депрессии температуры плавления в пробе смешения исследуемых веществ со свидетелем.

^ - вещества кумариновой природы

Рисунок 6-Схема выделения полифенольных соединений из E.purpurea

Вещество Х-1 - белые кристаллы с 1„,,= 280°С (этанол). Анализ результатов цветных реакций с хромогенными реагентами, значений и данных УФ-спектров чистого вещества с ионизирующими и комплексообразую-щими добавками позволил предположить, что Х-1 хлорогеновая кислота. Однозначным ответом в идентификации вещества Х-1 является отсутствие депрессии температуры плавления в пробе смешения с известным образцом свидетеля.

Вещество Х-Н - жёлто-зелёные кристаллы, с ^ = 280оС (из воды). Х-И аналогичным образом идентифицировали как кофейная кислота.

Таким образом, из фракции II были выделены хлорогеновая и ко-, фейная кислоты.

При изучении УФ-спектров поглощения спиртовых извлечений надземной части Е.ригригеа установлено, что спектральная кривая характеризуется интенсивной полосой поглощения с максимумом при и минимум поглощения при Х=(365±2) НМ и перегибом в области 300-310 нм. Такой характер спектральной кривой обычно указывает на наличие феноло-кислот, что подтверждено получением индивидуальных соединений Х-1 и Х-П. Полученные данные свидетельствуют, что в надземной части Е.ригригеа сумма оксикоричных кислот составляет 2,11±0,019% в пересчёте на цикориевую кислоту.

После препаративного хроматографического разделения на колонке с силикагелем были получены четыре фракции, дающие положительную циа-нидиновую реакцию. Далее выделенные вещества Ф-1 - Ф-1У изучались методом бумажной хроматографии в системе БУВ=4:1:5, с последующей обработкой хромагенными реактивами. Полученные результаты позволяют отнести их к классу флавонолов. Идентификацию соединений Ф-1 - Ф-1У проводили на основании данных УФ-спектроскопии с комплексующими добавками, хроматографии и результатов кислотного гидролиза

Вещество Ф-1 - светло-жёлтые кристаллы, состава С27Н30О16 • Н2О (из 70% этанола), 1пл = 190-192оС, растворимо в кипящей воде, в низших

спиртах, ацетоне, этилацетате и пиридине. В продуктах гидролиза раствором H2SO4 (©=5%) методом бумажной хроматографии со свидетелями достоверных образцов флавонолов и моносахаридов были идентифицированы кверце-тин, D-глюкоза, L-рамноза. Следовательно, вещество Ф-I является кверцетин-биозидом. В результате анализа электронных спектров вещества Ф-I можно сделать вывод о наличии свободных гидроксигрупп у Cs, С7, С3 и CJ что позволяет сделать вывод о положении гликозидной связи у Сз - хромонового ядра.

Сравнение физико-химических свойств и хроматографического поведения вещества Ф-I с известными образцами 3-биозидов кверцетина указывает, что Ф-I соответствует рутину.

Вещество Ф-И - светло-желтые кристаллы, состава С21Н22О12, t^ =

237°С (метанол), [ст]д —40,0 (с 0,1 этанолом), легко подвергается кислотному гидролизу (1н. HCI 30 мин) с образованием агликона Ф-И, и D-глюкозы.

Агликон - Ф-И, - бесцветные кристаллы, t^ = 227°С (этанол), [ог]д

- 42 (0,1 метанол). В УФ-спектре: 290, 327 нм, 312,

375 нм, №fJ,+OT)COOA'a292 нм, [Я^'1380, 315 нм. УФ-спеетр агликона

мало отличается от УФ-спектра гликозида. Для установления строения агликона 10 мг вещества Ф-Н» нагревали в течение 20 мин с 2 мл 20% гидросульфата натрия на кипящей водяной бане, продукты реакции пропускали через колонки с полиамидом и элюировали ярко-желтую зону 10% этанолом. Хроматографией на бумаге с достоверными свидетелями продукт превращения вещества Ф-П, идентифицировали как кверцетин. Таким образом, исходный агликон является 2, 3-дигидрокси-кверцетином. Сравнение хроматографиче-ских данных вещества Ф-Н с образцами гликозидов таксифолина позволило отнести его к 3-гликозиду. Отсутствие депрессии; t^ с выбранным образцом указывает, что вещество Ф-П является З-О-Р-В-глюкопиранозидом таксифолина.

