Разработка стандартного образца для оценки производных хлорофилла

Пасько, Екатерина Игоревна

Диссертации по медицине → Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Разработка стандартного образца для оценки производных хлорофилла

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Пасько, Екатерина Игоревна Москва 2011 г.

Ученая степень: кандидата фармацевтических наук

ВАК РФ: 14.04.02

Автореферат диссертации по медицине на тему Разработка стандартного образца для оценки производных хлорофилла

На правах рукописи

ПАСЬКО ЕКАТЕРИНА ИГОРЕВНА

РАЗРАБОТКА СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОИЗВОДНЫХ ХЛОРОФИЛЛА

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат '<нл

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва

г < марш

4841401

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН.

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук,

профессор Саканян Елена Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук Боковикова Татьяна Николаевна кандидат фармацевтических наук Кашникова Марина Вадимовна Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита состоится «// » дирслц 2Q11 г. в/У ч.^мин. на заседании диссертационного совета Д 006.070.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН (117216, г. Москва, ул.Грина, д.7) по адресу:123056, ул.Красина, д.2.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216, г. Москва, ул.Грина, д.7

Автореферат разослан «_»_2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 006.070.01

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Высокая частота распространения анемических состояний, нередко принимающих угрожающий жизни человека характер, а также ограниченность выбора лекарственных средств для лечения некоторых видов анемий, делают исследования по созданию новых препаратов с противоанемическим действием весьма актуальными.

Наиболее часто встречается железодефицитная анемия (ЖДА). По данным ВОЗ дефицит железа в той или иной степени имеется у 20% населения планеты, а ЖДА составляет около 80% всех анемий.

В настоящее время на отечественном фармацевтическом рынке лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения ЖДА, представлены препараты как зарубежного, так и отечественного производства. При этом следует отметить, что они относятся к двум группам: стимуляторы гемопоэза (витамины: фолиевая кислота, цианокобаламин, аскорбиновая кислота; серии, алоэ сок, глутаксим, ленограстим, натрия дезоксирибонуклеат, нартия нуклеоспермат, эпоэтин бета и др.) и препараты железа, а также сочетание этих двух групп в одном лекарственном средстве (актиферрин, актиферрин композитум, алое сироп с железом, биофер, венофер, гино-тардиферон, мальтофер фол, сорбифер дурулес, ферлатум, фероглобин -В 12, ферретаб, ферро-фольгамма, ферроплекс, хефарол и др.).

Лекарственные средства, содержащие железо, занимают лидирующие позиции в терапии ЖДА, однако их применение не всегда оказывает ожидаемый эффект ввиду недостаточного усвоения железа, поэтому необходимо проведение комплексной терапии, в которую входили бы вещества улучшающие усвоение железа. К таким веществам относятся соединения меди.

В настоящее время перечень препаратов, предназначенных для лечения ЖДА, содержащих ионы меди представлен такими лекарственными средствами как: тотема, ферроглобин В12 и меди

сульфата 1% раствор, а так же БАД (жидкий хлорофилл, фитоглобин, фитолон, радохлорофилл).

Однако, при оценке качества этих препаратов и БАД используются преимущественно методики химического и физико-химического анализа (колориметрия), которые не всегда отличаются достаточной чувствительностью и специфичностью и не отражают в полной мере особенностей химического состава анализируемых лекарственных средств.

В связи с этим представляется актуальным проведение исследований, связанных с разработкой технологии получения стандартного образца хлорофилльных производных меди, предназначенного к использованию в фармацевтическом анализе.

Цель исследования. Целью настоящего исследования является разработка технологии получения стандартного образца меди феофитината предназначенного для оценки качества лекарственных средств на основе производных хлорофилла и определение показателей его качества.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

1. Определить состав производных хлорофилла являющихся основой лекарственных средств, полученных из слоевищ ламинарии.

2. Разработать технологию получения стандартного образца меди феофитината а.

3. Установить показатели качества стандартного образца меди феофитината а и разработать методики их определения.

4. Оформить полученные результаты в виде проекта фармацевтической статьи (ФС).

5. Осуществить масштабированную наработку стандартного образца меди феофитината а и разработать лабораторный регламент на его получение.

6. Разработать методику оценки качества лекарственных средств на

основе производных хлорофилла с использованием полученного

стандартного образца меди феофитината а.

Научная новизна работы. Впервые изучен состав хлорофилльных комплексов, полученных из слоевищ ламинарии. Показано, что они представляют собой преимущественно хлорофилл а, который может быть использован в дальнейшем для получения феофитина а и его медной соли.

Доказана перспективность использования для получения стандартного образца меди феофитината а производных хлорофилла, полученных из листьев крапивы двудомной.

Разработана оригинальная схема получения стандартного образца меди феофитината а, на основе хлорофилльных комплексов листьев крапивы двудомной, которая успешно воспроизводится в лабораторных условиях с выходом конечного продукта не менее 90% по отношению к исходному растительному сырью.

Установлены основные показатели качества стандартного образца меди феофитината а и разработаны методики их определения. Полученные показатели использовались при оценке качества партий стандартного образца, наработанного по предложенной технологической схеме в лабораторных условиях и в процессе их хранения.

Впервые получен стандартный образец меди феофитината а, предназначенный для оценки качества субстанций и лекарственных средств, содержащих в своем составе медные производные хлорофилла.

Практическая значимость работы. Материалы исследования оформлены в виде:

• проекта ФС на стандартный образец меди феофитинат а,

• лабораторного регламента на производство стандартного образца меди феофитинат а,

• изменений и дополнений к НД на БАД фитолон по показателям подлинность и количественное определение.

Связь исследования с проблемным планам НИР. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2006-2010 гт.»5 заданию 04.13. Разработка технологии производства высокоэффективных лечебных и профилактических препаратов из растительного сырья.

На защиту выносятся следующие положения.

1. Результаты исследований по изучению химического состава хлорофилльных комплексов слоевищ ламинарии и крапивы двудомной.

2. Технология получения стандартного образца меди феофитината а из листьев крапивы двудомной.

3. Показатели качества стандартного образца меди феофитината а и методы их определения.

4. НД в виде проекта ФС «Меди феофитинат а, стандартный образец» и лабораторного регламента на его получение.

5. Методики определения подлинности и количественного содержания медных производных хлорофилла в БАД и лекарственных средствах.

конгресса, посвященного 30-летию со дня открытия Центрального НИИ рефлексотерапии «Традиционная медицина - 2007», Москва; доложены на региональной научной конференции студентов и аспирантов «Молодые ученые - практическому здравоохранению. 1819 апреля 2007» СПХФА, СПб.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 4 тезиса и 5 статей, в том числе 3 в журналах, рецензируемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, экспериментальной части, выводов, списка использованной литературы, приложений. Работа изложена на _120_ страницах машинописного текста, содержит 42 таблицы, 27 рисунков. Библиографический указатель включает 133 литературных источника, из них 32 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

Во введении изложена актуальность темы диссертации, определены цель и задачи исследования, раскрыта ее научная новизна и практическая значимость.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ (ГЛАВА 1)

Рассмотрена проблема железодефицитной анемии и способов ее коррекции, в том числе с использованием препаратов железа. Проведен обзор препаратов на основе хлорофилла, применяемых с этой целью в медицинской практике, рассмотрены свойства биологически активной добавки (БАД) к пище фитолон. Также в этой главе рассмотрены хроматографические методы выделения, очистки и контроля качества стандартных образцов. В этой же главе описаны свойства и приведены характеристики меди феофитина а, как основного компонента медных производных хлорофилла.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЕЛЕДОВАНИЯ (ГЛАВА 2)

Объектами исследования служило высушенное лекарственное растительное сырьё: слоевища ламинарии {Laminaria saccharina), сем. Ламинариевые (Laminariaceae), отвечающее требованиям ГФХ1 (ФС 83, с.377) и листья крапивы двудомной (Urtica dioica), сем. Крапивные (Urticaceae), отвечающее требованиям ГФХ1 (ФС 25, с.274) и ФСП 420045-0072-00.

