Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Нейрохимическое изучение участия метаботропных и АМРА-рецепторов глутамата в механизме формирования эффектов ноотропных средств

На правах рукописи

щ

ВАСИЛЬЕВА ЕКАТЕРИНА ВАЛЕРЬЕВНА

НЕЙРОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ УЧАСТИЯ МЕТАБОТРОПНЫХ и АМРА-РЕЦЕПТОРОВ ГЛУТАМАТА В МЕХАНИЗМЕ ФОРМИРОВАНИЯ ЭФФЕКТОВ НООТРОПНЫХ

СРЕДСТВ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г 8 ноя ш

Москва-2013

005540175

005540175

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В.Закусова» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН)

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Ковалёв Георгий Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории психофармакологии ФГБУ «НИИ фармакологии

имени В.В. Закусова» РАМН Калинина Татьяна Сергеевна

доктор биологических наук, профессор,

заведующий лабораторией молекулярной генетики соматических клеток Института

молекулярной генетики РАН Гривенников Игорь Анатольевич

Ведущая организация - ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится 2013 года в «.......» часов на

заседании диссертационного совета Д 001.024.01, созданного на базе ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН (125315, Москва, Балтийская ул., 8)

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН (125315, Москва, Балтийская ул., 8)

Автореферат разослан «. /О. »

,2013 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Вальдман Елена Артуровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Фармакологическая коррекция сниженной когнитивной деятельности является одной из актуальных проблем здравоохранения, поэтому поиск и изучение механизмов специфического действия ноотропных средств остаётся важной задачей психофармакологии (Середенин, Вальдман, 2003; Воронина, Островская, 2000; Островская и др., 2002; Ковалев Г.И., 1993).

В настоящее время группа ноотропных препаратов включает вещества из различных групп химических соединений с разными спектрами фармакологических эффектов и механизмами действия; мишени для действия веществ чрезвычайно разнообразны, многие препараты способны реализовывать свой эффект, воздействуя на несколько мишеней (Воронина, Середенин, 2007). Ноотропы объединены общностью терапевтического эффекта, но отличаются отсутствием общего молекулярного механизма действия. В нейропсихофармакологии всё ещё остаются актуальными следующие вопросы: через какие молекулярные мишени и синаптические механизмы ноотропы осуществляют свое модулирующее влияние на когнитивные процессы; какие звенья в нейрохимическом механизме действия являются общими для всех ноотропов, а какие специфическими; существуют ли универсальные для всех ноотропов фармакологические мишени (Ковалёв Г.И., 1993; Ковалёв Г.И. и др., 2010; Froestl et al., 2013).

Известно, что в реализации эффектов ноотропных препаратов значительную роль играет глутаматергическая нейромедиаторная система, которая активно вовлечена в процессы синаптической пластичности и долговременной потенциации. В работе к.б.н. Ю.Фирстовой с помощью комплексного поведенческо-нейрохимического подхода, было убедительно установлено, в частности, что канальный сайт NMDA-рецептора, никотиновые рецепторы, а также нейротрофин BDNF специфически участвуют в процессах нормализации пластической функции мозга животных с помощью ноотропных препаратов различного строения (Фирстова, 2008). Вместе с тем, роль других глутаматных рецепторов - АМРА-, метаботропных - в фармакологических эффектах ноотропов остается невыясненной.

В лаборатории радиоизотопных методов исследований ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова» РАМН на протяжении ряда лет разрабатывается концепция о модулирующем влиянии ноотропов на эффективность синаптической передачи, осуществляемом по различным механизмам модуляции. Согласно данной гипотезе, ноотропы как нейромодуляторы не являются прямыми лигандами нейромедиаторных рецепторов, но способны изменять показатели активности рецепторов, что ведет к адекватному изменению эффективности синаптической нейропередачи (Ковалев Г.И.,

1993).