Ф-111 - жёлтые кристаллы, состава С21Н20О2, ^ = 249-250°С (этанол). При кислотном гидролизе раствором образуется кверце-тин и Б-глюкоза. По данным УФ-спектроскопии вещество Ф-Ш имеет свободные гидрокситруппы в положениях углеродных атомов. Гидроксигруппа положении С7 в молекуле кверцетина закрыта гликозидной связью. Поэтому можно предположить, что остаток глюкозы находится в положении С7. По значению ИХ и характеру свечения в УФ-свете соединение Ф-III характеризуется как монозид. Окончательным подтверждением строения вещества Ф-Ш служило отсутствие депрессии ^ со свидетелем. Следовательно, вещество является кверцетин-7-О-В-О-глюкопиранозидом.

Ф-1У - желтые кристаллы, состава С^НюОя, ^ = 2780С (этанол). Продукт цианидиновой реакции малинового цвета извлекается октанолом. Это указывает, что данное соединение не является гликозидом. В УФ-спектрах соединение Ф-1У в присутствии свежеплавленного ацетата натрия и хлорида алюминия имеются батохромные сдвиги полос поглощения, что говорит о наличии свободных гидроксильных групп у С7 И С5 углеродных атомов. Отсутствие батохромии в присутствии борной кислоты и ацетата натрия указывает на отсутствие ортодигидроксигруппировки в боковом фенильном радикале.

При щелочной деструкции образуются п-гидроксибензойная кислота и флороглюцин, что подтверждает наличие свободных гидроксигрупп у С3, С5, С.1у И С4. По значению ИХ и отсутствию депрессии в пробе смешения, вещество Ф-1У соответствует 3,5,7,4-тетрагидроксифлавону (кемпферолу).

Таким образом, во фракции II были идентифицированы следующие флавоноиды: 3-0-р4)-глюкотфанозил-1-6-а-Ь-рамнопиранозид кверцетина (рутин); З-О-р-О-глюкопиранозид таксифолина; кверцетин-7-0-р-1>глюко-пиранозид; 3,5,7,4-тетрагидроксифлавон.

УФ-спектры поглощения спиртовых извлечений надземной части Е.ригригеа характеризуются наличием выраженных максимумов светопогло-щения при 395-420 нм. В данном интервале длин волн характерные максиму-

мы светопоглощения имеют лютеолин и кверцетин. Этим обстоятельством и был обусловлен выбор веществ, которые использовались в качестве стандартов при определении количественного содержания флавоноидов в сырье. Проведённые исследования показали, что в надземной части E.puгpuгea содержание флавоноидов составляет 0,491±0,01178% в пересчёте на кверцетин.

Хлороформный экстракт E.puгpuгea после сгущения хроматографи-ровали на колонке с А12О3 фирмы "Лабтех" ТУ - 6-09-428-76. При элюирова-нии смесью хлороформ-метанол (9:1) были получены две основные фракции, содержащие индивидуальные вещества.

Использование тонкослойной хроматографии на А1г03 и цветных реакций со специфическими реактивами позволило их отнести к соединениям кумариновой природы. Установление конкретной структуры выделенных веществ проводили физико-химическими методами анализа.

Окончательным, доказательством структуры служило отсутствие депрессии температуры плавления пробы смешения исследуемого вещества со свидетелем. Вещество - светло-жёлтые кристаллы. ^ = 204-208оС, (А^Оэ / хлороформ-метанол 9:1), не подвергающееся гидролизу. Деметилиро-вание йодоводородной кислотой приводит к веществу, имеющему в УФ-спектре что по физическим свойствам со-

ответствует 6,7-дигидроксикумарину. Вещество не дает депрессии температуры плавления в пробе смешения с достоверным образцом С-метокси-6-7-гидроксикумарином, известного под названием скополетин.

Вещество С-П - бесцветные кристаллы с ^ = 217-2190С, (А^Оэ / хлороформ-метанол 9:1), подвергается гидролизу. В продуктах гидролиза обнаружены D-глюкоза и агликон в соотношении 1:1. Агликон по хромато-графическому поведению и своим характеристикам напоминает вещество - скополетин, и не даёт депрессии в пробе смешения с образцом скополетина.

Вещество ^П является 7-0-р-В-ГЛЮК0ПираН03ИД0М скополетина, известным под названием скополин. Таким образом, из хлороформного экстракта были выделены скополетин и его глюкозид скополин.

Выделение и идентификацию полисахаридов Е.ригригеа проводили известными методами, описанными в литературе.