Объектом исследования также служила биологически активная добавка к пище фитолон (капли) на основе медных произвдных хлорофилла из ламинарии во флаконах по 100 мл (ТУ 9284-02957912873-2005), серии 03042007 и 07022009.

Для измельчения лекарственного растительного сырья использовали измельчитель типа «Эксцельсиор».

Для получения медного комплекса феофитина использовали аппарат с магнитной мешалкой ПЭ-6110, от 120-1500 об./мин.

Подтверждение подлинности феофитинов а и б проводили с помощью тонкослойной хроматографии на в системе бензол-петролейный эфир-ацетон (10:2,5:2) на пластинках «Silufol».

Для выделения и очистки меди феофитината а использовали пластины для тонкослойной хроматографии "Sorbfil" ПТСХ-П-В-УФ и колонку диаметром 2 см, длинной 50 см, сорбент - алюминия гидроксид. Разделение проводили препаративно с помощью тонкослойной хроматографии в системе ацетон: петролейный эфир (1:4).

Для определения состава хлорофшшьных комплексов сырья использовали метод двумерной восходящей бумажной хроматографии (использовались следующие системы растворителей - система №1: бензол-петролейный эфир-ацетон 10:2,5:2; система № 2: бензол-петролейный эфир-ацетон-спирт этиловый 10:2,5:1:0,25) хроматографии на бумаге Filtrak № 11 и 16, а также методом ТСХ на пластинках "Sorbfil" ПТСХ-П-В-УФ.

Для качественной оценки меди феофитината применяли спектрофотометр СФ-2000, ИК-Фурье спектрометр. ИК-спектр снимали на ИК-Фурье спектрометре ФСМ-1201.

УФ-спектры области снимали в виде спиртовых растворов на СФ-2000. Спектры снимали в кювете с толщиной слоя 10мм, используя в качестве растворителей спирт этиловый 90 и 96% и ацетон.

Посторонние примеси и процентное содержание меди феофитината а в БАД фитолон оценивали методом ВЭЖХ с помощью жидкостного хроматографа типа «Миллихром».

Для определения массовой доли хлорофилла использовали метод Гетри.

Определение растворимости меди феофитината а осуществляли по методике, приведённой в ГФ XII издания (том 1 с.92) ОФС 42-004907 "Растворимость".

Определение потери в массе при высушивании в лекарственном средстве осуществляли по методике ГФ XI (том 2 с. 149).

Определение свободных ионов меди в лекарственном средстве, содержания тяжелых металлов в лекарственном средстве определяли по методикам ГФ XII (том 1, с. 121).

Определение объемной доли спирта этилового в лекарственном средстве проводили по методике изложенной в ГФ XII (том 1 с. 49) ОФС 42-0039-07.

Определение плотности в лекарственном средстве проводили по методике, изложенной в ГФ XII (том 1, с. 38) ОФС 42-0037-07.

Элементный анализ образцов меди феофитината а проводили на анализаторе СНК-З с использованием в качестве стандартов амида п-аминобензолсульфокислоты и лютеолина. Все определения повторяли 6-8 раз до получения воспроизводимых данных.

ИК-спектроскопию феофитина а, феофитина б и медной соли феофитина а проводили согласно методке изложенной в ГФ XII, (том 1, стр. 62), ОФС 42-0043-47, в диске калия бромида.

Статистическая обработка результатов биологических испытаний осуществлялась с учетом требований ГФ XI, (вып. 1, стр. 199), статья "Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний".

Валидация методик определения содержания меди феофитината а в ЛС на основе медных производных хлорофилла (МПХ) на примере БАД фитолон проводилась согласно требованиям ГОСТ Р ИСО 5725 от 2002.

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА МЕДИ ФЕОФИТИНАТА (ГЛАВА 3)

Анализ литературных данных и результаты собственных исследований, позволили установить, что лекарственные средства и БАД, применяемые для лечения ЖДА на основе медных производных хлорофилла, содержат преимущественно хлорофилл а в виде жирорастворимой формы (феофитина а). В этой связи представляется целесообразным проведение исследования по разработке технологии получения стандартного образца для оценки качества этих лекарственных средств в виде медной соли феофитина а.

Исследования хлорофилльного состава слоевищ ламинарии сахаристой как одного из наиболее часто используемых сырьевых источников препаратов и БАД, показало, что он представлен преимущественно хлорофиллом а. Это позволило приступить к разработке технологии получения стандартного образца меди феофитината а, минуя стадию разделения возможных феофитинов.

На рис. 1 приведена схема выделения феофитина а из слоевищ ламинарии. Технология получения феофитина а согласно этой схеме заключается в экстракции хлорофилла а из высушенных измельченных слоевищ ламинарии сахаристой спиртом этиловым 90% и последующей обработкой полученного спиртового извлечения

кислотой хлористоводородной 10% с целью вытеснения магния из хлорофилла с получением феофитина а. Выпавший в осадок феофитин а, после его отделения и промывания на фильтре кислотой хлористоводородной 10%, подвергали дополнительной очистке с использованием колоночной хроматографии (сорбент - силикагель, элюент эфир петролейный: ацетон в соотношении 4:1). Отгонку элюента проводили в вакуум-выпарном аппарате с последующей сушкой феофитина а в вакуумном эксикаторе.

Слоевища ламинарии _+_

Спиртовое извлечение

-1-

подкисление

Кислый спиртовой раствор феофитина "о* т

отделение осадка +

феофитан "а"

колоночная хроматография _♦_

Сушка в вакуум-эксикаторе

Рис.1. Схема выделения феофитина а из слоевищ ламинарии.

Для идентификации полученного феофитина а были использованы следующие методы: тонкослойная хроматография (ТСХ) и спектрофотометрия. ТСХ проводили в системе бензол-петролейный эфир-ацетон (10:2,5:2) на пластинках <&Пи1Ы». На хроматограмме наблюдается одна окрашенная зона адсорбции зеленого цвета с величиной Ш" 0,95, которая по значению Ш7 и окраске зоны адсорбции совпадает с таковыми приводимыми в литературных источниках для феофитина а (рис.2).

Рис.2. Схема тонкослойной хроматограммы феофитина а.

В УФ-спектре феофитина а, снятом в спирте этиловом 90% наблюдаются характерные полосы поглощения при длинах волн: 415 нм, 475 нм, 508 нм, 539 нм, 560 нм, 612 нм, 668 нм, что также согласуется с данными электронной библиотеки спектров феофитина а (рис.3).