В настоящее время в экспериментальной фармакологии широко используются инвазивные методы моделирования психопатологии (болевое раздражение, использование токсинов и блокаторов рецепторов), но появляется все больше работ, использующих неинвазивные модели состояния когнитивного дефицита, от которых можно ожидать большей степени адекватности в воспроизведении процессов, происходящих в мозге под воздействием психофармакологических препаратов (Thiel et al., 1999; Pawlak, Schwarting, 2002; Gorisch, Schwarting, 2006; Antoniou et al., 2008). Учитывая сложность соотношения высших интегративных функций человека и животных, представляется необходимым использовать формы отражения когнитивной недостаточности в поведенческих экспериментах (Chamberlain et al., 2006). Одним из информативных критериев является реакция особи на новизну обстановки (исследовательское поведение), которая составляет часть высших интегративных процессов. Показательно, что индивидуальная реакция животного на новизну обстановки непосредственно связана с различным типом поведения и нейрохимическим профилем организма (Ковалёв Г.И. и др., 2007; Antoniou et al., 2008).

Для изучения характера действия ноотропов на нейромедиаторные системы, играющих '"важную роль в процессах обучения и памяти, в работе был использован комплексный поведенческо-нейрохимический подход к изучению индивидуально-типологического рецепторного профиля препаратов с использованием оригинальной неинвазивной методики типирования животных по уровням эффективности исследовательского поведения в крестообразном лабиринте.

Целью данного исследования явилось изучение участия AMP А- и метаботропных рецепторов глутамата в формировании общих и специфических эффектов ноотропных препаратов.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить с помощью метода радиолигандного связывания in vitro прямое влияние ноотропных препаратов (пирацетама, фенотропила, ноопепта, семакса, пантогама, нооглютила) на AMP А- и метаботропные (mGluR II) глутаматные рецепторы коры мозга грызунов.

2. Исследовать особенности поведения инбредных мышей линий BALB/c и C57BL/6 в закрытом крестообразном лабиринте.

3. Оценить влияние ноотропных препаратов в режиме субхронического введения на параметры поведения линий мышей BALB/c и C57BL/6 в закрытом крестообразном лабиринте.

4. Сравнить АМРА- и метаботропные глутаматные рецепторные профили коры мозга инбредных мышей линий BALB/c и C57BL/6.

5. Исследовать с помощью метода радиолигандного связывания ex vivo влияние субхронического введения ноотропных препаратов на характеристики АМРА- рецепторов в коре мозга мышей BALB/c и C57BL/6.

6. Исследовать с помощью метода радиолигандного связывания ex vivo влияние субхронического введения ноотропных препаратов на характеристики mGluR П-рецепторов в коре мозга мышей BALB/c и C57BL/6.

Научная новизна. На основе статистически репрезентативной серии экспериментов впервые методом радиолигандного связывания in vitro было обнаружено сродство отечественных ноотропных препаратов к выбранным рецепторам глутамата: нооглютила и ноопепта - к АМРА-рецепторам, семакса - к метаботропным глутаматным рецепторам II группы. При сравнении поведения и нейрохимических показателей инбредных мышей BALB/c и C57BL/6 описаны различия АМРА- и метаботропного глутаматного рецепторного профиля коры мозга и характеристик поведения двух линий. Показано, что эффекты субхронического введения всех исследованных ноотропных препаратов направлены на улучшение показателей исследовательской активности животных в закрытом крестообразном лабиринте, кроме того, для некоторых из них характерен анксиолитический компонент. Впервые показано неоднородное влияние субхронического введения ноотропных препаратов различных классификационных групп на АМРА- и mGluR II рецепторы коры мозга мышей Balb/C и C57BL/6, проявляющееся в изменении плотности рецепторов (Вшах) без изменения их аффинности к селективным лигандам (Kd) в указанной структуре.

