Автореферат и диссертация по медицине (14.04.01) на тему:Разработка технологии лекарственных форм на основе арники облиственной (Arnica foliosa Nutt.)

На правах рукописи

Qjlttj

Михеева Наталья Сергеевна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ НА ОСНОВЕ АРНИКИ ОБЛИСТВЕННОЙ (Arnica follosa Nutt.j

14.04.01 технология получения лекарств

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

005559672

3 ПАР 2015

Москва 2015

005559672

Диссертационная работа выполнена в ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» (ФГБНУ ВИЛА?).

Научный руководитель:

кандидат фармацевтических наук, Охотником Валентина Федоровна Официальные оппоненты:

Алексеев Константин Викторович, доктор фармацевтических наук, профессор, ФГБНУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова, заместитель директора по инновационной деятельности

Жиляковя Елена Теодоровна, доктор фармацевтических наук, профессор, ФГАУВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», заведующая кафедрой фармацевтической технологии

Ведущая организация: ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ» (ОАО «ВНЦ БАВ»).

Защита состоится «30» марта 2015 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 006.070.01 при ФГБНУ Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (117216, г. Москва, ул. Грина, д.7) по адресу: 123056, г. Москва, ул. Красина, д.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ ВШ1АР по адресу: 117216. Г. Москва, ул. Грина, 7.www.vilarnii.ru

Автореферат диссертации

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор фармацевтических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В соответствии с Федеральной целевой программой «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 г.» создание эффективных и безопасных лекарственных средств отечественного производства является актуальной задачей современной фармацевтической науки [Постановление Правительства РФ от 17 февраля 2011 г. N 91 "О федеральной целевой программе "Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу"].

Как известно, номенклатура современных лекарственных средств, разрешенных к медицинскому применению в Российской Федерации представлена препаратами синтетического и природного происхождения, при этом в некоторых фармакологических группах доля препаратов на основе лекарственного растительного сырья составляет около 40%. Фитопрепараты выгодно отличаются от синтетических лекарственных средств мягким щадящим действием на организм в сочетании с минимальными токсико-аллергическими проявлениями [Коржавых Э.А., 2004; Куркин В.А., 2009; Охотникова В.Ф. с соавт., 2012].

Для достижения терапевтической эффективности и безопасности при разработке лекарственных препаратов особое значение имеет обоснование выбора лекарственной формы. Использование мягких лекарственных форм для наружного применения (мази, линименты, кремы, гели) позволяет обеспечивать максимальную концентрацию лекарственных веществ непосредственно в очаге поражения, например, в месте нарушения целостности кожи, воспаления слизистой оболочки, нагноении, пролежнях, ожогах [Харкевич Д.А., 2001].

Востребованной лекарственной формой являются суппозитории, в которых выгодно сочетаются достоинства пероральных и инъекционных лекарственных средств. Их применение позволяет решить вопрос проблемы боли и вкуса, связанные с назначением лекарственных средств для парентерального введения и приема внутрь, а так же возможность применения лекарственного препарата при нарушении акта глотания, тошноте и рвоте, возможность использования в бессознательном состоянии [Абрамович P.A., 2012; Охотникова В.Ф. с соавт., 2013]. Кроме того, поступление большей части активной субстанции из суппозиториев происходит непосредственно в большой круг кровообращения, чем объясняется высокая скорость всасывания биологически активных веществ (БАВ).

В настоящее время при создании фитопрепаратов в качестве субстанций чаще всего используются сухие экстракты из растительного лекарственного сырья. К числу таких субстанций относится арники облиственной экстракт сухой (АОЭС), получаемый из травы

арники облиственной, разработанный в ФГБНУ ВИЛАР и отвечающий требованиям нормативного документа.

Учитывая, что в номенклатуре лекарственных средств, зарегистрированных в Российской Федерации, созданных на основе растения рода Арника (Arnica L.), присутствуют только гомеопатические лекарственные препараты, разработка отечественных лекарственных средств на основе сухого экстракта арники, обладающих противовоспалительным, ранозаживляющим и кровоостанавливающим действием, является своевременной и актуальной задачей и перспективным направлением современной фармацевтической науки.

Цель и задачи исследования:

Целью настоящего исследования является проведение комплексных исследований по разработке состава, технологии получения и стандартизации суппозиториев ректальных и крема 1,5%, созданных на основе арники облиственной экстракта сухого.

Для достижения поставленной цели в задачи исследования входило:

- теоретически и экспериментально обосновать и разработать оптимальный состав и технологию получения суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе арники облиственной экстракта сухого с использованием рациональных основ;

- разработать критерии подлинности и установить нормы содержания действующих веществ в разрабатываемых лекарственных формах с целью их стандартизации;

- исследовать кинетику высвобождения действующих веществ из суппозиториев ректальных и изучить реологические свойства крема 1,5% на основе арники облиственной экстракта сухого;

- изучить стабильность суппозиториев ректальных и крема 1,5% в процессе хранения в естественных условиях и установить их срок годности;

- изучить безопасность разработанных лекарственных форм (суппозитории и крем);

- провести исследования по изучению противовоспалительной и ранозаживляющей активности крема 1,5%;

- на основании полученных результатов разработать и оформить проект фармакопейной статьи (ФС) и опытно-промышленный регламент (ОПР) на производство суппозиториев ректальных; технические условия (ТУ) и технологическую инструкцию (ТИ) на крем 1,5% на основе арники облиственной экстракта сухого.

