Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Разработка системы поиска препаратов для коррекции нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях в ряду лигандов глутаматных рецепторов

На правах рукописи

003467063

ГРИГОРЬЕВ ВЛАДИМИР ВИКТОРОВИЧ

РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ПОИСКА ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ КОГНИТИВНЫХ ФУНКЦИЙ ПРИ

НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ В РЯДУ ЛИГАНДОВ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2009

003467063

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте физиологически активных веществ РАН

Научный консультант:

Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Сергей Олегович Бачурин

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Георгий Иванович Ковалев Доктор биологических наук, профессор Николай Михайлович Митрохин Доктор биологических наук Анатолий Николаевич Иноземцев

Ведущая организация - ГОУ ВПО Российский Государственный Медицинский Университет имени Н.И. Пирогова Росздрава.

Защита состоится 29 апреля 2009 года в _ часов на заседании

диссертационного Совета Д 001.024.01 при ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д. 8.

Автореферат разослан "_"_ 2009 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Е.А. Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Характерной тенденцией развития современного общества в большинстве :тран мира является увеличение продолжительности жизни и связанное с этим ювышение в структуре населения доли лиц пожилого и старческого возраста. 9ти процессы видоизменяют удельный вес различных форм патологий в юпуляции, среди которых доминирующее место занимают нейродегенеративные болезни. Именно поэтому, проблема когнитивных расстройств, в большинстве лучаев развивающихся при нейродегенеративных заболеваниях позднего юзраста, признается в настоящее время одной из наиболее актуальных и значимых с медико-социальной точки зрения (Иллариошкин, 2007).

Болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее распространенной формой нейродегенеративных заболеваний в пожилом возрасте. Ежегодно число больных БА и родственными формами увеличивается на 800 тысяч в Европе и на 360 тысяч в США и Канаде (Brookmeyer et al., 1998; Sykes et al., 2001). К настоящему времени число больных БА составляет около 20 млн. человек во всем мире, что наносит экономический ущерб, оцениваемый в 100 миллиардов долларов ежегодно (Fillit, Hill, 2005). Проблема старческого слабоумия является исключительно актуальной также и для нашей страны. Анализ эпидемиологических исследований позволяет говорить о том, что общая численность больных БА в России превышает 1 млн. человек (Гаврилова, 2001).

Вместе с тем, в настоящее время в реальной медицинской практике для лечения, в частности, БА широко используется крайне ограниченное число препаратов - всего четыре, три из которых являются ингибиторами ацетилхолинэстеразы. Все эти препараты обладают рядом побочных свойств. Поэтому создание новых препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний и улучшения когнитивных функций является важнейшей задачей современной фармакологии (Воронина Т.А., Середенин С.Б., 1998; Воронина Т.А., 2003; Островская Р.У. и др., 2002; Bachurin S.O., 2003; Середенин С.Б. и др., 2006).

Одним из наиболее интенсивно развиваемых в настоящее время направлений создания новых лекарственных средств является поиск потенциаторов АМРЛ рецепторов и блокаторов NMDA рецепторов глутаматергической медиаторной системы мозга (Lynch, Gall, 2006; Villmann, Becker, 2007). Неконкурентный блокатор NMDA рецепторов мемантин уже используется для лечения больных БА (Farlow, 2004). В то же время попытки применения других блокаторов NMDA- или потенциаторов АМРА рецепторов для лечения нейродегенеративных заболеваний и улучшения когнитивных функций у человека дают неоднозначные результаты. Потенцируя АМРА рецепторы в опытах in vitro, и улучшая память экспериментальных животных в поведенческих экспериментах, а также у людей-добровольцев, ряд потенциаторов АМРА рецепторов в клинических испытаниях не показывает достоверного улучшения когнитивных функций больных (Chappel et al., 2007; Goff et al., 2008). Безуспешными до сих пор остаются и попытки клинического использования антагонистов NMDA рецепторов (кроме мемантина) (Ikonomidou et al., 2000; Ikonomidou, Turski, 2002; Albensi et al, 2004). Все это делает актуальным выработку системы поиска перспективных соединений среди потенциаторов АМРА- и блокаторов NMDA рецепторов для оптимизации процесса создания новых лекарственных средств.

Цель исследования.

Определить прогностическую роль модуляции АМРА и NMDA рецепторов ЦНС млекопитающих лигандами глутаматных рецепторов с целью оптимизации поиска лекарственных средств для коррекции нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях.

Задачи исследования

1. Изучить влияние ряда эндогенных пептидов на функциональное состояние АМРА и NMDA рецепторов нейронов мозга млекопитающих.

2. Определить электрофизиологическим методом параметры ответов АМРА и NMDA рецепторов нейронов головного мозга млекопитающих на воздействие новых соединений.

3. Исследовать когнитивно-стимулирующие свойства наиболее активных соединений в поведенческих тестах.

1. Изучить нейропротективное и когнитивно-стимулирующее действие отечественного лекарственного препарата димебон и участие глутаматных рецепторов в его реализации.

5. По результатам исследований определить критерии поиска лекарственных средств для лечения нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях в ряду лигандов глутаматных рецепторов.

Научная новизна

Впервые электрофизиологическим методом показано существование в коре и гиппокампе головного мозга млекопитающих четырех типов нейронов, в которых ответы NMDA рецепторов на агонисты NMDA и хинолиновую кислоту, соагонист глицин, конкурентные антагонисты АР5 и АР7 значительно отличаются. Полученные результаты, наряду с данными других исследователей, полученными методами молекулярной биологии, послужили основанием для идентификации 4-х основных типов NMDA рецепторов в нейронах головного мозга млекопитающих.

Получены новые данные о механизмах действия ряда эндогенных пептидов на глутаматные рецепторы, свидетельствующие об их способности существенно модулировать работу АМРА и NMDA рецепторов нейронов головного мозга и тем самым влиять на когнитивные функции и нейродегенеративные процессы.

Впервые выявлено, что кортикотропин-подобный промежуточный лобный пептид (CLIP) потенцирует токи АМРА рецепторов и блокирует токи NMDA рецепторов. Установлено, что соматостатин аналогичным образом влияет на ответы АМРА и NMDA рецепторов. Можно предположить, что эти свойства CLIP и соматостатина определяют их важную роль в процессах формирования памяти.

Среди новых представителей химических классов; ациклических производных изотиомочевины (дибензиламинов и алкилизотиомочевин) и N,N'-3aMeiyeHHbix 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанов выявлены вещества, обладающие свойствами

позитивных аллостерических модуляторов АМРА рецепторов и неконкурентны антагонистов NMDA рецепторов. Показано, что соединения-лидеры - IP5051 IP9040, IP9150 и ХХХ-2 - обладают высокими когнитивно-стимулирующим] свойствами и низкой токсичностью.

Впервые установлен механизм действия димебона на АМРА и NMD/ рецепторы и изучены его переносимость и влияние на отдельные показател] старения у экспериментальных животных при длительном применении.

Установлено, что действие димебона на АМРА и NMDA рецепторь аналогично действию эндогенных пептидов, играющих важную роль i формировании памяти.

Сформулирована система поиска лекарственных средств для коррекции нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях в ряду лигандов глутаматных рецепторов на основе способности веществ одновременно потенцировать АМРА- и блокировать NMDA рецепторы. Научно-практическая значимость

1. Разработана методология поиска препаратов для коррекции когнитивных функций при нейродегенративных заболеваниях в ряду лигандов глутаматных рецепторов.

2. Расширено представительство химических классов позитивных модуляторов АМРА рецепторов.

3. Показано, что соединения-лидеры - IP5051, IP9040, IP9150 и ХХХ-2 представляют несомненный интерес для дальнейших предклинических испытаний в качестве препаратов для коррекции нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях.

4. Показано, что представитель гидрированных пиридо ([4,3-Ь]) индолов -димебон - помимо высоких когнитивно-стимулирующих и нейропротекторных свойств, обладает также свойствами при длительном применении предупреждать развитие отдельных признаков старения экспериментальных животных.

5. Результаты электрофизиологических и фармакологических исследований димебона легли в основу нормативных материалов и были представлены в

Россздравнадзор для получения разрешения на проведение клинических испытаний димебона по новому применению - в качестве средства для лечения БА.

Личный вклад автора

Личный вклад соискателя заключается в разработке идеи и планов работы, в постановке и проведении экспериментальных исследований, в статистической обработке и интерпретации полученных результатов.

Апробация работы

Результаты исследования и основные положения работы доложены на следующих научных конференциях и съездах: на I Всесоюзном Совещании «Глутаматные рецепторы», Ленинград, 1987; на 7-th Conference of European Neurochemical Society, Sweden, Stockholm, 1988; на межреспубл. конференции, Волгоград, 1989; на XIY Менделеевском Съезде, Москва, 1989; на 13rd Int. Congress of the Int. Society for Neurochemistry, Australia, Sydney, 1991; на 3rd Int. Congress of Compar. Physiol, and Bioch., Tokyo, 1991, на 16-th Meeting of the Int. Society for Neurochemistry, 1997, Boston, USA; на 4-th Congress of European Society for Clinical Neuropharmacology, 1997, Eilat, Israel; на 9-th Int. Congress of the Czech and Slovak Neurochemichal Society, 1998, Martin, Slovakia; на 2-й Российской конф. Болезнь Альцгеймера и старение: от нейробиологии к терапии, 1999, Москва; на 5th Int. Conf. on Neuroprotective Agents, 2000, Lake Tahoe, Calofornia, USA; на III Российской конф., посвящ. 100-летию со дня рождения проф. Э.Я. Штернберга, 2003, Москва; на Конф. «Фундаментальные науки - медицине». Росс. Акад. Наук, Москва, 2003; на XVIIth Int. Symposium on Medicinal Chemistry, 2004, Copenhagen, Denmark & Malmo, Sweeden; на Conference en Neurobiologie Ladislav Tauc: the World of Synapse: Molecular Basis, Pathology and Drug Discovery, 2004, Gif-sur-Yvette, France; на Симпозиуме «Современное состояние исследований, диагностики и терапии нейродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера, Паркинсона и др.), 2005, Москва; на 7lh Int. Conference "Alzheimer's and Parkinson's Diseases", Sorento, Italy, 2005; на XIV European Bioenergetics Conference, 2006, Moscow; на 8th Int. Symposium on Neurobiology and

Neuroendocrinology of Aging, Bregenz, Austria, 2006; на 10th Int. Conf. 01 Alzheimer's Disease and Related Disorders, Madrid, Spain, 2006; на III съезд фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению», 2007 С-Петербург; на конференции «Орг. химия для медицины», 2008, Черноголовка.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 41 печатная работа, в ton числе 14 статей в периодических изданиях, рекомендованных ВАК; получено ! патентов на изобретения.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзор; литературы, 5-ти глав, посвященных описанию материала, методов и результате] исследования, обсуждению результатов, выводов, а также списк; использованных 472 источников литературы, включающего 86 рабо-отечественных и 386 работ зарубежных авторов. Работа изложена на 281 страницах машинописного текста, содержит 36 таблиц и 85 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследованы новые соединения 3-х химических классов. Ациклические изотиомочевины были условно разделены на два класса: дибензиламины (N, S-замещенные К'-1-[(гетеро)арил] -1М'-[(гетеро)арил] метилизотиомочевины), и алкилизотиомочевины (S-замещенные N-1 - [(гетеро)арил] алкил-N' -1 -[(гетеро)арил] алкилизотиомочевины), синтезированные к.х.н. А.Н. Прошиным (ИФАВ РАН); К,№-замещенные 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонаны и производные пирролидинового ряда (аналоги АМПАкина BDP), синтезированы на кафедре органической химии МГУ им. М.В. Ломоносова М.И. Лавровым (Зав. кафедрой - академик РАН Н.С. Зефиров).

Исследованы эндогенные вещества: дельта-пептид сна (DSIP) (кат. № 150793, ICN), уридин (кат. № U3750, Sigma), мурамиловые пептиды (MDP) (кат. № А9519, Sigma), интерлейкин-lp (IL-1(3) (кат. № 195774, ICN), кортикотропин-подобный промежуточный лобный пептид (CLIP) (кат. № 152723, ICN), холецистокинин (ССК-4) (кат. № 154544, ICN), соматостатин (кат. № 195505, ICN); производные арахидоновой и докозагексаеновой кислот: амиды арахидоновой (АК) кислоты с дофамином - анандамид (АК-ДА), и этаноламином

АК-ЭА), амид докозогексаеновой кислоты (ДГК) с дофамином (ДГК-ДА), и фиры ДГК с этиленгликолем (ДГК-ЭГ) и нитроэтиленгликолем (ДГК-НЭГ). 1роизводные АК и ДГК синтезированы д.х.н., проф. В.В. Безугловым (Институт >иоорганической Химии РАН) и к.х.н. И.В. Серковым (ИФАВ РАН); [роизводные глутаминовой кислоты - фосфорсодержащие аминокарбоновые :ислоты - 2-амино-5-фосфонопентановая (АР5) и 2-амино-7-фосфоногептановая АР7) кислоты, синтезированные к.х.н. В. В. Рагулиным (ИФАВ РАН). В качестве препаратов сравнения исследованы лекарственные средства: ;имебон (субстанция, ООО "Органика"), мемантин (М9292, Sigma), такрин (№ 154198, ICN), и соединения: циклотиазид (С9847, Sigma) и МК-801 (М107, Sigma).

Для создания на животных экспериментальной модели болезни

Альцгеймера использовали нейротоксин AF64A - (1-этил-1[2-гидроксиэтил]азиринидиум хлорид ("Bachem").

Эксперименты в тесте «Условный рефлекс активного избегания» проведены на 160 крысах самцах популяции Вистар массой 240-280 г.

Эксперименты в тесте «Узнавания новой локализации объекта» проведены на 440 мышах самцах линии С57В1/6 в возрасте 3-4 месяца.

Эксперименты в тесте «Открытое поле» проведены на 30 мышах самках линии С57В1/6 в возрасте 27 месяцев.

Хронический эксперимент по изучению переносимости димебона при его длительном применении проведен на 98 мышах-самках линии С57В1/6 возраста 21 месяц.

Все животные содержались в виварии ИФАВ РАН в стандартных условиях. Световой цикл состоял из 12 часов дня и 12 ночи, день начинался в 6 часов и заканчивался в 18 часов.

Животные получали комбикорм ПК-120-1 для лабораторных крыс и мышей (экструдированный). Сертификат соответствия № РОСС RU. ПР15. В11046. ГОСТ Р50258-92.

Для измерения трансмембранных токов исследуемых нейронов Пуркинье мозжечка головного мозга крыс и нейронов коры головного мозга крыс, а также культивируемых нейронов гиппокампа крыс нами использован электрофизиологический метод patch-clamp в конфигурации whole cell (Hamill et al., 1980).

Нейроны Пуркинье выделяли из мозжечков 12-16 дневных крыс популяции Вистар. Для выделения использовали модифицированный метод Канеды (Kaneda et al., 1988). Для выделения нейронов коры головного мозга использовали тот же метод с той лишь разницей, что возраст крыс составлял 7-9 дней.