Научио-практическая значимость. Полученные результаты существенно расширяют имеющиеся представления о нейрохимическом и нейрорецепторном механизме действия изученных ноотропных препаратов. Обнаруженные эффекты ноотропов па поведение и нейрохимические характеристики АМРА- и метаботропных глутаматных рецепторов позволяют выявить общие и специфические фармакологические мишени для препаратов, улучшающих когнитивные функции. Выявленные различия эффектов ноотропных препаратов могут способствовать оптимизации их клинического применения при направленной фармакотерапии различных психо- и неврологических расстройств.

Положения, выносимые на защиту

1. Ноотропные препараты проявляют фармакологически значимую конкуренцию за места связывания АМРА- и метаботропных рецепторов глутамата с их селективными лигандами.

2. В условиях теста закрытого крестообразного лабиринта инбредные мыши линий BALB/c и C57BL/6 отличаются по эффективности исследовательского поведения, тревожности и двигательной активности.

3. Инбредные мыши линий BALB/c и C57BL/6 отличаются по характеристикам AMP А- и метаботропных рецепторов глутамата.

4. Субхроническое введение ноотропных препаратов избирательно воздействует на поведенческие характеристики мышей линий BALB/c и C57BL/6 в условиях теста закрытого крестообразного лабиринта.

5. Субхроническое введение ноотропных препаратов изменяет характеристики АМРА-рецепторов коры мозга мышей линий BALB/c и C57BL/6.

6. Субхроническое введение ноотропных препаратов влияет на характеристики mGluR П-рецепторов коры мозга мышей линий BALB/c и C57BL/6.

Апробация. Результаты работы представлены на 5-ой Международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Москва, июнь 2010), Научно-практической конференции с международным участием «Нейрохимические подходы к исследованию функционирования мозга» (Ростов-на-Дону, сентябрь 2011), 4-м съезде фармакологов России (Казань, сентябрь 2012), IV-м Всероссийском научно-практическом семинаре молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекар-ственных средств» (Волгоград, октябрь 2012), П-ой Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, ноябрь, 2012), первой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств» (Москва, июнь 2013), межлабораторной конференции ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН (июнь, 2013), Всероссийской научной конференции «Экспериментальная и клиническая фармакология: научные чтения» (Рязань, октябрь 2013).

Публикации. Результаты работы опубликованы в 3 статьях в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, и в 7 тезисах в материалах российских и международных конференций.

Личный вклад. Автор является непосредственным исполнителем всех этапов проведенного исследования: поиска и анализа литературы по теме диссертации, проведения радиолигандного анализа, поведенческих экспериментов, обработки и анализа полученных результатов, формулирования положений и выводов работы. При активном участии автора подготовлены основные публикации по материалам диссертации.

Структура работы. Диссертация изложена на 137 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, список литературы, включающий 72 отечественных и 228 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 30 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Животные. Исследования по радиолигандпому связыванию в структурах мозга проводили на 30 самцах крыс линии Wistar массой 200-250 г, 150 самцах мышей линии BALB/C (потомите «Столбовая») и 150 самцах мышей линии C57BL/6 (питомник «Столбовая») массой 25-30 г. При проведении экспериментов ex vivo физиологический раствор (контрольная группа - NaCl, 0.9%), либо препарат (опытная группа) вводили животным посредством внутрибрюшинных инъекций в течение 5 дней (субхроническое введение), один раз в супси. Животных умерщвляли через 24 часа после последней инъекции путём цервикальной дислокации с последующей декапитацией, головной мозг извлекали при температуре тающего льда и выделяли целую кору по схеме (Glowinski and Iversen, 1966).

2. Препараты и дозы. Пирацетам - 200 мг/кг/день (Sigma); фенотропил - 100 мг/кг/день (ОАО Отечественные препараты), пантогам - 200 мг/кг/день (ООО ПИК Фарма); семакс - 0,6 мг/кг/день (ОХФАВ ИМГ РАН), нооглютил - 50 мг/кг/день и ноопепт - 1 мг/кг/день (синтезированы в ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова» РАМН). Препараты были использованы в эквипотенциальных дозах, проверенных в ранее проведенных экспериментах в тесте УРПИ по антиамнестическому эффекту, а также при микродиализе (Ковалев Г.И., 1993).

