Автореферат и диссертация по медицине (14.04.00) на тему:Разработка состава, технологии и стандартизация комплексных глазных капель с природными антиоксидантами

На правах рукописи

Фадеева Дарья Александровна

РАЗРАБОТКА СОСТАВА, ТЕХНОЛОГИИ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ КОМПЛЕКСНЫХ ГЛАЗНЫХ КАПЕЛЬ С ПРИРОДНЫМИ АНТИОКСИДАНТАМИ

14.04.01 - Технология получения лекарств 14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

4841343

Москва-2011 г.

2 4 МАР 20/|

4841343

Диссертационная работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Белгородский государственный университет"

Научные руководители:

Доктор фармацевтических наук, доцент

Жилякова Елена Теодоровна

Доктор фармацевтических наук

Новиков Олег Олегович

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор

Степанова Элеонора Федоровна

Доктор химических наук, профессор Толкачев Олег Никифорович

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию"

Защита состоится «-И »2011 г. в~/ 1* часов на заседании диссертационного совета Д 006.070.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН (117216, г. Москва, ул. Грина, д.7) по адресу: 123056, г. Москва, ул. Красина, д.2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, д.7

Автореферат разослан

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 006.070.01, доктор фармацевтических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы.

В настоящее время одним из важных направлений современной фармацевтической науки является создание новых отечественных глазных капель антикатарактального действия, т.к. существующий арсенал целевых фармацевтических продуктов не в полной мере решает задачи практической фармакотерапии катаракты. Одним из наиболее широко применяемых средств антикатарактального действия является 4%-ный раствор таурина («Тауфон»). Однако его применение сопряжено с частыми инсталляциями, что приводит к механическому раздражению слизистой оболочки глаза и увеличению срока лечения из-за отсутствия пролонгированного эффекта. Дальнейшее эффективное использование таурина возможно при его рациональном сочетании с лекарственными веществами альтернативного действия, а также за счет увеличении длительности действия активных } компонентов при одной инсталляции. Это представляется возможным в случае сочетания таурина с природными антиоксидантами и введения в состав глазных капель дополнительных вспомогательных веществ.

Лекарственная терапия катаракты допускает использование природных антиоксидантов для предотвращения окислительного стресса, ведущего к помутнению хрусталика.

По результатам анализа используемых и потенциальных антиоксидантов (аденозин, резвератрол, карнозин, глутатион и др.) в качестве активных антиоксидантных компонентов разрабатываемых капель были предложены дипептид карнозин и полифенол резвератрол. Карнозин повышает содержание эндогенных антиоксидантов в хрусталике, таким образом, опосредованно предотвращая развитие катаракты. Антикатарактальное действие карнозина и резвератрола также заключается в их способности препятствовать воздействию окислительного стресса на белки хрусталика. Наличие в составе глазных капель карнозина, являющегося активным биологическим стабилизатором рН, позволит не вводить в композицию дополнительных буферных агентов.

Увеличение длительности терапевтического эффекта глазных капель при разовой инсталляции возможно путем введения в лекарственную форму пролонгаторов-загустителей.

Исследований по данному направлению до настоящего времени не проводилось, тогда как расширение ассортимента лекарственных препаратов и улучшение характеристик существующих средств является важной задачей. Поэтому разработка технологии комплексного лекарственного препарата, содержащего карнозин и таурин и обладающего пролонгированным действием, является актуальной проблемой фармацевтической технологии.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования является разработка состава и технологии комплексных глазных капель антикатарактального действия с карнозином и таурином и разработка для них норм качества.

Для реализации настоящей цели предстояло решить следующие задачи:

1. Обосновать состав комплексных глазных капель с карнозином и таурином, основываясь на химических, физико-химических и фармакологических свойствах компонентов;

2. Провести исследования по выбору вспомогательных веществ для разрабатываемых глазных капель, в том числе в обеспечение их пролонгированного действия;

3. Разработать технологическую схему производства комплексных глазных капель с карнозином и таурином с учетом требований вМР;

4. Разработать методики идентификации и количественного определения карнозина и таурина;

5. Определить нормы качества для комплексных глазных капель предложенного состава и разработать проект нормативной документации на них;

6. Провести исследования токсичности и антикатарактального действия разработанных глазных капель

Научная новизна исследований. Теоретически обоснована возможность разработки состава и технологии комплексных глазных капель, содержащих карнозин и таурин.

Проведено изучение физико-химических свойств вспомогательных веществ, применяемых в качестве загустителей. Доказано, что оптимальным полимером-загустителем для разрабатываемой лекарственной формы является гидроксипропилметилцеллюлоза.

Разработана оригинальная технология глазных капель. Технологическая схема производства имеет особые акценты на таких технологических этапах, как растворение и смешение, обусловленных физико-химическими свойствами загустителя.

Разработаны новые и адаптированы существующие методики определения карнозина и таурина для последующего использования в определении норм качества разрабатываемых глазных капель. Ряд разработанных методик использован для определения качества глазных капель, изучения их стабильности в процессе хранения, определения норм качества.

Изучены токсичность и фармакологическое действие разработанных комплексных глазных капель. Проведены исследования их влияния на ткани глаза, в результате которых доказана эффективность глазных капель предложенного состава.

Новизна одного из основных фрагментов работы подтверждена патентом Российской Федерации на изобретение № 2404768 «Глазные капли».

Практическая значимость и внедрение результатов в практику.

Разработана технология комплексных антикатарактальных глазных капель, содержащих карнозин и таурин пролонгированного действия. Проведена наработка препарата в условиях производства на предприятии ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (акт внедрения предложения от 27.09.2010 г). Разработаны регламент и проект ФСП Карнофон ЛОНГ, глазные капли. Разработанные методики включены в учебный процесс кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии (акт внедрения № 1 от 30.08.2009 г), кафедры фармацевтической технологии, управления и экономики здравоохранения (акт внедрения № 1 от 31.09.2009 г) Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Белгородский государственный университет», кафедры фармацевтической технологии (акт внедрения № 1 от 31.08.2010 г), кафедры фармацевтической, аналитической и токсикологической химии (акт внедрения № 92 от 15.11.2010 г) Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет».

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО . «Белгородский государственный университет» в рамках научного направления «Разработка методологических подходов к анализу природных ¡* и синтетических биологически активных соединений в объектах различного происхождения. Изучение фармакологических аспектов использования данных биологически активных соединений». Номер государственной регистрации темы диссертационных исследований 01201057121.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы обсуждались на международной научно-практической конференции «Биологически активные соединения природного происхождения: фитотерапия, фармацевтический маркетинг, фармацевтическая технология, фармакология, ботаника» (г. Белгород, 2008), Всероссийской школе-семинаре «Современные наукоемкие лечебные и фармацевтические технологии для офтальмологии» для молодых ученых (г. Белгород, 2009), международной научно-практической конференции «Ботанические сады в 21 веке: сохранение биоразнообразия, стратегия развития и инновационные решения» (г. Белгород, 2009), международной научно-практической конференции «Фитодизайн в современных условиях» (г. Белгород, 2010), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики» (г. Владикавказ, 2010), научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной фармации и фармацевтического образования» (г. Белгород, 2010).

Основные положения, выносимые на защиту:

- методики качественного и количественного определения карнозина химическими и физико-химическими методами;

- результаты обоснования и разработки состава и технологии комплексных глазных капель с карнозином и таурином;

- результаты разработки и обоснования состава комплексных глазных капель с карнозином и таурином;

- результаты исследований физико-химических свойств гидроксипропилметилцеллюлозы, использованной в качестве загустителя в составе глазных капель;

- результаты разработки технологической схемы производства глазных капель с карнозином и таурином с учетом требований вМР;

- нормы качества для глазных капель предложенного состава.

Публикации по работе. По материалам диссертационных

исследований опубликовано 11 научных работ, из них 1 патент, 4 в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 161 странице машинописного текста, содержит 50 таблиц, 24 рисунка, состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы, включающего 132 источника, в т.ч. 90 работ зарубежных авторов, приложений.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 1. Характеристика карнозина и таурина как соединений с потенциальным антикатарактальным действием (обзор литературы)

На основании обзора литературы представлены сведения о проблеме катарактогенеза и путях профилактики и лечения катаракты. Как лекарственная форма охарактеризованы глазные капли, описаны основные группы веществ, используемые в технологии офтальмологических препаратов.