Культуральные нейроны получали из гиппокампов новорожденных крыс (1-суток) способом трипсинизации с последующим пипетированием. Культуральны клетки приготовлялись к.б.н. H.H. Лермонтовой и н.с. Т.П. Серковой (ИФА РАН).

Для получения трансмембранных токов производили активацию АМРА (а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовая кислота) рецепторов аппликацией растворов агонистов этих рецепторов - каиновой кислоты (КК) или глутаминовой кислоты, активацию NMDA рецепторов - аппликацией растворов агониста этих рецепторов М-метил-О-аспартата (NMDA) методом быстрой суперфузии растворов.

Для отведения токов использовали боросиликатные микроэлектроды (сопротивление 2,5 - 5,5 мОм). Для регистрации токов использовали прибор ЕРС-9 (НЕКА, Germany). Запись токов осуществлялась при помощи лицензионной программы Pulse (НЕКА, Germany) на жесткий диск компьютера Pentium-3. Обработка результатов осуществлялась при помощи программы Pulsefit (НЕКА, Germany).

Экспериментальная модель БА на крысах создавалась внутрижелудочковой инъекцией нейротоксина AF64A, который вызывает селективное разрушение ацетилхолиновых синаптических окончаний с последующей деградацией нейронов и снижением содержания ацетилхолиновых маркеров в гиппокампе и коре головного мозга крыс (Fisher, Hanin, 1986; Walsh, Opello, 1994; Lermontova et

al., 1998). Под эфирным наркозом в стереотаксисе крысам в боковые желудочки мозга инъецировали 3 нмоль AF64A в 3 мкл искусственной спино-мозговой жидкости, контрольным крысам вводили 3 мкл искусственной спино-мозговой жидкости.

Действие эндогенных пептидов на пресинаптические глутаматные рецепторы определяли при помощи метода захвата 45Са2+ в синаптосомы коры мозга крыс при стимуляции глутаматом и NMDA. Синаптосомы коры мозга крыс выделяли по стандартной методике Хайоша (Hajosh, 1975) из коры мозга новорожденных крысят (9-10 дней) популяции Вистар. Данные эксперименты проводили совместно с н.с. Л.Н. Петровой (ИФАВ РАН).

Исследования по оценке «Условного рефлекса активного избегания» (УРАИ) проведены на крысах с экспериментальной моделью БА по методу Т.А. Ворониной, Р.У. Островской (2005). На следующий день после операции крысам первой группы внутрибрюшинно вводили исследуемые вещества - димебон или IP5051 - в соответствующих дозах и это введение осуществляли ежедневно в течение 12 - 14 дней. Другой группе крыс с холинотоксином AF64A давали физраствор из расчета 0,1 мл/кг веса. Группам сравнения с холинотоксином AF64A вводили антихолинэстеразный препарат такрин или блокатор NMDA рецепторов мемантин. Контрольной интактной группе крыс внутрибрюшинно в течение всего времени эксперимента вводили физраствор. Все крысы в двухкамерной клетке типа Shuttle-box обучались избегать болевого раздражения, подаваемого через электрифицированный пол. Данные эксперименты проводили совместно с к.х.н. Н.В. Лукояновым и к.б.н. Н.Н. Лермонтовой (ИФАВ РАН).

Изучение действия веществ на память осуществляли с помощью теста узнавания объекта (Object recognition test) по методу (Gaffan, 1992; Kolb et al., 1994; Steckler et al., 1998). Эксперименты проводили в камере наблюдения, которая изготовлена из непрозрачного органического стекла белого цвета размером 48x38x30 см. В качестве объектов обследования использовали стеклянные флаконы коричневого цвета диаметром 2,7 см и высотой 5,5 см. За 2 - 3 мин. до помещения животного камеру и объекты обследования протирали

85% спиртом. Животных всегда помещали в центр камеры. Исследуемые вещества вводили внутрижелудочно за 1 час до тренировки. Контрольным животным вводили эквивалентный объем растворителя. Данные эксперименты проводили совместно с к.м.н. Б.К. Безноско (ИФАВ РАН).

Для определения двигательной активности животных, их эмоционального состояния и ориентировочно-исследовательской реакции использовали тест открытого поля по методу Т.А. Ворониной, С.Б. Середенина (2005). Данные эксперименты проводили совместно с к.м.н. Б.К. Безноско (ИФАВ РАН).

Состояние органов и тканей животных в длительном эксперименте оценивали с помощью гистологического метода. Для этого у павших животных и у животных в атональном состоянии забирали кусочки из внутренних органов и тканей. Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, после гистологической проводки заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Данные эксперименты проводили совместно с проф. JI.M. Михалевой (ГУ НИИ морфологии человека РАМН).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием статистического пакета программы Microsoft Excell (версия Windows ХР). Представлены средние арифметические и их доверительные интервалы (M±SD). Достоверность различий определяли по t-критерию Стьюдента. Достоверными принимали различия при р<0,05. Построение графиков осуществляли также с помощью программы Microsoft Excell.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изучение влияния эндогенных физиологически активных веществ и их синтетических производных на функциональное состояние АМРА и

NMDA рецепторов

Фундаментальные исследования, проведенные электрофизиологическим методом patch-clamp на свежевыделенных нейронах коры и гиппокампа головного мозга крыс в конце 80-х годов, показали, что в разных нейронах

пветы на агонист NMDA рецепторов NMDA, его эндогенный лиганд :инолиновую кислоту (ХК), соагонист глицин и конкурентные антагонисты АР5 I АР7 существенно варьировали. Обнаружено 4 типа нейронов, в которых ючетания ответов на эти вещества имели устойчивый характер, но существенно »тличались друг от друга (Grigoriev et al., 1991а, 1991b; Григорьев и др., 1992, Григорьев, 1993а; 19936). В нейронах 1 типа возможность генерации токов vMDA и ХК полностью зависела от наличия глицина, АР5 полностью подавляла NMDA- и ХК-активируемые токи, АР7 блокировала токи только на 60%; в нейронах 2 типа NMDA и ХК вызывали одинаковые токи, которые не зависели от наличия глицина, АР5 и АР7 полностью блокировали токи NMDA и ХК с глицином и без него; в нейронах 3 типа NMDA и ХК вызывали одинаковые токи, которые глицин существенно потенцировал, АР5 и АР7 обе почти одинаково блокировали токи обоих агонистов на 40-70%; в нейронах 4 типа NMDA и ХК без глицина вызывали разные токи, глицин изменял ток NMDA, но не влиял на ток ХК, АР5 не влияла на токи ХК, но блокировала изменение тока NMDA, АР7 блокировала прибавку тока, которую давал глицин, и частично подавляла ток без глицина.

Одновременно в ведущих лабораториях мира методами молекулярной биологии были выделены тРНК субъединиц NMDA рецепторов. Было установлено, что имеются два основных типа субъединиц: NR1 и NR2, но субъединиц NR2 имеется 4 подтипа - NR2A, NR2B, NR2C и NR2D (Holmann, Heineman, 1994). Полученные методом реконструкции 4 типа NMDA рецепторов, состоящие из двух NR1 и двух каких-либо NR2(X) субъединиц имели существенные отличия в своих функциональных и фармакологических свойствах (Buller et al., 1994; Chazot et al., 1994; Monyer et al., 1994; Laurie, Seeburg, 1994; Kendrick et al., 1996; Buller, Monaghan, 1997). В то же время имелось значительное сходство в реакциях этих разнородных NMDA рецепторов с данными, полученными нами.

Таким образом, полученные нами результаты, наряду с данными других исследователей, послужили основанием для идентификации 4-х основных типов

NMDA рецепторов в нейронах головного мозга млекопитающих, что явилос фундаментом для последующего синтеза избирательных и терапевтическ перспективных лигандов этих рецепторов.

С целью установления механизмов эндогенной регуляции когнитивных : нейродегенеративных процессов было изучено влияние ряда эндогенны пептидов на АМРА и NMDA рецепторы.

Электрофизиологические эксперименты на нейронах гиппокампа показали что кортикотропин-подобный промежуточный лобный пептид (CLIP) вызывав потенциацию ответов АМРА рецепторов в широком диапазоне концентрации (рис. 1). Кроме того, CLIP блокирует ответы постсинаптических NMD/ рецепторов, и в определенном диапазоне концентраций блокируе пресинаптические NMDA рецепторы. Особенностью действия CLIP н пресинаптические NMDA рецепторы является то, что он вызывает их блокад; только в очень низких концентрациях - 10"14—10"11 М.

контроль -14 -13 -12 -11 -10 -9 -8

Концентрация, lg М

Рис. 1. Влияние CLIP на NMDA (1) и КК (2) - активируемые токи в культивируемых нейронах гиппокампа крыс.

Примечание: по оси абсцисс - логарифм концентраций CLIP в Молях, по оси ординат - амплитуда токов по отношению к контролю %.

Соматостатин блокирует постсинаптические NMDA рецепторы, но активирует АМРА рецепторы практически во всем диапазоне концентраций (рис. 2). Это хорошо согласуется с его противосудорожным действием и

участием в процессах памяти (Matsuoka et al., 1994). Соматостатин также блокирует вход кальция, который вызывается активацией пресинаптических NMDA рецепторов, что подтверждает ранее полученные результаты о блокаде им входа кальция в пресинаптические терминала (Boehm, Betz, 1997).

200 160 160 НО 120 100 * 60 60 40 20 0

контроль -14 -13 -12 -11 -10 -9 -9 -7

Концентрация, ig M

Рис. 2. Влияние соматостатина на КК- (1) и NMDA (2) - активируемые токи в культивируемых нейронах гиппокампа крыс.

Примечание: по оси абсцисс - логарифм концентраций соматостатина в Молях, по оси ординат - амплитуда токов по отношению к контролю в %.

Установлено, что дельта-сон-вызывающий пептид (DSIP) блокирует постсинаптические NMDA рецепторы. Определенный интерес имеют установленные нами различия в действии DSIP на постсинаптические NMDA рецепторы в нейронах коры и гиппокампа. Начиная с концентрации DSIP 1x10"13 М, величина ответов в нейронах коры составляет в среднем 40% от контрольных величин. В нейронах гиппокампа его действие несколько отличается: блокирующий эффект наблюдается с концентраций DSIP на порядок выше -lxlO'12 M - и имеет волнообразный характер. Установлено, что DSIP также оказывает ингибирующее действие на пресинаптические NMDA рецепторы. В то же время DSIP не влияет на ответы АМРА рецепторов.

Уридин вызывал значительную, но не полную блокаду постсинаптических NMDA рецепторов и практически полную концентрационно-зависимую блокаду пресинаптических NMDA рецепторов. Учитывая сомногенное действие уридина, можно предположить, что он играет важную роль в процессах общего

торможении ЦНС, и также нейропротекторную роль во время сна (Kimura et al., 2001). Обнаружен небольшой потенцирующий эффект уридина на АМРА рецепторы, но пока не установлена его роль в когнитивных процессах.

Мурамиловые дипептиды (MDP) в наших экспериментах потенцировали АМРА и блокировали NMDA рецепторы. Холестокинин (ССК-4) блокировал захват кальция в узком диапазоне доз - (1x10"9 - 1x10'7 М) и в этом отношении его действие похоже на действие интерлейкина 1-(3 (IL1-P), только последний был на 2 порядка активнее. Эти данные говорят о том, что оба эти вещества в узком диапазоне доз способны модулировать пресинаптические NMDA рецепторы и тем самым нервную возбудимость и пластичность.

Проведенные исследования показали, что производные АК и ДГК в низких концентрациях, в отличие от самих кислот, способны влиять на ответы АМРА рецепторов. АК-ДА, ДГК-ДА и ДГК-ЭГ способны заметно потенцировать трансмембранные токи, вызываемые активацией АМРА рецепторов. ДГК-НЭГ, напротив, вызывает угнетение токов АМРА рецепторов. Полученные результаты подтверждают, что модификация молекулы эндогенного вещества может привести к весьма существенному изменению спектра его физиологической активности.

Наибольший интерес представляют данные о действии CLIP, который оказывает стимулирующее влияние на память во время фазы парадоксального сна, на глутаматные рецепторы (Seidenbecher et al., 1993; Wetzel et al., 2003; Ambrosini et al., 2001; Wetzel et al., 1994), а также соматостатина. Нами впервые установлено, что CLIP и соматоститин потенцируют АМРА рецепторы и блокируют NMDA рецепторы в широком диапазоне концентраций (6 порядков), что является крайне важным для проявления их память-стимулирующего эффекта. Полученные результаты расширяют наши знания о том, как эндогенные соединения могут осуществлять регуляцию когнитивных процессов. Один из таких механизмов может заключаться в модуляции АМРА и NMDA рецепторов.

Анализ полученных результатов в данном разделе работы позволяет заключить, что исследованные эндогенные пептиды играют важную роль в

зегуляции глутаматергической медиаторной системы мозга. Они действуют в срайне низких концентрациях, начиная с концентрации lxlO'14 М, сонцентрационно зависимо и обратимо, что говорит об исключительной специфичности соответствующих рецепторов. Диапазон оказываемого ими влияния на ответы постсинаптических глутаматных рецепторов достаточно узок и, как правило, не превышает 60-70% изменения от уровня контрольных значений.

Таким образом, выявленные параметры модуляции АМРА и NMDA рецепторов эндогенными веществами, в первую очередь CLIP и соматостатином, дают качественные и количественные ориентиры для поиска и отбора синтетических соединений в качестве потенциальных терапевтических препаратов. На их основе были разработаны направления синтеза новых соединений в нескольких химических классах.

Изучение влияния новых химических соединений на функциональное состояние АМРА и NMDA рецепторов В результате направленного синтеза в ИФАВ РАН и на кафедре органической химии МГУ им. М.В. Ломоносова были синтезированы новые вещества в трех химических классах, которые были изучены на их способность модулировать ответы АМРА и NMDA рецепторов нейронов ЦНС.

Изучение влияния производных дибензиламинов

Действие веществ на АМРА рецепторы. Показано, что большая часть соединений этого класса потенцирует токи АМРА рецепторов, но с разной степенью эффективности. Результаты исследований действия веществ на КК-вызванные токи в нейронах Пуркинье представлены в таблице 1.