Научная новизна

На основании технологических, аналитических и биофармацевтических исследований, впервые разработан состав суппозиториев ректальных и крема 1,5%,

созданных на основе арники облиственной экстракта сухого, для лечения воспалительных заболеваний различной этиологии.

Изучены параметры биодоступности суппозиториев ректальных, позволяющие выбрать их оптимальный состав, а также структурно-механические и реологические свойства крема 1,5%, способствующие прогнозированию его стабильности при длительном хранении.

В рамках гармонизации методов контроля качества сухого экстракта, суппозиториев ректальных и крема 1,5% разработаны унифицированные и валидированные методики количественного анализа суммы фенольных соединений в пересчете на лютеолин-7-глюкозид методом спектрофотометрии.

Разработаны рациональные технологические схемы производства для суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе арники облиственной экстракта сухого.

Дана оценка токсикологической безопасности разработанных лекарственных форм и эффективность крема 1,5% на экспериментальной модели патологии.

Теоретическая значимость исследования

Представленный в работе экспериментально-практический материал может служить теоретической базой разработки и исследования новых лекарственных форм на основе арники облиственной экстракта сухого.

Практическая значимость работы.

Проведенные исследования позволили разработать и научно обосновать состав суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе арники облиственной экстракта сухого.

На основании полученных результатов разработаны и оформлены: - проект фармакопейной статьи (ФС) и опытно-промышленный регламент (ОПР 04868244-03-2014) на производство суппозиториев;

- технологическая инструкция и технические условия на крем 1,5% (ТУ 9373-12204868244- 2014).

Методы исследования

В работе использованы физико-химические, технологические, структурно-механические, биофармацевтические и микробиологические методы.

Связь темы диссертационной работы с планом научных работ учреждения, где выполнялась диссертация

Диссертационная работа выполнена в отделе фармацевтической технологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» в соответствии с «Программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований ФГБНУ ВИЛАР

по научному обеспечению развитая агропромышленного комплекса (АПК) Российской Федерации на 2011 - 2015 годы».

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в направлении исследований, постановке цели и задач, выборе объектов и проведении экспериментальных исследований, обобщению полученных данных и их статистической обработке.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.04.01 - технология получения лекарств. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 3 и 4 паспорта специальности.

Основные положения, выносимые на защиту - результаты исследования по обоснованию составов и технологий получения лекарственных форм в виде суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе арники облиственной экстракта сухого для лечения заболеваний различной воспалительной этиологии;

- результаты изучения подлинности и нормы содержания действующих веществ в суппозиториях ректальных и креме 1,5% на основе арники облиственной экстракта сухого;

- результаты исследования кинетики высвобождения действующих веществ из суппозиториев ректальных;

- результаты изучения структурно-механических и реологических свойств крема

1,5%;

- результаты изучения стабильности суппозиториев ректальных и крема для обоснования сроков их годности;

- результаты доклинических исследований разработанных лекарственных форм.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены на XXI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2014 г. II научно-практической конференции с международным участием «От растения к препарату: традиции и современность», Москва, ФГБНУ ВИЛАР, 23-24 апреля 2014 г. II научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые и фармация XXI века», Москва, 11-12 декабря 2014 г.

Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликованы 12 научных работ, в том числе 6 статей в научных изданиях, рекомендованных ВАК, 4 тезисов докладов, 2 статьи в сборнике научных трудов ФГБНУ ВИЛАР.

Объем и структура работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух экспериментальных глав, заключения, выводов, библиографии и приложений. Библиография включает 140 источников литературы. Работа изложена на 147 страницах машинописного текста, содержит 34 таблицы, 23 рисунка.

Во введении обоснована актуальность темы. Сформулированы цель и задачи исследования. Охарактеризованы научная новизна и практическая значимость работы. Перечислены доклады и публикации по теме диссертации.

В обзоре литературы (глава 1) дана ботаническая характеристика, химический состав арники облиственной и ее применение в народной и научной традиционной медицине, приведена номенклатура лекарственных средств на основе арники. Рассмотрены современные аспекты технологии получения сухих экстрактов из лекарственного растительного сырья. Отражены аспекты применения мягких лекарственных форм (МЛФ), созданных на основе лекарственного растительного сырья для лечения заболеваний различной воспалительной этиологии. Дана характеристика вспомогательных веществ, используемых в технологии изготовления суппозиториев и кремов.

Во второй главе описаны материалы и методы, используемые в работе. Дано описание АОЭС и вспомогательных веществ, применяемых при разработке лекарственных форм, а также современных физико-химических, технологических, структурно-механических, биофармацевтических методов исследований, позволяющих получить воспроизводимые и достоверные результаты.