Приведена характеристика карнозина и таурина, их физико-химических свойств и биологической активности, а также методы выделения и анализа данных соединений.

Проведенный литературный обзор подтвердил актуальность создания пролонгированных многокомпонентных глазных капель, содержащих в своем составе карнозин и таурин.

Глава 2. Материалы и методы исследования

В качестве объектов исследования использовали вещества, приведенные в таблице 1. Для приготовления хроматографических систем и проведения аналитических экспериментов использовали растворители и реактивы марок «ХЧ», «ЧДА».

Таблица 1. Объекты исследований_

Вещество нд Субстанция Стандарт

1 2 3 4

Карнозин H,N-(CH7)-CO-NH-CH-CH71 1 соон N^_NH USPh 25, ВФС 42-2659-95 Wirud Co. Limited (Китай) Sigma (США), кат. № С9625

Продолжение таблицы 1

1 2 3 4

Таурин H2N-CH2-CH2-SO3H ФСП 42-8367-07 Экохим-Инновации (Россия) Sigma (США), кат. № Т0625

Резвератрол гтон он Св-во Роспотреб- надзора № 77.99.26.9.4.4087. 4.09 от 30.04.09г., проект ФСП "DSM Nutritional Products Europe Ltd" (Швейцария) Sigma (США), кат. № R5010

Гидроксипропил-метилцеллюлоза Eur. Ph. 5.2,2005 Acros Organics, Бельгия, Lot A015659801 -

Поливиниловый спирт ГОСТ 10779-79 Celanese Corporation (США) -

Поливинилпирролидон ФС 42-3678-98 AppliChem -

Полиэтиленгликоль 400 ФС 42-1242-96 Panreac -

Натрий карбоксиметил-целлюлоза ТУ 2231-06650664923-2005 ОАО "Бийская Химическая Компания" (Россия) -

Plasdone S-630 НД 42-10111-99 International Specialty Products (США) _

Гидроксиэтилцеллюлоза ТУ 6-55-2211210-91 ЗАО «Полицелл» (Россия) -

Бензалкония хлорид НД 42-13992-06 Fluka Analytical, Дания, Lot: 1397021 Fluka, кат. № С12060

Растворимость веществ определяли согласно ОФС 42-0049-07 «Растворимость» (ГФ XII, 4.1). Исследование физических и физико-химических свойств растворов веществ проводили согласно ГФ XII, ч. 1: ОФС 42-0037-07 («Плотность»), ОФС 42-0038-07 («Вязкость»), ОФС 42-0047-07 («Осмолярность»), ОФС 42-0048-07 («Ионометрия»), ОФС 42-0050-07 («Степень окраски жидкостей»), ОФС 42-0051-51 («Прозрачность и степень мутности жидкостей»).

Спектры поглощения в УФ- и видимой области спектра регистрировали с помощью спектрофотометра СФ-56 (ЛОМО-Спектр, Россия). При хроматографировании в тонком слое сорбента были использованы полуавтоматическое устройство для нанесения проб ЬтопШ 5, автоматическая камера дяя элюирования, визуалайзер хроматограмм (Сап^, Швейцария).

Идентификацию и количественное определение карнозина и таурина методом ВЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе Shimadzu LC-20AD (Япония) методом обращеннофазной высокоэффективной хроматографии. Для анализа была использована колонка Reprosil-Pur C18-AQ 150x4 мм, с размером частиц сорбента 5 мкм. Валидация аналитических методик проводилась в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений».

Оценку качества глазных капель осуществляли согласно ГФ XI, вып. 2, с 138. Стерильность глазных капель определяли согласно ОФС 42-0066-07 «Стерильность» (ГФ XII, 4.1).

Эксперименты по изучению общетоксического действия глазных капель проводили на обоеполых белых лабораторных мышах и нелинейных крысах. Исследование антикатарактальной активности препаратов проводили на молодняке беспородных белых крыс с моделированной селенитовой катарактой, вызванной подкожным введением селенита натрия (Merck, Германия), растворенного в 0,9 % растворе натрия хлорида, в дозе 30 нмоль/г массы тела.

Глава 3. Разработка методик анализа активных компонентов глазных капель

Одной из наиболее важных причин особого внимания к разработке собственных методик анализа карнозина и таурина являются их сходные химические свойства. Используемый в нормативной документации метод количественного определения таурина (метод формольного титрования) применить в случае совместного присутствия карнозина и таурина не представляется возможным по причине его неспецифичности. Применение метода количественного определения карнозина (метод ТСХ) в предлагаемых условиях не позволит разделить его смесь с таурином.

Ввиду вышесказанного первым этапом экспериментальных исследований по разработке комплексных глазных капель стала разработка методик анализа карнозина и таурина, позволяющих их идентифицировать и определить количественно при совместном присутствии.

Для идентификации карнозина и таурина в нативном виде и в модельных смесях использовали качественные реакции. Для карнозина в качестве реагентов были выбраны растворы нингидрина, меди сульфата, кобальта хлорида, ванилина, железа хлорид, висмута нитрата, свинца ацетата, а также реактивы Паули и Драгендорфа. Для идентификации таурина были использованы растворы нингидрина и меди сульфата.

С использованием метода спектрофотометрии в видимой области были получены спектры поглощения окрашенных производных карнозина с нингидрином, ионом меди (II), кислотой сульфаниловой диазотированной и таурина с нингидрином и ионом меди (II). Проведенные реакции были устойчивы во времени (не менее 20 минут), и поэтому могут быть

использованы для идентификации и количественного определения карнозина и таурина.

Была разработана методика идентификации таурина и карнозина в смеси методом тонкослойной хроматографии. На основании предварительных экспериментов была установлена оптимальная подвижная фаза спирт этиловый 95%-ный - вода - раствор аммиака 25%-ный (5:4:0,1; об.).

В данной системе была получена хроматограмма карнозина, таурина и их смеси, на которой фиксировали зоны адсорбции со значением Яг 0,58 (карнозин) и 0,73 (таурин), совпадающие по значению показателей и окраске с зонами адсорбции свидетелей (рисунок 1).

'Щ

.12 3 4 5 .

Рис. 1. Хроматограмма СОВС карнозина (1), СОВС таурина (2), субстанции карнозина (3), субстанции таурина (4) и их смеси (5)

Использование титриметрических методов в количественном анализе аминокислот применяется довольно часто, особенно в случае аптечного производства препаратов. Как было сказано выше, фармакопейным методом определения таурина является формольное титрование. Для определения карнозина были разработаны методики косвенной йодометрии и прямой ацидиметрии, отличающиеся быстротой исполнения и невысокой относительной погрешностью - 1,79 % и 1,97 % соответственно.

В процессе разработки методики косвенной йодометрии были установлены стехиометрические показатели комплекса карнозин-Си2+ с помощью спектрофотометрического титрования по методу Иоу-Джонса.

Разработанные титриметрические методики применимы как альтернативные для количественного определения карнозина в присутствии таурина или других аминокислот.

В качестве наиболее специфичного метода идентификации и количественного определения карнозина и таурина была использована обращеннофазная высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Ввиду того, что карнозин и таурин не обладают значимым собственным поглощением в ультрафиолетовой области спектра, для их анализа использовали динитрофенильные (ДНФ) производные, полученные путем проведения реакции аминокислот с 1-фтор-2,4-динитробензолом. В

результате эксперимента были получены хроматограммы 1-фтор-2,4-динитробензола, ДНФ-производных карнозина и таурина, а также их смеси. Для реагента - 1-фтор-2,4-динитробензола - в данной системе характерно наличие двух пиков со временами удерживания 16,4 и 16,7 минут. При дериватизации карнозина образуются два производных соединения со временами удерживания 13,8 мин. и 20,1 мин. Время удерживания ДНФ-производного таурина составило 14,3 мин (рисунок 2)

3

2 1

Рис. 2. Хроматограмма ДНФ-производных 0,2% раствора СО таурина (1), 0,2% раствора СО карнозина (2) и смеси карнозина и таурина(З)

На хроматограмме, полученной при исследовании смеси карнозина и таурина представлены пики, совпадающие по времени удерживания с таковыми для дериватов стандартных образцов (СО) карнозина и таурина. Данный факт свидетельствует о возможности использования данного метода для идентификации карнозина и таурина при их совместном присутствии.