Табл. 1. Влияние новых производных дибензиламинов на КК-вызванные токи в нейронах Пуркинье мозжечка крыс. В колонках - амплитуды токов в % при действии соответствующей концентрации вещества (M±SD)._

№ Шифр Концентрация веществ

п/п 10"7М 2ХЮ"7М 5х10'уМ ю-ьм 1<Г*М Зх10°М

1 IP5051J 100 - 130±5 165±10 550±35 1050±55

2 IP5051C1 100 - 130±5 165±10 550±25 1050±55

3 IP5051Br 100 - 130±5 165±10 550±25 1050±45

4 IP6016 100 - - 145±5 260±15 295±35

5 IP6024 100 - - 160±10 285±25 350±45

6 IP6025 100 - - 100 100 100

7 IP9011 100 145±35 155±25 145±25 100 100

8 IP9039 - 100 150±15 130±5 100 100

9 IP9095 105 105 105 105 100

10 IP9117 100 - - 100 100 100

11 IP9118 100 - - 100 100 100

12 IP9120 100 - - 120±10 160±20 290±35

13 IP9121 100 - - 110±5 140±15 210±30

14 IP9122 100 - - 125±10 170±20 310±35

15 IP9125 100 - - 100±5 125±5 145±15

16 IP9126 100 - - 180±10 250±20 250±30

17 IP9127 100 - - 100 100 100

18 IP9128 100 - - 100 100 100

19 IP9129 100 - - 100 100 100

20 IP9143 100 - - 100 100 100

21 IP9152 100 - - 210±10 245±20 275±35

22 IP9153 100 - - 220±20 280±30 320±40

23 IP9200 100 - - 100 100 100

24 IP9223 100 - - 100 100 100

25 IP9225 104 - - 170±10 210±15 -

26 IP9236 100 - - 100 100 100

27 IP9238 100 - - 124±5 150±15 150±15

28 IP9240 100 - - 139±10 180±25 215±40

29 IP9241 100 - - 119±5 140±10 180±25

30 IP9242 100 - - 125±5 360±45 700±95

31 IP9255 100 - - 100 100 100

32 1Р9260 169 - - 173±5 164±15 125±20

33 1Р9262 100 - - 160±20 560±45 800±70

34 1Р9263 100 - - 200±20 810±130 910±95

35 1Р9266 100 - 180±15 210±20 275±25

36 1Р9267 130 - 140±15 178±22 200±29

37 1Р9268 100 - 135±5 470±10 770±15

38 1Р9269 120 - 260±5 330±10 360±15

39 1Р9270 130 - 170±10 185±10 350±150

40 1Р9271 100 - 100 160±5 380±10

41 1Р9275 100 - 115±5 300±45 615±65

42 1Р9276 200 - - 143±15 142±10 135±8

Примечание: амплитуда контрольных токов взята за 100%.

На рисунке 3 приведены графики влияния некоторых представителей производных дибензиламинов на каинат-вызванные токи, демонстрирующие диапазон их активности как потенциаторов АМРА рецепторов.

На основании анализа полученных данных определено наиболее активное соединение. Этим соединением оказалось 1Р5051, вызывающее наибольшую потенциацию АМРА рецепторов.

Проведенные исследования показали, что циклотиазид (ЦТ) - модельный потенциатор АМРА рецепторов, блокирующий их десенситизацию, и соединение 1Р5051 оказывают на КК-вызванные токи аналогичное действие. Графики зависимости концентрация - ответ для КК, и для КК в присутствии 30 мкМ ЦТ или 1Р5051 (рис. 4) показывают, что оба соединения вызывают непараллельный сдвиг кривой концентрация-ответ для КК в диапазоне концентраций последней от 10 до 4000 мкМ. Ответы в присутствии 1Р5051 были немного больше, чем в присутствие ЦТ.

Практически полное сходство действия ЦТ и 1Р5051 на ответы, вызываемые активацией АМРА рецепторов в нейронах Пуркинье (рис. 4),

позволяет сделать вывод, что в основе механизма потенцирующего действия 1Р5051 лежит блокада десенситизации АМРА рецепторов.

контроль -7 5х-7 -6 -5 Зх-5

Концентрация, М

Рис. 3. Действие некоторых производных дибензиламинов на КК-вызванные токи в нейронах Пуркинье мозжечка крыс. Соединения: 1 - 1Р5051,2 - 1Р9242, 3 - 1Р9122, 4 - 1Р9260, 5 - 1Р9128.

Примечание: по оси абсцисс - логарифм концентраций веществ в Молях, по оси ординат - амплитуда токов по отношению к контролю в %.

Рис. 4. Влияние ЦТ и соединения 1Р5051 на зависимость концентрация - ответ для

токов, вызванных аппликацией КК в нейронах Пуркинье.

Примечание: Ответы нормализованы к ответам, вызываемым аппликацией

максимально использованной концентрации КК - 4 мМ для соответственно контроля (о) (принятом за 1) и в присутствии 30 мкМ ЦТ (о) и IP5051 (□).

Действие соединения IP5051 на NMDA рецепторы в нейронах коры головного мозга крыс. Установлено, что IP5051 блокирует токи, вызываемые активацией NMDA рецепторов. По степени чувствительности NMDA-активируемых токов к действию IP5051 и характеру вызываемой им блокады NMDA рецепторов исследованные нейроны коры головного мозга крыс были разделены на 2 группы.

Соединение IP5051 в нейронах 1 группы (п=5) блокировало ответы NMDA рецепторов в низких концентрациях. Важной особенностью действия IP5051 в этих нейронах явилось то, что более эффективно оно блокировало токи большей амплитуды. 1С5о соединения IP5051 для блокады токов различной амплитуды были неодинаковы и тем меньше, чем больше были NMDA-активируемые токи. Для максимальных токов в наших экспериментах ICj0 равнялась 0,4±0,15х10'6 М. Для самых маленьких токов IС50 равнялась 2,1±0,4х10"6 М (рис. 5).

5

-V-1-I I -------1--—Ч

в

---1_-------г ------,

5x1 ОМ Ю^М 5x10'3М 10"гМ ММОА

500 рА| 10 5

Рис. 5. Блокада соединением 1Р5051 NMDA-вызвaнныx токов в нейронах 1 группы коры головного мозга крыс.

Примечание: 1- контроль, 2-6 - концентрации 1Р5051- 0,5 мкМ, 1,0 мкМ, 2,0 мкМ, 10,0 мкМ и 30,0 мкМ соответственно.

Соединение 1Р5051 в нейронах 2 группы (п=13) вызывало блокаду №^ОА-активированных токов в гораздо более высоких концентрациях. Характер блокирующего действия в этих нейронах также существенно отличался от

действия 1Р5051 в нейронах 1 группы. Величина блокирующего эффекта не зависела от амплитуды НМОА-активированных токов. 1С50 соединения 1Р5051 в этой группе нейронов составляет примерно 2,3х10'5 М.

Изучение влияния производных алкилизотиомочевины Действие веществ на АМРА рецепторы. Только два соединения данного класса веществ - 1Р9040 и 1Р9150 потенцировали токи АМРА рецепторов. Особенностями действия этих веществ на токи АМРА рецепторов являются небольшие величины потенцирующего эффекта - максимум 170% от контроля -и обращение потенцирующего эффекта на противоположный при дальнейшем увеличении концентрации веществ (табл. 2).

Табл. 2. Влияние новых производных алкилизотиомочевины на каинат-

№ п/ п Шифр 1Р 10'" М 10"* М ЗхЮ"8 М 10"7М 5x10' 7М Ю'^М Ю'ь м 3x10" 5М

1 1Р9040 - 100 136±5 137.5± 148± 121±3 51 ±1 38±9

4 6 105

2 1Р9130 - - - 102 - 110 83 -

3 1Р9131 - - - 105 - 100 92 -

4 1Р9132 - - - 100 - 100 98 -

5 1Р9133 - - - 100 - 105 100 -

6 1Р9134 - - 100 107 - 100 80 -

7 1Р9135 - - - 100 - 100 100 -

8 1Р9142 - - - 100 - 100 100 -

9 1Р9150 107±2 165±22 - 127±9 - ±10 90 85

Примечание: вверху - концентрации веществ в молях. В колонках - амплитуды токов в % к контрольным значениям при действии соответствующей концентрации вещества (М±50). Амплитуда контрольных токов взята за 100%.

Действие веществ на ЫМРА реиепторы. Установлено, что соединение 1Р9040 во всех исследованных нейронах коры головного мозга (п=7) одинаково блокирует ИМОА-активируемые токи независимо от их амплитуды. 1С50 для

1Р9040 составила 0,8±0,2х10"6 М. Соединение 1Р9150 аналогичным образом блокировало токи ИЖ)А рецепторов. 1С5о для 1Р9150 - 1,5±0,5х10'6 М (п=4).

Изучение влияния производных Ы^'-замещенных 3,7-диазабицикло

[3.3.1] нонанов на функциональное состояние АМРА рецепторов

На основании компьютерного моделирования на кафедре органической химии МГУ были предсказаны и синтезированы новые производные, в качестве потенциаторов АМРА рецепторов, относящиеся к классу 3,7-диазабицикло[3.3.1 ]нонанов.

Действие обоих веществ на АМРА рецепторы имело куполообразную форму: низкие концентрации увеличивали токи, а большие наоборот -блокировали их (рис. 6). Оба соединения не влияли на КМОА-вызванные токи в нейронах коры головного мозга крыс в концентрациях 1x10'7 М - ЗхЮ"5 М.

контроль -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5

Концентрация, М

Рис. 6. Влияние производных ^ЗМ'-замещенных 3,7-диазабицикло[3.3.1] нонанов на каинат-вызванные токи в нейронах Пуркинье мозжечка крыс. Примечание: 1 - соединение ХХХ-1, 2 - соединение ХХХ-2. По оси абсцисс -логарифм концентрации веществ в молях, по оси ординат - % амплитуды ответов к контролю, принятому за 100%.

По своей активности в потенцировании АМРА рецепторов соединение

ХХХ-2 является "абсолютным рекордсменом": концентрация Ю-11 М является

наименьшей из известных в настоящее время, в которой вещества - позитивные

модуляторы АМРА рецепторов - способны вызывать потенциацию АМРА рецепторов. Как недавно установлено, процесс десенситизации предотвращается встраиванием двух молекул потенциатора АМРА рецепторов в межщелевое пространство между двумя димерами АМРА рецептора (Jin et al., 2005). Молекулы соединений XXX-1 или ХХХ-2, представляя собой производные сдвоенных молекул АМРАкина BDP (Тихонова и др., 2004), по-видимому, способны более эффективно, чем одиночные молекулы потенциатора, встраиваться в это пространство, предотвращая поворот димеров.

Изучение влияния соединений серии OCJIM (производных BDP) на функциональное состояние АМРА рецепторов.

Два соединения из синтезированного ряда - OCJIM-4 и OCJIM-8 -оказались активнее на 3 порядка исходного соединения BDP в потенциации токов АМРА рецепторов (рис. 7). Другие соединения этого ряда не показали

контроль -10 -9 -8 -7 -6 -5 Зх-5 -4

Концентрация, lg М

Рис. 7. Действие ОСЛМ-4 (1), ОСЛМ-8 (2) и BDP (3) на КК-вызванные токи в нейронах Пуркинье мозжечка крыс.

Примечание: по оси абсцисс - логарифм концентрации веществ в молях, по оси ординат - % амплитуды ответов к контролю, принятому за 100%.

способности потенцировать КК-вызванные токи. Все исследованные соединения, кроме BDP, приобрели свойство при определенном увеличении концентрации блокировать КК-вызванные токи.

Таким образом, среди новых производных ациклических алкилизотиомочевин и КИ'-замещенных 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанов выявлены соединения, которые обладают свойствами позитивных модуляторов АМРА рецепторов. Ранее подобная активность для представителей данных химических классов показана не была. Изучение механизма действия новых соединений на АМРА рецепторы показало, что потенциация ответов АМРА рецепторов происходит аналогично действию ЦТ, т.е. за счет уменьшения их десенситизации.

Другой важнейшей особенностью некоторых представителей производных ациклических алкилизотиомочевин является их способность неконкурентно блокировать ЫМОА рецепторы наряду с потенциацией АМРА рецепторов.

Изучение процесса блокады ЫМБА рецепторов соединением 1Р5051 показало, что в разных нейронах оно блокирует рецепторы различными механизмами. Один из механизмов, по-видимому, заключается в блокаде ЫМОА рецепторов, содержащих N{12 В субъединицы. Такое предположение можно сделать, сравнивая блокаду №уЮА рецепторов в нейронах 1 группы с литературными данными, полученными при изучении действия ифенпродила на ответы ЫМБА рецепторов, содержащих М12В субъединицы (Ке\у е1 а1., 1996) (Ифенпродил -прототипический антагонист М12В субъединицы КМБА рецепторов). Имеется практически полная аналогия в характере блокирующего действия 1Р5051 и ифенпродила (рис. 8).

А

Б

90

0.1

10

0,01

0,1

10

Рис. 8. Сравнение блокирующего действия соединения IP5051 на токи NMDA рецепторов в нейронах 1 группы и ифенпродила на токи Ы112В-содержащих NMDA рецепторов (из Kew et al., 1996).

Примечание: А- маленькие токи, в - большие токи. По оси абсцисс - логарифм концентрации IP5051 (А) и ифенпродила (Б), по оси ординат - величина блокирующего действия соединений в %, полная блокада - 100%.

В нейронах 2 группы IP5051 связывается, по-видимому, только с участком связывания МК-801 (блокатор ионного канала NMDA рецептора с очень медленной скоростью диссоциации) в ионном канале NMDA рецептора, но в гораздо более высоких концентрациях, чем в нейронах 1 группы. Вероятно, что и характер этого связывания сходен с характером блокирующего действия МК-801, о чем говорит длительное время отмывки МК-801 и IP5051 в больших концентрациях.

Соединение IP9040 также блокирует NMDA рецепторы. Вероятно, IP9040 блокирует NMDA рецепторы только путем блокады ионного канала NMDA рецептора, но характер этой блокады существенно отличается от блокады, вызываемой IP5051 в нейронах 2 группы. Сравнительный анализ блокирующего действия IP9040 и мемантина позволяет предположить, что оно осуществляется аналогично, по механизму быстрой диссоциации с рецептором, поскольку и мемантин и соединение IP9040 отмывались одинаково быстро, в течение 2-3-х минут.

Изучение фармакологической активности соединений-лидеров на моделях хронических нейродегенеративных заболеваний и в поведенческих тестах

Целью данной серии экспериментов было установить возможную связь между параметрами изменения ответов АМРА рецепторов в нейронах головного мозга при действии соединений и влиянием этих соединений на обучение и память экспериментальных животных. Для достижения этой цели определено влияние наиболее активных новых и модельных соединений на обучение и память как нормальных животных, так и животных с экспериментальной моделью БА.

Изучено влияние соединения IP5051 на обучение и память животных с

экспериментальной моделью БА в тесте УРАИ. В таблице 3 представлены результаты измерения количества правильных переходов во время обучения животных.

Табл. 3. Процент "правильных" переходов крыс в другую камеру во время подачи условного сигнала; последние 15 сигналов - при действии соединения 1Р5051.

Группы Контроль АР64А АР64А+ 1Р5051 1,0 мг/кг АР64А+ 1Р5051 5,0 мг/кг

Процент правильных переходов 78 ±5 р < 0,001 37 ±6,5 67 ±6 р < 0,05 85 ±7 р < 0,001

Примечание: достоверность рассчитывали по сравнению с группой животных

с АБ64А.

Через 24 часа крыс повторно помещали в установку и замеряли количество "правильных" переходов в другую камеру при подаче 25 сигналов. В расчет брали 5 последних сигналов. Тем самым было определено влияние 1Р5051 на память животных (табл. 4).

Табл. 4. Процент "правильных" переходов крыс в другую камеру во время подачи условного сигнала - последние 5 сигналов - при действии соединения 1Р5051 (влияние на память).

Группы Контроль АР64А АР64А+ 1Р5051 1,0 мг/кг АБ64А+ 1Р5051 5,0 мг/кг

Процент правильных переходов 66 ±8 Р < 0,05 28 ±7 68 ±7 р < 0,05 88 ±6 р < 0,05

Примечание: достоверность рассчитывали по сравнению с группой животных с

АР64А.