Рис.3. УФ-спектр 0,001% раствора феофитина а в спирте этиловом

90%

Для подтверждения подлинности соединения нами было проведено изучение ИК-спектра, представленного на рисунке 3. В ЭСП в ИК области феофитина а полосы в области «отпечатков пальцев» полностью соответствуют ИК-спектру и частотам максимумов приведенных в литературе(рис.4). Таким образом, анализ спектра позволяет заключить, что выделенный феофитин представляет собой индивидуальное вещество и соответствует по структуре феофитину а.

Полученный нами из слоевищ ламинарии сахаристой феофитин а был использован для разработки стандартного образца меди

феофитината а. В качестве основного реагента использовали раствор меди хлорида 2%. Однако, при этом масса полученного стандартного образца была мала (порядка 0,01% по отношению к использованному сырью). В этой связи было принято решение об использование для получения стандартного образца другого растительного объекта, более богатого хлорофилльными производными. Проведенный нами анализ литературных данных позволил выделить среди таких объектов листья крапивы двудомной. Согласно литературным источникам содержание хлорофилла в листьях крапивы - не менее 1% в свежем сырье и не менее 0,7% в высушенном.

Для проведения исследований листья крапивы двудомной высушенные изначально были подвергнуты анализу на их соответствие требованиям ФСП 42-0045-0072-00, для количественного определения хлорофилла в сырье использовался метод Гетри, табл. 1.

Полученные данные свидетельствуют о том , что содержание хлорофилла в листьях крапивы двудомной высушенных составляет около 0,8%.

Условные обозначения:

По оси абсцисс - волновое число, 1/см По оси ординат • пропускание, Т

Рис. 4.ИК-спектр области феофитина а.

Таблица 1. Содержание хлорофилла в листьях крапивы (п=5,Р>95%)

Номер образца Содержание, % Метрологические характеристики

1 0,76 х=0,78

2 0,78 Б=0,0056

3 0,75 8х=0,0025

4 0,81 Дх=0,007

5 0,78 е=0,9%

Для определения оптимальных условий извлечения комплекса хлорофилла из листьев крапивы двудомной было изучено влияние различных факторов на процесс экстрагирования. В качестве основных были отобраны следующие факторы: измельченность, соотношение сырья и экстрагента, продолжительность процесса экстракции, количество экстракций. Во всех случаях в качестве экстрагента был использован спирт этиловый 90%. Для дальнейшей работы были выбраны следующие условия проведения экстракции: измельченность сырья 1-2мм, соотношение сырья и экстрагента 1:5, кратность 2, продолжительность экстракции 3 ч. Эффективность процесса экстракции проиллюстрирована на рис. 5. В качестве основного критерия был выбран выход производных хлорофилла.

Рис. 5. Эффективность процесса экстракции хлорофилла из листьев крапивы двудомной этиловым спиртом 90%

На основании проведенных исследований можно заключить, что выбранные параметры проведенной экстракции являются оптимальными, приводя к извлечению из сырья порядка 92% хлорофилла. Анализ выделенных хлорофилловых комплексов позволил установить, что они представлены производными хлорофилла а и б. Для получения стандартного образца меди феофитината а использовался метод экстрагирования сырья спиртом этиловым 90%, с последующей обработкой полученной вытяжки 10% раствором хлористоводородной кислоты и добавлением воды очищенной. Смесь феофитинов а и б выделялась в виде осадка.

На стадии выделения смеси феофитинов а и б проводилось подтверждение их подлинности. Для этого использовали метод ТСХ в системе бензол-петролейный эфир-ацетон (10:2,5:2). Наблюдаются зоны адсорбции: с величиной Rf 0,95-зона темно-зеленого цвета -феофитин а, с величиной Rf 0,85-зона светло-зеленого цвета -феофитин б.

В ультрафиолетовом спектре смеси феофитинов а и б, снятом в спирте этиловом 90%, наблюдаются характерные полосы поглощения при длинах волн: 415, 435, 508, 539, 560, 610, 668 нм. Наиболее выраженные максимумы поглощения зафиксированы при длинах волн - 415±2 нм и 668±2 нм.

Нами была разработана методика получения медной соли феофитина а из очищенного методом колоночной хроматографии феофитина а. Однако очищенный феофитин а неустойчив и при получении медной соли образуется множество изомеров и примесей, что затрудняет выделение индивидуального вещества и уменьшает выход стандарта. Поэтому в дальнейшем выделение медной соли феофитина а проводили из смеси медных солей феофитинов а и б методом ТСХ (рис.6).

Полученный стандартный образец феофитина меди а представляет собой аморфный порошок тёмно-зелёного цвета, без запаха, мало растворимый в спирте, хорошо в хлороформе, петролейном эфире, ацетоне. Для оценки подлинности использовали физико-химические методы анализа: Ж- и УФ-спектроскопию, ЯМР-спектроскопию, элементный анализ. Инфракрасный спектр

Подготовка помещений, персонала, вспомогательных

8Р 1.2.

Подготовка сырья, экстра гентов

ТП1.1.

Цобавлеиие к растительному сырью _экстрагентз_

ТП 1.2.

Экстрагирование в течение 2 часов [

ТП 1.3.

Фильтрация

Цобавление к растительному сырью экстрзгента

ТП 1.6.

| Экстрагирование в течение 2 часов |.

Ц}

Фильтрация

ТП 1.7.

Добэзление 10% раствора хлористоводородной кислоты

ТП 1.8.

Выдерживание в течение 24 часов I

ТП 2.2. I Фильтрация вытяжки

ТП 2.3. | Промывание осадка спиртом |-

ТП 3.1.

Растворение СиС12 в спирте этиловом

ТП 3.2.

Растворение осадка а спирте __этиловом _

ТП 3.3.

Сушка в эксикаторе

Заполнение хроматографической камеры системой

ТП 4.2.

Разделение смеси феофитинов а и

ТП 5.1.

Заполнение хроматографической камеры системой_

ТП 5.2.

Очистка препарата

УМО 1.1.

Упаковка под обкатку

УМО 1.2.

Маркировка

УМО 1.3.

Готовая продукция

ВР1 Подготовительные пябпты

ТП 1 :пиртовЬго

Получение кислого извлечения_

ТП 2 Отделение смеси

ТПЗ Получение медного

комплекса

ТП4 П| епаративное выделение (Ьеофитина а

ТП 5 Очистка препарата тонкослойной хроматографией

УМ01 Упаковка

Рис. 6. Технологическая схема производства стандартного образца -

меди феофитината а.

меди феофитината а, высушенного при температуре от 100 до 105°С в течение 1,5ч, в области частот от 500 до 4000 см"1 представлен на рис. 7.

При получении медного комплекса феофитина происходит сдвиг максимума поглощения в УФ области с 667±2 нм до 657±2 нм, а также исчезают максимумы поглощения при длине волны 506 и 534 нм (рис. 8). Соотношение величины оптической плотности D415 и D657 составляет 1,24, что свидетельствует о чистоте препарата, в частности о полноте прохождения коплексообразования.

Определение содержания меди феофитината а в стандартном образце «Меди феофитинат а» производилось с использованием метода ВЭЖХ на колонке Kromasil С18, 7 мкм, подвижная фаза: ацетон-ацетонитрил 55%:45% при скорости 1 мл.мин, детекция осуществлялась при длине волны 430 нм (рис. 9).

Рис. 7. РЖ-спектр области меди фефитината а.

Рис. 8 УФ-спектр области 0,001% раствора меди феофитината а.

5 9"ЯД

__л I —

I 1 ) 4 г * 5 9 Э И И и 13 М й 'ши

Рис.9. ВЭЖХ стандартного образца меди феофитината а.