Для определения моносахаридного состава водорастворимых полисахаридов (ВРПС), пектиновых веществ (ПВ) и гемицеллюлоз (ГЦ), использовали результаты гидролиза и обработки ГЖК хроматограмм ацетатов аль-донитрилов.

В углеводный комплекс надземной части Е.ригригеа входят водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества и гемицеллюлозы. Общее содержание полисахаридов составляет 20,5% с преобладанием ПВ, поэтому нами была определена молекулярная масса полисахаридов, содержащихся во фракции ПВ. Определение проводили вискозиметрическим методом. На основе анализа данных ГЖХ можно сделать вывод о том, что в ВРПС преобладают рамноза и глюкоза, в ПВ - арабиноза, в ГЦ - ксилоза.

Количественное содержание комплекса полисахаридов в надземной части определяли с помощью гравиметрического метода общее содержание комплекса полисахаридов в надземной части Е.ригригеа находится в пределах 19,7+0,314%.

Исследования микроэлементного состава проводили после озоле-ния изучаемых образцов сырья спектральным методом на спектрографе СТЭ-1. Использовались государственные стандартные образцы горных пород и руд. Были получены следующие результаты: никель - 0,001%; кобальт -<0,0003%; ванадий - <0,001%; молибден - <0,0003%; медь - 0,005%; свинец -<0,001%; цинк - <0,003%; фосфор - 1%; серебро - 0,00001%; титан - 0,01%; марганец - 0,01 %; хром - 0,005%; барий - 0,01%; иттрий - 0,001%; Мя - 3%. Из указанных микроэлементов нет токсичных. Некоторые из них: магний, цинк, медь, серебро могут оказывать влияние на процессы формирования иммунных реакций организма.

Сырье стандартизировали по сумме оксикоричных кислот в пересчете на цикориевую кислоту, что составило 2,11-0,019%.

4. Разработка методики получения лекарственного препарата из травы E.purpurea, обладающего иммунотропным действием и его стандартизация

В результате биологических и химических исследований нами показано, что культивируемая в условиях Ставропольского края E.purpurea может стать сырьевым источником лекарственных средств, среди которых наибольший интерес представляет детская лекарственная форма в виде сиропа. Исследования проводились совместно с учеными кафедры технологии лекарств ПятГФА (д.ф.н. Андреева И.Н.).

Согласно существующей стандартной технологии сироп получали растворением экстракта-концентрата эхинацеи 1:2 в водном растворе смеси сорбита, сахара, натрия бензоата и эфирного масла мяты перечной. Нормами качества для экстракта-концентрата травы эхинацеи 1:2 является: сухой остаток не менее 5%, содержание оксикоричных кислот в пересчете на цикориевую кислоту не менее 0,6%, спирта этилового не менее 36%.Сироп представляет собой вязкую прозрачную жидкость красновато-коричневого цвета со слабым своеобразным запахом, холодящим сладким вкусом с горьковатым привкусом.

Для контроля качества нами предложена методика спектрофотометри-ческого определения суммы оксикоричных кислот в сиропе. Около 2,0 г сиропа (точную навеску) переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в воде, доводят до метки, перемешивают (раствор А). 5,0 мл полученного раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки 0,1 моль/л раствором хлористоводородной кислоты, перемешивают (раствор Б). Оптическую плотность полученного раствора измеряют на спектрофотометре при 328 нм в кювете с толщиной слоя 1,0 см относительно растворителя. Содержание суммы оксикоричных кислот в пересчете на цикорие-вую кислоту в граммах (X) рассчитывают по формуле: ^Л-50 25-100^ Л-250. где

А - оптическая плотность анализируемого раствора;

а - навеска сиропа, взятая для анализа, г,

удельный показатель поглощения цикориевой кислоты при 328 нм в 0,1 моль/л в растворе хлористоводородной кислоты равен 782);

Содержание суммы оксикоричных кислот в пересчете на цикориевую кислоту должно быть не менее 0,05%.

Плотность сиропа- 1,250-1,300 г/смЗ, рН сиропа - 6,0-6,5, содержание натрия бензоата (консервант) должно быть 0,09 - 0,11%, спирта - не выше 4,0%.

5. Фармакологическое исследование сиропа "Иммунекс"

Исследования проводились совместно с учеными кафедры анатомии и физиологии ПятГФА (к.ф.н. Гутенева Г.С.)