В третьей главе изложены результаты экспериментальных исследований по обоснованию оптимального состава и технологии получения суппозиториев и крема 1,5% на основе АОЭС, по материалам которых разработаны технологические схемы для наработки экспериментальных серий препаратов.

В четвертой главе представлены результаты доклинического изучения лекарственных форм, созданных на основе АОЭС, включающих: микробиологическое изучение субстанции, суппозиториев ректальных и крема 1,5%; изучение стабильности суппозиториев ректальных и крема 1,5% в процессе хранения в естественных условиях, установлен их срок годности; результаты экспериментального токсикологического изучения суппозиториев ректальных и крема 1,5%; результаты изучения

аплергизирующих свойств, противовоспалительной и репаративной активности крема 1,5% на основе АОЭС.

Приложения содержат проект ФС и опытно-промышленный регламент на суппозитории ректальные; технологическую инструкцию и технические условия на крем 1,5%.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объеюы и методы исследования. Объектом исследования является арники облиственной экстракт сухой, полученный из высушенной травы арники облиственной (Arnica foliosa Nutt., семейства Сложноцветные — Asteraceae) путем экстракции 40% спиртом, с последующей очисткой и сушкой. Сухой экстракт представляет собой аморфный порошок желто-коричневого цвета со специфическим запахом, гигроскопичен, потеря в массе при высушивании не более 5% с содержанием суммы фенольных соединений в количестве 8,26%, а в пересчете на лютеолин-7-глюкозид составляет 4,0-4,5% [Азаркова А.Ф. с соавт., 2000; Никонов Г.К. 1959].

Показатели качества действующего и вспомогательных веществ, используемых в эксперименте, соответствуют требованиям нормативной документации (НД).

Определение подлинности суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе АОЭС осуществляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Условия хроматографирования. Хроматограф «Gilson», модель 305 (Франция), колонка размером 4,6x250 мм. Неподвижная фаза: Kromasil С 18, размер частиц 5 мкм. Подвижная фаза: метанол - вода - фосфорная кислота концентрированная, в соотношении 400:600:5. УФ-детектор«ОП50п» UV/VIS модель 151.

Количественное определение суммы фенольных соединений в лекарственных формах, в пересчёте на лютеолин-7-глюкозид осуществлено спектрофотометрическим методом анализа. Электронные спектры соединений в УФ - и видимой областях света записывали на приборе «Helios» (США) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см. Для регистрации УФ - спектров исследуемых веществ готовили 0,05% растворы в 70% спирте.

Изучение процесса высвобождения АОЭС из суппозиториев оценивали методом равновесного диализа через полупроницаемую мембрану (по Крувчинскому). Измерение эффективной вязкости крема 1,5% в широком диапазоне значений при разных скоростях сдвига и температуры проводили с помощью ротационного вискозиметра «Реотест-2». По полученным результатам рассчитывали касательное напряжение сдвига и эффективную вязкость и строили реограммы течения исследуемого крема [Кутузова И.В. с соавт., 1991, Ряпосова О.И., 1972].

Математические методы статистической обработки и анализа экспериментальных данных были проведены в соответствии с ГФ XI изд. 2. и методом вариационной статистики с применением «t» - критерия Стьюдента. Все экспериментальные данные, представленные в работе являются результатом не менее пяти определений.

Изучение антимикробной активности АОЭС, суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе АОЭС проводили в соответствии с методикой, рекомендованной ГФ XI вып. 2 и ГФ XII ч. 1, раздел 32 «Микробиологическая чистота» (ОФС 42-0067-07). Доклиническое изучение суппозиториев ректальных 0,05 г и крема 1,5% для наружного применения проведено в соответствии с «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств (2012 г.)» [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012]. Кожно-сенсибилизирующее действие крема 1,5% проведено на модели экспериментального аллергического контактного дерматита на морских свинках-альбиносах [Рабен A.C.,с соавт.1970]. Эффективность ранозаживляющего действия крема 1,5% проводили на модели термического повреждения кожи у мышей [Бортникова В.В. с соавт., 2014 г.].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Технология получения суппозиториев ректальных на основе АОЭС

Важными критериями при создании суппозиториев, отвечающих требованиям ГФ XI гад., вып.2, являются равномерное распределение БАВ и вспомогательных веществ в основах, и высвобождение активной субстанции из основ. В связи с этим при оценке качества суппозиториев учитывались параметры, позволяющие выбрать их оптимальный состав. К этим параметрам относятся: скорость высвобождения лекарственного вещества из суппозиториев, pH, время полной деформации, стабильность и микробиологическая чистота в процессе хранения.

В лаборатории экспериментальной и клинической фармакологии ФГБНУ ВИЛАР экспериментально установлена эффективная доза АОЭС - 10 мг/кг, вызывающая гиперкоагуляционный эффект при внутривенном введении кроликам. Это послужило основанием для разработки лекарственной формы препарата в виде суппозиториев ректальных, содержащих 50 мг активного вещества (АОЭС). Рекомендуемая суточная терапевтическая доза 100 мг (2 суппозитория в сутки).