3. Тест исследовательского поведения в закрытом крестообразном лабиринте. Для оценки исследовательского поведения животных использовали закрытый крестообразный лабиринт (ЗКЛ) (Салимов, 1988). Крестообразный лабиринт состоял из 4-х прозрачных пластмассовых закрытых пустых отсеков, которые имели номера 1-4 и соединялись с таким же центральным отсеком с помощью входных отверстий (Salimov et al., 1995; 1996). Мышь помещали в центральный отсек лабиринта и в полуавтоматическом режиме с помощью программы Behaviour регистрировали последовательность и продолжительность ее переходов из одного рукава в другой. Последующий анализ данных позволял выделить ряд показателей поведения, наиболее информативными из которых являются:

1. Длина первого цикла патрулирования (количество заходов) (FPtrN), а также число циклов патрулирования (PatrIN) являются показателями эффективности исследовательского поведения и используются для оценки ноотропного действия вещества (Салимов, 1988; Markina et al., 2004): чем большее число заходов (величина цикла патрулирования) требуется животному, чтобы посетить все 4 боковых рукава, то есть совершить один цикл патрулирования, тем менее эффективно исследование лабиринта; чем больше циклов патрулирования успевает совершить животное, тем выше эффективность его исследовательского поведения.

2. Латентный период (F_ChTm) и продолжительность первого визита в боковой отсек (F GITm) - это показатели, отражающие уровень тревожности животного в новой

обстановке. Они могут рассматриваться как показатель баланса между любопытством и тревогой животного в новой обстановке (Beizung, Le Pape, 1994; Salimov, et al., 1996; Salimov, 1999), а также использоваться для оценки транквилизирующего (анксиолитического) эффекта веществ (Салимов и др., 2003).

3. Общее время пребывания животного в центральном (Т_СЬТш) и боковых отсеках (T GiTtn) лабиринта отражает уровень двигательной активности животного, а также характеризует интенсивность обследования новой среды. Оба показателя могут быть использованы для оценки стимулирующего или, наоборот, седативного эффекта вещества (Salimov et al., 1996; Salimov et al., 2000; Markina et al., 2004).

4. Раднолигапдиое связывание

4.1. Радиолигандный анализ АМРА-рецепторов. В экспериментах по радиолигандному связыванию использовали меченый тритием Ro 48-8587 с удельной активностью 22 Кюри/ммоль. Инкубационная смесь (конечный объем 0,5 мл) содержала 50 мкл [3H]Ro 48-8587, 200 или 250 мкл буфера (50 гаМ Tris-HCl рН=7.1) и 200 мкл белковой суспензии мембран, для неспецифического связывания добавляли 50 мкл немеченного лиганда (глутамат). Реакционную смесь инкубировали при 4°С в течение 1 часа. По окончании инкубации пробы фильтровали через стекловолоконные фильтры GF/C (Whatman), предварительно смоченные в 0.3% полиэтиленимине в течение 2 часов при 4°С. Каждую пробирку промывали два раза холодным буфером (50 mM Tris-HCl рН=7.1), затем фильтры промывали два раза тем же объемом буфера. Фильтры просушивали на воздухе и переносили в сцинтилляционные флаконы, затем заливали 5 мл сцинтилляционной жидкости на основе толуола (4 г РРО, 0.2 г РОРОР на 1 л толуола).