Определение острой токсичности сиропа "Иммунекс" и расчет по ЛД50 осуществляли по методу Кербера. Эксперименты проводили на беспородных мышах обоего пола массой 16-20 г, которым перорально вводили исследуемое вещество. По острой токсичности сироп Еригригеа относится к малотоксичным препаратам.

Длительное поступление новой лекарственной формы в трёх дозах 1/10, 1/50 и 1/100 от ЬБ 50 в организм крыс вызывает: снижение уровня билирубина и холестерина в крови; повышение количества эритроцитов и гемоглобина; снижение скорости свертывания крови и увеличения её продолжительности. На основании проведённых морфологических исследований установлено, что сироп эхинацеи не вызывает структурных нарушений в печени, почках, сердце, селезёнке, желудке и кишечнике крыс обоего пола. Морфологической картины местнораздражающего действия желудка не отмечено.

Эксперименты по изучению влияния сиропа "Иммунекс" на формирование первичного иммунного ответа по клеточному типу в организме животного осуществляли на 40 мышах обоего пола линии СВА, массой 18-20 грамм.

Таблица 2 - Результаты изучения влияния сиропа "Иммунекс" на формирование первичного иммунного ответа по клеточному типу в организме животных

Вещество ИР ГЗТ к ЭБ (%) % изменения относительно контроля

Контроль 25Д8±1,37

Иммунал (препарат сравнения) 13,17±1,19* 47,941

Сироп эхинацеи в дозе 1/10 от ЛД» 17,18±1,26* 31,871

Примечание: 4- - угнетение иммунного процесса.

ИР ГЗТ к ЭБ - индекс реакции гиперчувствительности замедленного типа к эритроцитам барана.

Установлено, что раствор, содержащий 1\50 дозу от ЬБ50, снижал индекс реакции ГЗТ на 31% по сравнению с контролем, проявляя иммуноде-прессивный эффект наравне с препаратом сравнения - "Иммуналом" (на 47,9%) (таб.2).

Контроль Иммунал Сироп

Рисунок 7-Результаты изучения влияния сиропа "Иммунекс" на формирование первичного гуморального иммунного ответа в организме

животного

Влияние сиропа "Иммунекс" на гуморальную форму иммунного ответа оценивали методом локального гемолиза в специальных камерах по Оипш^Иаш, путем подсчета антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей. Установлено, что исследуемая лекарственная форма- сироп эхинацеи, оказывает стимулирующее влияние на формирование первичного иммунного ответа по гуморальному типу, не уступая препарату сравнения "Иммунал" (рис 7).

Таблица 3 - Показатели фагоцитоза у крыс-самцов через 4 недели после применения сиропа "Иммунекс"

Группа нет нет Коэффициент

животных спонтанный стимулиров. стимуляции

Контроль 60,2511,95 20,2511,781 0,335Ю,031

Животные получавшие сироп основу 118,812,644* 124,017,071* 1,0410,047«

Иммунал 123,517,925* 92,013,409* 0,7510,0288*

Сироп Э. в дозе 1/10 от ЛД» 67,017,098 134,75±12,447* 2,0310,122*

Сироп Э. в дозе 1/50 от ДД» 79,014,912* 93,518,736* 1,1710,0535

Сироп Э. в дозе 1/100 от ЛД» 59,75±5,152 47,7513,109* 0,80610,034*

Примечание: * - достоверно относительно контроля.

Таблица 4 - Показатели фагоцитоза у крыс-самок через 4 недели после применения сиропа "Иммунекс"

Группа нет нет Коэффициент

животных спонтанный стимулиров. стимуляции

Контроль 37,812,086 16,011,811 0,42Ю,047

Животные получавшие сироп основу 93,814,55* 127,617,56* 1,3410,044*

Иммунал 40,013,30 66,7515,27 1,6710,044*

Сироп Э в дозе 1/10 от ЛД» 73,5+6,796* 147,5116,145* 2.0Ю.138*

Сироп Э. в дозе 1/50 от ЛД» 122^519,535* 137,75115,81* 1,127Ю,086*

Сироп Э в дозе 1/100 от ЛДм 74,7513,542* 112,0110,093* 1,48710,079*

Примечание: * - достоверно относительно контроля.

Проведено изучение влияния сиропа "Иммунекс" на процессы фагоцитоза по способности нейтрофилов восстанавливать нитросиннй тетразолий (НСТ) в диформазан, что коррелирует с образованием пероксида водорода в клетке.