При выборе наиболее рациональной основы, исходили из преимуществ липофильных основ. В таблице 1 представлен состав основ, используемых в технологии экспериментальных образцов суппозиториев ректальных на основе АОЭС. По данным составам получены суппозитории массой от 1,9 до 2,1 г.

Таблица 1 - Состав экспериментальных образцов суппозиториев (г)

№ Наименование ингредиента Экспериментальные образцы

1 2 3 4 5 6 7

1 ПЭГ 400:1500 9,2 - - - - - -

2 Витепсол \V-35 - 13,7 - - - - -

3 Твердый жир (Тип А) - - 15,2 10,4 10,9 - -

4 Суппорин М - - - - - - 13,7

5 Моноглицериды - 1,4 - - - -

6 1,2- Пропиленгликоль 5,0 5,0 2,5 5,0 5,0 5,0 5,0

7 Твин 80 0,8 0,8 0,4 0,8 0,8 - 0,8

8 Воск эмульсионный - - - 2,8 - - -

9 Желатино- глицериновая основа 14,5

10 Эмульгатор Т-2 2,8

11 АОЭС 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Выбор основы для суппозиториев с АОЭС, был осуществлен с учетом исследований кинетики высвобождения лекарственного вещества из основ различной природы. Методом равновесного диализа (по Крувчинскому) была изучена скорость и полнота высвобождения АОЭС из основ различной природы: ПЭГ^К)0:1500, витепсол W-35, твердый жир (Тип А), воск эмульсионный, твердый жир (тип А)+воск эмульсионный, эмульгатор Т-2, твердый жир (тип А)+эмульгатор Т-2, желатино-глицериновая основа, суппорин М.

Кинетика высвобождения действующего вещества (%) из суппозиторных основ в опытах in vitro представлена на рисунке 1.

100,00% 90,00% 80,00% 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00%

-ПЭГ-400:1500

Витепсол W-35

Твердый жир (тип А)

■'Твердый жир (тип а)+воск эмульсионный Твердый жир (Тип

А)+эмульгатор Т-2 Желатино-глицериновая основа Суппорин М

30 минут

45 минут

60 минут

120 минут

Рисунок 1 - Кинетика высвобождения АОЭС (%) из суппозиторных основ в опытах in vitro

В результате проведенных исследований по высвобождению АОЭС в опытах in vitro установлено, что наибольшая степень высвобождения наблюдается у образцов на основе твердого жира (Тип А), которая через 120 мин. составляет 86%. Анализ полученных данных показал, что основа значительно влияет на высвобождение БАВ из лекарственной формы, что в свою очередь оказывает влияние на терапевтическую эффективность лекарственного средства.

Таким образом, на основании проведенных исследований для дальнейшего изучения был выбран образец суппозиториев №3 (таблица 2).

Таблица 2- Состав суппозиториев на основе АОЭС (образец №3)

Ингредиенты Нормативный документ Количество, г (на 1 суппозиторий)

Арники облиственной экстракт сухой ФС 42-0171-2953-02 0,05

1,2- Пропиленгликоль (ПГ) ФС 42-0175-5410-9611 0,25

Моноглицериды дистиллированные (МД) МГД94 ТУ10-И97-95 0,14

Твин-80 ФС 42-2540-88 0,04

Твердый жир (Тип А) ФС 42-1117-86 Достаточное количество до получения суппозитория массой от 1,9 и 2,1

В качестве растворителя АОЭС в суппозиториях использован 1,2 - пропиленгликоль с последующим введением его в основу; моноглицериды - для получения тонкодисперсной и стабильной эмульсии; твин-80- как поверхностно-активное вещество, усиливающее интенсивность диффузии и всасывание действующего вещества в прямой кишке [Дугашвили Н.Г, 1998, Охотникова В.Ф. с соавт. 2013]. Полученные суппозитории оценивали по следующим показателям: внешний вид, средняя масса, отклонения от средней массы, температура плавления и затвердевания, время полной деформации, твердость, рН водной вытяжки, йодное и кислотное число, подлинность, количественное определение, высвобождение и микробиологическая чистота, по методикам описанным в ГФ XI и XII изд. На основании проведенных оценок качества лекарственной формы разработана технологическая схема производства суппозиториев, содержащих АОЭС (рис. 2).

Рисунок 2 - Технологическая схема производства суппозиториев, содержащих АОЭС

Технология получения крема 1,5% на основе АОЭС Разработка состава и технологии крема 1,5% на основе АОЭС проведена в результате изучения физико-химических свойств, вводимого в ней лекарственного вещества, влияния вспомогательных веществ на терапевтический эффект и стабильность лекарственной формы. Известно, что большинство мягких лекарственных форм относятся к структурированным дисперсным системам и обладают определенными физико-химическими свойствами. Экспериментально установлено, что введение АОЭС в состав крема в количестве 1,5% от общей массы не оказывает влияние на значения вязкости и процессы структурообразования крема. На основании первичного скрининга образцов крема для дальнейшего экспериментального изучения были выбраны два состава крема (таблица 3).