В результате исследования установлено, что 1Р5051 в дозах 1,0 и 5,0 мг/кг достоверно улучшало количество "правильных" переходов как во время обучения, так и во время воспоминания у животных с экспериментальной моделью БА.

Влияние новых и модельных веществ на обучение и память интактных

животных было изучено в тесте узнавания новой локализации объекта. При тестировании через 48 часов после тренировки контрольные животные затрачивали на обследование объекта в известной и новой локализации одинаковое количество времени, т.е. они воспринимали объекты в обоих местах как новые. Животные, которым вводили 1Р5051 в дозах 0,05 и 0,1 мг/кг, затрачивали на обследование объекта в новой локализации достоверно больше времени, чем на обследование в старой, а результаты животных, получивших дозу 0,5 мг/кг (р=0,051), находятся на границе достоверности (рис. 9). Исследование соединения 1Р9268 показало, что только животные, получившие соединение в дозе 5,0 мг/кг, помнят расположение объектов (рис. 10). Животные, получившие другие соединения: 1Р9150 в дозах 0,05 - 2,0 мг/кг; 1Р9040 в дозах 0,1-1,0 мг/кг; XXX-1 в дозе 0,1 мг/кг; ХХХ-2 в дозе 0,01 мг/кг; ОСЛМ-4 в дозе 0,1 мг/кг; ВОР в дозах 1,0 и 2,0 мг/кг помнят расположение объектов.

контроль 0.05 0.1 0.5 1.0

время регистрации 10 мин

Рис. 9. Влияние соединения 1Р5051 на память в тесте узнавания новой локализации известного объекта.

Примечание: ряд 1- контроль, ряд 2 - 1Р5051. Дозы 1Р5051 - в мг/кг.

Проведенные исследования показали, что соединения, которые потенцируют токи АМРА рецепторов, улучшают память животных в

□ Известная !

локализация а Новая локализация I

_^_I

80

g 70-------------

I 60 —р----------Х------1---

¡m

Контроль 0,5 мг/кг ! мг/кг 5 мг/кг

Время регистрации 10 мин.

Рис. 10. Влияние соединения IP9268 на продолжительность обследования объекта в известной и новой локализации.

поведенческих экспериментах. Однако не во всех случаях имелась прямая связь между величиной потенцирующего эффекта ответов АМРА рецепторов веществом и величинами доз, в которых это вещество оказывает когнитивно-стимулирующее действие. Хотя для некоторых соединений одного j химического класса такая связь прослеживалась, в других случаях наблюдалось явное противоречие. Например, соединения XXX-1 и ХХХ-2 - отличаются по своей активности в качестве потенциаторов АМРА рецепторов в 10 раз. В качестве стимуляторов памяти ХХХ-2 также активнее XXX-1 в 10 раз. Однако, для другой пары веществ наблюдается совсем иная картина: соединения IP5051 и IP9268 вызывают почти одинаковую потенциацию АМРА рецепторов (1050% и 770% соответственно при Зх10"5М), но в поведенческих экспериментах первое соединение было в 100 раз активнее, чем второе. В поисках ответа на вопрос за счет чего возникает такая большая разница в I эффективных дозах этих веществ, обратим внимание на то, что IP5051 дополнительно блокирует NMDA рецепторы. Может ли блокада NMDA рецепторов вносить свой вклад в проявление когнитивно-стимулирующего действия вещества? Исследование механизма действия димебона -

лекарственного препарата, который обладает высоким

нейропротекторным и когнитивно-стимулирующим действием (Bachurin et al., 2001а; Doody et al., 2008) позволило предложить ответ на этот вопрос.

Прогностическая значимость для клинических испытаний результатов электрофизиологических и фармакологических исследований новых соединений на примере препарата димебон

Изучение влияния димебона на функциональное состояние АМРА рецепторов.

Установлено, что димебон вызывает позитивную модуляцию ответов АМРА рецепторов в нейронах Пуркинье. Димебон приводил к увеличению каинат-вызванных токов на 16%, начиная с концентрации 2х10'7 М. В концентрации 5х10'7 М димебон вызывал потенциацию в среднем на 52%. Увеличение концентрации препарата не приводило к увеличению потенциации КК-вызванных токов. В диапазоне концентраций димебона 1x10"6 - 2x10"5 М потенциация токов составляла в среднем 42%. Дальнейшее увеличение концентрации димебона приводило к уменьшению потенцирующего эффекта, и в концентрации 4х10"5 - 5х10'5 М потенциация токов была равна нулю или ответы были даже меньше, чем в контроле (до - 6%). Таким образом, потенциация каинат-вызванных токов димебоном имеет куполообразную форму. Сравнение действия димебона с действием ЦТ показало, что в основе потенцирующего влияния димебона на АМРА рецепторы лежит его способность снижать десенситизацию этих рецепторов (рис. 11).

Изучение влияния димебона на функциональное состояние NMDA рецепторов.

Установлено, что димебон оказывает блокирующее действие на токи, вызываемые аппликацией NMDA в нейронах (п=33) коры головного мозга крыс. По характеру этой блокады мы разделили исследованные нейроны коры на 2 группы. В нейронах 1-й группы (п=9) димебон в низких концентрациях блокировал NMDA-активируемые токи: ICjo—7,7±1,4х10"6 М (рис. 12). В нейронах 2-й группы (п=24) димебон блокировал NMDA-активируемые токи в гораздо более высоких концентрациях: IC50= 7,3±2,1х10'5 М.

1000 аоо 600 700 600 500 400 300 200 100 о

контроль 2х-7 5х-7 -6 5х-6 -5 2х-5

Концентрация, М

Зх-5 5х-5

Рис. 11. Действие димебона (1) и циклотиазида (2) на КК-вызванные токи в нейронах Пуркинье.

Примечание: по оси абсцисс - логарифм концентрация веществ в Молях. По оси ординат - амплитуда ответов в % по отношению к контролю, принятому за 100%.

Препарат сравнения мемантин также оказывал блокирующее действие на ИМБА-активируемые токи (п=23), отличавшееся от действия димебона. В нейронах 2-й группы по нашей классификации мемантин эффективно блокировал токи: 1С5о =1,4±0,4х10"6 М. В нейронах 1-й группы мемантин менее эффективен: ГС50=1,5±О,32х1О"5М(рис. 12).

В

.....

Рис. 12. Действие димебона (А) и мемантииа (Б) на ЫМБА-вызванные токи в нейронах 1 группы.

Примечание: 1- контроль, 2 - при добавлении в физраствор 10 мкМ димебона (А) и 20 мкМ мемантина (Б), 3 - ответы после 3 минут отмывки. Калибровка: вертикальная - 200 рА, горизонтальная - 2 сек.

Таким образом, оба препарата блокируют ЫМБА рецепторы, но действуют, вероятно, на разные их субъединицы и/или на разные участки рецептора. Наши опыты подтверждают, что мемантин является блокатором открытого состояния ионного канала КМБА рецептора, действующим по механизму быстрой диссоциации с рецептором. Одной из вероятных мишеней действия димебона, в отличие от мемантина, является участок связывания ифенпродила, локализованный на МЯ2В-субъединице ЫМБА рецептора. Сравнительный анализ результатов компьютерного 3<1 моделирования, проведенного на кафедре органической химии МГУ им. М.В. Ломоносова, показал, что димебон может достаточно эффективно взаимодействовать с участком связывания ифенпродила на Ы-концевом домене N112В субъединицы (чему соответствует блокада рецепторов в низких концентрациях в нейронах 1 группы), но гораздо менее эффективно взаимодействовать с участком связывания МК-801 внутри ионного канала >ШГОА рецептора (блокада №ЛБА рецепторов в высоких концентрациях в нейронах 2 группы) (Тихонова, 2005; Т^опоуа е1 а1., 2002).

Изучение влияния димебона на память в поведенческих экспериментах.

Тест УРАИ выполнен на животных с экспериментальной моделью БА. Животные, у которых нейротоксином АБ64А были разрушены холинергические нейроны, получали димебон в дозе 1,0 мг/кг в течение 12 дней. В результате исследования установлено, что димебон существенно уменьшает латентное время перехода крыс в другую камеру, что свидетельствует о его позитивном влиянии на обучение и память экспериментальных животных (рис. 13, рис. 14).

Также изучено влияние димебона на память мышей в тесте узнавания известного объекта в новой локализации (рис. 15). В данном тесте димебон достоверно улучшает память мышей в дозах 0,01 - 0,15 мг/кг (р<0,05).

«оитроль АРМА АЯМА+дммвбои А*МА+Т»крин

Рис. 13. Влияние димебона в дозе 1,0 мг/кг на латентное время перехода крыс в другую камеру после подачи условного сигнала сразу после обучения.

т т

контроль АР64А АР64А*0 АР64А*Т

Рис. 14. Влияние димебона в дозе 1,0 мг/кг на латентное время перехода крыс в другую камеру после подачи условного сигнала после через 24 часа после обучения (влияние на память).

Исследование влияния димебона на функциональное состояние животных в условиях длительного хронического применения. Мыши получали димебон в дозе 1,5 мг/кг в сутки в течение 15 месяцев. Через несколько месяцев эксперимента стало понятно, что димебон не только не оказывает каких-либо токсических эффектов на стареющих животных, но наоборот, вызывает улучшение их состояния. Число волосяных фолликулов на единице

0,05 0,1

Дозы димебона мг/кг. Время обследования 10 минут.

Рис. 15. Влияние различных доз димебона на продолжительность обследования объекта в известной и новой локализации. Ряд 1- известная локализация, Ряд 2-новая локализация.

площади кожного лоскута по данным морфологических измерений составляло в среднем в контрольной группе 2,19±1,07 и 3,54±0,67 (р<0,04) в экспериментальной группе. Количество животных с катарактой также было больше в контрольной группе - до 26% (р<0,03158, начиная с возраста 26 месяцев). Чисто внешне животные опытной группе выглядели намного сохраннее, активнее, чем в контрольной группе.

Двигательная активность молодых животных в возрасте 4-5 месяцев по числу пересеченных квадратов в тесте "открытое поле" составляла 59,5±6,16; старых контрольных животных - 9,17±4,27, старых животных, хронически получающих димебон - 18,83±4,34 (р<0,05). Т.е. димебон существенно сохранял двигательную активность старых животных.

Средние массы всех органов у животных экспериментальной группы были ближе к массам органов молодых животных. Они имели меньшие отклонения от среднего значения, что также характерно для молодых животных и, по-видимому,

связано с меньшим количеством органных патологий, значительно изменяющих массу того или иного органа.

Димебон увеличивал среднюю и максимальную продолжительность жизни животных. Наиболее показательно это проявилось в конце эксперимента: если сравнить количество живых мышей в каждой возрастной группе: 900, 950 и 1000 дней, то мы увидим, что если в группе 900 дней количество доживших животных опытной группы превышало таковых в контрольной только на 28% (р<0,05), то в группе 950 дней уже в 2,5 раза (р<0,002), а в группе 1000 дней - в 4 раза (р<0,0001).

При микроскопическом изучении взятых в исследование органов и тканей животных обеих групп существенных изменений в их гистоструктуре не выявлено, за исключением миокарда и головного мозга. В миокарде мышей контрольной группы определяются четкие изменения со стороны ядер кардиомиоцитов по типу кариорексиса и кариолизиса. Кроме того, определяются очаги фрагментации волокон. Вышеописанные изменения со стороны миокарда мышей опытной группы почти не наблюдаются. Микроскопическая характеристика вещества больших полушарий и мозжечка головного мозга мышей обеих групп соответствует нормальному строению. Однако, у большинства животных контрольной группы, по сравнению с опытной, относящихся к одной возрастной группе, выявлены выраженный перицеллюлярный отек и разрежение вещества мозга.

Таким образом, проведенный эксперимент на старых животных - мышах-самках линии С57В1/6 - показал, что димебон при его ежедневном пожизненном применении в течение 15 месяцев оказывает выраженное нейропротекторное и цитопротекторное действие. Димебон ни по одному показателю не проявил побочных токсических эффектов, что предполагает его безопасное использования на людях в течение продолжительного времени (ВасЬипп е1 а1., 2007). На основании полученных результатов была подана заявка в Росздравнадзор для получения разрешения медицинского применения димебона по новому

назначению в качестве лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера и стимулятора когнитивных функций.

На основании разрешения Росздравнадзора в начале 2006 года начались клинические испытания димебона на 2-ой фазе в 10 центрах в России по инициативе американской компании МесИуайоп. Испытания проводились по системе двойного слепого контроля. Терапевтическая эффективность оценивалась по шкалам АБА8-^ и С1В1С-р1и5 по пяти параметрам, наиболее часто измеряемым при оценке больных БА. По всем показателям были получены высокие достоверные отличия от пациентов, получающих плацебо (р<0,0001) (Боос1у е1 а1., 2007а, Ь; Ооос1у й а1., 2008).

Полученные результаты свидетельствуют о высоких терапевтических, нейропротекторных и когнитивно-стимулирующих свойствах димебона, что позволяет использовать его в качестве эталона при отборе новых перспективных соединений. Сравнение параметров влияния на ответы АМРА и ММОА рецепторов и когнитивно-стимулирующих свойств димебона и новых соединений-лидеров позволит нам понять связь между этими свойствами веществ и оценить их прогностическое значение при поиске новых потенциальных лекарственных средств (табл. 5).

Табл. 5. Соотношение концентраций и доз веществ, в которых они потенцируют АМРА рецепторы, блокируют №уГОА рецепторы в электрофизиологических экспериментах, и улучшают память животных в тесте узнавания новой локализации объекта (УНЛО).

Соединение; название или шифр Потенциация АМРА рецепторов (макс % к контролю) Блокада ЫМБА рецепторов, 1С50 Эффективные дозы в тесте УНЛО, мг/кг

Димебон 2x10"'-2x10"5 М (170%) 1) 7,7х10'ьМ 2) 7,ЗхЮ'5М 0,01-0,15

1Р5051 5х10"'-5х10'5М (1050%) 1) 0,4х10'6М 2) 2,3х10'5 М 0,05 - 0,5*

1Р9268 ЬсЮ^-ЗхЮ^М (770%) Не действует 5,0

IP9150 1х10'*-5х10"'М (165%) 1,5х10'й М 0,05-2,0

IP9040 Зх10"8~10'0М (148%) 8,0x10-' М 0,1-1,0

Мемантин Не действует 1,4х10"6М 2,0-2,5

Примечание- доза 0,5 мг/кг находится на границе достоверности (р=0,51).

Четыре из представленных в табл. 5 соединений потенцируют АМРА рецепторы и одновременно блокируют NMDA рецепторы: димебон, ÍP5051, IP9150 и IP9040; одно соединение, IP9268, только потенцирует АМРА рецепторы, и не действуют на NMDA рецепторы; препарат сравнения мемантин только блокирует NMDA рецепторы. Все 4 вещества, которые потенцируют АМРА рецепторы и одновременно блокируют NMDA рецепторы, имеют, в отличие от "чистых" потенциаторов АМРА рецепторов и "чистых" блокаторов NMDA рецепторов, более низкие действующие дозы, в которых они улучшают память животных, и более широкий диапазон эффективных доз.