У животных через 4 недели (таб. №3,4) после применения препарата показатели спонтанного и стимулированного НСТ-теста достоверно превосходили показатели контрольной группы. Значение коэффициента стимуляции существенно превышало показатели контрольной группы, включая и группу, получавшую сироп-основу.

Таким образом, проведенные исследования специфической активности сиропа "Иммунекс" показали, что препарат обладает выраженным иммуно-тропным действием, супрессируя формирование первичного иммунного отве-

та по клеточному типу, активируя гуморальное звено иммунитета и процессы фагоцитоза.

Выводы.

1. Результаты проведённых интродукционных исследований, включающих изучение биологических особенностей, семенного и вегетативного размножения, урожайности, накопления основных классов биологически-активных веществ в онтогенезе и в зависимости от возраста растений, позволяют считать, что E.purpurea может успешно культивироваться в условиях Ставропольского края.

2. Морфологические и анатомические исследования генеративных и репродуктивных органов E.purpurea, выявили основные диагностические признаки, позволяющие идентифицировать сырьё:

- дорсовентральное строение листа; аномоцитный тип устьиц, трихомы четырёх типов, эфиромасличные желёзки (тип сложноцветных) для листа и язычковых цветков;

- складчатость кутикулы на листочках обвертки; стереиды и склеренхимные волокна в паренхиме кроющих листьев трубчатого цветка.

3. Химический состав надземной части в условиях интродукции представлен следующими группами биологически активных веществ:

- флавоноиды: 3-0-р-0-глюкопиранозил-1-6-а-Ь- рамнопиранозид кверце-тин; З-О-р-О-глюкопиранозид таксифолин; кверцетин-7-О-р-О-глюкопи-ранозид; 3,5,7,4*-тетрагидроксифлавон (кемпферол); содержание флаво-ноидов в пересчёте на кверцетин составляет 0,491 ±0,0118%;

- фенолокислоты: хлорогеновая и кофейная кислоты; сумма оксикоричных кислот в пересчёте на цикориевую кислоту составляет 2,11 ±0,019%;

- кумарины: скополетин (6-метокси-7-гидроксикумарин) и его глюкозид ско-лолин (7-О-В-О-глюкопиранозид);

- углеводный комплекс представлен: водорастворимыми полисахаридами, пектиновыми веществами и гемицеллюлозой. Содержание полисахаридов в надземной части E.purpurea находится в пределах 19,7±0,31%.

4. Установлены оптимальные условия производства нового лекарственного средства сиропа "Иммунекс" на основе экстракта из надземной части эхина-цеи. Технологические и биофармацевтические исследования подтвердили рациональность состава вспомогательных веществ и предложенной технологии.

5. Проведена стандартизация исходного сырья и сиропа "Иммунекс" по содержанию суммы оксикоричных кислот в пересчёте на цикориевую кислоту: 2,11+0,019% (в сырье), 0,068±0,207% (в сиропе).

6. Фармакологические исследования позволили установить следующие характеристики разработанной лекарственной формы:

- в опытах in vivo выявлено, что сироп "Иммунекс" можно отнести к малотоксичным препаратам, длительное применение которого вызывает, снижение уровня билирубина и холестерина в крови; повышение количества эритроцитов и гемоглобина; снижение скорости свёртывания крови и увеличения её продолжительности;

- по специфической активности сироп "Иммунекс" действует идентично препарату "Иммунал", а в некоторых случаях, превосходит его. Проявляя иммуносулрессивный эффект на формирование первичного иммунного ответа по клеточному типу, препарат одновременно стимулирует антителоге-нез, фагоцитарную активность (НСТ-тест) и резервные метаболические возможности фагоцитоза (Кстим.).

По материалам исследований опубликованы следующие работы:

1. Челова, Л.В. Некоторые итоги изучения влияния фитокомплекса из эхинацеи пурпурной, интродуцированной в условиях Северного Кавказа, на иммунологические и биохимические показатели крови / Челова Л.В., Харченко А.В., Денисенко, О.Н. // Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (57; 2002; Пятигорск): Материалы...-Пятигорск: ПятГФА, 2000. -С200-202.

2. Челова, Л.В. Изучение некоторых лекарственных растений с целью создания на их основе фитокомплексов, обладающих иммуномодулирующим и ги-погликемическим действием / Челова Л.В., Буркова Л.А., Боряк В.П., Харченко А.В, Сизякина Л.П., Гринзайд Ю.М. // Человек и лекарство: Российский нац. конгресс (6; 19-23 апреля, 1999; Москва) Тез. докл. -Москва, 1999. -С.486.