4.2. Радиолигандный анализ mGIuR-рецепторов. В экспериментах по радиолигандному связыванию использовали меченый тритием LY 354740 с удельной активностью 42 Кюри/ммоль. Инкубационная смесь (конечный объем 0,5 мл) содержала 50 мкл [3H]LY 354740,200 или 250 мкл буфера (50 mM Tris-HCl, 2 mM MgCl2 , рН=7.4) и 200 мкл суспензии мембран, для неспецифического связывания добавляли 50 мкл немеченого лиганда для АМРА и mGIuR-рецепторов - глутамат (1 mM). Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. По окончании инкубации пробы фильтровали через стекловолоконные фильтры GF/C (Whatman), предварительно смоченные в 0.3% полиэтиленимине в течение 2 часов при 4°С. Каждую пробирку промывали два раза холодным буфером (50 mM Tris-HCl, 2 mM MgC12, рН=7.4), затем фильтры промывали два раза тем же объемом буфера. Фильтры просушивали на воздухе и переносили в сцинтилляционные флаконы, затем заливали 5 мл сцинтилляционной жидкости на основе толуола (4 г РРО, 0.2 г РОРОР на 1 л толуола).

Для анализа насыщения и получения характеристик связывания Kd и Вшах, отражающих .степень сродства рецептора к лиганду (нМ) и количество мест связывания

лиганда (фмоль/мг белка), соответственно, измеряли специфическое связывание для АМРА-рецепторов в диапазоне концентраций от 0.3125 до 50 нМ, для mGluR-рецепторов -от 1,56 до 200 нМ. Специфическое связывание рассчитывали как разницу между общим и неспецифическим связыванием. Величину IC50, представляющую собой концентрацию, в которой исследуемое вещество ингибирует специфическое связывание лиганда с соответствующим рецептором на 50%, определяли по отношению к связыванию меченых лигандов при добавлении в инкубационную среду 50 мкл исследуемых соединений в конечных концентрациях в диапазоне 10""'-10"1 М. Радиоактивность определяли на счетчике Tri-Carb 2900TR (Perkin Elmer) с эффективностью счета 42-46%. Концентрацию белка измеряли по стандартной методике Лоури (1951).

5. Статистическая обработка результатов. Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась с помощью программы Statistica 6.0. При обработке полученных результатов использовали методы параметрической и непараметрической статистики (t-тест Стьюдента, х-квалрат, F-критерий Фишера, U-критерий Манна -Уитни, критерий Колмогорова-Смирнова, критерий Вальда-Вольфовица) согласно «Методическим рекомендациям по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ». На графиках представлены средние значения с учетом стандартной ошибки среднего (mean±S.E.M). Для обработки результатов радиолигандного связывания использовали программу Graphpad Prism 4.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Автор выражает глубокую благодарность за техническое и консультационное содействие к.б.н. Ю.Ю. Фирстовой, д.б.н. P.M. Салимову (НИИ фармакологии имени В.В.Закусова» РАМН, д.х.н., профессору Ю.А. Золотарёву, академику РАН Н.Ф. Мясоедову (ОХФА'В ИМГ РАН).

1. Изучение влияния ноотропных препаратов на АМРА- и метаботропные

глутаматные рецепторы in vitro

Было изучено влияние исследуемых ноотропных препаратов на связывание селективного антагониста АМРА-рецепторов [3H]Ro 48-8587 с глутаматными АМРА-рецепторами мембран коры мозга грызунов. Эксперименты с радиолигандным связыванием [3H]Ro48-8587 показали фармакологически значимый уровень конкуренции препарата нооглютила за эти места связывания с величиной константы полуингибирования 1С50=6.4±0.2 мкмоль/л, дипептидный препарат ноопепт также обнаружил наличие конкурентного взаимодействия с меченым лигандом АМРА-рецепторов с 1С50=80±5.6 мкмоль/л. Семакс, пантогам, фенотропил и пирацетам не влияли на специфическое связывание ['Н]Ro 48-8587 во всём интервале изученных концентраций, что говорит об отсутствии структурного сродства этих препаратов к АМРА-рецепторам коры мозга.