Димебон блокирует, как было сказано выше, NR2B содержащие NMDA рецепторы. Таким же образом действует и соединение IP5051. Оба вещества улучшают память, начиная с низких доз, и имеют широкий диапазон эффективных доз. Вероятно, способность этих веществ блокировать NR2B содержащие NMDA рецепторы вносит важный вклад в проявление ими когнитивно-стимулирующих свойств, поскольку недавно было показано, что избирательные антагонисты NR2B содержащих NMDA рецепторов улучшают память животных (Higgins et al., 2005).

Известно, что блокада ионного канала NMDA рецептора веществом приводит к серьезным побочным поведенческим эффектам и ухудшает память животных, если осуществляется аналогично действию МК-801 (Filliat, Blanchet, 1995; Nöda et al., 2001). Однако эта блокада может не иметь побочных эффектов, и даже наоборот, существенно улучшать память, если она осуществляется по механизму действия препарата мемантин (Parsons et al., 2007). Мемантин связывается с участком внутри ионного канала NMDA рецептора, но в отличие от

МК-801, легко покидает его при деполяризации, если ионный канал откры (Parsons et al., 1993; Frankiewicz et al., 1996). Приведенный выше анализ блокирующего действия соединения IP9040 показал, что оно блокирует NMDA рецепторы подобно мемантину, результатом чего может быть усиление его когнитивно-стимулирующих свойств.

Исходя из полученных результатов, можно заключить, что сочетание у одного вещества свойств потенциатора АМРА рецепторов и блокатора NMDA рецепторов по определенным механизмам является крайне важным фактором для проявления веществом высоких когнитивно-стимулирующих свойств при нейродегенеративных заболеваниях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, по результатам нашего исследования установлены оптимальные критерии модуляции глутаматных АМРА и NMDA рецепторов ЦНС для веществ, являющихся потенциальными препаратами для лечения нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях. Изучение влияния на АМРА и NMDA рецепторы эндогенных пептидов: CLIP и соматостатина, играющих важную роль в механизмах памяти, показало, что они потенцируют токи АМРА и блокируют токи NMDA рецепторов. В результате изучения механизма действия на АМРА и NMDA рецепторы димебона установлено, что он потенцирует токи АМРА и блокирует токи NMDA рецепторов. Параметры его влияния на эти рецепторы существенно совпадают с параметрами влияния эндогенных стимуляторов памяти CLIP и соматостатина. Изучение действия новых веществ - производных ациклических алкилизотиомочевин, N,N'-3aMeineHHbix 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанов, пирролидинов (аналогов АМРАкина BDP), модельных соединений на АМРА и NMDA рецепторы, а также их влияния на память в различных поведенческих тестах показало, что наиболее эффективно влияют на память те соединения, которые способны одновременно потенцировать АМРА рецепторы и блокировать NMDA рецепторы. Важнейшим элементом является способность вещества блокировать NMDA рецепторы по одному из двух возможных механизмов:

неконкурентная блокада ионного канала подобно действию мемантина по механизму быстрой диссоциации с рецептором, или блокада NR2B субъединиц содержащих NMDA рецепторов.

В результате изучения действия веществ на АМРА и NMDA рецепторы на клеточном уровне были отобраны соединения- лидеры: IP5051, IP9040, IP9150 и ХХХ-2 (рис. 16), Все эти соединения (кроме ХХХ-2) потенцируют АМРА и блокируют NMDA рецепторы. В поведенческих экспериментах эти соединения оказывают наибольшее когнитивно-стимулирующее действие.

IP9150

оЛ^О.

^с/

ХХХ-2

сн3

димебон

Мемантин

Рис. 16. Строение соединений-лидеров и препаратов сравнения.

Принципы отбора наиболее перспективных соединений в ряду лигандов глутаматных рецепторов представлены на схеме на рисунке 17. Согласно этой схеме эффективность соединений «двойного» действия в улучшении когнитивных функций особенно при нейродегенеративных заболеваниях оказывается существенно выше, чем действие мемантина (другого антагониста NMDA рецепторов) или просто «чистого» потенциатора АМРА рецепторов.

Установлено соответствие механизма действия на АМРА- и ММОА рецепторы новых соединений-лидеров действию наиболее эффективного

препарата для лечения БА - димебона, и их общее соответствие действию эндогенных стимуляторов памяти CLIP и соматостатина.

Пре j j Пост |

I I____I

Глу

L

4} - - I......, !

1Г 'V

/£> i Г.......!

ч^ * * I,

мм

fWlMN

f\

IP, димебон |

С&)

ж ж \iLJ ж ж К

ЯШ

Рис. 17. Соединения с «двойным» механизмом действия на глутаматные рецепторы в условиях БА или другого снижения когнитивных функций при увеличении синаптического "шума" и снижении относительной величины "полезного сигнала".

Примечание: 1 - блокада "шума" мемантином, 2 - потенциация ответа "чистым" потенциатором АМРА рецепторов (+ потенциация "шума"), 3 - влияние IP9040, IP5051 или димебона: потенциация ответа AMP АР + блокада "шума" NMDAP. Пре - пресинаптический нейрон, Пост - постсинаптический нейрон. Глу -медиатор глутамат. AMP АР и NMDAP - соответствующие рецепторы.

Таким образом, система поиска препаратов для коррекции когнитивных нарушений при нейродегенеративных заболеваниях среди лигандов глутаматных рецепторов предполагает наличие у вещества способности потенцировать АМРА рецепторы и одновременно блокировать NMDA рецепторы по одному из двух механизмов: блокада ионного канала по механизму быстрой диссоциации с рецептором или блокада NR2B субъединицы, действуя на сайт связывания ифенпродила. Эффективность данного подхода подтверждена в поведенческих тестах и клинических испытаниях, и имеет высокую прогностическую ценность.

ыводы

. Электрофизиологическим методом patch-clamp показано существование в коре гиппокампе головного мозга млекопитающих четырех типов нейронов, которые одержат различные NMDA рецепторы, отличающихся по совокупности ответов a NMDA, хинолиновую кислоту, глицин, АР5 и АР7.

. Определены параметры и характер ответов АМРА и NMDA рецепторов на оздействие отдельных эндогенных пептидов, которые подтверждают участие екоторых из них (кортикотропин-подобный промежуточный лобный пептид, оматостатин) в формировании памяти и механизмах эндогенной ейропротекции.

. Из изученных новых представителей двух классов химических соединений -роизводных ациклических изотиомочевин и N.N'-замещенных иазабициклононанов - отобраны наиболее активные соединения (IP5051, Р9040, IP9150 и XXX-2), обладающие свойствами эффективных позитивных одуляторов АМРА рецепторов.

Установлено, что исследованные соединения, потенцирующие АМРА ецепторы, улучшают обучение и память как интактных животных, так и ивотных с экспериментальной моделью болезни Альцгеймера в поведенческих естах.

. Установлено, что неконкурентная блокада NMDA рецепторов, осуществляемая ли за счет блокады ионного канала по механизму быстрой диссоциации с ецептором, или за счет блокады NR2B субъединицы, вносит существенный клад в характер проявления соединением его когнитивно-стимулирующей ктивности и широты терапевтического действия.

. Установлен механизм действия отечественного препарата димебон на АМРА и MDA рецепторы, что явилось одним из оснований для его медицинского применения по новому назначению в качестве лекарственного средства для лечения нейродегенеративных заболеваний (в частности, болезни Альцгеймера) и стимулятора когнитивных функций.

7. Оптимальными критериями поиска препаратов для коррекции когнитивны нарушений при нейродегенеративных заболеваниях среди лигандов глутаматны рецепторов, являются их способность потенцировать АМРА рецепторы одновременно блокировать NMDA рецепторы, что подтверждено поведенческих тестах и клинических испытаниях, и имеет высокую прогностическую ценность. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Григорьев, В.В. Гипервозбуждение, вызываемое возбуждающими аминокислотами и его фармакологическая коррекция [Текст] / В.В. Григорьев, В.А. Неманова, В.А. Рагулин // Глутаматные рецепторы: тезисы I Всесоюзного совещания, Ленинград. - 1987. - С. 37.

2. Григорьев, В.В. Исследование противосудорожной активности антагонистов глутаматных рецепторов в ряду фосфорсодержащих аминокарбоновых кислот [Текст] / В.В. Григорьев, В.В. Рагулин, В.А. Неманова, E.H. Цветков // Хим.-фарм. ж. - 1988. -№3,- С. 275-277.

3. Grigoriev, V.V. Specific and functional differences of NMDA receptors [Текст] / V.V. Grigoriev, V.A. Nemanova, S.O. Bachurin // Proc. 7th Conference of European Neurochemichal Society. Sweden, Stockholm. - 1988. - P. 143.

4. Григорьев, B.B. Гиперактивность и судороги, вызываемые возбуждающими аминокислотами, и их фармакологическая коррекция [Текст] / В.В. Григорьев, В.А. Неманова; редкол. "Бюлл. экспер. биол. мед". - М., - 1988. - 5 с. - Деп. в ВИНИТИ № 3469-В88.

5. Григорьев, В.В. Фармакологические и функциональные различия NMDA-рецепторов у мышей и крыс [Текст] / В.В. Григорьев, В.В. Рагулин, E.H. Цветков // Синтез, фармакол. и клин, аспекты нов. психотр. и серд. сосуд, вещ-в: тезисы межреспубликанской конференции, Волгоград. - 1989. - С. 73.

6. Григорьев, В.В. Фосфорсодержащие аминокислоты - новый класс противосудорожных веществ [Текст] / В.В. Григорьев, В.А. Неманова, В.В. Рагулин, E.H. Цветков // Материалы XIY Менделеевского съезда, Москва. -1989.-С. 175.

. Григорьев, В.В. Видовые и функциональные различия NMDA рецепторов Текст] / В.В. Григорьев, В.А. Неманова // Бюлл. экспер. биол. мед. - 1989. - № 9. С. 299-302.

. Grigoriev, V.V. The action of glycine and competitive antagonists on NMDA-nduced currents in the rat cortical neurons [Текст] / V.V. Grigoriev, V.V. Ragulin, .0. Bachurin // Proc. of 13rd Internat. Congress of Intemat. Society for eurochemistry, Australia, Sydney. - 1991a. - P. 218.

. Grigoriev, V.V. Different influence of competitive antagonists (AP5 and AP7) on MDA responses in rat and mice hippocampal neurons [Текст] / V.V. Grigoriev, V.A. emanova, V.V. Ragulin, S.O. Bachurin // Abstacts of 3rd Internat. Congress of omparative Physiology and Biochemistry, Tokyo. - 1991b. - P. 95.

0. Григорьев, B.B. Видовые различия в действии конкурентных антагонистов MDA-рецепторов в нейронах гиппокампа мышей и крыс [Текст] / В.В. ригорьев, В.А. Неманова, В.В. Рагулин // Докл. Акад. Наук. - 1992 - Т. 326, № .-С. 742-745.

1. Григорьев, В.В. Действие NMDA и хинолиновой кислоты на нейроны коры оловного мозга крыс. [Текст] / В.В. Григорьев // Докл. Акад. Наук. - 1993а. - Т. 30,№5.-С. 646-648.

2. Григорьев, В.В. Общие рецепторы аспартата и хинолиновой кислоты, тличные от NMDA-рецепторов, на некоторых нейронах коры головного мозга рыс. [Текст] / В.В. Григорьев // Нейрофизиология/Neurophysiology, - 19936. - Т.

1,№4. -С. 264-266.

3. Bachurin, S.O. Directed selection of novel neuroprotectors for Alzheimer's desease reatment [Текст] / Bachurin S.O., A.Z. Afanas'ev, V.V. Grigoriev, N.N. Lermontova,

.V. Lukoyanov, S.E. Tkachenko, N.S. Zefirov // J. Neurochem. - 1997. - V. 69, uppl.-P. 48B.

14. Bukatina, E.E. Medicine for treatment of Alzheimer's desease [Текст] / E.E. -ukatina, A.Z. Afanasiev, S.O. Bachurin, V.V. Grigoriev, I.V. Grigorieva, S.E. kachenko, M.A. Yurovskaya, N. S. Zefirov // Proc. of the 4-th Congress of European Society for Clinical Neuropharmacology, Eilat, Israel. - 1997. - P. 66.

15. Bachurin, S.O. Cognition enhancing properties of antihistamine drug Dimebon [Текст] / S.O. Bachurin, E.E. Bukatina, V.V. Grigor'ev, I.V. Grigor'eva, Yu.J. Ivanov N.V. Lukoyanov, S.E. Tkachenko, N.S. Zefirov // Neurobiology of Aging. - 1998. Vol. 19.Ns4S.-P. 180.

16. Grigoriev, V.V. Isothiouronium derivative potentiates kainate - induced currents i Purkinje neurons of rat cerebellum. [Текст] / V.V. Grigoriev, O.A. Drany, A. N Proshin, S.E. Tkachenko, S.O. Bachurin // Proc. 9-th Internat. Congress of the Czec and Slovak Neurochemichal Society, Martin, Slovakia. - 1998. - P. 46.

17. Григорьев, B.B. Потенциация АМРА/каинатных рецепторов как возможны'" механизм усиления когнитивных функций и памяти у лабораторных животных н модели хронической частичной депривации холинэргической системы ЦНС. [Текст] / В.В. Григорьев, О.А. Драный, С.О. Бачурин // Болезнь Альцгеймера и старение: от нейробиологии к терапии: материалы 2-й Росс, конф., Москва, 18-20 октября 1999.-М., 1999.-С. 141-142.

18. Bachurin, S.O. Isothiouronium derivative potentiates Ampa/kainate - induce currents in rat cerebellar Purkinje neurons [Текст] / S.O. Bachurin, V.V. Grigoriev, O.A. Drany, A. N. Proshin, S.E. Tkachenko // J. Neurochem. - 1999. - Vol. 73, Suppl. -S143D.

19. Bachurin, S. Antihistamine agent Dimebon as novel neuroprotector and cognition enhancer [Текст] / S. Bachurin, E. Bukatina, N. Lermontova, S. Tkachenko, A. Afanasiev, V. Grigoriev, I. Grigorieva, Yu. Ivanov, S. Sablin, N. Zefirov // Neuroprotective Agents: Abstr. 5th Int. Conference on Neuroprotective Agents, Sept. 17-21, 2000, Lake Tahoe, Calofornia, USA. - 2000. - P. 249

20. Bachurin, S. Neuroprotective and cognition enhancing properties of MK-801 flexible analogs: structure-activity relationships [Текст] / S. Bachurin, S. Tkachenko, I. Baskin, N. Lermontova, L. Petrova, A. Ustinov, A. Proshin, V. Grigoriev, N. Lukoyanov, V. Palyulin, N. Zefirov // Abst. 5th Int. Conference on Neuroprotective Agents, Sept. 17-21,2000, Lake Tahoe, Calofornia, USA. - 2000. - P. 251

21. Bachurin, S. Neuroprotective and cognition enhancing properties of MK-801 flexible analogs. Structure-activity relationships [Текст] / S. Bachurin, S. Tkachenko, I.

Baskin, N. Lermontova, Т. Mukhina, L. Petrova, A. Ustinov, A. Proshin, V. Grigoriev, N. Lukoyanov, V. Palyulin, N. Zefirov // Ann. N.Y Acad. Sci. - 2001. - Vol. 939. - P. 219-235.