Количественное содержание карнозина и таурина в модельной смеси с теоретическим содержанием каждого из компонентов 20,0 мг/мл рассчитывали по величине площадей пиков их ДНФ-производных в сравнении с таковыми стандартных образцов. Результаты определения и метрологические характеристики приведены в таблице 2.

Таблица 2. Метрологические характеристики методики количественного определения карнозина и таурина в модельной смеси методом ВЭЖХ

{ X, мг/мл Б Р,% ДХ е, %

Карнозин

■ 5 20,01 0,20 95 2,57 0,51 2,56

Таурин

5 19,98 0,14 95 2,57 • 0,35 2,75

Как видно из данных таблицы, относительная ошибка измерений не превышает 3 %, и для карнозина составила 2,56 % (найдено 20,01±0,51 мг/мл), таурина - 2,75 % (найдено 19,98±0,35 мг/мл).

Для подтверждения отсутствия систематической ошибки были проведены опыты с добавками СО карнозина и таурина (таблица 3). Опыты с

добавками СО карнозина и таурина для методики количественного определения карнозина и таурина в модельной смеси показали, что относительная ошибка не превышает ошибки единичного определения и имеет отклонения в сторону как

Таблица 3. Результаты опытов с добавками СО карнозина и таурина для методики количественного определения карнозина и таурина в модельной смеси

Определяв мое вещество Взято, г Добавлено СО, г Должно быть, г Найдено, г Ошибка

Абсолютная, г Относительная, %

Таурин 0,0202 0,0051 0,0253 0,0256 +0,0003 1,1742

0,0202 0,0101 0,0303 0,0307 +0,0004 1,3029

0,0202 0,0152 0,0354 0,0348 -0,0006 1,5805

0,0202 0,0202 0,0404 0,0400 -0,0004 1,0000

Карнозин 0,0198 0,0050 0,0248 0,0250 +0,0003 1,0000

0,0198 0,0099 0,0297 0,0302 +0,0005 1,6556

0,0198 0,0149 0,0347 0,0342 -0,0004 1,3158

0,0198 0,0198 0,0396 0,0390 -0,0006 1,5385

положительных, так и отрицательных значений, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки.

Таким образом, метод ВЭЖХ, обладая высокой специфичностью, явился оптимальным для использования анализа смеси аминокислот и был применен в дальнейшем для разработки норм качества глазных капель.

Для методики идентификации и количественного определения карнозина и таурина методом ВЭЖХ была проведена валидация по характеристикам специфичность, правильность, прецизионность, линейность и диапазон применения.

Глава 4. Результаты экспериментальных исследований по разработке состава и технологии комплексных антикатарактальных глазных капель

В качестве действующих веществ разрабатываемых глазных. капель • были выбраны антиоксиданты карнозин и резвератрол, а также таурин как вещество, улучшающее метаболизм тканей глаза. Для улучшения' растворимости резвератрола в воде были использованы солюбилизаторы — твин 20, твин 80, полиэтиленоксид 400. В ходе предварительных экспериментов было установлено, что наиболее подходящим солюбилизатором в глазных лекарственных формах является твин 20, имеющий потенциал раздражения 100, характеризующий его воздействие на глаз как «отсутствие раздражения». Твин 20 добавляли в раствор в количестве 3 %, что позволило получить водный раствор солюбилизированного резвератрола с содержанием 0,1 %.

Для обоснования выбора действующих веществ разрабатываемой лекарственной формы было проведено определение антиоксидантной

активности потенциальных компонентов глазных капель in vitro. Антиоксидантные свойства веществ оценивали по таким показателям, как антиоксидантная активность (АОА, мг/мл) и антиоксидантная способность (АОС) — величина, обратная АОА. Полученные результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4. Результаты исследования антиоксидантной активности веществ_ _

№ п/п Вещества АОА, мг/мл ДАОА, мг/мл е, % АОС

1. Карнозин 51,700 0,21 0,39 19

2. Таурин _* - - 0

3. Аскорбиновая кислота 0,280 6,32-10^ 0,23 3571

4. Рутин 0,936 3,57-Ю"1 0,38 1068

5. Кверцетин 0,096 3,57-10"J 3,72 10417

6. Резвератрол (спиртовой раствор) 0,056 1,2610"J 2,25 17857

7. Резвератрол (солюбилизированный в воде) 0,063 7,49-10"4 1,18 15923

*- не проявляет антиоксидантной активности

По сравнению с модельным антиоксидантом — кислотой аскорбиновой, среди веществ аминокислотной природы значительно меньшей активностью обладает карнозин, а таурин не проявил антиоксидантных свойств. Полученные результаты, свидетельствующие о низкой активности карнозина, подтверждают имеющиеся в литературе данные о низкой активности данного соединения in vitro. Однако, из литературных источников известно, что данное соединение in vivo активирует дополнительные процессы, усиливающие его антиоксидантное действие (Болдырев A.A. с соавт, 1998).

Полученные результаты подтвердили целесообразность использования в качестве антиоксидантов в составе многокомпонентных глазных капель резвератрола и карнозина. Кроме того, необходимым является введение в разрабатываемый состав дополнительного активного компонента метаболического действия, которым является таурин.

При обосновании состава были проведены исследования по выбору вспомогательных веществ - полимеров, повышающих вязкость глазных капель и консерванта.

Известно, что вязкость водных растворов глазных капель повышают с помощью загустителей для продления контакта лекарственного вещества с роговицей глаза и предупреждения его вымывания. Для подбора загустителя были исследованы растворы полимеров, наиболее часто применяемых в технологии глазных лекарственных форм. По результатам измерений кинематической вязкости были рассчитана динамическая вязкость (таблица 5).

Полученные результаты позволили подобрать полимеры, наиболее подходящие для составов разрабатываемых глазных капель по показателям вязкости и pH. Таковыми явились 0,4 %-ный раствор ГПМЦ, 0,2 %-ный раствор ГЭЦ, 3,0 %-ный раствор ПВС.

Ввиду высокой реакционной способности резвератрола, подтвержденной рядом экспериментов, в дальнейших экспериментах было принято решение не использовать дополнительные загустители в составах, его содержащих. Увеличения вязкости раствора глазных капель с резвератролом добивались за счет присутствия в их составе солюбилизатора твина 20. Динамическая вязкость 3 %-ного раствора твина 20 составляет 1,57 мПа-с.