Таблица 3 - Составы крема 1,5% на основе АОЭС (г)

№ Наименование ингредиентов №№ образцов (количество, г) Нормативный документ

№1 №2

1 Арники облиственной экстракт сухой 1,5 1,5 ФС 42-0171-2953-02

2 Полиэтиленгликоль-400 8,5 8,5 ТУ 2483-167-05757587-2000

3 Воск эмульсионный 8,0 3,0 ТУ 9154-003-00333865-99

4 Спен-60 0,5 0,5 Европейская Фармакопея

5 Эмуксол 268 (Полавакс) 3,0 3,0 ТУ 2483-047-05784466-2007

6 Вазелин 10,0 10,0 ГОСТ 3582-84

7 Сорбиновая кислота 0,125 0,125 ТУ 6-14-358-76

8 Вода очищенная 68,375 До 100,0 ФС 42-2619-97

Основообразующим компонентом в качестве жировой основы обоих составов крема был выбран вазелин. Воск эмульсионный (ВЭ), обладающий высокими эмульгирующими свойствами, использовали для создания стабильной эмульсии в концентрациях 3% и 8%. Полмзтиленгликоль-400 - солюбилизатор АОЭС, применяли для повышения эластичности образуемой на коже пленки, а за счет его осмотических свойств и бактерицидного действия -для подсушивания раневой поверхности и усиления оттока экссудата из раны и подавления патогенной микрофлоры [Слюсар О.И. с соавт., 2000]. Дня снижения поверхностного натяжения на границе раздела фаз в состав крема включены вспомогательные вещества:

спен-60 - эмульгатор и стабилизатор, эмуксол-268 -эмульгатор, сорбиновая кислота -консервант [Михеева Н.С., 2014].

Для определения упруго-вязко-пластичных характеристик нами были изучены структурно-механические свойства лекарственной формы, что в дальнейшем определило выбор состава крема 1,5% на основе АОЭС. Графики, представленные на рис. 3 и 4, характеризуют изменения логарифма эффективной вязкости (Ьг^зфф) от градиента логарифма

скорости сдвигового течения (у).

Логарифм скорости сдвига Ьп (Ог)

Рисунок 3 - Логарифмическая зависимость изменения эффективной вязкости (1пг1эфф) от градиента логарифма скорости сдвигового течения (у) лечебного крема 1,5% АОЭС на основе эмульсионной основе с 8% ВЭ. По оси абсцисс - логарифм скорость сдвига (Ог),с по оси ординат - логарифм эффективной вязкости (1пг|эфф)-

Логарифм скорости сдвига Ьп (Ог)

Рисунок 4 - Логарифмическая зависимость изменения эффективной вязкости (1пг|Эфф) от градиента логарифма скорости сдвигового течения (у) лечебного крема 1,5% на основе эмульсионной основе с 3% ВЭ. По оси абсцисс - логарифм скорость сдвига (Ог),спо оси ординат-логарифм эффективной вязкости (1пг|эфф).

Проведенные исследования показали, что составы, содержащие 8% воска эмульсионного, имеют более высокие значения эффективной вязкости по сравнению с образцами, содержащими 3% воска эмульсионного. Так, значение эффективной вязкости для образцов №1 при градиенте скорости сдвига 0,3 с составляет 5044 Па с, в то время как значение эффективной вязкости для образцов №2 при этом же градиенте составляет всего лишь 2716 Па с. При малых скоростях сдвига структура крема разрушается и имеет тенденцию к восстановлению, что более характерно для образцов № 1. С увеличением скорости сдвига разрушение структуры крема начинает преобладать над восстановлением, и вязкость резко уменьшается. Об этом свидетельствуют значение эффективной вязкости, которое при градиенте скорости сдвига 24,3 ссоставляет для образцов №1 - 203,6 Па-с, а для образцов № 2 - 112,6 Па-с. При этом отмечено, что при больших скоростях сдвига структура полностью разрушается и система начинает течь.

Для изучения тиксотропных свойств строили кривые кинетики деформации крема в координатах "скорость сдвига - напряжение сдвига". Графики, представленные на рис. 5 и 6, характеризуют изменения зависимость градиента скорости сдвигового течения от напряжения сдвига (т) для исследуемых составов.

Рисунок 5 - Реограмма кинетики деформации лечебного крема 1,5% АОЭС на эмульсионной основе с 8% ВЭ. По оси абсцисс - напряжение сдвига (0, н/м 2, по оси ординат - скорость сдвига (Вт),с

Рисунок 6 - Реограмма кинетики деформации лечебного крема 1,5% АОЭС на эмульсионной основе с 3% ВЭ. По оси абсцисс - напряжение сдвига (0, н/м 2, по оси ординат - скорость сдвига (Эг),с'

Наличие гистерезисных петель свидетельствует о наличии тиксотропных свойств исследуемых образцов. Помимо этого, можно заключить, что обратимые тиксотропные связи чуть преобладают в исследуемых образцах №1 по сравнению с образцами №2, о чем свидетельствует меньшая разница между восходящими и нисходящими кривыми. Наличие восходящих и нисходящих кривых петли гистерезиса указывает на то, что составы исследуемых кремов обладают разными тиксотропными свойствами. При этом «восходящая» кривая, характеризующая разрушение системы, отличается от «нисходящей» кривой, характеризующей восстановление системы, что объясняется сохранением остаточной деформации после сильного ослабления структуры под влиянием ранее приложенного напряжения. Эта способность к восстановлению структуры имеет важное значение в производстве крема. Она свидетельствует о возможности выдерживать механические воздействия в процессе гомогенизации, а также позволяет прогнозировать стабильность при длительном хранении. Таким образом, на основании проведенных исследований нами был выбран образец крема №1, содержащий воск эмульсионный в количестве 8%, способствующий получению стабильной рациональной лекарственной формы и обладающей хорошими фармакотерапевтическими свойствами (таблица 4).