3. Харченко, А.В. Некоторые аспекты изучения эхинацеи пурпурной -Echinacea purpurea (L.) Moench., интродуцированной в условиях Северного Кавказа / Харченко А.В., Челова Л.В., Житарь Б.Н. // Изучение и использование эхинацеи: Материалы междунар. науч. конф. (21-24 сентября, 1998, Полтава). -Полтава: Верстка, 1998. -С43-44.

4. Денисенко, О.Н. Клинические аспекты применения фитокомплекса из Echinacea purpurea, Sophora japonica и Calendula officinalis в условиях курорта / Денисенко, О.Н., Челова Л.В., Харченко А.В., Житарь Б.Н. // Сборник материалов конгресса (27-29 сентября 2000; Элиста): Тез. докл. -Элиста, 2000. -С.157-159.

5. Челова, Л.В. Изучение иммуномодулирующих биоэффектов эхинацеи пурпурной, софоры японской, календулы лекарственной / Челова Л.В., Сизя-кина Л.П., Денисенко О.Н. // Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (55; 2000; Пятигорск): Материалы...-Пятигорск: ПятГФА,

2000.-С233-234.

6. Челова, Л.В. Разработка фитопрепарата для повышения неспецифической резистентности и иммунокоррекции организма / Челова Л.В., Харченко А.В., Сизякина Л.П., Гринзайд Ю.М. // Человек и лекарство: Российский нац. конгресс (8; 2-6 апреля, 2001; Москва) Тез. докл. -Москва, 2001. - С.269.

7. Челова, Л.В. Некоторые итоги изучения эхинацеи пурпурной, интродуцированной в условиях Северного Кавказа / Челова Л.В., Сизякина Л.П., Боряк В.П. // Тихоокеанский медицинский журнал: Тез. докл. науч. практ. конф. с междунар. участием «Современные технологии восстановительной медицины 22 июня

2001. Владивосток - Южно-Сахалинск») -Владивосток,-2001. -№ 1 (6). -С83.

8. Денисенко, О.Н. Интродукция видов Семейств Papaveraceae, Fumariaceae, Asteraceae и Fabaceae на Северном Кавказе / Денисенко О.Н., Харченко А В., Челова Л.В., Савченко А.А., Буркова Л.А. // Биологическое разнообразие. Интродукция растений (2; 20-23 апреля; 1999; СПб): Материалы международной науч. конф. -СПб., 1999. -С 153-155.

9. Челова, Л.В. Некоторые итоги изучения фитокомплекса из эхинацеи пурпурной / Челова Л.В., Боряк В.П. // Южно-Российский Медицинский журнал: Тезисы докладов научно практической конференции юга России «Актуаль-

ные проблемы клинической иммунологии, аллергологии и иммунореа-билитологии» 26-27 сентября 2002; -Пятигорск, 2002. -С.34. 10. Некоторые итоги изучения лекарственных растений, дикорастущих и культивируемых на Северном Кавказе / Денисенко О.Н., Челова Л.В., Харченко А.В. и др. // Человек и лекарство: Российский нац. конгресс (9; 8-12 апреля, 2002; Москва) Тез. докл. -Москва, 2001. -С.269.

ЧЕЛОВА ЛАРИСА ВЛАДИМИРОВНА

»110 44

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭХИНАЦЕИ ПУРПУРНОЙ, КУЛЬТИВИРУЕМОЙ В УСЛОВИЯХ СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ, И РАЗРАБОТКА НА ЕЁ ОСНОВЕ НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

15.00.02. фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати 26.04.04 Формат 60*84-1/16. Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 132.

Отпечатано в издательском отделе ЛПУП санатория «Родник» 357504, г. Пятигорск, бульвар Гагарина, 2.

Актуальность проблемы. В настоящее время отмечается широкое распространение вторичных иммунодефицитов, связанных с урбанизацией, химизацией, повышенной стрессовой нагрузкой, приводящих к срывам в функционировании иммунной системы. Такие состояния нуждаются в иммуно-коррекции. Но, иногда, это трудно осуществимо из-за высокой ценовой стоимости препаратов и их возможных побочных эффектов. В этой связи актуальной проблемой является целенаправленный поиск лекарственных растений, обладающих иммуномодулирующим действием. В развитии современной фармацевтической науки особое место занимают исследования, связанные с внедрением в медицинскую практику лекарственных препаратов растительного происхождения, изучение их химического состава и разработка оптимальных технологий получения на их основе доступных лекарственных средств. Растительное сырьё является экологичным, применение его базируется на глубокой взаимосвязи человеческого организма и природных компонентов и составляет в настоящее время одну треть от общего арсенала лекарственных средств.