Таблица 5. Физико-химические показатели растворов полимеров-загустителей

Л"» Кинематическая Динамическая

п/п Исследуемый раствор г/см3 РН вязкость, вязкость,

мм2-с"' мПа-с

1 2 3 4 5 6

1 ПВП (4%) 1,005 3,33 1,725 1,730

2 ПВП (15%) 1,039 3,73 4,992 5,187

3 ПВП (30%) 1,074 3,85 25,357 27,233

4 ПВС (2%) 1,001 6,00 4,532 4,536

5 ПВС (3%) 1,003 6,22 7,925 7,940

6 ПВС (4%) 1,005 5,86 13,100 13,160

7 ПВС (5%) 1,008 5,90 24,960 25,160

8 Дексгран (5%) 1,015 6,44 2,464 2,531

9 Декстран (10%) 1,027 6,35 5,038 5,114

10 ГЭЦ (0,025%) 0,996 6,96 1,59 1,58

11 ГЭЦ (0,05%) 0,996 6,43 1,96 1,95

12 ГЭЦ (0,1%) 0,997 6,40 3,35 3,34

13 ГЭЦ (0,2%) 1,006 6,25 9,590 9,650

14 ИгксЬгЕ 8-630(3%) 1,000 5,81 1,755 1,755

15 Налоге 8-630 (5%) 1,002 5,72 2,244 2,248

16 Найлк 8-630 (7%) 1,008 4,17 2,835 2,857

17 РМопе Б-630 (10%) 1,017 4,10 4,798 4,879

18 ПЭГ 6000 (2%) 0,997 7,04 1,609 1,604

19 ПЭГ 6000 (3%) 0,998 6,85 1,766 1,762

20 ПЭГ 6000 (5%) 1,002 6,64 2,197 2,201

21 ПЭГ 6000 (7%) 1,008 6,51 2,711 2,733

22 ПЭГ 6000 (10%) 1,010 5,91 3,284 3,317

23 ЫаКМЦ (0,5%) 0,995 5,25 2,489 2,477

24 ЫаКМЦ (1%) 0,997 5,05 5,054 5,039

25 ЫаКМЦ (2%) 1,007 4,85 28,80 29,00

26 ГПМЦ (0,1%) 0,997 7,05 2,870 2,879

27 ГПМЦ (0,2%) 0,997 6,96 3,560 3,550

28 ГПМЦ (0,3%) 0,997 6,13 6,117 6,099

29 ГПМЦ (0,4%) 0,997 6,28 10,561 10,530

30 ГПМЦ (0,5%) 0,997 5,81 37,155 37,044

В качестве потенциальных консервантов разрабатываемых глазных капель рассматривались хлоргексидин, бензалкония хлорид (БАХ) и хлорбутанол. Широкое использование БАХ в технологии глазных лекарственных форм, а также его совместимость с остальными компонентами послужило основой для выбора именно этого консерванта. Кроме того, бензалкония хлорид, являясь поверхностно-активным веществом,

снижает поверхностное натяжение раствора глазных капель, что приводит к его более равномерному распределению по роговице.

По результатам исследований были разработаны экспериментальные составы (модельные смеси) глазных капель, представленные в таблице 6. Для приготовления составов № 1 и 2 согласно прописи в стакан отвешивали твин 20, туда же помещали навеску резвератрола и перемешивали до получения прозрачного раствора, после чего вводили навеску карнозина или таурина, натрия хлорид и БАХ, предварительно растворенный в воде, перемешивали и доводили объем до 1 л. Для приготовления составов №№ 3-11 предварительно оставляли для набухания навеску полимера в 80 % воды, затем вводили раствор БАХ, карнозин и таурин, перемешивали и доводили объем до 1 л.

Таблица 6. Составы модельных смесей глазных капель

Компонент Состав

№1 №2 №3 №4 №5 №6 №7 №8 №9 № 10 № 11

Карнозин 20,0 20,0 20,0 20,0 30,0 30,0 30,0 40,0 40,0 40,0

Таурин 20,0 20,0 20,0 20,0 30,0 3 0,0 30,0 40,0 40,0 40,0

Резвератрол 1,0 1,0

Гвин 20 30,0

ГПМЦ 4,0 4,0 4,0

ГЭЦ 2,0 2,0 2,0

ПВС 30,0 30,0 30,0

БАХ 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 ОД 0,1 ОД 0,1

Натрия хлорид 5,67 3,58

Осмолярносгь, «Осм/л 308 308 248 248 248 372 372 372 496 496 496

РН 7,24 5,74 7,58 7,65 7,45 7,15 7,22 7,07 6,63 6,45 6,32

Вязкость, мПа-с 2,13 2,25 11,18 10,78 8,05 11,52 10,85 8,11 11,68 10,88 8,20

Рассчитанные показатели осмолярности были подтверждены экспериментально с помощью миллиосмометра-криоскопа термоэлектрического МТ-5 с ошибкой ± 2,1%.

Способность загустителей увеличивать время высвобождения действующих веществ была доказана при проведении метода равновесного диализа по Крувчинскому. Исследовали скорость высвобождения карнозина и таурина из модельной смеси без полимера и составов №№ 3-11 (рисунок 3).

На основании проведенного биофармацевтического эксперимента было установлено, что оптимальным загустителем для композиции карнозин -таурин является 0,4 %-ный раствор гидроксипропилметилцеллюлозы (состав № 3). Результаты исследований свидетельствуют о быстром начале высвобождения действующих веществ, которое начинается через 5-10 минут. Максимальная концентрация карнозина и таурина в диализате наблюдается через 120 минут и поддерживается постоянной в течение 6 часов.

При изучении стабильности экспериментальных составов установлено, что модельные смеси № 1 и № 2 неустойчивы при хранении.

Таким образом, предварительные эксперименты по установлению сроков годности и биофармацевтические исследования показали, что оптимальной по всем показателям является модельная смесь № 3, которой было дано рабочее название «Карнофон ЛОНГ».

з,о -2,5 • 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0

100

200

300 время,мин

3,0 1

£ 2,5 "

О

2,0 -

1,5 ■

1,0 '

0,5 "

0,0 -

100

200 300

время, мин

Модельные смеси № 3-5

Модельные смеси № 6-8

- з,о

! 2,5 .Г

2,0 ' 1,5 ' 1,0 ' 0,5 " 0,0

0

100

200 300

время, мин

1— Карнозин+Таурин+ГПМЦ ■— Карнозин+Таурин+ГЭЦ '•• Карнозин+Таурин+ПВС Карнозин+Таурин

Модельные смеси № 9-11 Рис. 3. Высвобождение карнозина и таурина из модельных смесей

Для глазных капель «Карнофон ЛОНГ» разработана технологическая схема (рисунок 4), а также лабораторный регламент производства.

Приготовление водного раствора проводили в помещении класса чистоты С массо-объемным методом. Ввиду того, что ГПМЦ относится к набухающим полимерам, его вводили в раствор в первую очередь для предварительного набухания. В реактор загружали около 90 % воды для инъекций, а затем навеску гидроксипропилметилцеллюлозы, включали мешалку и перемешивали в течение 25-30 минут до полного растворения. После достижения однородности раствора отключали мешалку и оставляли раствор ГПМЦ для набухания в течение 12 часов.

ВР 1.1 Приготовление дезинфицирующих растворов (кт.кб)

ВР 1.2 Подготовка вентиляционного воздуха (кт,кб)_

ВР 1.3 Подготовка производственных помещений (кт,кб)_

ВР 1.4 Подготовка оборудования и инвентаря (кт,кб)_

ВР 1.5 Подготовка технологической одежды (кт.кб)_

ВР 1.6 Подготовка персонала к работе (кт,кб)_

ВР 1.7 Подготовка сырья (кт,кб, кх)

ТП 3.1 Приготовление раствора (кт, кх)_

| ТП 3.2 Фильтрация раствора (кт)

ТП 4.1 Наполнение и укупорка флаконов пробками (кт) __

ТП 4.2 Укупорка флаконов алюминиевыми колпачками (кт)

ВР 1 Санитарная подготовка производства

ВР 2.1 Мойка флаконов (кт,кб,кх) ВР 2 Подготовка флаконов и укупорочных средств

ВР 2.1 Мойка пробок (кт,кб,кх) | | потери | | отходы |

ВР 2.3 Мойка колпачков алюминиевых (кт,кб,кх) в промстоки на полигон ТБО

ТП 3 Приготовление глазных капель «Карнофон ЛОНГ»_

потери

в промстоки

ТП 4 Наполнение и укупорка флаконов

потери

отходы

в промстоки

на полигон ТБО

ТП 5 Стерилизация препарата во флаконах (кт,кб)_

потери

отходы

в промстоки

на полигон ТБО

ТП 6 Контроль флаконов препарата на механические включения (кт)_

потери

в промстоки

| отходы | на полигон ТБО

На склад готовой продукции_

Рис. 4. Технологическая схема производства глазных капель «Карнофон ЛОНГ»

Навеску бензалкония хлорида растворяли отдельно в емкости с плотно закрывающейся крышкой, в 50 мл воды для инъекций ввиду того, что данный компонент гигроскопичен (при адгезии воды происходит инактивация консерванта). После набухания в раствор ГПМЦ переносили раствор бензалкония хлорида и перемешивали в течение 5 минут. Затем в полученный раствор вручную количественно переносили карнозин, таурин, перемешивали с помощью мешалки в течение 10 минут. После растворения всех компонентов объем раствора в реакторе доводили до необходимого уровня водой для инъекций. Включают мешалку и еще раз перемешивают раствор в течение 10 минут.