Таблица 4- Состав крема 1,5% на основе АОЭС (образец №1)

Ингредиенты Нормативный документ Количество, г

Арники облиственной экстракт сухой ФС 42-0171-295302 1,5

Полиэтиленгликоль-400 ТУ2483-167-05757587-2000 8,5

Воск эмульсионный ТУ 9154-00300333865-99 8,0

Спен-60 Европейская Фармакопея 0,5

Эмуксол 268 (Полавакс) ТУ 2483-04705784466-2007 3,0

Вазелин ГОСТ 3582-84 10,0

Сорбиновая кислота ТУ 6-14-358-76 0,125

Вода очищенная ФС 42-2619-97 68,375

На основании проведенной оценки качества лекарственной формы разработана следующая технологическая схема производства крема 1,5% на основе АОЭС (рис.7).

Рисунок 7 - Технологическая схема производства крема 1,5% на основе АОЭС

Методы оценки подлинности и количественного содержания БАВ в АОЭС, суппозиториях ректальных и креме 1,5%

Фенольные соединения являются превалирующей группой БАВ в АОЭС, их исследованию решено уделить особое внимание. Необходимо было также сопоставить их содержание и состав в АОЭС и в лекарственных формах - суппозиториях ректальных и креме 1,5% для обеспечения возможности их сквозной стандартизации по БАВ.

Обнаружение фенольных соединений и их количественную оценку в АОЭС и в лекарственных формах осуществляли методом ВЭЖХ.

На основе проведенных исследований установлено, что в АОЭС содержатся: флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, а также витамин С. Данные соединения фенольной природы найдены и в извлечениях из лекарственных форм - суппозиториях ректальных и креме 1,5% (Рис.8-10)

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

Рисунок 8 - Хроматограмма водно-спиртового извлечения из АОЭС

шУ 2500'

Рисунок 9 - Хроматограмма водно-спиртового извлечения из суппозиториев, содержащих АОЭС

Рисунок 10 - Хроматограмма водно-спиртового извлечения из крема с АОЭС

Методом внутренней нормализации определено, что превалирующим компонентом среди идентифицированных БАВ является лютеолин-7-глкжозид, содержание которого в АОЭС, в суппозиториях ректальных и креме 1,5% оценено количественно и составляет от 4,0 до 4,5%, от 0,120 до 0,131%, и около 0,045 %, соответственно.

Таким образом, установлено, что АОЭС, суппозитории ректальные и крем 1,5% содержат фенольные соединения, основным компонентом суммы которых является лютеолин-7-глюкозид, что делает перспективной для оценки качества сквозную стандартизацию АОЭС, суппозиториев и крема по этому веществу.

Для экспресс анализа и для включения в НД нами использован спектрофотометрический метод анализа определения суммы фенольных соединений в пересчете на лютеолин-7-глюкозид.

Количественное определение суммы фенольных соединений в субстанции и лекарственных формах, в пересчёте на лютеолин-7-глюкозид методом спектрофотомстрии

На основании полученных результатов по качественному и количественному составу фенольных веществ в исследуемых объектах, целесообразна оценка их качества по содержанию фенольных соединений в пересчете на лютеолин-7-глюкозид.

Для оценки содержания суммы фенольных соединений предложена унифицированная методика, позволяющая проводить сквозной анализ как в сухом экстракте, так и лекарственных формах.

Реакция комплексообразования с хлоридом алюминия является селективной для фенольных соединений и дает батохромный сдвиг спектра в длинноволновую область, что позволяет отделить фенолы от большой группы сопутствующих веществ.

Спектры поглощения полученных комплексов снимали на саморегистрирующем спектрофотометре «Гелиос» в интервале длин волн от 350 до 460 нм.

Установлено, что продукт взаимодействия из АОЭС с раствором алюминия хлорида имеет спектральную кривую, идентичную таковой комплекса лютеолин-7-глкжозида с раствором алюминия хлорида, и при длине волны 400±3 нм их максимумы поглощения совпадают. Это определило выбор данной длины волны в качестве аналитической.

Результаты определения представлены на рис. 11-15 и в таблице 5.