Величина 1С50 для немеченого избирательного лиганда ЫВС^Х составила 0.007±0.0002 мкмоль/л (Рис. 1 а).

В экспериментах по связыванию селективного лиганда т01иК Н-рецепторов (1гЮ1иК2, ггЮ1иЯЗ) [3Н] ЬУ354740 с твЫЯ П-рецепторами мембран коры мозга грызунов было показано, что влияние агониста ЬУ354740 описывается классической кривой вытеснения и характеризуется величиной 1С50=0.020±0.001 мкмоль/л. Фармакологически значимая конкуренция за рецепторные места связывания обнаружена только для гептапептидного препарата семакса с величиной 1С50=33±2.4 мкмоль/л. Представители других классификационных групп ноотропов вплоть до максимальной использованной концентрации 100 мкМ не показали эффекта конкуренции с лигандом за рецепторные места связывания (Рис. 1 б).

Полученные данные свидетельствуют об избирательности действия изученных ноотропных препаратов на семейство глутаматных рецепторов.

к 5 Z Ш Л

к со о

о ф

3

ю о

о

-10 -9-8-7-6-5-4 Log (концентрация соединения, М)

1_од (концентрация соединения, М)

■ Пантогам о Пирацетам

* Фенотрогил

♦ Ноопепг Нооггклил Семакс

з " LY354740

Нооглютил

NBQX

Семакс

Пирацетам

Фенотропил

Ноопегтг

а б

Рис. 1. Влияние ноотропных препаратов на связывание селективных лигандов с АМРА-рецепторами коры мозга (а) и тС1иЯ П-рецепторами коры мозга (б) мышей (т ± 8.Е.М.)

2. Изучение поведения мышей лини» ВАЬВ/с и С57ВЬ/6 в ЗКЛ.

При сравнении параметров поведения наблюдались значимые межлинейные отличия по длине первого цикла патрулирования (Р_Р1гЬ1) и числу циклов патрулирования (РацЫ): мыши ВАЬВ/с демонстрировали исходно более низкую эффективность исследовательского поведения (больше число заходов и меньше циклов патрулирования) по сравнению с мышами С57ВЬ/6 (Рис. 2 а). По показателям латентного периода первого захода в тупик (Р СИТт) и продолжительности 1-го визита в боковой отсек (Р_С1Тт) также была выявлена разница между исследуемыми линиями мышей: ВАЬВ/с демонстрировали большую степень их тревожности (в среднем, в 2,5-4 раза) и двигательной активности по сравнению с С57ВЬ/6 (Рис. 2 б).

í

Рис. 2. Сравнение исследовательского поведения (а), тревожности и двигательной активности (б) мышей BALB/c и С57В1/6 в тесте «закрытый крестообразный лабиринт» Примечание: *, + - статистически значимые отличия от контроля по 1-критерию Стьюдента и непараметрическим критериям, соответственно, р<0,05

2.1. Эффекты субхронического введения ноотропных препаратов на

поведенческие характеристики мышей линий BALB/c и C57BL/6 в 3KJI.

В результате субхронического введения всех исследуемых ноотропных препаратов у мышей BALB/c наблюдалось статистически значимое снижение числа заходов в отсеки лабиринта, в среднем на 15 % по сравнению с контрольной группой (Рис. 3 а-е). Общее число патрулирований отсеков в группах мышей BALB/c, получавших препараты, в среднем, увеличилось на 10% по сравнению с контрольной группой. Согласно полученным данным для мышей линии BALB/c препараты по убыванию ноотропной активности можно условно расположить в следующей последовательности: нооглютил > семакс = пантогам = пирацетам ~ фенотропил » ноопепт. В этих же условиях в группах мышей C57BL/6 значимых изменений указанных показателей не наблюдалось, за исключением избирательного увеличения времени исследования ими тупиков лабиринта, наблюдавшегося после введения гшрацетама, что, по-видимому, свидетельствует о некотором усилении исследовательского поведения, которое, тем не менее, не сопровождается изменением его эффективности.