22. Bachurin, S. Antihistamine agent Dimebon as novel neuroprotector and cognition enhancer [Текст] / S. Bachurin, E. Bukatina, N. Lermontova, S. Tkachenko, A. Afanasiev, V. Grigoriev, I. Grigorieva, Yu. Ivanov, S. Sablin, N. Zefirov // Ann. N.Y Acad. Sci. - 2001. - Vol. 939. - P. 425-435.

23. Григорьев, B.B. Сравнительное исследование механизма действия препаратов Димебона и Мемантина на AMP А- и NMDA-подтипы глутаматных рецепторов нейронов головного мозга крыс [Текст] / В.В. Григорьев, О.А. Драный, Е.А. Кустова, С.О. Бачурин // Болезнь Альцгеймера и старение: материалы III Российской конф., посвященной 100-летию со дня рождения проф. Э.Я.Штернберга, 23-24 апреля 2003 г., Москва. -М., 2003. - С. 178-182.

24. Григорьев, В.В. Сравнительное исследование механизма действия препаратов Димебона и Мемантина на AMP А- и NMDA-подтипы глутаматных рецепторов нейронов головного мозга крыс [Текст] / В.В. Григорьев, О.А. Драный, С.О. Бачурин //Бюлл. экспер. биол. мед.-2003.-Т.136, № 11.-С. 535-538.

25. Зефиров, Н.С. Направленный поиск и создание новых лекарственных средств для лечения болезни Альцгеймера на основе специфических модуляторов активности глутаматных рецепторов ЦНС [Текст] / Н.С. Зефиров, В.В. Григорьев, В.А. Палюлин, И.Г. Тихонова, И.И. Баскин, С.О. Бачурин // Тез. конф. «Фундаментальные науки - медицине» Росс. Акад. Наук, Москва. - 2003. - С. 156-158.

26. Bachurin, S. Focused Design, Synthesis and Study of Novel Neuroprotectors and Cognition-Enhancers in Series of Glutamate Receptors Ligands [Текст] / S. Bachurin, I. Baskin, V. Grigoriev, V. Palyulin, A. Proshin, I. Tikhonova, S. Tkachenko, G. Vankin, N. Zefirov // Drugs of the Future: Abstr. XVII-th Int. Symposium on Medicinal Chemistry, Copenhagen, Denmark, Malmo, Sweeden - 2004. - V. 29, Suppl. A. - P. 296.

27. Grigoriev, V.V. Effect of Delta Sleep Inducing Peptide on NMDA and GABA

Evoked Ion Currents in Cortical, Cerebellar and Hippocampal Neurons [Текст] / V.V Grigoriev, A.E. Redkozubov, E.A. Kustova, T.A. Ivanova, S.O. Bachurin // The Worl of Synapse: Molecular Basis, Pathology and Drug Discovery: Abstr. Conference e Neurobiologie Ladislav Tauc, Gif-sur-Yvette, France. - 2004. - P. 48.

28. Grigoriev, V.V. Mechanism of action of new cognition-enhancing agent IP5051 о glutamate receptors [Текст] / V.V. Grigoriev, S.O. Bachurin, A.N. Proshin, V.A Palulin, N.S. Zefirov // Alzheimer's and Parkinson's Diseases: Abstr. of 7' International Conference, Sorento, Italy, - 2005. - P. 95.

29. Бачурин, C.O. Роль глутаматных рецепторов в развитии и лечении болезн Альцгеймера [Текст] / С.О. Бачурин, В.В. Григорьев, Т.А. Иванова, Е.А. Кустова А.Н. Прошин // Современное состояние исследований, диагностики и терапи нейродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера, Паркинсона и др.) материалы Симпозиума, 17-18 ноября 2005г., Москва. - М., - 2005. - С. 99-104.

30. Петрова, JI.H. Влияние интерлейкина -ip на NMDA-индуцированный захва 45Са2+ в синаптосомы коры мозга крыс [Текст] / JI.H. Петрова, В.В. Григорьев С.О. Бачурин // Бюлл. экспер. биол. мед. - 2005. - Т. 140, № 12. - С. 645-646.

31. Shevtsova, Е.Р. Dimebon as mitoprotective and antiaging drug [Текст] / E.P Shevtsova, V.V. Grigoriev, E.G. Kireeva, I.V. Koroleva, S.O. Bachurin // Biochimic et Biophysia Acta. - 2006. - V. 14. - P. 454.

32. Григорьев, B.B. Действие дельта-сон-вызывающего пептида (DSIP) на пре-постсинаптические глутаматные и постсинаптические ГАМК рецепторы нейронах коры, гиппокампа и мозжечка головного мозга крыс [Текст] / В.В Григорьев, Т.А. Иванова, Е.А. Кустова, JI.H. Петрова, Т.П. Серкова, С.О. Бачури // Бюлл. экспер. биол. мед. - 2006. - Т. 142, № 8. - С. 149-151.

33. Серков, И.В. Действие производных докозогексаеновой кислоты на AMP рецепторы в нейронах Пуркинье [Текст] / И.В. Серков, В.В. Григорьев, Т.А Иванова, Н.М. Грецкая, В.В. Безуглов, С.О. Бачурин // Докл. Акад. Наук. - 2006 -Т. 411, № 3.-С. 1-2.

34. Гарибова, Т.Д. Эффект нооглютила на поведение и память мышей лини SAM (Senescence-accelerated mouse) с генетически детерминированны

скоренным старением [Текст] / T.JI. Гарибова, Т.А. Воронина, С.А. Литвинова, .В. Григорьев, С.О. Бачурин // Экспер. Клинич. Фармак. - 2007. - Т. 70, № 4. -.3-6.

5. Bachurin, S. Anti-aging properties of dimebon. Relation to mitochondrial ermeability inhibition [Текст] / S. Bachurin, V. Grigoriev, E. Shevtsova, I. Koroleva, . Dubova, E. Kireeva // Experimental Gerontology. - 2007. - Vol. 42, N 1-2. - P. 142.

6. Гарибова, T.JI. Изучение влияния нооглютила на поведение и память мышей инии SAM(Senescence-accelerated Mouse) с генетически детерминированным скоренным старением [Текст] / Т.Л. Гарибова, Т.А. Воронина, С.А. Литвинова, .В. Григорьев, С.О. Бачурин // Тезисы III Съезда фармакологов, С-Петербург, 3-27 сентября 2007 г.,- С-Пб., 2007. - Т. 1. - № 1654.

7. Безноско, Б.К. Влияние позитивных модуляторов АМРА рецепторов на бучение и память экспериментальных животных [Текст] / Б.К. Безноско, В.В. ригорьев, Т.А. Иванова, И.В. Королева, М.И. Лавров, А.Н. Прошин, С.О. ачурин // Тезисы III Съезда фармакологов, С-Петербург, 23-27 сентября 007 г.,- С-Пб., 2007. - Т. 1. - № 1604.

8. Григорьев, В.В. Действие производных арахидоновой и докозогексаеновой ислот на АМРА рецепторы в нейронах Пуркинье [Текст] / В.В. Григорьев, И.В. ерков, Т.А. Иванова, Н.М. Грецкая, В.В. Безуглов, С.О. Бачурин // Тезисы III ъезда фармакологов, С-Петербург, 23-27 сентября 2007 г.,. - С-Пб., 2007. - Т. 1. № 1667.

9. Григорьев, В.В. Действие мурамиловых дипептидов на постсинаптические АМК-, NMDA- и АМРА-рецепторы и пресинаптические NMDA-рецепторы оловного мозга крыс [Текст] / В.В. Григорьев, Л.Н. Петрова, А.В. Габрельян, .А. Иванова // Бюлл. экспер. биол. мед. - 2008. - № 9. - С. 247-249.

0. Григорьев, В.В. Действие кортикотропин-подобного промежуточного лобного ептида на пре- и постсинаптические глутаматные и постсинаптические ГАМК-ецепторы в нейронах головного мозга крыс [Текст] / В.В. Григорьев, Л.Н. етрова, Т.А. Иванова, А.В. Габрельян, Т.П. Серкова // Органическая химия для едицины: тез. конф., Черноголовка. - 2008. - С. 61.

41. Григорьев, В.В. Действие кортикотропин-подобного промежуточного лобно пептида на пре- и постсинаптические глутаматные и постсинаптические ГАМ рецепторы в нейронах головного мозга крыс [Текст] / В.В. Григорьев, Л. Петрова, Т.А. Иванова, A.B. Габрельян, Т.П. Серкова, С.О. Бачурин // Бюл. экспер. биол. мед. - 2009. - № 3. - С. 291-294.

ПАТЕНТЫ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. А. с. № 1410489 (СССР) от 15.03.1988. Способ получения галогеналкилфосфонатов / В.В. Рагулин, В.В. Григорьев, E.H. Цветков.

2. Патент РФ № 2106864 от 20.03.1998. Средство для лечения болезн Альцгеймера / Н.С. Зефиров, А.З. Афанасьев, C.B. Афанасьева, С.О. Бачури Е.Е. Букатина, С.Е. Ткаченко, В.В. Григорьев, И.В. Григорьева, В.П. Четверико М.А. Юровская.

3. Патент РФ № 2140417 от 27.10.1999. Производные гидрированных пиридо[4, Ь]индолов, способы их получения / Н.С. Зефиров, А.З. Афанасьев, С. Афанасьева, С.О. Бачурин, С.Е. Ткаченко, В.В. Григорьев, М.А. Юровская.

4. US Patent № 6,187,785 Bl; Agent for Treating Neurodegenerative Disorders. 13.0 2001 / N.S. Zefirov, A.Z Afanas'ev, S.V. Afanas'eva, S.O. Bachurin, E.E. Bukatin I.V. Grigor'eva, S.E. Tkachenko, V.V. Grigor'ev, M.A. Yurovskaya, V.P. Chetverikov.

5. European Patent № 0 876 818 Bl (Pub.18.12.2002, Bull.2002/51). Agent f Treating Neuro-Degenerative Disorders / N.S. Zefirov, A.Z. Afanas'ev, S.\ Afanas'eva, S.O. Bachurin, S.E. Tkachenko, V.V. Grigor'ev, M.A. Yurovskaya, V. Chetverikov, E.E. Bukatina, I.V. Grigor'eva.

6. Патент РФ № 2252936 от 27.05.2005. S-замещенные К-1-[(гетеро)арил]алки Ы'-[(гетеро)арил] алкилизотиомочевины, способ их получения, фармацевтическа композиция, способ изучения глутаматэргической системы, способы лечени (варианты) / С.Е. Ткаченко, А.Н. Прошин, М.Э. Дмитриев, H.H. Лермонтова, В. Григорьев, С.О. Бачури^ Н.С. Зефиров.

7. Патент РФ № 2333211 от 10.09.2008. Незамещенные 3, диазабицикло[3.3.1]нонаны, обладающие фармакологической активность фармацевтические композиции на их основе и способ их применения / С.

ачурин, В.В. Григорьев, Н.С. Зефиров, М.И. Лавров, В.Л. Лаптева, В.А. 1алюлин.

. Патент РФ № 2334514 от 27.09.2008. Средство для улучшения когнитивных

ункций и памяти на основе гидрированных пиридо(4,3-Ь)индолов (варианты),

армакологическое средство на его основе и способ его применения / С.О.

ачурин, С.И. Гаврилова, В.В. Григорьев, Б.К. Безноско, Н.С. Зефиров.

писок сокращений

К - арахидоновая кислота

КТГ - адренокортикотропный гормон

МРА - а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовая кислота Р5 - 2-амино-5-фосфонопентановая кислота Р7 - 2-амино-7-фосфоногептановая кислота А - болезнь Альцгеймера ГК- докозогексаеновая кислота SIP - дельта-сон-вызывающий пептид L-ip - цитокин полипептид интерлейкин-ip К - каиновая кислота DP - мурамиловые дипептиды

CI - mild cognitive impairment (мягкое когнитивное снижение) РНК - матричная РНК (рибонуклеиновая кислота) VIDA - N-метил-О-аспартат И - субъединица NMDA рецептора

LIP - кортикотропин-подобный промежуточный лобный пептид СК-4 - холецистокинин

НЛО - тест узнавания объекта в новой локализации РАИ - условный рефлекс активного избегания Т - циклотиазид К - хинолиновая кислота

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 17.03.2009 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ 127. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

i

Характерной тенденцией развития современного общества в большинстве стран мира является увеличение продолжительности жизни и связанное с этим повышение в структуре населения доли лиц пожилого и старческого возраста. Эти процессы видоизменяют удельный вес различных форм патологий в популяции, среди которых доминирующее место занимают нейродегенеративные болезни. Именно поэтому, проблема когнитивных расстройств, в большинстве случаев развивающихся при нейродегенеративных заболеваниях позднего возраста, признается в настоящее время одной из наиболее актуальных и значимых с медико-социальной точки зрения (Иллариошкин, 2007).

Болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее распространенной формой нейродегенеративных заболеваний в пожилом возрасте. Ежегодно число больных БА и родственными формами увеличивается на 800 тысяч в Европе и на 360 тысяч в США и Канаде (Brookmeyer et al., 1998; Sykes et al., 2001). К настоящему времени число людей с БА составляет около 20 млн. человек во всем мире, что наносит экономический ущерб, оцениваемый в 100 миллиардов долларов ежегодно (Fillit, Hill, 2005). Проблема старческого слабоумия является исключительно актуальной также и для нашей страны. Анализ эпидемиологических исследований позволяет говорить о том, что общая численность больных БА в России превышает 1 млн. человек (Гаврилова С.И., 2001).

Вместе с тем, в настоящее время в реальной медицинской практике для лечения, в частности, БА широко используется крайне ограниченное число препаратов — всего четыре, три из которых являются ингибиторами ацетилхолинэстеразы. Все эти препараты обладают рядом побочных свойств. Поэтому создание новых препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний и улучшения когнитивных функций является важнейшей задачей современной фармакологии (Воронина Т.А., Середенин С.Б., 1998; Воронина,

Т.А., 2003; Островская Р.У. и др., 2002; Bachurin, 2003; Середенин С.Б. и др., 2006).

Одним из наиболее интенсивно развиваемых в настоящее время направлений создания новых лекарственных средств является поиск потенциаторов АМРА рецепторов и блокаторов NMDA рецепторов глутаматергической системы мозга (Lynch, Gall, 2006; Villmann, Becker, 2007). Неконкурентный блокатор NMDA рецепторов мемантин уже используется для лечения больных Б A (Farlow, 2004). В то же время попытки применения других блокаторов NMDA- или потенциаторов АМРА рецепторов для лечения нейродегенеративных заболеваний и улучшения когнитивных функций у человека дают неоднозначные результаты. Потенцируя АМРА рецепторы в опытах in vitro, и улучшая память экспериментальных животных в поведенческих экспериментах, а также у людей-добровольцев, ряд потенциаторов АМРА рецепторов в клинических испытаниях не показывает достоверного улучшения когнитивных функций больных (Goff et al., 2008; Chappel et al., 2007). Безуспешными до сих пор остаются и попытки клинического использования антагонистов NMDA рецепторов (кроме мемантина) (Ikonomidou et al., 2000; Ikonomidou, Turski, 2002; Albensi et al., 2004). Все это делает актуальным выработку системы поиска перспективных соединений среди потенциаторов АМРА- и блокаторов NMDA рецепторов для оптимизации процесса создания новых лекарственных средств.