Были определены основные показатели качества стандартного образца меди феофитината а, полученные данные представлены в табл. 2.

Таблица 2. Основные характеристики стандартного образца меди феофитината а

Характеристика Значение, заложенное в НД

Описание Меди феофитинат а представляет собой аморфный порошок тёмно-зелёного цвета, без запаха.

Растворимость Определение проводили по методике ГФ XII, ОФС 42-0049-07. Полученный стандартный образец мало растворим в спирте, хорошо растворяется в хлороформе, петролейном эфире, ацетоне.

Ультрафиолетовый электронный спектр 0,001% раствора меди феофитината в ацетоне, в области длин волн от 390 нм до 680 нм имеет полосы поглощения с максимумами при длинах волн: 415 нм ±2 нм и 657 нм ± 2 нм.

Инфракрасный спектр меди феофитината Соответствует приведенному в НД

Потеря в массе при высушивании Не более 7%

Количественное определение, ВЭЖХ Не менее 92%

Удельный показатель поглощения Ь ]см 202,6

Способ хранения В защищенном от света месте при температуре от 0 до 5° С

Упаковка Ампулы темного стекла

СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ (ЛС) И

БАД НА ПРИМЕРЕ СУБСТАНЦИИ МЕДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ХЛОРОФИЛЛА И ФИТОЛОНА (ГЛАВА 4)

В соответствии с требованиями ОСТа 91500.05.001.00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения» предъявляемыми к ЛС, субстанции медных производных хлорофилла и БАД фитолон (на основе МПХ) исследовались по следующим показателям: описание, подлинность, плотность, объемная доля этилового спирта, посторонние примеси, тяжелые металлы, определение сухого остатка, количественное определение. Для определения подлинности субстанции МПХ и БАД фитолон предложено использовать УФ-спектроскопию с использованием стандартного образца меди феофитината а. Так как согласно существующей НД для количественного определения МПХ и БАД фитолон используется фотоколориметрический метод, основанный на применении в качестве колориметрического стандарта смеси неорганических веществ, была предложена спектрофотометрическая методика определения медных производных хлорофилла с использованием стандартного образца меди феофитината а (табл.4).

Таблица 4. Содержание МПХ в БАД фитолон

№

серии

Содержание МПХ

В пересчете на меди феофитинат а, мг/мл

С использованием стандартного раствора Гётри, мг/мл

1 0,59

2 0,60

3 0,57

4 0,63

5 0,58

Х = 0,5940 S = 0,6641 Sx = 0,297 А х = 0,0206 е = 3,3 %

0,91 0,89 1,12 1,00 0,98

X = 0,980 S = 1,096 Sx = 0,490 Ах = 0,0812 в = 8,3%

Проведена валидация методики определения содержания меди феофитината а в субстанции, установлены параметры линейности, повторяемости, воспроизводимости и правильности разработанной методики. В результате проведения опытов с добавками стандартного образца меди феофитината а установлено, что относительная погрешность методики имеет отклонения в сторону как положительных, так и отрицательных значений, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки, табл. 6.

Таблица 6. Определение правильности методики количественного определения содержания МПХ в БАД фитолон

№ Содержание Добавлен Ожидаемое Получен- Откло- Ошиб-

п/ МПХ в о PCO содержание, ное нение от ка, %

п исследуемо меди мг содержан расчетной

м растворе, феофити- ие, мг величины,

мг ната а, мг мг

1 5,6002 0,3920 5,9940 5,9900 -0,0040 -0,07

2 5,6002 0,3920 5,9940 5,9960 0,0020 0,03

3 5,6002 0,3920 5,9940 5,9950 0,0010 0,02

4 5,6002 0,8403 6,4405 6,4456 0,0051 0,08

5 5,6002 0,8403 6,4405 6,4403 -0,0002 -0,01

6 5,6002 0,8403 6,4405 6,4445 0,0040 0,06

7 5,6002 1,6806 7,2822 7,2847 0,0025 0,03

8 5,6002 1,6806 7,2822 7,2826 0,0004 0,01

9 5,6002 1,6806 7,2822 7,2801 -0,0021 0,03

Среднее значение 0,01%

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ.

1. Изучен состав хлорофилльных комплексов, выделенных из слоевищ ламинарии. Установлено, что он представлен производными хлорофилла а.

2. Разработана схема выделения феофитинатов а и б из слоевищ ламинарии и листьев крапивы двудомной. Доказана целесообразность использования для получения стандартного образца меди феофитината а сырья -листья крапивы двудомной высушенные.

3. Разработана технология получения стандартного образца меди феофитината а из листьев крапивы двудомной высушенных с выходом не менее 90% от содержания в сырье. Осуществлена масштабированная наработка стандартного образца и составлен регламент на его получение.

4. Установлены основные показатели качества стандартного образца меди феофитината а и предложены методики их определения.

5. Составлен проект ФС на стандартный образец меди феофитинат а. Определены упаковка, условия и сроки хранения стандартоного образца меди феофитината а. На момент наблюдений срок годности составил не менее 1 года.

6. Доказана целесообразность оценки качества лекарственных средств и БАД, на основе медных производных хлорофилла, с применением для этих целей разработанного стандартного образца меди феофитината а.

Список опубликованных работ

1. Пасько, Е. И. Разработка и стандартизация субстанции для жидкой лекарственной формы на основе МПХ / Е. И. Пасько, Е. И. Саканян, К.Э. Кабишев, Е.В. Кобелева // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник науч. тр. Пятигорской ГФА - Пятигорск, 2007.- вып. 62.- С. 342-343.

2. Кабишев, К.Э. Перспективы разработки составов, технологии и методов стандартизации средств растительного происхождения / К.Э. Кабишев, Е.И.Пасько, Е.В. Кобелева, Е.И. Саканян // Вестник Российской медицинской академии - 2007 - № 1(17).-С. 151-152.

3. Пасько, Е.И. Антианемическая активность жидкой лекарственной формы на основе медных производных хлорофилла из ламинарии / Е.И. Пасько, Е.И. Саканян, К.Э. Кабишев // Сборник науч. трудов конгресса, поев. 30-летию со дня открытия Центрального НИИ рефлексотерапии, «Традиционная медицина -2007». Москва. 1-Змарта 2007.- М., 2007,- С. 76-77.

4. Пасько, Е.И. Разработка технологии и методов оценки качества стандартного образца медной соли феофитина а / Е.И. Пасько, Е.И. Саканян, К.Э. Кабишев // Материалы региональной научно-практической конференции, посвященной 40-летию фармацевтического факультета КГМУ «Достижения, проблемы и перспективы фармацевтической науки и практики».Курск. 15 декабря 2006,-Курск, 2006.- С. 232-234.

5. Пасько, Е.И. К вопросу о разработке лекарственного средства для лечения железодефицитной анемии на основе медных производных хлорофилла / Е.И. Пасько, Е.И. Саканян, К.Э. Кабишев, Л.Ф. Стрелкова // Сб. материалов третьей международной научно-практической конференции МЕДБИОТЕК "Актуальные вопросы

инновационной деятельности в биологии и медицине". Москва, 4-5 декабря 2006.-М., 2006.- С. 72-73.