Известно, что растительное сырьё по-разному влияет на иммунную систему. Некоторые из лекарственных растений, обладающих иммунотропным действием, оказывают стимулирующее влияние на иммунный статус, но большинство характеризуются как модуляторы. Тем не менее, при применении лекарственных растений и препаратов на их основе, необходима фокусировка на всём лечебном процессе, так как их нельзя рассматривать как простое органическое вещество. По мере того как фармакологические исследования выявляют новые возможности растений, возрастает необходимость изучения биологически активных веществ и механизма их действия на организм животных и человека.

Таким образом, использование лекарственных растений, обладающих иммунотропным действием, потенциально может быть использовано в практике иммуннореабилитации у лиц с вторичными иммуннодефицитными состояниями, в том числе в качестве терапии сопровождения химиотерапии инфекций, при онкологических и аутоиммунных заболеваниях.

Объектом наших исследований является Echinacea purpurea L. Moench семейства Asteraceae.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы явилось проведение комплексных фармакогностических, технологических и фармакологических исследований по введению в культуру E.purpurea в районе Кавказских Минеральных Вод (Ставропольский край), и разработка на её основе новых лекарственных средств.

В соответствии с целью были определены следующие задачи:

1. Провести интродукционные исследования E.purpurea в условиях ботанического сада Пятигорской государственной фармацевтической академии.

2. Провести морфолого-анатомические исследования с целью установления основных диагностических признаков сырья и его стандартизации.

3. Изучить качественный и количественный состав основных биологически активных веществ надземной части культивируемого растения.

4. Разработать оптимальные условия производства экстракта из надземной части E.purpurea и сиропа на его основе.

5. Осуществить фармакологическую оценку предлагаемого лекарственного средства, определить эффективность его действия на клеточное и гуморальное звенья иммунной системы.

6. Разработать НД на траву и сироп на основе экстракта из травы E.purpurea.

Научная новизна. Впервые на основе интродукционных исследований показана возможность культуры E.purpurea в Ставропольском крае. Установлен качественный состав основных классов природных соединений культивируемого растения. Предложены критерии оценки качества и идентификации сырья по его основным морфологическим и анатомическим признакам. На основе разработанного экстракта концентрата из травы E.purpurea предложено оригинальное лекарственное средство — сироп "Иммунекс" с выраженным иммуномодулирующим действием. Предложена методика количе7 ственного определения суммы оксикоричных кислот в пересчёте на цикорие-вую кислоту в сиропе на основе экстракта концентрата из травы E.purpurea с использованием УФ-спектрофотометрии. Установлена специфическая фармакологическая активность сиропа "Иммунекс", подтвердившая правомерность его применения в качестве иммунотропного средства.

Практическая значимость. Результаты, полученные в процессе фар-макогностических, технологических, фармакологических исследований позволили показать возможность интродукции Е. purpurea в условиях Ставропольского края, разработать Фармакопейную статью на траву E.purpurea и предложить из нее лекарственную форму в виде сиропа на основе густого экстракта - "Иммунекс", обладающего иммунотропным действием.

Внедрение результатов исследования. На основании результатов исследований разработаны и внедрены в производство ОАО "АЙ СИ ЭН Лексредство" г. Курск технологическая инструкция, лабораторно-производ-ственный регламент и ФСП на экстракт и сироп из травы. Материалы на препарат "Иммунекс" — сироп из травы E.purpurea получили положительную оценку Фармакологического комитета, и направлены для дальнейших клинических испытаний (письмо 40001.5/2843 от 6.10.03 ОАО "АЙ СИ ЭН Лексредство"; акт сдачи-приёмки научно-технической продукции по договору №199 от 6 мая 1999г.).

Проект ФСП на траву эхинацеи пурпурной принят на экспертизу в Фармацевтический Государственный комитет МЗ РФ (письмо № 425 от 17.12.2002 г.)

Апробация полученных результатов. Основные результаты исследований доложены на научных конференциях Пятигорской государственной фармацевтической академии (1998-2004 г.г.). Диссертационная работа доложена на межкафедральной конференции Пятигорской государственной фармацевтической академии (Пятигорск, 2003г.)

По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Основные положения, выносимые на защиту.

- Опыт введения в культуру E.purpurea в условиях Кавказских Минеральных Вод Ставропольского края.