Scan Graph

0.4949------------*------------

401.0.0 403

0 0230 - - - ----

350 360 зас 400 420 440 430 480 see

WavefengtHnm)

Рисунок 11 - Спектры поглощения комплексов лютеолин-7-глюкозида и фенольных соединений АОЭС (2) с алюминия хлоридом

Рисунок ] 2 - Спектр комплекса лютеолин-7-гликозида с алюминия хлоридом

Рисунок 13 - Спектр комплекса фенольных соединений, содержащихся сухом экстракте, с алюминия хлоридом

Рисунок 14 - Спектр комплекса фенольных соединений, содержащихся в извлечении из суппозиториев, с алюминия хлоридом

извлечении

Рисунок 15 - Спектр комплекса фенольных соединений, содержащихся в из крема, с алюминия хлоридом

Таблица 5 - Результаты определения суммы фенольных соединений, в пересчете на лютеолин-7-глюкозид

Наименование образца Содержание

Сухой экстракт 8,26 %

Суппозитории 3,29 мг/суппозиторий (0,16%)

Крем 0,12%

Метрологические характеристики результатов спектрофотометрического количественного определения фенольных соединений в АОЭС и лекарственных формах, в пересчёте на лютеолин-7-глюкозид спектрофотометрическим методом представлены в таблице 6. Таблица 6 - Метрологические характеристики методики количественного определения суммы фенольных соединений методом спектрофотометрии в пересчете на лютеолин - 7-глюкозид.

Название п f Р (% ) Т(Р, f) Х% S Sx ЛХср ДХ Ё % Е %

АОЭС 5 4 95 2,78 8,26 1,25-10" 2 0,112 0,0500 0,139 0,311 1,7 3,76

Суппозитории с АОЭС 5 4 95 2,78 0,16 9,20 -10" 6 0,003 0,0013 3,77-10' 3 8,43-1 О"3 2,35 5,26

Крем с АОЭС 5 4 95 2,78 0,12 2,30-10' 6 1,52-10" 3 6,78-10" 4 1,88-10" 3 4,21-1 О"3 1,56 3,49

Относительная погрешность отдельной варианты в предложенной методике в АОЭС не превышает 3,76%, в суппозиториях - 5,26%, в креме с АОЭС - 3,49%.

Полученные результаты подтверждают достоверность методики количественного определения суммы фенольных соединений в пересчёте на лютеолин-7-глюкозид в АОЭС, суппозиториях и креме по параметрам: правильность, прецизионность, сходимость, воспроизводимость, линейность и диапазон, специфичность, аналитическая область, что позволяет использовать ей при сквозной стандартизации от экстракта к лекарственным формам и при разработке нормативной документации.

В результате исследований бактериостатической и фунгистатической активности в опытах in vitro установлено, что АОЭС и его лекарственные формы суппозитории

ректальные и крем 1,5%, обладают антимикробным действием и соответствуют требованиям ГФ ГФ XI вып.2 и ОФС 42-0067-07.

Изучение стабильности суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе АОЭС при длительном хранении проводили с помощью физико - химических, химических, микробиологических методов анализа. С этой целью изготовлены три серии суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе АОЭС по разработанному и экспериментально изученному составу. Хранение лекарственных форм осуществлялось в условиях холодильника (4±2°С). Контролировали суппозитории на основе АОЭС в момент изготовления, через 3 мес., 6 мес., 9 мес., 1 год, 1 год и 6 мес., 1 год и 9 мес., 2 года и 3 мес. Определяли: внешний вид, среднюю массу, отклонение от средней массы, температуру плавления, подлинность, количественное содержание и микробиологическую чистоту. Изменение концентрации АОЭС укладывалось в ошибку методики количественного определения. Внешний вид, средняя масса, отклонение от средней массы, температура плавления, микробиологическая чистота суппозиториев на основе АОЭС, соответствуют требованиям ГФ XI и XII изд. и ОФС 42-0067-07 «Микробиологическая чистота». Результаты анализа суппозиториев на основе АОЭС в процессе хранения, свидетельствуют о стабильности разработанной лекарственной формы в течение 2-х лет.

Крем 1,5% на основе АОЭС контролировали в момент изготовления, через 3 мес., 6 мес., 9 мес., 1 год, 1 год и 3 мес. Определяли: внешний вид, рН, однородность, массу содержимого упаковки, подлинность, количественное содержание и микробиологическую чистоту. Изменение концентрации АОЭС укладывалось в ошибку методики количественного определения. Внешний вид, рН, микробиологическая чистота соответствуют требованиям ГФ XI и XII изд. и ОФС 42-0067-07 «Микробиологическая чистота». Результаты анализа крема 1,5% на основе АОЭС в процессе хранения, свидетельствуют о стабильности разработанной лекарственной формы в течение 1 года.

Одним из обязательных этапов доклинического изучения нового лекарственного препарата является изучение специфической активности и токсикологической безопасности.

Крем 1,5% на основе АОЭС, на экспериментальной модели термического повреждения кожи мышей проявляет противовоспалительные и репаративные свойства.

В результате экспериментального токсикологического изучения готовых лекарственных форм, разработанных на основе АОЭС - суппозиториев ректальных и крема 1,5% для наружного применения, установлено, что указанные лекарственные средства в условиях длительного применения не оказывают повреждающего действия на организм экспериментальных животных не раздражают кожу и слизистые оболочки. Крем 1,5% на основе АОЭС не обладает кожно-сенсибилизирующим действием.