6. Пасько, Е.И. К вопросу о разработке стандартного образца медных производных хлорофилла и стандартизации жидкого лекарственного средстваиз слоевищ ламинарии / Е.И. Пасько, Е.И. Саканян, К.Э. Кабишев, Л.Ф. Стрелкова, М.А. Царькова, Е.В. Кобелева // Академический журнал Западной Сибири- 2006 - № 6. - С.24-27.

7. Пасько, Е.И. Разработка жидкой лекарственной формы на основе медных производных хлорофилла из слоевищ ламинарии для лечения железодефицитной анемии / Е.И. Пасько, К.Э. Кабишев // Сб. тезисы докладов региональный научной конференции студентов и аспирантов "Молодые ученые - практическому здравоохранению". 18-19 апреля 2007.- СПб.: Изд-во СПХФА, 2007 -С. 22-23.

8. Пасько, Е.И. Разработка технологии и показателей качества стандартного образца, используемого для оценки качества лекарственного средства «Фитолон» / Е.И. Пасько, Е.И. Саканян, К.Э. Кабишев, Л.Ф.Стрельникова, М.А. Царькова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. Пятигорской государственной фармацевтической академии.- Пятигорск, 2006- вып.61- 632 с.

9. Саканян Е.И., Разработка жидкой лекарственной формы на основе медных производных хлорофилла из слоевищ ламинарии/ Е.И.Саканян, Е.И.Пасько, К.Э.Кабишев// Журнал «Вопросы биологической, фармацевтической и медицинской химии», 2010. - № 12.-С.8-13.

Пасько Екатерина Игоревна. «Разработка стандартного образца для оценки производных хлорофилла»

Объем -1,5 условных печатных листа. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Тираж 100 экз. Подписано в печать: 03.03.2011. Заказ № 439. Отпечатано с оригинал-макета в Полиграфическом центре ООО «ДжазПринт». 191119, Санкт-Петербург, ул. Марата, д. 70А-70Б, т./ф: (812) 404-65-54.

Оглавление диссертации Пасько, Екатерина Игоревна :: 2011 :: Москва

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 .СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ КАЧЕСТВА 10 ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ И БАД НА ОСНОВЕ ПРОИЗВОДНЫХ ХЛОРОФИЛЛА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА И БАД К ПИЩЕ В 10 ПРОФИЛЛАКТИКЕ И ТЕРАПИИ ЖЕЛЕЗОДЕФИЦИТНОЙ АНЕМИИ

1.2. ПРОИЗВОДНЫЕ ХЛОРОФИЛЛА. СВОЙСТВА И 14 ПРИМЕНЕНИЕ В МЕДИЦИНЕ

1.3 СВОЙСТВА ФЕОФИТИНА А И ЕГО МЕДНОЙ СОЛИ

1.4 СТАНДАРТНЫЕ ОБРАЗЦЫ И ИХ РОЛЬ В ОЦЕНКЕ 30 КАЧЕСТВА ЛЕКАРТСВЕННЫХ СРЕДСТВ

Выводы

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования, растворители, реактивы

2.2. Приборы и оборудование

2.3. Методики анализа, применяемые в исследовании

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ 49 СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА МЕДИ ФЕОФИТИНАТА^

3.1 Анализ хлорофилльного комплекса слоевищ ламинарии сахаристой

3.2. Разработка технологии выделения феофитина а из слоевищ 50 ламинарии сахаристой

3.3. Разработка технологии получения стандартного образца меди 56 феофитината а из листьев крапивы двудомной высушенных

3.3.1. Оценка доброкачественности сырья и количественное 57 определение хлорофилла в листьях крапивы двудомной

3.3.2. Изучение технологических показателей сырья

3.3.3. Исследование основных факторов, влияющих на процесс 59 экстрагирования хлорофилла из листьев крапивы двудомной

3.3.4 Изучение эффективности процесса экстракции

3.4. Разработка технологии получения стандартного образца 62 меди феофитината а

3.4.1. Разработка технологической схемы получения 63 стандартного образца меди феофитината а

3.4.2. Оценка качества стандартного образца меди феофитината а 69 Выводы

ГЛАВА 4. СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ 77 (ЛС) И БАД НА ПРИМЕРЕ СУБСТАНЦИИ МЕДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ХЛОРОФИЛЛА И ФИТОЛОНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СО МЕД И ФЕОФИТИНАТА А

Выводы

Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия, фармакогнозия", Пасько, Екатерина Игоревна, автореферат

Актуальность темы. Высокая^ частота распространения анемических состояний, нередко принимающих угрожающий жизни человека характер, а также ограниченность выбора-лекарственных средств для лечения некоторых видов анемий, делают исследования- по созданию новых препаратов с противоанемическим действием весьма актуальными.

Наиболее часто, встречается железодефицитная анемия (ЖДА). По данным ВОЗ дефицит железа в той или иной степени имеется у 20% населения планеты, а ЖДА составляет около 80% всех анемий.

В настоящее время на отечественном фармацевтическом рынке лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения ЖДА, представлены препараты, как зарубежного, так и отечественного производства. При этом следует отметить, что они относятся к двум группам: стимуляторы гемопоэза (витамины: фолиевая кислота, цианокобаламин, аскорбиновая кислота; серин, алоэ сок, глутаксим, ленограстим, натрия дезоксирибонуклеат, натрия нуклеоспермат, эпоэтин бета и др.) и препараты железа, а также сочетание этих двух групп в одном лекарственном средстве (актиферрин, актиферрин композитум, алое сироп с железом, биофер, венофер, гино-тардиферон, мальтофер фол, сорбифер дурулес, ферлатум, фероглобин -В 12, ферретаб, ферро-фольгамма, ферроплекс, хефарол и др.).

В настоящее время перечень препаратов предназначенных для лечения ЖДА, содержащих ионы меди представлен такими лекарственными средствами как: тотема, ферроглобин В12 и меди сульфата 1% раствор, а так же БАД (жидкий хлорофилл, фитоглобин, фитолон, радохлорофилл).

Однако при- оценке качества этих препаратов и БАД используются преимущественно методики химического- и- физико-химического анализа (колориметрия), которые не всегда отличаются достаточной чувствительностью и специфичностью' и не отражают в полной мере особенностей химического состава, анализируемых лекарственных средств.

В связи с этим, представляется актуальным проведение исследований, связанных с разработкой технологии получения стандартного образца хлорофилльных производных меди, предназначенного к использованию в фармацевтическом анализе.

Цель исследования. Целью настоящего исследования является разработка технологии получения стандартного образца меди феофитината а предназначенного для оценки качества лекарственных средств на основе производных хлорофилла и определение показателей его качества.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

2. Разработать технологию получения стандартного образца меди феофитината а.

4. Оформить полученные результаты в виде проекта фармакопейной статьи (ФС).

6. Разработать методику оценки качества лекарственных средств на основе производных хлорофилла с использованием полученного стандартного образца меди феофитината а.

Доказана перспективность использования для" получения стандартного образца меди феофитината производных хлорофилла, полученных из листьев крапивы двудомной.

Установлены основные показатели качества стандартного образца« меди феофитината а и разработаны методики их определения. Полученные показатели использовались при оценке качества партий стандартного образца, наработанного по предложенной» технологической' схеме в лабораторных условиях и в процессе их хранения.

Впервые получен стандартный образец меди феофитината а предназначенный для оценки качества субстанций и лекарственных средств, содержащих в своем составе медные производные хлорофилла.