- Данные по изучению химического состава биологически-активных веществ интродуцируемой E.purpurea.

- Обоснование условий получения сиропа на основе густого экстракта из травы E.purpurea.

- Результаты исследования сиропа E.purpurea - "Иммунекс" в качестве им-мунотропного средства, характеризующегося стимулирующим эффектом на процессы фагоцитоза, а также на адаптационные резервы фагоцитов.

Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации № 01200112164) в рамках проблемы "Фармация" секция № 38 Ученого совета МЗ РФ.

Личный вклад автора. Диссертация представляет собой самостоятельный труд, включающий исследования, проводимые автором с 1998 по 2003 год. В диссертации использованы фрагменты, выполненные совместно с сотрудниками кафедр фармакогнозии, технологии лекарств, фармацевтической химии, биологии, физиологии и патологии Пятигорской государственной фармацевтической академии; кафедры иммунологии Ростовского государственного медицинского университета. Во всех работах, выполненных в соавторстве, вклад автора определяется личным участием в постановке задач, выполнении экспериментальных исследований и обобщении полученных результатов.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 183 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 6 глав, отражающих собственные экспериментальные данные, списка литературы, включающего 213 источников (в том числе 111 иностранных авторов) и приложений; диссертация иллюстрирована 37 рисунками и 63 таблицами.

Общие выводы.

1. Результаты проведённых интродукционных исследований, включающих изучение биологических особенностей, семенного и вегетативного размножения, урожайности, накопления основных классов биологически-активных веществ в онтогенезе и в зависимости от возраста растений, позволяют считать, что E.purpurea может успешно культивироваться в условиях Ставропольского края.

2. Морфологические и анатомические исследования генеративных и репродуктивных органов E.purpurea, выявили основные диагностические признаки, позволяющие идентифицировать сырьё.

-дорсовентральное строение листам аномоцитный тип устьиц, трихомы четырёх типов, эфиромасличные желёзки (тип сложноцветных) для листа и язычковых цветков; -складчатость кутикулы на листочках обвертки; стереиды и склеренхимные волокна в паренхиме кроющих листьев трубчатого цветка.

3. Химический состав надземной части в условиях интродукции представлен следующими группами биологически активных веществ: -флавоноиды: 3-0-Р-0-глюкопиранозил-1-6-а-Ь- рамнопиранозид кверцетин; З-О-Р-О-глюкопиранозид таксифолин; кверцетин-7-0-Р-0-глюкопи-ранозид; 3,5,7,4'-тетрагидроксифлавон (кемпферол); содержание флавонои-дов в пересчёте на кверцетин составляет 0,491 ±0,0118%;

-фенолокислоты: хлорогеновая и кофейная кислоты; сумма оксикоричных кислот в пересчёте на цикориевую кислоту составляет 2,11 ±0,019%; -кумарины: скополетин (6-метокси-7-гидроксикумарин) и его глюкозид скополин (7-0-Р-0-глюкопиранозид); -углеводный комплекс представлен: водорастворимыми полисахаридами, пектиновыми веществами и гемицеллюлозой. Содержание полисахаридов в надземной части E.purpurea находится в пределах 19,7±0,31%.

4. Установлены оптимальные условия производства нового лекарственного средства сиропа "Иммунекс" на основе экстракта из надземной части эхина

149 цеи. Технологические и биофармацевтические исследования подтвердили рациональность состава вспомогательных веществ и предложенной технологии.

5. Проведена стандартизация исходного сырья и сиропа "Иммунекс" по содержанию суммы оксикоричных кислот в пересчёте на цикориевую кислоту: 2,11^0,019% (в сырье), 0,068±0,207% (в сиропе).

6. Фармакологические исследования позволили установить следующие характеристики разработанной лекарственной формы:

-в опытах in vivo выявлено, что сироп "Иммунекс" можно отнести к малотоксичным препаратам, длительное применение которого вызывает: снижение уровня билирубина и холестерина в крови; повышение количества эритроцитов и гемоглобина; снижение скорости свёртывания крови и увеличения её продолжительности; -по специфической активности сироп "Иммунекс" действует идентично препарату "Иммунал", а в некоторых случаях, превосходит его. Проявляя им-муносупрессивный эффект на формирование первичного иммунного ответа по клеточному типу, препарат одновременно стимулирует антителогенез, фагоцитарную активность (НСТ-тест) и резервные метаболические возможности фагоцитоза (Кстим.).