Цель исследования.

Определить прогностическую роль модуляции АМРА и NMDA рецепторов ЦНС млекопитающих лигандами глутаматных рецепторов с целью оптимизации поиска лекарственных средств для коррекции нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях

Задачи исследования

1. Изучить влияние ряда эндогенных пептидов на функциональное состояние

АМРА и NMDA рецепторов нейронов мозга млекопитающих.

2. Определить электрофизиологическим методом параметры ответов АМРА и NMDA рецепторов нейронов головного мозга млекопитающих на воздействие новых соединений.

3. Исследовать когнитивно-стимулирующие свойства наиболее активных соединений в поведенческих тестах.

4. Изучить нейропротективное и когнитивно-стимулирующее действие отечественного лекарственного препарата димебон и участие глутаматных рецепторов в его реализации.

5. По результатам исследований определить критерии поиска лекарственных средств для лечения нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях в ряду лигандов глутаматных рецепторов.

Научная новизна

Впервые электрофизиологическим методом показано существование в коре и гиппокампе головного мозга млекопитающих четырех типов нейронов, в которых ответы NMDA рецепторов на агонисты NMDA и хинолинат, соагонист глицин, конкурентные антагонисты АР5 и АР7 значительно отличаются. Полученные результаты, наряду с данными других исследователей, полученными методами молекулярной биологии, послужили основанием для идентификации 4-х основных типов NMDA рецепторов в нейронах головного мозга млекопитающих, что явилось фундаментом для последующего синтеза избирательных и терапевтически перспективных лигандов этих рецепторов.

Получены новые данные о механизмах действия ряда эндогенных пептидов на глутаматные рецепторы, свидетельствующие об их способности существенно модулировать работу АМРА и NMDA рецепторов нейронов головного мозга и тем самым влиять на когнитивные функции и нейродегенеративные процессы.

Впервые выявлено, что кортикотропин-подобный промежуточный лобный пептид (CLIP) потенцирует токи АМРА рецепторов и блокирует токи NMDA рецепторов. Установлено, что соматостатин аналогичным образом влияет на ответы АМРА и NMDA рецепторов. Можно предположить, что эти свойства CLIP и соматостатина определяют их важную роль в процессах формирования памяти.

Среди новых представителей химических классов: ациклических производных изотиомочевины (дибензиламинов и алкилизотиомочевин) и N,N'-замещенных 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанов выявлены вещества, обладающие свойствами позитивных аллостерических модуляторов АМРА рецепторов и неконкурентных антагонистов NMDA рецепторов. Показано, что соединения-лидеры - IP5051, IP9040, IP9150 и ХХХ-2 - обладают высокими когнитивно-стимулирующими свойствами и низкой токсичностью.

Впервые установлен механизм действия димебона на АМРА и NMDA рецепторы и изучены его переносимость и влияние на отдельные показатели старения у экспериментальных животных при длительном применении.

Установлено, что действие димебона на АМРА и NMDA рецепторы аналогично действию эндогенных пептидов, играющих важную роль в формировании памяти.

Сформулирована система поиска лекарственных средств для коррекции нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях в ряду лигандов глутаматных рецепторов на основе способности веществ одновременно потенцировать АМРА- и блокировать NMDA рецепторы.

Научно-практическая значимость

1. Разработана методология поиска препаратов для коррекции когнитивных функций при нейродегенративных заболеваниях в ряду лигандов глутаматных рецепторов.

2. Расширено представительство химических классов позитивных модуляторов АМРА рецепторов.

3. Показано, что соединения-лидеры - IP5051, IP9040, IP9150 и ХХХ-2 представляют несомненный интерес для дальнейших предклинических испытаний в качестве препаратов для коррекции нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях.

4. Показано, что представитель гидрированных пиридо ([4,3-Ь]) индолов — димебон — помимо высоких когнитивно-стимулирующих и нейропротекторных свойств, обладает также свойствами при длительном применении предупреждать развитие отдельных признаков старения экспериментальных животных.

5. Результаты электрофизиологических и фармакологических исследований димебона легли в основу нормативных материалов и были представлены в Россздравнадзор для получения разрешения на проведение клинических испытаний димебона по новому применению - в качестве средства для лечения БА.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Установленные различные сочетания ответов NMDA рецепторов нейронов коры и гиппокампа головного мозга крыс на агонисты NMDA и хинолинат, соагонист глицин, конкурентные антагонисты АР5 и АР7 являются основанием для разделения нейронов на 4 типа, которые содержат различные NMDA рецепторы.

2. Эндогенные пептиды способны модулировать функциональное состояние АМРА и NMDA рецепторов, с чем, вероятно, связано их участие в процессах формирования памяти.

3. Соединения-лидеры IP5051, IP9040 и IP9150 — производные ациклических изотиомочевин — являются новыми представителями позитивных аллостерических модуляторов АМРА рецепторов, одновременно обладающие свойствами неконкурентных антагонистов NMDA рецепторов.

4. Соединения-лидеры IP5051, IP9040, IP9150 и ХХХ-2 в поведенческих тестах эффективно улучшают когнитивные функции экспериментальных животных.

5. Установленные количественные параметры влияния димебона как позитивного модулятора АМРА рецепторов и неконкурентного антагониста NMDA рецепторов являются важными в реализации его когнитивно-стимулирующих свойств.

6. Сравнительный анализ механизма действия соединений-лидеров IP5051, IP9040 и IP9150 и димебона позволяет утверждать, что присущие им свойства позитивных модуляторов АМРА рецепторов и одновременно неконкурентных антагонистов NMDA рецепторов обуславливают их эффективное когнитивно-стимулирующие действие.

Личный вклад автора

Личный вклад соискателя заключается в разработке идеи и планов работы, в постановке и проведении экспериментальных исследований, в статистической обработке и интерпретации полученных результатов.

Апробация работы

Результаты исследования и основные положения работы доложены на следующих научных конференциях и съездах: на I Всесоюзном Совещании «Глутаматные рецепторы», Ленинград, 1987; на 7-th Conference of European Neurochemichal Society, Sweden, Stockholm, 1988; на межреспубл. конференции, Волгоград, 1989; на XIY Менделеевском Съезде, Москва, 1989; на 13rd Int. Congress of the Int. Society for Neurochemistry, Australia, Sydney, 1991; на 3rd Int. Congress of Compar. Physiol, and Bioch., Tokyo, 1991, на 16-th Meeting of the Int. Society for Neurochemistry, 1997, Boston, USA; на 4-th Congress of European Society for Clinical Neuropharmacology, 1997, Eilat, Israel; на 9-th Int. Congress of the Czech and Slovak Neurochemichal Society, 1998, Martin, Slovakia; на 2-й Российской конф. Болезнь Альцгеймера и старение: от нейробиологии к терапии, 1999, Москва; на 5th Int. Conf. on Neuroprotective Agents, 2000, Lake Tahoe, Calofornia, USA; на III Российской конф., посвящ. 100-летию со дня рождения проф. Э.Я.Штернберга, 2003, Москва; на Конф. «Фундаментальные науки — медицине». Росс. Акад. Наук, Москва, 2003; на

XVIIth Int. Symposium on Medicinal Chemistry, 2004, Copenhagen, Denmark & Malmo, Sweeden; на Conference en Neurobiologie Ladislav Tauc: the World of Synapse: Molecular Basis, Pathology and Drug Discovery, 2004, Gif-sur-Yvette, France; на Симпозиуме «Современное состояние исследований, диагностики и терапии нейродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера, Паркинсона и др.), 2005, Москва; на 7th Int. Conference "Alzheimer's and Parkinson's Diseases", Sorento, Italy, 2005; на XIV European Bioenergetics Conference, 2006, Moscow; на 8th Int. Symposium on Neurobiology and Neuroendocrinology of Aging, Bregenz, Austria, 2006; на 10th Int. Conf. on Alzheimer's Disease and Related Disorders, Madrid, Spain, 2006; на III съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению», 2007, С-Петербург; на конференции «Орг. химия для медицины», 2008, Черноголовка.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 41 печатная работа, в том числе 14 статей в периодических изданиях, рекомендованных ВАК; получено 8 патентов на изобретения.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5-ти глав, посвященных описанию материала, методов и результатов исследования, обсуждению результатов, выводов, а также списка использованных 472 источников литературы, включающего 86 работ отечественных и 386 работ зарубежных авторов. Работа изложена на 281 страницах машинописного текста, содержит 36 таблиц и 85 рисунков.

Выводы

1. Электрофизиологическим методом patch-clamp показано существование в коре и гиппокампе головного мозга млекопитающих четырех типов нейронов, которые содержат различные NMDA рецепторы, отличающихся по совокупности ответов на NMDA, хинолинат, глицин, АР5 и АР7.

2. Определены параметры и характер ответов АМРА и NMDA рецепторов на воздействие отдельных эндогенных пептидов, которые подтверждают участие некоторых из них (кортикотропин-подобный промежуточный лобный пептид, соматостатин) в формировании памяти и механизмах эндогенной нейропротекции.

3. Из изученных новых представителей двух классов химических соединений -ациклических производных изотиомочевины и N,N'-замещенных диазабициклононанов — отобраны наиболее активные соединения (IP5051, IP9040, IP9150 и ХХХ-2), обладающие свойствами эффективных позитивных модуляторов АМРА рецепторов.

4. Установлено, что исследованные соединения, потенцирующие АМРА рецепторы, улучшают обучение и память как интактных животных, так и животных с экспериментальной моделью болезни Альцгеймера в поведенческих тестах.

5. Установлено, что неконкурентная блокада NMDA рецепторов, осуществляемая или за счет блокады ионного канала по механизму быстрой диссоциации с рецептором, или за счет блокады NR2B субъединицы, вносит существенный вклад в характер проявления соединением его когнитивно-стимулирующей активности и широты терапевтического действия.

6. Установлен механизм действия отечественного препарата димебон на АМРА и NMDA рецепторы, что явилось одним из оснований для его медицинского применения по новому назначению в качестве лекарственного средства для лечения нейродегенеративных заболеваний (в частности, болезни Альцгеймера) и стимулятора когнитивных функций.

7. Оптимальными критериями поиска препаратов для коррекции когнитивных нарушений при нейродегенеративных заболеваниях среди лигандов глутаматных рецепторов, являются их способность потенцировать АМРА рецепторы и одновременно блокировать NMDA рецепторы, что подтверждено в поведенческих тестах и клинических испытаниях, и имеет высокую прогностическую ценность.

Заключение

Целью данной работы являлось: определить прогностическую роль модуляции АМРА и NMDA рецепторов ЦНС млекопитающих лигандами глутаматных рецепторов с целью оптимизации поиска лекарственных средств для коррекции нарушений когнитивных функций при нейродегенеративных заболеваниях

Для достижения поставленной цели изучено влияние широкого круга новых и известных (эндогенных и экзогенных) веществ на пост- и пресинаптические АМРА и NMDA рецепторы нейронов головного мозга млекопитающих, и фармакологическими методами оценены когнитивно-стимулирующие свойства наиболее активных соединений.

В работах последних десятилетий убедительно показана и доказана ведущая роль глутаматных рецепторов в процессах передачи информации в ЦНС, их роль в процессах обучения, формирования памяти, а также их роль в механизмах развития ряда нейродегенеративных заболеваний, в том числе таких тяжелых и распространенных как БА, боковой амиотрофический склероз, болезнь с тельцами Леви, мягкие когнитивные расстройства. Поэтому очень актуальным на сегодняшний день является разработка и создание новых лекарственных средств, способных целенаправленно модулировать работу глутаматных рецепторов. Работы в этих направлениях интенсивно ведутся во многих исследовательских центрах.

Тем не менее, несмотря на большое количество синтезированных и изученных потенциаторов АМРА рецепторов, явную способность наиболее активных из них улучшать обучение и память разных видов экспериментальных животных в различных поведенческих моделях, улучшение когнитивных способностей у здоровых людей-добровольцев, клинические испытания на больных БА не показывают пока достоверного улучшения состояния этих больных. Причины этих расхождений пока не установлены. Именно поэтому, нахождение критериев поиска и отбора клинически перспективных веществ среди потенциаторов АМРА рецепторов, является актуальной задачей.

Решение этой задачи происходило путем последовательно прохождения нескольких этапов, важнейшими из которых были: установление гетерогенности, функциональной и фармакологической неоднородности NMDA рецепторов, которое позволило перейти к синтезу избирательных антагонистов NMDA рецепторов; выяснение механизмов действия на АМРА и NMDA рецепторы эндогенных пептидов - CLIP и соматостатина, играющих важную роль в механизмах формирования памяти, которое позволило определить желаемые параметры модуляции этих типов глутаматных рецепторов; изучение действия новых производных нескольких химических классов веществ на АМРА и NMDA рецепторы в нейронах мозга; изучение влияния наиболее активных из исследованных веществ на обучение и память экспериментальных животных; выявление механизма действия на АМРА и NMDA рецепторы, а также влияния на когнитивные функции экспериментальных животных клинически эффективного лекарства для лечения больных БА — димебона; проведение сравнительного анализа результатов исследования наиболее активных веществ с димебоном.

На первом этапе исследования нами экспериментально установлено, что имеются различия в поведенческих ответах мышей и крыс на внутрижелудочковое введение NMDA, что дало основание предположить существование определенных различий в свойствах NMDA рецепторов у этих животных (Григорьев и др., 1987, 1988; Grigoriev et al., 1989). Проведенные вслед за этим электрофизиологические эксперименты на свежеизолированных нейронах из коры и гиппокампа мышей и крыс показали, что имеются определенные различия в свойствах NMDA рецепторов в разных нейронах и у животных одного вида. По совокупности ответов NMDA рецепторов нейронов на агонисты: NMDA, глицин, хинолиновую кислоту, и особенностей блокирующего действия конкурентных антагонистов NMDA рецепторов АР5 и

АР7, - мы разделили исследованные нейроны коры и гиппокампа головного мозга на 4 типа (Grigoriev et al., 1991, Григорьев и др., 1992, Григорьев, 1993а,б). Разделение нейронов коры и гиппокампа на 4 типа в зависимости от содержащихся в них NMDA рецепторов было осуществлено нами одновременно и независимо от результатов, которые были получены в других исследовательских лабораториях методами молекулярной биологии. Только методами молекулярной биологии удалось установить, что NMDA рецепторы состоят из субъединиц различных типов. Одна из этих субъединиц — NR1 субъединица — присутствовала во всех типах NMDA рецепторов, а четыре другие типа субъединиц — NR2A, NR2B, NR2C и NR2D определяли функциональные и фармакологические свойства NMDA рецепторов. В итоге пришли к выводу, что на нейронах головного мозга млекопитающих имеются 4 основных типа NMDA рецепторов (Erreger et al., 2007).