Практическая значимость работы. Материалы исследования оформлены в виде:

• проекта ФС на стандартный образец меди феофитинат а,

• лабораторного регламента на производство стандартного образца меди феофитинат а,

• изменений и дополнений к НД на БАД фитолон по показателям подлинность и количественное определение.

Связь исследования с проблемным планом НИР. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2006-2010 гг.», заданию 04.13. Разработка технологии производства высокоэффективных лечебных ^профилактических препаратов из растительного сырья. На защиту выносятся следующие положения.

1. Результаты исследований* по изучению химического состава хлорофилльных комплексов слоевищ ламинарии и крапивы двудомной.

2. Технология получения стандартного образца меди феофитината а из листьев крапивы двудомной.

3. Показатели качества стандартного образца меди феофитината а и методы их определения.

4. НД в виде проекта ФС «Меди феофитинат а, стандартный образец» и лабораторного регламента на его получение.

Апробация. Основные результаты исследований представлены в материалах региональной научно-практической конференции, посвященной 40-летию фармацевтического факультета КГМУ «Достижения, проблемы и перспективы фармацевтической науки и практики». - Курск, 2006; в сборнике материалов. Третьей международной научно-практической конференции МЕДБИОТЕК «Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине (Москва, 4-5 декабря 2006)»; в сборнике научных трудов конгресса, посвященного 30-летию со дня открытия Центрального НИИ рефлексотерапии «Традиционная медицина -2007», Москва; доложены на региональной научной конференции студентов и аспирантов «Молодые ученые - практическому здравоохранению. 18-19 апреля 2007» СПХФА, СПб.

ГЛАВА ^.СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ И БАД НА ОСНОВЕ ПРОИЗВОДНЫХ ХЛОРОФИЛЛА (ОБЗОР . ЛИТЕРАТУРЫ) ■

Заключение диссертационного исследования на тему "Разработка стандартного образца для оценки производных хлорофилла"

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

2. Разработана схема выделения феофитинатов а и Ь из слоевищ ламинарии и листьев крапивы двудомной. Доказана целесообразность использования для получения стандартного образца меди феофитината а сырья -листья крапивы двудомной высушенные.

4. Установлены основные показатели качества стандартного образца меди феофитршата а и предложены методики их определения.

5. Составлен проект ФС на стандартный образец меди феофитинат а. Определены упаковка, условия и сроки хранения стандартного образца меди феофитината а. На момент наблюдений срок годности составил не менее 1 года.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Пасько, Екатерина Игоревна

1. Аразашвили А.И. Биологически активные вещества и другие природные соединения морских водорослей. Тбилиси: Изд-во «Мицниереба», 1980. - 336 с.

2. Арзамасцев А.П. Химические стандартные образцы, применяемые в анализе лекарственных веществ. В кн.: Современные проблемы фармацевтической науки и практики. Киев, 1972, с. 588-589.

3. Арзамасцев А.П., Сенов П.Л. Стандартные образцы лекарственных веществ. М., «Медицина», 1978, 248с.

4. Аркадьева Г.В, Диагностика и лечение железодиефицитных анемий. М.: ВУНМЦ, 1999, 59-63 с.

5. Багирова B.JI. Актуальные вопросы экспертизы и стандартизации лекарственных средств/ Багирова B.JL, Ковалёва E.JL, Шаназаров К.С.// Химико-фармацевтический журнал. 2005. т.39. №6.

6. Барашков Г.К. Химия водорослей. М., 1963. - 143 с.

7. Басова, Е.М. Влияние природы неподвижной фазы и гидрофобности лиганда в ион-парной хроматографии хелатов металлов / Е.М. Басова, O.A. Шпигун, В.М. Иванов // Вестник московского университета. -1999.- сер.2 химия, Т. 40, №6, С.102-106.

8. Беликов В.Г. Анализ лекарственных веществ фотометрическими методами. Опыт работы отечественных специалистов// Рос.хим.ж. -2002. T.XLVI. №4, с.52-56.

9. Ю.Белошевский В.А. Железодефицит у взрослых, детей и беременных. -Воронеж, 2000, 121-132 с.

10. П.Белошевский В.А., Мннаков Э.В. Анемия при хронических заболеваниях./ Издательство Воронежского университета. 1995, 34-37 с.

11. Беспалов В.Г. Лечебно-профилактические препараты из морских водорослей. СПб.: Изд-во СПБГПУ, 2004. 160 с.

12. Билич И.Л. Кламин и Фитолон препараты выбора для профилактики илечения в гастрэнтерологиии/ в сб. Изучение лечебно-профилактических препаратов на основе природных биологически активных веществ. -СПб.: Эскулап, 2000. С. 236

13. Бохински Р. Современные воззрения в биохимии: Пер. с англ. - М.: Мир, 1987. - 544 с.

14. Брыкина Г.Д., Лазарева Е.Е., Уварова М.И., Шпигун O.A. Высокоэффкективная жидкостная хроматография комплексов металлов с феофитинами а и Ь. Ж. Аналитической химии, 1997, том 52, № 10, с. 1067-1072.

15. Верболович П.А., Верболович В.П, В: Большая медицинская энциклопеия. М.: Советцкая энциклопедия, 1986, с. 15-16.

16. Волков B.C., Кириленко Н.П, Железодефицитные состояния./ Кардиология №6, т.31, 1991, 64-67 с.

17. Гагаринова В.М. От неспецифической резистентности организма к неспецифической профилактике инфекционных заболеваний: возможности и перспективы, НИИЭМ им. Пастера, СПб., 2002, с.20-21.

18. Гапоненко В.И. Влияние внешних факторов на метаболизм хлорофилла.- Минск, «Наука и техника», 1976, 240 с.

19. Гельфонд M.JI. Некоторые аспекты механизма действия препарата «Фитолон»/, в сб. Изучение лечебно-профилактических препаратов на основе природных биологически активных веществ.- СПб.: Эскулап, 2000.-297-299 с.

20. Гельфонд М.Л., Зарецкий A.M., Каплан М.А. Методические рекомендации по применению фотодинамической терапии/ ж. Лечащий врач № 10, декабрь 2004 г, с. 24-25.

21. Годнев Т.Н. Стороение хлорофилла и методы его количественного определения, Минск, 1952. 200 с.

22. Годнев Т.Н. Строение хлорофилла и возможные пути его образования в растении, Тимерязевские чтения VI, изд-во академии наук СССР, М., 1947, 49с.

23. Горохова С.Г. Лечение железодефицитных состояний. Всё ли решено?// РМЖ. 2004. т. 12. № 17.

24. Государственная фармакопея российской федерации.-ХП изд., часть.1/ Изд-во: «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», 2008.- 704с.

25. Гуринович Г. П., А. И. Севченко, К. Н. Соловьев Спектроскопия порфиринов/ Ж. Успехи Физических Наук, 1963 г. Февраль Т. Л.ХХ1Х, вып. 2 с. 173-234.

26. Даиилов Л.Н. Экспериментальное влияние медных производных хлорофилла на заживление послеоперационной раны/ в сб. Изучение лечебно-профилактических препаратов на основе природных биологически активных веществ.- СПб.: Эскулап, 2000. с.394.

27. Дворецкий Л.И, Алгоритмы диагностики и лечения железо дефицитной анемии// РМЖ. 2002. т. 10. № 17.

28. Дворецкий Л.И. Железодефицитные анемии. -М.: Ньюдиамед АО,1998, 40-59с.