После окончания процедуры приготовления раствора «Карнофона ЛОНГ», глазные капли отбирали пробу для контроля полупродукта по показателям: внешний вид, цветность, количественное содержание карнозина, таурина, бензалкония хлорида.

Полученный раствор «Карнофон ЛОНГ», глазные капли фильтровали при помощи вакуума и фильтра типа «Миллипор» с фильтрующим материалом из полипропилена с диаметром пор 0,22 мкм и осуществляли розлив глазных капель во флаконы стеклянные и укупорку резиновыми пробками под обкатку алюминиевыми колпачками. Стерилизацию глазных капель проводили в стерилизаторе паровом текучим паром при давлении пара 0,11 МПа в течение 15 минут при температуре 121°С.

Для глазных капель были разработаны нормы качества, включенные в проект ФСП «Карнофон ЛОНГ, капли глазные» (таблица 7).

Таблица 7. Спецификация глазных капель «Карнофон ЛОНГ»

Показатели Методы исследования, нормативные документы Нормы

1 2 3

1. Описание Визуальный Прозрачная бесцветная жидкость.

2. Подлинность 2.1.Таурин и карнозин ВЭЖХ (методика раздела "Количественное определение") На хроматограммах испытуемого раствора, полученных при количественном определении таурина и карнозина, времена удерживания пиков динитрофенильных производных таурина и карнозина должны совпадать с временами удерживания пиков динитрофенильных производных таурина и карнозина, соответственно, на хроматограмме раствора сравнения таурина и карнозина.

Продолжение таблицы 7

1 2 3

2.2. Таурин и карнозин 2.3. Бензалкония хлорид 2.4. ГПМЦ Метод ТСХ Качественная реакция Вискозиметрия На хроматограмме испытуемого раствора препарата, полученной при определении 2-аминоэтанола, после проявления пластинки раствором нингидрина, основные зоны адсорбции должны находиться на уровне основных зон адсорбции на хроматограммах раствора сравнения таурина (таурин) и раствора сравнения карнозина (карнозин). Качественная реакция с раствором аммония рейнеката. Вязкость препарата должна соответствовать требованию раздела «Вязкость».

3. Прозрачность ОФС 42-0051-51 (ГФ XII, ч. 1, с. 98) Препарат должен быть прозрачным

4. Цветность ОФС 42-0050-07 (ГФ XII, ч. 1, с. 93) Препарат должен быть бесцветным (выдерживать сравнение с эталоном В?)

5. рН ОФС 42-0048-07 (ГФ XII, ч. 1, с. 89) От 7,0 до 8,0

6. Осмолярность ОФС 42-0048-07 (ГФ XII, ч. I, с. 78) От 239 до 376 мОсм/л

7. Вязкость ОФС 42-0038-07 (ГФ XII, ч. 1, с.41) От 9 до 15 мПа-с

8. Механические включения РДИ 42-504-00 Препарат должен соответствовать требованиям РДИ 42-504-00 «Инструкция по контролю на механические включения глазных капель».

}. Номинальный объем ГФ XI, вып. 2, с. 140 Препарат должен выдерживать требования

10. Посторонние примеси Метод ТСХ Не более 0,1 % 2-аминоэтанола

11. Стерильность ОФС 42-0066-07 (ГФ XII, ч.1, с. 150) Препарат должен быть стерильным

^.Количественное определение 12.1. Таурин 12.2. Кар-нозин 12.3. Бензалкония шэрид Метод ВЭЖХ Метод ВЭЖХ Метод 2-х фазового титрования От 0,018 г до 0,022 г в 1 мл препарата От 0,018 г до 0,022 г в 1 мл препарата От 0,000085 г до 0,000115 г в 1 мл препарата

15.Срок годности 24 месяца

Для установления подлинности препарата, а также определения наличия примеси 2-аминоэтанола использовали метод ТСХ. Подвижной фазой служила смесь растворителей спирт этиловый 95 % - хлороформ -аммиака раствор концентрированный - вода (6:2:0,5:1,5).

При определении посторонних примесей в препарате на хроматограмме допускается наличие зоны адсорбции 2-аминоэтанола, расположенного на том же уровне, что и зона адсорбции раствора сравнения 2-аминоэтанола и не превышающего его по величине и интенсивности окраски (не более 0,1 %).

Помимо метода хроматографии в тонком слое сорбента подлинность глазных капель определяли методом обращеннофазной ВЭЖХ.

На хроматограммах, полученных при количественном определении карнозина и таурина методом ВЭЖХ, времена удерживания пиков динитрофенильных производных таурина и карнозина в исследуемых глазных каплях должны совпадать с временами удерживания пиков динитрофенильных производных стандартных образцов таурина и карнозина.

Подлинность глазных капель «Карнофон ЛОНГ» определяли также с помощью проведения качественной реакции на бензалкония хлорид с раствором аммония рейнеката, в результате которой раствор мутнеет и образуется розовый осадок. Наличие в составе капель загустителя гидроксипропилметилцеллюлозы подтверждается вискозиметрически. Вязкость разработанных глазных капель должна быть в пределах от 9 до 15 мПа-с.

Количественное определение действующих компонентов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии продуктов реакции карнозина и таурина и 1-фтор-2,4-динитробензола. Содержание таурина или карнозина в препарате определяли по величине площадей пиков их ДНФ-производных в сравнении с таковыми стандартных образцов.

Содержание таурина в 1 мл препарата должно быть в пределах от 0,01В г до 0,022 г, карнозина — от 0,018 г до 0,022 г. Содержание в препарате консерванта бензалкония хлорида регламентируется в пределах от 0,000085 г до 0,000115 г, и определялся методом двухфазного титрования раствором натрия лаурилсульфата.

Методики, использованные для разработок норм качества глазных капель «Карнофон ЛОНГ» были подвержены валидадии и признаны корректными.

Серии разработанных глазных капель «Карнофон ЛОНГ» были исследованы по показателям количественного содержания действующих компонентов и консерванта вышеозначенными методами.

После статистической обработки данных было установлено, что содержание таурина в глазных каплях составило 0,0200 ± 0,0006 г/мл, карнозина — 0,0201 ± 0,0006г/мл, бензалкония хлорида — 0,000100 ± 0,000004 г/мл (таблица 8). Аналогичные методики были использованы для определения стабильности и сроков годности глазных капель «Карнофон ЛОНГ».

Таблица 8. Результаты количественного определения компонентов глазных капель «Карнофон ЛОНГ»

Определяемое вещество Метод определения Найдено, г/мл С 8 дс г,%

1 2 3 4 5 6 7

Таурин ВЭЖХ 0,0202 0,0197 0,0197 0,0201 0,0201 0,0199 0,0200 0,0002 0,0006 2,79

_Продолжение таблицы 8

1 2 3 4 5 6 7

Карнозин вэжх 0,0199 0,0198 0,0202 0,0204 0,0201 0,0203 0,0201 0,0002 0,0006 2,95

Бензалкония хлорид Двухфазное титрование 0,000097 0,000105 0,000099 0,000102 0,000101 0,000096 0,0001 0,0000017 0,000004 4,42

Консервирующие свойства бензалкония хлорида были исследованы при изучении стерильности глазных капель во вскрытой упаковке. Результаты исследований показали, что заявленное количество бензалкония хлорида позволяет глазным каплям оставаться стерильными не менее чем 30 суток.

Для проверки срока годности глазных капель их разливали во флаконы стеклянные по 5 мл, укупоривали пробками резиновыми и колпачками алюминиевыми, подвергали стерилизации и закладывали на хранение в темном месте при температуре 4°С. В течение срока наблюдения контролировали нормы качества, заявленные в спецификации.

Стабильность показателей по основным нормам качества глазных капель «Карнофон ЛОНГ» продемонстрировала жизнеспособность технологической схемы и формы выпуска глазных капель. При изучении стабильности глазных капель «Карнофон ЛОНГ» установлено, что срок хранения глазных капель на момент наблюдения составляет 24 месяца.