После субхронического введения ноотропов у мышей BALB/c отмечалось снижение тревожности под действием пирацетама, фенотропила, ноопепта, семакса, а также увеличение двигательной активности под влиянием фенотропила в сравнении с контрольной группой (Рис. 4 а - е). По убыванию выраженности анксиолитического компонента изученные ноотропы формируют следующую последовательность: семакс=феиотропил~ноопепт>пираиетам»11антогам=1100глютил. Надо отметить, что в отношении мышей C57BL/6 были отмечены фармакологические эффекты, наблюдавшиеся лишь у некоторых из изучавшихся веществ, а именно анксиогенный эффект после введения фенотропила и семакса (Рис. 4 а - е).

вв

6.0 £ 6,0 I 4,0

I |

НИШ II!

1

В

ВА1.В'е контроль ВАЬВ/с пирацетам ИС57ВЦ6 контроль й С57ВЦ6 пирацетам ВА1.В/С контроль ВА1В/С фенотропил 105781^6 контроль ЙС67ВЦ6 фенотропил

1

ВЛ.8/с контроль • ВАЬВ/с ж

■ сб7виб контроль 8 С57ВЦ6 ноопегтг

ВА1.В/е контроль • ВА1.В/С семакс иС67Виб контроль 2СБ7В1./6 семаке

ВА1В'е контроль . ВА1.В/С

■ С67ВЦ6 контроль аС67ВЦ6

ВАЬВ'с контроль ' ВА|_В'с

■ С57Виб контроль й С57В1./6 нооглютил

Рис. 3. Влияние субхронического введения ноотропных препаратов на продолжительность 1-го цикла патрулирования и число циклов патрулирования у мышей линий ВАЬВ/с и С57В1/6 в тесте «закрытый крестообразный лабиринт» (т±5ЕМ)

Примечание: *. + - статистически значимые отличия от контроля по /-критерию Стьюдента и непараметрическим критериям, соответственно, р<0,05

1611.0 150,0 140,0 | 130,0

Р 120,11 1 110,0 с 100,0

в 90,0

1 Sll.ll

я 70,0 -

* 60,0

2 50,0 I 40.11 | 30,11 Т 20.0

10.0 0.0

Г+1

№

Покате.

□ ВА1_В/с контроль □ ВА1_В/с пирацетам ■ С57В1_/6 контроль ЕЗ С57В1-/6 пирацетам

110,0

100,0

90,0

80,0

§ 70,0

§ 60,0

я 50,0

40,0

5 30,0

20,0

10,0

0,0

Г СЬТш

Р СГГш

Т_СЬТт

Т СГГш

□ BALB/c контроль □ BALB/c фенотропил ■ C57BL/6 контроль £Э С57В1./6 фенотропил

б

110,0

100,0

'5 90,0

« 80,0

в 70,0

2 60,0

5

г 50,0

40,0

2

§ 30,0

5

20,0

10.0

0,0

□ ВА1.В/С контроль

Р_С1Тт ТСНТт

□ ВА1_В/с ноопепт ■ С57Виб контроль

Э С57ВУ6 ноопегтт

I 10.0 100.0

>5

С 90,0

Ф

п 80.0

О 70,0

| 60,0

го ?(>.<> х

Ф 40,0

§ 30,0 с

х 20.0 10.0 0.0

±

Щт

□ ВА1_В/с контроль

□ ВА1_В/с семакс

■ С57В1_/6 контроль

Т_С1Тт 3 С57Виб семакс

1 10,0

,5 100,0

ф 90,0

я 80.0

с 70,0 •

к

60,0

со 50.0

Ф 40,0

т 30,0 •

о

и 20,0

Т

10,0

0,0

□ ВАЬВ/с контроль

□ ВА1_В/с пантогам

I С57В1./6 контроль

Т_С1Т| 3 С 57 В ив

1 10.0 ; ним»