29. Дворецкий Л.И. Железодефицитные анемии//РМЖ 1997.Т.5. № 19.

30. Дегтярев Е.В. Анализ лекарственных средств в исследованиях, производстве и контроле качества// Рос.хим.ж. 2002. т.ХЬУТ. №4, с.43-51.

31. Дмитриева Н.В., Климов А.А, и др. Изучение противогрибковой активности препарата Фитолон/ в сб. Изучение лечебно-профилактических препаратов на основе природных биологически активных веществ. -СПб.: Эскулап, 2000. С. 314-318

32. Дорсон Р., Эолиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика, М.: Мри, 1991, 544с - ил.

33. Дриневский В.П. Острые респираторные инфекции у детей и подростков/ Дриневский В.П., Осидак Л.В., Цымбалова Л.М.- СПб.: СпецЛит, 2003.-181 с.

34. Дьяков Ю.Т. Введение в альгологию и микологию: Учебное пособие. -М.: изд-во МГУ, 2000 с. 192.

35. Евгеньева И.И. Планарная хроматография и анализ органических веществ / И.И. Евгеньева // Соросовский образовательный журнал.1999. -№ 11, С.50-55./

36. Зубов Л.А., Савельева Т.А. Целебный дар моря. Архангельск, 1997. -18 стр.44.3узук Б. М., Куцик Р. В. Ламинария сахаристая (син. Морская капуста) Laminaria saccharina (L.) Lamour (Аналитический обзор)// ж-л Провизор.- 2004.№ 8,№9

37. Кадымова К.Г. Хлорофилл в лечении ран // Сб. науч. работ НИИ рентгенологии, радиологии, онкологии. Баку, 1953. С. 223-230.

38. Калинин Ф.Л., Лобов В.П., Жидков В.А. Справочник по биохимии. -Киев: изд-во «Наукова думка» 1971.

39. Ковалёва Е.Л. От внедрения ОСТ 91500.05.001.00 "Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения" к созданию государственной фармакопеи/ Ковалёва Е.Л., Багирова В.Л., Шаназаров К.С.// Химико-фармацевтический журнал. 2003.Т. 37. №11.

40. Коган Ю.Д. Отечественное оборудование для количественной тонкослойной хроматографии/ Коган Ю.Д., Гольцберг М.А. // Рос. хим. ж. (Ж. об-ва им. Д.И. Менделеева), 2003, т. XLVII, №1, с.136-139.

41. Козинец Г.И„ Макаров В.А. Исследование системы крови в клинической практике./ред., М.: Триада-Х, 1997., 54-68с.

42. Койфман О.И., Березин Б.Д. Реакционная способность порфирина и хлорина в реакциях с солями мелаллов. Ж. Общей химии, Изд-во Науки, Ленинград, 1970, Вып. 12, Т. 40, с. 2710-2705.

43. Красновский A.A. Преобразование энергии света при фотосинтезе. Молекулярные механизмы, М., 1974 (Баховские чтения, 29)

44. Курнигина В.Т., Никитина Т.В. Антибактериальное действие препаратов хлорофилла // Тез. докл. 8-го совещ. по проблемам фитонцидов. Киев, 1979. С. 55.

45. Лукьяненко В.И., Фрагина А.И., Черноморский С.А. Антимикробные, регенеративные, дезодорирующие свойства препаратов хлорофилла. -М., 1968. С. 34-35.

46. Маркарян, A.A. Разработка методов контроля качества и фармакологическое изучение комплексного средства растительного происхождения- гранулы «нефрофит»/ Маркарян A.A.// Вестник московского университета. 2003.- сер.2 химия, Т. 44, №6, С.422-425.

47. Мешковский А.П. Обеспечение качества фармацевтических субстанций за рубежом сегодня и завтра// ж-л "Фарматека". - 2000.№ 1(37).

48. Моисеева М.В., Михайлец Г.А. Применение производных хлорофилла в медицине/ в сб. Изучение лечебно-профилактических препаратов на основе природных биологически активных веществ.-СПб.:Эскулап,2000.- с.297-299.

49. Надинская М.Ю. Анемия// ж. Consillium provisorum. 2002 т.2. №2.

50. Некрасова В.Б. Экстракт ламинарии/ Некрасова В.Б., Полянская Т.Е. // Пищевая и перерабатывающая промышленность, 1987. №9. - С.35-36.

51. ОСТ 91500.05.001.00 "Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения".

52. Пахомов В.П. Хроматография в химико-фармацевтических исследованиях (к 100-летию открытия хроматографии М.С. Цветом)// ХФЖ.-2003.т.37.№8.

53. Рекомендации к применению препарата ФИТОЛОН из ламинарии, НИИ гриппа РАМН, №20-л от 11.10.01

54. Рожило, Я.К. Проблема оптимизации процессов разделенияв адсорбционной тонкослойной хроматографии/ / Я:К. Рожило,: Ш.

55. Рудаков О.Б;, Селеменев В.Ф. Физико-химические системы сорбат-сорбент-элюент. Воронеж: ВГУ, 2003, 300с.

56. Сакодынский К.И:,Бражников В.В. и др. Аналитическая хроматография. М^: Химия; 1993г. 464 с.

57. Стренев Ф.В. Об изменениях сердца, центральной гемодинамики и физической работоспособности под влиянием железодефицитной анемии легкой и средней тяжести./ 1989, 45-47 с.

58. Сумина Е.Г. Применение поверхностноактивных веществ для модификации подвижных и неподвижных фаз при определении пищевых красителей методом ТСХ/ Сумина Е.Г., Ермолаева Е.В. // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 2001. Т.67, №5, с.5-8.

59. Сумина Е.Г. Гидрофобная ТСХ фенилкарбоновых кислот трифенил метанового ряда в мицеллах ПАВ/ Сумина Е.Г., Штыков С.Н, Тюрина Н.В.//Химиями химическая технология. 2001. Т.44. №4. с.10-13.

60. Тимирязев К.А, Солнце, жизнь и хлорофилл. Избр. Соч., т.1, М., 1948, 10с.

61. Титов А.М. Морские водоросли уникальное сырьё для изготовления лекарственных препаратов и БАД// СПб: ООО "Центр Биотехнологий "БИОНЕТ", 2001, 20с.

62. Тринус Ф.П. Фармакотерапевтический справочник. Киев: Изд. «Здоровья», 1988, 640 с.

63. Трифонов А.В. Опыт применения препарата Фитолон в комплексной программе реабилитации больных/ в сб. Изучение лечебно-профилактических препаратов на основе природных биологически активных веществ.- СПб.: Эскулап, 2000. с.449.

64. Тулаева JI.A., Г.П. Потапов Синтез и свойства водорастворимых производных хлорина Е6, ж. химия растительного сырья, 2002, № 2 С. 85-88.

65. Тярасова К.Г., Виноградова Т.И., Дьякова А.И. и др. Опыт использования препарата фитолон в клинике туберкулеза/ в сб. Изучение лечебно-профилактических препаратов на основе природных биологически активных веществ. -СПб.: Эскулап, 2000. С.342.

66. Фрагина А.И. Производные хлорофилла в отходах переработки сырья видов Laminaria./ Фрагина А.И., Никитина Т.В., Некрасова В.Б. Курныгина В.Т.// Раст. Ресурсы. 1992. - т.28, №2. - с. 89-93.