Глава 5. Предварительное изучение токсичности и антикатарактального действия глазных капель «Карнофон ЛОНГ»

В результате проведения опытов по установлению острой и подострой токсичности установлено, что глазные капели «Карнофон ЛОНГ» относятся к малотоксичным препаратам, не оказывающим негативного воздействия на основные функции организма.

На заключительном этапе была изучена фармакологическая активность глазных капель «Карнофон ЛОНГ» на модели селенитовой катаракты. В качестве препарата сравнения использовали глазные капли «Тауфон» (4 %-ный раствор таурина). Исследуемые препараты вводили субконьюктивально 3 раза в день по 1 капле в каждый глаз, начиная со дня инъекции селенита натрия.

Во всех сериях экспериментов применение глазных капель «Карнофон ЛОНГ» и «Тауфон» сопровождалось значительным терапевтическим эффектом, при этом эффект от применения глазных капель «Карнофон ЛОНГ» и оказался на 22,5 % выше, чем у препарата сравнения - глазных

капель «Тауфон» (рисунок 5). Таким образом, комбинация карнозина и таурина привела к лучшим результатам и может быть более конкурентоспособна, нежели монокомпонентный препарат.

100±5,4%

Контроль Карнофон Тауфон ЛОНГ

Рис. 5. Плотность помутнения в хрусталике крыс при применении глазных капель «Карнофон ЛОНГ» и «Тауфон»

Выводы

1. Обоснован и разработан состав комплексных глазных капель с пролонгированным действием под условным названием «Карнофон ЛОНГ», содержащие в своем составе карнозин, таурин, гидроксипропилметилцеллюлозу, бензалкония хлорид;

2. Установлено, что 0,4%-ный водный раствор гидроксипропилметилцеллюлозы обладает вязкостью 10,53 мПа-с и показателем рН 6,28 и для данного состава является оптимальным загустителем;

3. Разработана оригинальная технологическая схема производства с акцентом на использование таких технологических этапов как растворение и смешивание;

4. Разработаны методики качественного и количественного определения карнозина и таурина химическими и физико-химическими методами (титриметрия, спектрофотометрия в видимой областях спектра, хроматография в тонком слое сорбента, высокоэффективная жидкостная хроматография);

5. Определены нормы качества для данной лекарственной формы: испытания на подлинность, прозрачность, цветность, рН, осмолярность, вязкость, механические включения, посторонние примеси (2-аминоэтанол), стерильность, количественное определение. Содержание карнозина должно находиться в интервале от 0,018 г до 0,022 г, таурина — от 0,018 г до 0,022 г, бензалкония хлорида —от 0,000085 г до 0,000115 г,

6. Установлены сроки хранения для глазных капель: они составили 24 месяца;

7. Проведены фармакологические исследования разработанных глазных капель, в результате которых установлено, что препарат «Карнофон ЛОНГ» не обладает острой и хронической токсичностью и имеет выраженный защитный эффект при визуальной оценке прозрачности хрусталика на модели селенитовой катаракты, превышающий на 22,5 % эффект препарата сравнения - глазных капель «Тауфон»;

8. Разработаны и апробированы нормативные документы на глазные капли «Карнофон ЛОНГ» в виде ФСП и лабораторного регламента.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фадеева, Д.А. Перспективы использования карнозина в глазных лекарственных формах / Д.А. Фадеева, Д.И. Писарев, О.О. Новиков, Е.Т. Жилякова // Биологически активные соединения природного происхождения: фитотерапия, фармацевтический маркетинг, фармацевтическая технология, фармакология, ботаника: матер, междунар. научн.-практич. конф., Белгород, 30 июня-3 июля 2008г. Под ред. проф. В.Н. Сорокопудова. — Белгород: "Политерра", 2008. - С. 69 -72.

2. Фадеева, Д.А. Целесообразность применения природных антиоксидантов для профилактики и лечения катаракты / Фадеева Д.А., Халикова М.А., Жилякова Е.Т., Новиков О.О.// Ботанические сады в 21 веке: сохранение биоразнообразия, стратегия развития и инновационные решения: матер, междунар. научн.-практич. конф., посвященной 10-летию образования Ботанического сада БелГУ - Белгород, 2009. - С. 472-473.

3. Фадеева, Д.А. Изучение физико-химических свойств пролонгаторов для глазных лекарственных форм / Фадеева Д.А, Халикова М.А., Новикова М.Ю., Жилякова Е.Т, Новиков О.О., Киселева Т.С. // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. — №3. - С. 132-135.

4. Жилякова, Е.Т. Применение прогнозирующего метода анализа иерарахий в форме Саати при выборе загустителя для глазных капель дексаметазона / Е.Т. Жилякова, Т.С. Киселева, О.О. Новиков, М.Ю. Новикова, М.А. Халикова, Д.А.Фадеева // Вестник новых медицинских технологий — 2009.-T.XVI,- №2. — С.196—199.

5. Фадеева, Д.А. Исследование растворимости тя/юис-резвератрола / Д.А. Фадеева, О.О. Новиков, Е.Т Жилякова // Современные наукоемкие лечебные и фармацевтические технологии для офтальмологии: Сборник материалов Всеросс. школы-семинара. - Белгород, ИПЦ «Политерра», 2009. -С 140-145.

6. Халикова, М.А. Разработка состава и технологии антикатарактальных глазных капель с антиоксидантами / М.А. Халикова, Д.А. Фадеева, О.О. Новиков, Е.Т Жилякова // Ползуновский альманах. — 2009 - №3. - Т.2. - С.81-83.

7. Фадеева, Д.А. Определение антиоксидантной активности веществ аминокислотной природы / Д.А. Фадеева, М.А. Халикова II Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики / Сборник научных трудов. — Сев.-Осет.гос.ун-т им.К.Л.Хетгаурова. Владикавказ: Изд-во СОГУ, 2010. -С.301-303.

8. Фадеева, Д.А. Разработка методики идентификации карнозина с использованием метода тонкослойной хроматографии / Д.А. Фадеева, М.А. Халикова, О.О. Новиков, Е.Т Жилякова // Фитодизайн в современных условиях: материалы междунар.науч.-практ. конф., Белгород, 14-17 июня 2010 г./ под ред. В.К.Тохтарь, В.Н.Сорокопудов. - Белгород: Изд-во БелГУ, 2010. - С.428—431.

9. Фадеева, Д.А. Токсикологические исследования новых антикатарактальных капель / Д.А. Фадеева, М.А. Халикова, М.В. Покровский, О.О. Новиков, Е.Т Жилякова, М.Ю. Новикова, H.H. Попов // Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина. Фармация. — 2010. — №10 (81). Выпуск 10.-С. 93-96.

10. Халикова, М.А. Применение метода обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии для разделения смеси и идентификации таурина, карнозина и глутатиона / М.А. Халикова, Д.А. Фадеева, A.A. Зинченко, Е.Т Жилякова, О.О. Новиков // Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина. Фармация. — 2010. — №22 (93). Выпуск 12.-С. 157-160.

11. Глазные капли: пат. 2404768 Рос. Федерация: МПК7 А61К31/4172, А61К38/07, А61К47/40, А61Р27/02 / Новиков О.О, Жилякова Е.Т, Фадеева Д.А., Халикова М.А, Покровский М.В, Писарев Д.И.; заявители и патентообладатели Федеральное агентство по науке и инновациям, Общество с ограниченной ответственностью "Асклепий". - № 2009113845/28, заявл. 28.10.2009; опубл. 27.11.2010. - Бюлл. №33.

Подписано в печать 04.03.2011 .Times New Roman. Формат 60*84/16. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 17. Оригинал-макет подготовлен и тиражирован в издательстве Белгородского государственного университета 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Актуальность темы.