ВЫВОДЫ

1.Впервые разработаны оптимальные составы и технология получения суппозиториев ректальных и крема 1,5% на основе арники облиственной экстракта сухого, обладающих противовоспалительными и ранозаживляющими свойствами.

2. Исследован качественный состав фенольных соединений в лекарственных формах методом ВЭЖХ. Установлены критерии подлинности и нормы содержания суммы фенольных соединений в пересчете на лютеолин-7-глюкозид в суппозиториях и креме. Разработанные методики количественного анализа суммы фенольных соединений методом спектрофотометрии валидированы.

3. Методом in vitro исследована кинетика высвобождения БАВ из суппозиториев, при этом установлено, что в качестве оптимальной основы для лекарственной формы выбран Твердый жир (Тип А).

4.В результате изучения структурно-механических, реологических свойств и предварительного фармакологического скрининга предложен рациональный состав крема 1,5% на основе арники облиственной экстракта сухого.

5. По результатам проведенных исследований оформлены проект фармакопейной статьи (ФС) на суппозитории ректальные и технические условия (ТУ 9369-187-04868244 - 2014) на крем 1,5%; опытно-промышленный регламент (ОПР 4868244-03-2014) на производство суппозиториев ректальных и технологическая инструкция на изготовление крема 1,5% на основе арники облиственной экстракта сухого.

6. Крем 1,5% на модели ожога у мышей обладает противовоспалительными и ранозаживляющими свойствами, не проявляет колено - сенсибилизирующего действия. Суппозитории ректальные и крем 1,5% нетоксичны и не вызывают раздражения кожи и слизистой оболочки экспериментальных животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Охотникова В.Ф., Михеева Н.С., Семкина O.A., Джавахян М.А., Азаркова А.Ф., Качалина Т.В.. Сокольская Т.А. Разработка суппозиториев на основе арники облиственной экстракта сухого. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, №5, 2013, с.IIIS.

2. Михеева Н.С., Охотникова В.Ф., Джавахян М.А., Качалина Т.В., Сокольская Т.В. Вспомогательные вещества, применяемые в технологии суппозиториев. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, №9, 2013, с. 16-19.

3. Михеева Н.С., Охотникова В.Ф., Сокольская Т.В. Выбор основы при технологии мазей. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, №10,2013, с. 26-28.

4. Охотникова В.Ф, Качалина Т.В., Балакина М.В., Джавахян М.А., Семкина O.A., Качалин Д.С., Климова Е.И., Михеева Н.С., Сокольская Т.А.. Современные мягкие лекарственные формы, содержащие фитопрепараты. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии №11,2013 г. с. 121-126.

5. Михеева Н.С., Охотникова В.Ф. Состав и оценка качества суппозиториев на основе Арники облиственной экстракта сухого. Молодые ученые и фармация XXI века. Сборник научных трудов. Материалы первой научно-практической конференции аспирантов и молодых ученых ГНУ ВИЛАР Россельхозакадемии, Москва, ВИЛАР 2013, с.110-113.

6. Бортникова В.В., Крепкова Л.В., Михеева Н.С., Охотникова В.Ф., Сокольская Т.А. Экспериментальное изучение лекарственных форм, созданных на основе арники облиственной экстракта сухого. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, №3,2014 г., с. 3-9.

7. Михеева Н.С. Обоснование целесообразности использования растения арники облиственной (Arnica foliosa NUTT.) с целью разработки лекарственных форм противовоспалительного и ранозаживляющего действия. «От растения к препарату: традиции и современность». Сборник научных трудов Всероссийской конференции посвященной 95-летию со дня рождения проф. А. И. Шретера. ВИЛАР. Москва, 2014 г. С.248-253.

8. Михеева Н.С., Охотникова, Бортникова В.В., Сокольская Т.А. Крем - как рациональная лекарственная форма. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии №12,2014 г. С. 14-20.

9. Бортникова В.В., Крепкова Л.В., Михеева Н.С. Гнугов В.Б. Изучение общетоксического действия арники облиственной экстракта сухого (Arnica foliosa NUTT.) //Тез. Докл. XXI Российский нац. конгресс «Человек и лекарство». М. 2014. С. 209.

10. Крепкова Л.В., Савинова Т.Б., Михеева Н.С. Изучение эмбриотоксичности арники облиственной экстракта сухого (Arnica foliosa NUTT.) /Яез. Докл. XXI Российский нац. конгресс «Человек и лекарство». М. 2014. С.269-270.

11. Крепкова Л.В., Бортникова В.В., Боровкова М.В., Михеева Н.С., Токсикологическое изучение Арники облиственной геля и суппозиториев// Тез. Докл. XIX Российский нац. конгресс «Человек и лекарство». М.2012. С.393.

12. Бортникова В.В., Крепкова Л.В., Михеева Н.С. Исследование аллергизирующего действия Арники травы экстракта сухого // Тез. Докл. XIX Российский нац. конгресс «Человек и лекарство». М.2012.С.474.

Подписано в печать:

11.02.2015

Заказ № 10539 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 vvww.autoreferat.ru