Открытие различных субъединиц NMDA рецепторов играет в настоящее время огромную роль в понимании их различных функциональных особенностей в фундаментальных процессах функционирования нервной системы: пластичности, лежащей в основе обучения и памяти, нейродегенерации и выживании нейронов, их участия в развитии нейропатологий. Новые представления о фармакологических свойствах различных NR2 субъединиц — и, как следствие, различных типов NMDA рецепторов — имеют концептуальное значение для поиска и создания избирательных антагонистов и модуляторов различных типов NMDA рецепторов. Тот период, когда стремились создать наиболее активные антагонисты NMDA рецепторов без учета состава их субъединиц, закончился, показав свою полную бесперспективность. В настоящее время становится все более очевидным, что только избирательное высокоспецифичное воздействие на определенные субъединицы NMDA рецепторов способно привести к созданию веществ, которые могут быть потенциальными лекарственными средствами.

Исследование действия ряда эндогенных пептидов, в основном, имеющих свойство модулировать цикл сон-бодрствование, на глутаматные рецепторы дало новое понимание роли этих эндогенных веществ в регуляции когнитивных функций. Показано, что ряд веществ, имеющих сон-вызывающее действие, обладают и нейропротекторным действием за счет их способности блокировать NMDA рецепторы. Впервые показано, что некоторые из исследованных веществ могут оказывать достаточно сильное влияние на функциональное состояние АМРА и NMDA рецепторов. Так, дельта-сон

1 "3 вызывающий пептид (DSIP), начиная с крайне низких концентраций - 1x10" М - способен блокировать NMDA рецепторы в нейронах коры. Его действие имеет свои особенности в нейронах разных отделов головного мозга. В нейронах гиппокампа DSIP блокирует NMDA рецепторы, только начиная с концентрации lxlO"12 М. Зависимость концентрация-ответ в нейронах коры и гиппокампа также имеет свои особенности. В нейронах коры DSIP в диапазоне концентраций lxlO"12 М — lxlO'7 М вызывает почти одинаковую блокаду ответов NMDA рецепторов — примерно на 60%. Таким образом, изменение концентрации вещества в 100000 раз практически не влияет на силу его воздействия. В нейронах гиппокампа концентрационная зависимость действия DSIP более выражена: блокирующее действие максимально при концентрации lxlO"11 М, в концентрации lxlO"10 М резко уменьшается и затем снова с увеличением концентрации плавно увеличивается. Возможно, это связано с особой ролью гиппокампа в механизмах формирования памяти. DSIP практически не влиял на АМРА рецепторы.

Уридин также блокировал NMDA рецепторы, что, в общем, коррелировало с его сон-вызывающим действием, и практически не влиял на АМРА рецепторы.

Кортикотропин-подобный промежуточный лобный пептид (CLIP) вызывал достоверную блокаду NMDA рецепторов в диапазоне концентраций 1x10"14 М - 1x10"8 М. Максимальная блокада наблюдалась при концентрации 1x10"п М, а затем плавно уменьшалась. Кроме того, CLIP достоверно потенцировал ответы АМРА рецепторов в диапазоне концентраций 1x10"13 М - 1x10"8 М, максимальная потенциация наблюдалась в концентрации lxlO"10 М. Как для блокирующего, так и для потенцирующего действия CLIP характерны весьма умеренные величины воздействия: 60% максимальной блокады и 60% максимальной потенциации.

Напомним, что CLIP играет главную роль в индукции фазы парадоксального сна, во время которого значительно усиливаются процессы консолидации памяти (Wetzel et al, 1994; Wetzel et al, 2003). Сам по себе CLIP существенно усиливает возбудимость нейронов гиппокампа, на 200% усиливает популяционный потенциал, и играет важную роль в усилении процессов консолидации памяти (Bonnet et al, 1997; Cespuglio et al, 1995; Seidenbecher et al, 1993). Важнейшей особенностью действия CLIP на АМРА и NMDA рецепторы, установленной в наших экспериментах, является широта диапазона концентраций, в которых он вызывает потенциацию АМРА рецепторов — 5 порядков, и частичную блокаду NMDA рецепторов - 6 порядков.

Важную нейропротекторную роль и влияние на процессы памяти оказывает и соматостатин, который в наших экспериментах также потенцировал АМРА рецепторы и блокировал NMDA рецепторы. Имеется большое сходство в качественном и количественном влиянии CLIP и соматостатина на АМРА и NMDA рецепторы. Можно предположить, что такой характер действия этих веществ является не случайным, и, вероятно, связан с их важной ролью в прцессах формирования памяти. Кроме того, как недавно подтверждено, соматостатин блокирует нейротоксическое действие, оказываемое хинилиновой кислотой и NMDA на нейроны (Kumar, 2008).

Таким образом, в наших экспериментах все исследованные эндогенные вещества могли блокировать NMDA рецепторы не более чем на 50-60%, и потенцировать АМРА рецепторы не более, чем на 60%. Можно предположить, что эндогенные механизмы регуляции постсинаптических АМРА и NMDA рецепторов глутаматергической медиаторной системы имеют строгие рамки своего влияния, которые ограничивают возможности их избыточной активации или чрезмерного торможения.

Другое дело - влияние эндогенных веществ на пресинаптические глутаматные рецепторы. Все исследованные пептиды, кроме простагландина D2, модулировали пресинаптические глутаматные, в частности, NMDA рецепторы. Эта модуляция в большинстве случаев сводилась к концентрационно-зависимой блокаде пресинаптических NMDA рецепторов, к уменьшению входа ионов кальция в пресинаптические окончания и, тем самым, к модуляции синаптической передачи различных нейромедиаторных систем ЦНС млекопитающих. Можно предположить, что отрицательная модуляция пресинаптических NMDA рецепторов вносит существенный вклад в реализацию сон-вызывающих эффектов DSIP, CLIP и уридина.

Существенным отличием влияния эндогенных веществ на пресинаптические глутаматные рецепторы от их влияния на постсинаптические глутаматные рецепторы является тот факт, что "они могут полностью заблокировать глутамат- или NMDA-зависимый вход ионов кальция в пресинаптические терминали. Можно предположить, что эта блокада пресинаптических глутаматных рецепторов не является критичной для осуществления синаптической передачи, а изменяет только величину их регулирующего воздействия на выброс различных нейромедиаторов.

Таким образом, наши исследования эндогенных пептидов показали, что они в крайне низких концентрациях оказывают модулирующее влияние на пре- и постсинаптические глутаматные рецепторы.

Исследование производных эндогенных физиологически активных веществ подтвердило известный факт, что их структурная модификация может привести к весьма существенному изменению активности производного вещества, и в ряде случаев, поменять направление его действия на противоположное. Например, конкурентные антагонисты NMDA рецепторов -АР5 и АР7 - являются гомологами эндогенного лиганда — глутаминовой кислоты, - в которых одна из карбоксильных групп заменена на фосфоновую. Производные арахидоновой (АК) и докозогексаеновой (ДГК) кислот в низких концентрациях, в отличие от самих кислот, способны влиять на ответы АМРА-подтип глутаматных рецепторов. Дофамиды АК и ДГК и этиленгликолевый эфир ДГК способны заметно потенцировать трансмембранные токи, вызываемые активацией АМРА рецепторов. Нитроэтиленгликолевый эфир ДГК, напротив, вызывает угнетение токов АМРА рецепторов.

Таким образом, параметры модуляции АМРА и NMDA рецепторов эндогенными веществами, в первую очередь CLIP и соматостатина, дают ориентиры для поиска и отбора синтетических соединений в качестве потенциальных терапевтических препаратов. На их основе были разработаны направления синтеза новых соединений в нескольких химических классах.

В результате направленного синтеза в ИФАВ РАН и на кафедре органической химии МГУ им. М.В. Ломоносова были синтезированы новые вещества в трех химических классах, которые были изучены на их способность модулировать ответы АМРА и NMDA рецепторов нейронов ЦНС.

Электрофизиологические исследования действия новых производных ациклических изотиомочевин, которые были условно разделены на два класса - дибензиламины и алкилизотиомочевины, показали, что они способны потенцировать токи АМРА рецепторов.

Всего нами было исследовано 42 производных дибензиламинов, 31 из которых потенцировали токи АМРА рецепторов. Активность этого класса соединений начиналась с концентрации 1x10"8 М, а максимально изученная концентрация - 5х10"5 М. Величина вызываемой ими потенциации варьировала от 10% до 2900%. Наиболее активным соединением в отношении потенциации токов АМРА рецепторов оказалось соединение IP5051. Его потенцирующий эффект начинался в достаточно низкой концентрации — 5x10"7 М и в концентрации Зх10"5М превышал 1000%.

Сравнительное изучение механизма действия ЦТ, модельного потенциатора АМРА рецепторов, и соединения IP5051 на АМРА рецепторы показало, что в основе механизма его потенцирующего действия лежит блокада десенситизации, вызываемая агонистами этих рецепторов. Поскольку характер потенциации, оказываемой остальными соединениями этого класса, не отличался от того, что оказывало соединение IP5051, мы предположили, что все активные соединения этого класса потенцируют токи АМРА рецепторов за счет уменьшения их десенситизации.

Исследование действия новых производных дибензиламинов на токи, вызываемые активацией NMDA рецепторов, показало, что соединение IP5051 и здесь является наиболее активным в блокаде этих токов. В электрофизиологических экспериментах было установлено, что соединение IP5051 вызывает два типа блокады NMDA рецепторов: в одной группе нейронов оно блокирует NMDA-вызванные токи в низких концентрациях, причем более активно оно блокирует токи большой амплитуды, и менее активно - меньшей амплитуды. Сравнивая характер блокирующего действия NMDA-вызванных токов в этих нейронах, и характер блокады токов NMDA рецепторов, содержащих NR2B субъединицы, ифенпродилом - специфическим антагонистом данной субъединицы, описанный в литературе (Kew et al., 1996), - мы предположили, что в этой группе нейронов соединение IP5051 также блокирует NMDA рецепторы, содержащие NR2B субъединицы.

В другой группе нейронов блокада NMDA-вызванных токов осуществляется в значительно большей концентрации (примерно в 50 раз). В электрофизиологических экспериментах мы определили IC50 равной примерно 23 мкМ. В электрофизиологических экспериментах другие исследованные соединения класса дибензиламинов не блокировали токи NMDA рецепторов, но некоторые вызывали небольшую (10-30%) (р>0,05) потенциацию этих токов.

На основании анализа полученных данных нами в качестве соединения-лидера выбрано соединение IP5051.

Проведенные электрофизиологические исследования действия новых производных алкилизотиомочевины показали, что они, как и представители дибензиламинов, способны потенцировать токи АМРА рецепторов. Всего было исследовано 9 соединений этого класса, 2 из которых - IP9040 и IP9150 — потенцировали токи АМРА рецепторов. Активность соединения IP9150 начиналась с концентрации 1х10"9М, а максимально изученная концентрация была 3x10"5. Величина вызываемой ими потенциации не превышала 65%. Характерной чертой действия этих соединений явилось то, что максимальный потенцирующий эффект проявлялся при некоторой промежуточной концентрации. Дальнейшее увеличение концентрации вело к уменьшению потенцирующего эффекта, а затем и к частичной блокаде токов АМРА рецепторов.

Ряд соединений этого класса, в том числе и те, которые не влияли на токи АМРА рецепторов, в низких концентрациях блокировали токи NMDA рецепторов.

Таким образом, действие производных алкилизотиомочевины существенно отличалось от действия производных дибензиламинов. Если для наиболее активных представителей производных дибензиламинов наблюдалась монотонное концентрационно-зависимое увеличение потенцирующего влияния на токи АМРА рецепторов, то для производных алкилизотиомочевины наблюдалось куполообразная зависимость потенцирующего эффекта, который, кроме того, был во много раз меньше по своему абсолютному значению, чем у представителей дибензиламинов. Еще более существенная разница наблюдалась в их влиянии на NMDA рецепторы. Для представителя производных дибензиламинов соединения IP5051 предположительно определены два участка связывания с NMDA рецептором: NR2B субъединица и участок связывания МК-801 в ионном канале, которые существенно различаются по концентрациям, которые вызывают блокаду.

Ряд данных указывает на то, что характер связывания соединения IP9040 в ионном канале NMDA рецептора аналогичен связыванию мемантина, а не МК-801. В наших электрофизиологических экспериментах восстановление NMDA-вызванных токов при отмывке мемантина происходила достаточно быстро (2-3 минуты), восстановление амплитуды токов немного ускорялось, если на фоне отмывки давалась аппликация NMDA. Восстановление NMDA-вызванных токов после блокады, вызванной соединением IP9040, происходило при отмывке столь же быстро, как и при отмывке мемантина. Это свидетельствует о том, что соединение IP9040 имеет такую же высокую скорость диссоциации с NMDA рецептором, как и мемантин. В отличие от этих данных, восстановление NMDA-вызванных токов после блокады, вызванной МК-801, занимает гораздо большее время - десятки минут и требует постоянных аппликаций NMDA. Другими словами, характер связывания веществ с участком связывания МК-801 в ионном канале NMDA рецептора определяет не величина сродства соединения с этим участком, а константа скорости диссоциации вещества.

Таким образом, в результате направленного синтеза в ИФАВ РАН были синтезирован новый класс позитивных модуляторов АМРА рецепторов -производные ациклических изотиомочевин, отдельные представители которых обладают свойством одновременно блокировать NMDA рецепторы.

В результате компьютерного моделирования на кафедре органического синтеза МГУ синтезирован новый класс высокоафинных позитивных модуляторов АМРА рецепторов — производных N,N'-3aMenjeHHbix 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанов. В основу данного подхода был положен установленный факт, что блокада десенситизации АМРА рецептора происходит вследствие встраивания двух молекулы потенциатора, например, циклотиазида в пространство между двумя димерами АМРА рецептора (Jin et al., 2005). Новые соединения представляют собой как бы сдвоенную молекулу потенциатора (АМРАкина BDP), которая бы могла встроиться в межсубъединичное пространство лиганд-связывающих доменов, заменив собой две молекулы потенциатора.

Электрофизиологические эксперименты показали, что отдельные соединения этого класса являются на сегодняшний день абсолютными "рекордсменами" по своей активности - потенцирующее действие самого активного соединения ХХХ-2 начинало проявляться с концентрации 1x10"11 М -т.е. практически в тех же концентрациях, что и эндогенных пептидов.

Применение компьютерного моделирования позволило осуществить синтез новых производных известного АМПАкина BDP. В наших электрофизиологических экспериментах эти соединения показали существенное усиление их активности как позитивных модуляторов АМРА рецепторов. Показатели активности некоторых соединений выросли на 2-3 порядка по сравнению с активностью самого BDP.

В поведенческих тестах все наиболее активные в потенциации АМРА рецепторов соединения разных химических классов улучшали когнитивные функции экспериментальных животных. Показатели по модуляции АМРА и NMDA рецепторов и диапазоны действующих доз при оценке влияния на когнитивные функции наиболее активных соединений представлены в таблице 7.1.

Из 10 представленных соединений 4 соединения потенцируют АМРА рецепторы и одновременно блокируют NMDA рецепторы: это димебон, IP5051, IP9150 и IP9040; 5 соединений, которые только потенцируют АМРА рецепторы, и не действуют на NMDA рецепторы. И препарат сравнения — мемантин, который только блокирует NMDA рецепторы.