В настоящее время одним из важных направлений современной фармацевтической науки является создание новых отечественных глазных капель антикатарактального действия, т.к. существующий арсенал целевых фармацевтических продуктов не в полной мере решает задачи практической фармакотерапии катаракты. Одним из наиболее широко применяемых средств антикатарактального действия является 4%-ный раствор таурина («Тауфон»). Однако его применение сопряжено с частыми инсталляциями, что приводит к механическому раздражению слизистой оболочки глаза и увеличению срока лечения из-за отсутствия пролонгированного эффекта. Дальнейшее эффективное использование таурина возможно при его рациональном сочетании с лекарственными веществами альтернативного действия, а также за счет увеличении длительности действия активных компонентов при одной инстилляции. Это представляется возможным в случае сочетания таурина с природными антиоксидантами и введения в состав глазных капель дополнительных вспомогательных веществ.

Лекарственная терапия катаракты допускает использование природных антиоксидантов для предотвращения окислительного стресса, ведущего к помутнению хрусталика.

По результатам анализа используемых и потенциальных антиоксидантов (аденозин, резвератрол, карнозин, глутатион и др.) в качестве активных антиоксидантных компонентов разрабатываемых капель были предложены дипептид карнозин и полифенол резвератрол. Карнозин повышает содержание эндогенных антиоксидантов в хрусталике, таким образом, опосредованно предотвращая развитие катаракты. Антикатарактальное действие карнозина и резвератрола также заключается в их способности препятствовать воздействию окислительного стресса на белки хрусталика. Наличие в составе глазных капель карнозина, являющегося активным биологическим стабилизатором рН, позволит не вводить в композицию дополнительных буферных агентов.

Увеличение длительности терапевтического эффекта глазных капель при разовой инсталляции возможно путем введения в лекарственную форму пролонгаторов-загустителей.

Исследований по данному направлению до настоящего времени не проводилось, тогда как расширение ассортимента лекарственных препаратов и улучшение характеристик существующих средств является важной задачей. Поэтому разработка технологии комплексного лекарственного препарата, содержащего карнозин и таурин и обладающего пролонгированным действием, является актуальной проблемой фармацевтической технологии. Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования является разработка состава и технологии комплексных глазных капель антикатарактального действия с карнозином и таурином и разработка для них норм качества.

Для реализации настоящей цели предстояло решить следующие задачи:

1. Обосновать состав комплексных глазных капель с карнозином и таурином, основываясь на химических, физико-химических и фармакологических свойствах компонентов;

2. Провести исследования по выбору вспомогательных веществ для разрабатываемых глазных капель, в том числе в обеспечение их пролонгированного действия;

3. Разработать технологическую схему производства комплексных глазных капель с карнозином и таурином с учетом требований СМР;

4. Разработать методики идентификации и количественного определения карнозина и таурина;

5. Определить нормы качества для комплексных глазных капель предложенного состава и разработать проект нормативной документации на них;

6. Провести исследования токсичности и антикатарактального действия разработанных глазных капель.

Научная новизна исследований.

Теоретически обоснована возможность разработки технологии комплексных глазных капель, содержащих карнозин и таурин.

Проведено изучение физико-химических свойств вспомогательных веществ, применяемых в качестве загустителей. Доказано, что оптимальным полимером-загустителем для разрабатываемой лекарственной формы является гидроксипропилметилцеллюлоза.

Разработана оригинальная технология глазных капель. Технологическая схема производства имеет особые акценты на таких технологических этапах, как растворение и смешение, обусловленных физико-химическими свойствами загустителя.

Разработаны новые и адаптированы существующие методики определения карнозина и таурина для последующего использования в определении норм качества разрабатываемых глазных капель. Ряд разработанных методик использован для определения качества глазных капель, изучения их стабильности в процессе хранения, определения норм качества.

Изучены токсичность и фармакологическое действие разработанных комплексных глазных капель. Проведены исследования их влияния на ткани глаза, в результате которых доказана эффективность глазных капель предложенного состава.

Новизна одного из основных фрагментов работы подтверждена патентом Российской Федерации на изобретение № 2404768 «Глазные капли».

Практическая значимость и внедрение результатов в практику.

Разработана технология комплексных антикатарактальных глазных капель, содержащих карнозин и таурин пролонгированного действия. Проведена наработка препарата в условиях производства на предприятии

ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (акт внедрения предложения от 27.09.2010 г). Разработаны регламент и проект ФСП Карнофон ЛОНГ, глазные капли. Разработанные методики включены в учебный процесс кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии (акт внедрения № 1 от 30.08.2009г), кафедры фармацевтической технологии, управления и экономики здравоохранения (акт внедрения № 1 от 31.09.2009 г) Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Белгородский государственный университет», кафедры фармацевтической технологии (акт внедрения № 1 от 31.08.2010 г), кафедры фармацевтической, аналитической и токсикологической химии (акт внедрения № 92 от 15.11.2010 г) Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет».

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Белгородский государственный университет» в рамках научного направления «Разработка методологических подходов к анализу природных и синтетических биологически активных соединений в объектах различного происхождения. Изучение фармакологических аспектов использования данных биологически активных соединений». Номер государственной регистрации темы диссертационных исследований 01201057121.

Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы обсуждались на международной научно-практической конференции «Биологически активные соединения природного происхождения: фитотерапия, фармацевтический маркетинг, фармацевтическая технология, фармакология, ботаника» (г. Белгород, 2008), Всероссийской школе-семинаре «Современные наукоемкие лечебные и фармацевтические технологии для офтальмологии» для молодых ученых (г. Белгород, 2009), международной научно-практической конференции «Ботанические сады в 21 веке: сохранение биоразнообразия, стратегия развития и инновационные решения» (г. Белгород, 2009), международной научно-практической конференции «Фитодизайн в современных условиях» (г. Белгород, 2010), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы фармацевтической науки и практики» (г. Владикавказ, 2010), научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной фармации и фармацевтического образования» (г. Белгород, 2010).

Основные положения, выносимые на защиту:

- методики качественного и количественного определения карнозина химическими и физико-химическими методами;

- результаты обоснования и разработки состава комплексных глазных капель с карнозином и таурином;

- результаты разработки и обоснования состава комплексных глазных капель с карнозином и таурином;

- результаты исследований физико-химических свойств гидроксипропилметилцеллюлозы, использованной в качестве загустителя в составе глазных капель;

- результаты разработки технологической схемы производства глазных капель с карнозином и таурином с учетом требований ОМР;

- нормы качества для глазных капель предложенного состава. Публикации по работе.

По материалам диссертационных исследований опубликовано 11 научных работ, из них 1 патент, 4 в изданиях, рекомендованных ВАК. Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 161 странице машинописного текста, содержит 50 таблиц, 24 рисунка, состоит из введения, 5 глав,

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. ■ Обоснован и разработан состав комплексных глазных капель с пролонгированным действием под условным названием «Карнофон ЛОНГ», содержащие в своем составе карнозин, таурин, гидроксипропилметилцеллюлозу, бензалкония хлорид;

2. Установлено, что 0,4 %-ный водный раствор гидроксипропилметилцеллюлозы обладает вязкостью 10,53 мПа-с и показателем рН 6,28 и для данного состава является оптимальным загустителем;

3. Разработана оригинальная технологическая схема производства с акцентом на использование таких технологических этапов как растворение и смешивание;

4. Разработаны методики качественного и количественного определения карнозина и таурина химическими и физико-химическими методами (титриметрия, спектрофотометрия в видимой областях спектра, хроматография в тонком слое сорбента, высокоэффективная жидкостная хроматография);

5. Определены нормы качества для данной лекарственной формы: испытания на подлинность, прозрачность, цветность, рН, осмолярность, вязкость, механические включения, посторонние примеси (2-аминоэтанол), стерильность, количественное определение. Содержание карнозина должно находиться в интервале от 0,018 г до 0,022 г, таурина - от 0,018 г до 0,022 г, бензалкония хлорида - от 0,000085 г до 0,000115 г,

6. Установлены сроки хранения для глазных капель: они составили 24 месяца;

7. Проведены фармакологические исследования разработанных глазных капель, в результате которых установлено, что препарат «Карнофон ЛОНГ» не обладает острой и хронической токсичностью и имеет выраженный защитный эффект при визуальной оценке прозрачности хрусталика на модели селенитовой катаракты, превышающий на 22,5 % эффект препарата сравнения - глазных капель «Тауфон»; 8. Разработаны и апробированы нормативные документы на глазные капли «Карнофон ЛОНГ» в виде ФСП и лабораторного регламента.