67. ФС 42-2844-92, «Алпизарин-стандартный образец».

68. ФС 42-3150-95, «Лютеолин-7-гликозид-стандартный образец».88;Хлорофилл, Сб. ст. Минск, 1974,40с.

69. Черноморский; С.А., Курныгина В.Т., Дейнеко И.П., Цыбина Л.В. Препаративное получение феофитинатов металлов/ в сб. Химическая и механическая переработка древесины и древесных отходов, вып.1. Ленинград, 1974, с.90-94:

70. Черноморский С.А., Фрагина А.И., Курныгина В.Т., Солодкая Г.Ф. Препаративное получение безметальных аналогов: хлорофилла/ в сб. Использование биологически активных веществ дерева. Рига, 1973 с. 25-27.

71. Шакирова Э.М. Опыт применения Фитолона для санации носителей инфекции в окружении новорожденных/ в сб. Изучение лечебно-профилактических препаратов на основе природных биологически активных веществ.- СПб.: Эскулап, 2000. с.344.

72. Шах Ц.И. Применение УФ-спектрофотометрии в анализе лекарственных форм^ и смесей. / Шах Ц.И., Ковальчук Т.В; // «Фарм. Журн.», 1970, т. 25, с.3-14.

73. Шигабутдинова Ф.Г. Опыт применения' препарата «Фитолон» в поликлинической практике/, в сб. Изучение лечебно-профилактических препаратов на основе природных биологически- активных; веществ. -СПб:: Эскулап, 2000.-271-272с.

74. Штыков С.Н., Поверхностно-активные вещества в анализе. Основные ' достижения и тенденции развития// Журнал аналитической химии.2000. Т. 55, №7, с.679-686.

75. Штыков С.Н. Применение мицеллярных подвижных фаз для разделения производных флуоресцина методом ТСХ/ Штыков С.Н., Сумина Е.Г. // Журнал. Аналитической химии. 1995г т.50, №7 с. 747751.

76. Штыков С.Н. Аналитические возможности мицеллярных подвижных фаз в тонкослойной1 хроматографии 1,3-дикетоноатов некоторых металлов/ Штыков С.Н., Сумина E.F.// Журнал аналитич. Химии. 1998. Т.53, №5, с. 508-513.

77. Ягодин В.И. Основы химии и технологии переработки древесной зелени, Л.,: изд-во Ленингр. Ун-та, 1981,224 с:

78. Arimasa Nakamura Separation; and determination of minor photosynthetic pigments by reversed-phase HPLC with; minimal alterations of chlorophylls/ Arimasa Nakamura, Tadashi Watanabe// Analytical sciences, v 17 (april- 2001), P. 507-508:

79. Boucher L. J., Joseph J. Katz. Aggregation of Metallochlorophylls J. Am. Chem. Soc., August 30, 1967, Vol. 89:18, p. 4703-.4708;

80. Braumann, T. Reversed-phase high-erformance chromatography of chlorophylls and caratinoids / T. Braumann, I. H. Grimme // Biochimica et Biophysica Acta. -1981.- Vol. 637.-P.8-17.

81. Chernomorsky, S. Evaluation of commercial Chlorophyllin Gopper Complex preparations by liquid chomatography with photodiode arrey detection/ S. Chernomorsky et al.// Journal of AOAC International.-1997.-Vol.80.-№2.-P.433-435.

82. Comar C.L., Erwin J. Benne, and Buteyn. Calibration of a Photoelectric Colorimeter for the Determination of Chlorophyll. Industrial and Engineering Chemistry. Analytical Edition-v.15, №8, 1943, p. 524-526.

83. French C. S. Virgin Fluorescence-spectruam curves of chlorophylls, pheophytins phycoerythrins, phycocyan\in\s and hypericin/ French C. S., James H. C. Smith, Hemming I. Virgin/ZPlant Physiology v 31 n 5 (September, 1956) P. 369-374.

84. Guthrie J.D, American Journal of Botany, 15(1), 86-87 (1928).

85. Higashi-Okai K, Otani S and Okai Y, Potent suppressive activity ofpheophytin a and b from non-polyphenolic fraction of green tea (Camelliasinensis) against tumor promotion in mouse skin. Cancer Lett 129: 223-228 (1998).

86. Higashi-Okai K, Taniguchi M and Okai Y, Potent antioxidative activiti of non-polyphenolic fraction of geen tea (Camellia sinensis) -assotiation with pheophytins a and b J. Sci Food Agric 80:117-120 (2000).

87. Jeffery, SW. Per cromatographic seperation of pigments in marine phytoplankon / SW Jeffery.- Australian Journal of Nmarine and Freshwater Research.- 1965,-Vol. 16(3).-P.307-314.

88. Koning G.M., Wright A.D., Sticher O. et al. Biological activities of seected marine natural products// Planta Med. 1994. - vol.60. - P. 532537.

89. Kupper, H. Kinetics and efficiency of excitation enegy transfer from chlorophylls their heavy metal-substitutedderivatives, and pheophytins to singlet oxygen / H. Kupper et al.// Biochimica et Biophysica Acta. -2002.-Vol. 1572.-P.107-113.

90. Kurreck, J. Stoichiometry of pigments and radical formation under saturating pulse excitation in Dl/D2/cyt b559 preparations / Kurreck J. Et al.// Biochimica et Biophysica Acta. -1997.- Vol. 1318.-P.307-315.

91. Masao Fujiwara and Mitsuo Tasumi. MetaCSensitive Bands in the Raman and Infrared Spectra of Intact and Metal-Substituted Chlorophyll a/ J. Phys. Chem. 1986, 90, p. 5646-5650.

92. Morfles-Ramirez P. In vivo effect of clorofillin on gamma-ray induced sister chromatide exchange in murine bone marrow cell// Mutat. Res.-1994.-Vol.320.-P.329-334.

93. Pennington F.C., Strain H.H., Svec W.A., and Katz J.J. Preparetion and Properties of Pyrochlorophyll a, Methyl Pyrochlorophyllide a, Pyropheophytin a, and Methyl Pyropheophobide a Derived from

94. Chlorophyll by Decarbomethoxylation/ J. Am. Chem. Soc. april 5, 1964 Vol. 86, p. 1418-1426.

95. Roca M. Control of Olive Oil Adulteration with Copper-Chlorophyll Derivatives / Roca M., Gallardo-Guerrero L., Minguez-Mosquera M. I., Gandul Rojas B.// J. Agric. Food Chem., 2010, V 58, P. 51-56.

96. Rothemund P. Hemin and Chlorophyll : the Two Most Important Pigments for Life on Earth // The Ohio Journal of Science. v56 n4 (July, 1956), P. 193-202.

97. Scott E. Newer Aspects of Nutritional Anemia/Scott Ernest, DeLor C. Joseph// The Ohio Journal of Science. v34 n5 (September, 1934), P.284-286.

98. Toxicological Evaluation of Some Food Colours, Emulsifiers and other Food Additives. WHO Techn. Rep. Ser. №445. - Geneva: World Health Organization, 1969. - P. 14-17.

99. Vernon L.P., Seel y G.R., The chlorophylls, N.Y.-L., 1966.

100. Watanabe N., Yamamoto K., Ihshikawa H. Et al. New chlorophyll-A-related compounds isolated as antioxidant from marine bivalves// J. Nat/ Prod.-1993.-Vol.56.-P.305-317.