Заключение

Высокая биологическая активность природного антиоксиданта карнозина наряду с его низкой токсичностью может быть использована для создания многокомпонентных глазных лекарственных форм для лечения и профилактики катаракты. Идея создания композитных глазных капель достаточно нова [22, 26, 29], т.к. большинство существующих являются однокомпонентными. Объединение в одной лекарственной форме нескольких действующих веществ может способствовать проявлению синергизма их фармакологического действия.

Вышеизложенный обзор литературных данных позволяет сделать вывод о широких перспективах применения карнозина в медицине, в том числе, в офтальмологии. Существующий арсенал противокатарактальных средств в полной мере не решает проблем лечения данного заболевания. Антиоксидантные, противовоспалительные, репаративные свойства карнозина, а также его доказанная антикатарактальная активность априори могут быть использованы в лечении и профилактике катаракты.

Применение таурина в составе глазных капель позволит улучшить метаболизм тканей глаза, что благотворно отразится на терапевтическом эффекте. Разработка новых композитных лекарственных форм с карнозином и таурином поможет расширить спектр существующих целевых препаратов.

Для вновь создаваемых лекарственных форм необходимо соответствующее аналитическое обеспечение. Существующие методики определения карнозина, таурина не в полной мере пригодны для целей фармацевтического анализа, нуждаются в серьезной адаптации и, зачастую, требуют наличия дорогостоящего лабораторного оборудования. Это определяет необходимость разработки новых адаптированных к фармацевтическим объектам исследования методик анализа карнозина и таурина, в том числе, при совместном присутствии.

Как было указано выше, большинство зарегистрированных на территории Российской Федерации антикатарактальных глазные капли не содержат в своем составе вспомогательных веществ, обеспечивающих повышение вязкости раствора, то есть являются непролонгированными.

Тенденции фармацевтического рынка таковы, что разработка глазных капель должна вестись по пути использования нескольких действующих веществ в одном препарате, а также достижения пролонгированности его действия за счет введения полимеров. Поэтому очевидна актуальность создания пролонгированных многокомпонентных глазных капель, содержащих в своем составе антиоксиданты.

Таким образом, все вышесказанное определило цели и задачи диссертационного исследования, подтвердило его актуальность.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы исследования 2.1.1.Карнозин

Карнозин (/?-аланил-1,-гистидин) — дипептид, представляющий собой аморфный порошок белого или слегка желтоватого цвета. Молярная масса 226,2 г/моль, температура плавления 260-262°С (с разложением). Удельное оптическое вращение 1 %-ного водного раствора карнозина +21,9. Карнозин растворим в воде (32г/100мл), нерастворим в спирте, ацетоне [15]. Используемый стандартный образец: Sigma, кат. № С9625. Используемая субстанция: производитель - Wirud Co. Limited (Китай), партии № 070901, 080608, USPh 25, ВФС 42-2659-95.

Таурин - (2-аминоэтансульфоновая кислота) - порошок, состоящий из игольчатых кристаллов, растворимый в воде (10,48г/100 мл при 25°С), практически нерастворим в спирте этиловом (0,0032 г/100 мл при 17°С), нерастворим в диэтиловом эфире [15]. Молекулярная масса 125,2. Температура плавления - 320°С (с разложением). Используемый стандартный образец: Sigma, кат. № Т0625. Используемая субстанция: производство Экохим-Инновации (Россия), ФСП 42-8367-07.

Резвератрол (3,5,4'-тригидрокси-траис-стильбен) — соединение полифенольной природы, представляет собой аморфный порошок кремового цвета:

2.1.2.Таурин

2.1.3 .Резвератрол он

Молекулярная масса 228,2 г/моль. Температура плавления 261-263°С. Резвератрол растворим в спирте этиловом (0,05 г/мл), диметилсульфоксиде (0,016 г/мл), диметилфлормамиде, растворах щелочей, нерастворим в воде, хлороформе, четыреххлористом углероде [108]. Используемый стандартный образец: производитель — Sigma (США), кат. № R5010, используемая субстанция: производство "DSM Nutritional Products Europe Ltd" (Швейцария), зарегистрирована в РФ как сырье для БАД (свидетельство № 77.99.26.9.4.4087.4.09 от 30.04.2009 г.).

2.1 АГидроксипропилметилцеллюлоза

Гидроксипропилметилцеллюлоза (ГПМЦ, [СбН702(0Н)з.х(СЖ)х]п, где R=H, СН3, СН2СН(ОН)СНз) - полимерное соединение, представляющее белый аморфный порошок без запаха. Молекулярная масса 86000. ГПМЦ растворима в холодной воде, ДМСО, ДМФА, горячем этиленгликоле, пиридине; нерастворима в горячей воде, безводном этаноле, диэтиловом эфире, хлороформе [83, 117]. Используемая субстанция: производитель Acros Organics, Бельгия, Lot: А015659801, Eur. Ph. 5.2, 2005.

2.1.5.Бензалкония хлорид

Бензалкония хлорид представляет собой смесь алкилбензилдиаммония хлоридов с алкильным цепочками С8-С18 (ВФС 42-3156-98). Молекулярная масса рассчитывается по брутто-формуле C22H40CIN и составляет 354 г/моль. Субстанция бензалкония хлорида представляет собой гигроскопичный порошок белого или желтоватого цвета со специфическим запахом, мыльный наощупь, хорошо растворим в воде и спирте этиловом, практически нерастворим в диэтиловом эфире. Водные растворы при встряхивании образуют пену [69, 117]. Используемый стандартный образец: Fluka, кат. № С12060. Используемая субстанция: производитель - Fluka Analytical, Дания, Lot: 1397021; НД 42-13992-06.

2.2. Методы исследования 2.2.1. Приготовление растворов карнозина

Рабочие стандартные растворы карнозина с концентрацией 0,2 %, 1 % и 2 %, использованные при разработке методик идентификации и количественного определения, готовили следующим образом. Для приготовления 0,2 %-ного раствора точную навеску стандартного вещества карнозина (0,2 г) отвешивали на аналитических весах, затем количественно переносили ее в мерную колбу вместимостью 100 мл. К веществу приливали 30 мл воды дистиллированной, перемешивали до полного растворения, затем доводили объем в колбе до метки тем же растворителем. Растворы карнозина концентрацией 1,0 % и 2,0 % готовили аналогично, отмеривая на аналитических весах навески, равные 1,0 г и 2,0 г соответственно.

Для приготовления растворов субстанции карнозина концентрацией 0,1 % 1,0 % и 2,0 % брали точную навеску субстанции карнозина 0,05 г, 0,5 г или 1,0г, соответственно, переносили количественно в колбу мерную на 50 мл, добавляли 15 мл воды дистиллированной, перемешивали до полного растворения субстанции и доводили объем в колбе до метки водой.

2.2.2. Приготовление растворов таурина

Растворы субстанции таурина концентрацией 0,1 %, 1,0 % и 2,0 % готовили следующим образом: точную навеску субстанции карнозина 0,05 г, 0,5 г и 1,0 г, соответственно, переносили количественно в колбу мерную вместимостью 50 мл, добавляли 15 мл воды дистиллированной, перемешивали до полного растворения таурина и доводили объем в колбе до метки водой.

При разработке методик идентификации и количественного определения таурина использовали рабочие стандартные растворы таурина с содержанием вещества 0,2 %, 1 % и 2 %. Для приготовления 0,2 %-ного раствора точную навеску стандартного вещества таурина (0,2 г) отвешивали на аналитических весах, затем количественно переносили ее в мерную колбу вместимостью 100 мл. К веществу приливали 50 мл воды дистиллированной, перемешивали до полного растворения, затем доводили объем в колбе до метки тем же растворителем. Растворы таурина концентрацией 1,0 % и 2,0 % готовили аналогично, отмеривая на аналитических весах навески, равные 1,0 г и 2,0 г соответственно.

2.2.3. Приборы и оборудование

Приборы и оборудование, использованные в экспериментальных исследованиях, представлены в таблице 3.