; 90,0

! 80,0

; 70,0

: 60.0

\ 50,0

> 40,0

I 30,0

; 20,0

: 10,0 0,0

□ ВА1_В/с контроль □ ВАЬВ/с нооглютил

I С57В1./6 контроль

3 С57В1./6 нооглютил

е

Рис. 4. Влияние субхронического введения ноотропных препаратов на поведение мышей ВАЬВ/с и С57ВЬ/6 в тесте «закрытый крестообразный лабиринт» Примечание: *. + - статистически значимые отличия от контроля по I-критерию Стьюдента и непараметрическим критериям. соответственно, р<0,05

1. Влияние субхроннческого введения ноотропиых препаратов на характеристики связывания селективных лигандов с АМРА- и метаботропными рецепторами глутамата мозга мышей BALB/c и C57BI/6 ex vivo

При сравнении связывания [3H]Ro 48-8587 с АМРА-рецепторами в мозге контрольных фупп мышей BALB/c и C57BL/6 были найдены отличия по плотности рецепторов в мембранах коры мозга: у C57BL/6 она оказалась выше на 10-19%. Величины Kd в мембранах коры мозга обеих линий мышей не различались статистически значимо (Таб. 1), (Рис. 5).

После субхронического введения семакса и пантогама у мышей BALB/c плотность АМРА-рецепторов увеличивалась на 9% и 15%, а под воздействием нооглютила уменьшалась на 14%. Пирацетам, фенотропил, ноопепт никакого воздействия на мышей BALB/c не оказывали. Под воздействием фенотропила, ноопепта, семакса, нооглютила у мышей C57BL/6 уменьшалось количество мест связывания [3H]Ro 48-8587 на 19%, 17%, 23%, 12%, соответственно. Пирацетам и пантогам в отношении этого параметра оставались неактивными. Величина константы диссоциации (Kd) под действием всех препаратов оставалась неизменной между группами (Таб. 1), (Рис. 5).

а

б

Концентрация [3H]Ro 46-85 87, нМ

В

Концентрация [3H]Ro 48-85 87, нМ

Г

Концентрация [3H]Ro 48-85 87, нМ

Д

Концентрация [3Н]Ро 48-85 87, нМ

е

Концентрация £3Н]Ко 48-85 87, нМ

Ж

Концентрация [3Н]Ро 48-85 87, нМ

3

Рис. 5. Влияние ноотропов на связывание [3Н]Яо 48-8587 с АМРА-рецепторами коры мышей ВАЬВ/с (а,в,д,ж) и С57В1/6 (б,г,е,з) (кривая насыщения и график Скетчарда)

Примечание: * - статистически значимые отличия от контроля р<0,05

Таблица 1. Влияние ноотропных средств на характеристики связывания с АМРА-рецепторами коры мышей BALB/c и С57В1/6 ex vivo после субхронического введения (m±S.E.M.)

Препараты BALB/c C57BL/6

Вшах, ФМОЛЬ/МГ Kd, нМ Вшах, фмоль/иг Kd, нМ

Контроль Пирацетам Фенотропил 4363±218+ 36,22±3,30 5112±227+ 42,85±3,29

4624±196 36,58±2,82 4998± 186,5 43,93±2,82

4297±201 40,32±3,32 4135±209* 42,73±3,75

Контроль Ноопепт Семакс 5849±148+ 43,95±1,92 7194±161+ 46,94±1,78

6041±151 44,62±1,91 5960±148* 46,34± 1,95

6390±160* 44,03±1,89 5529±145* 49,44±2,14

Контроль Пантогам 4610±120+ 41,93± 1,89 5141±184+ 40,13±2,53

5311±156* 40,44±2,08 4973±186 39,40±2,62

Контроль Нооглютил 7110±264+ 33,53±2,33 7899±292+ 35,98±2,43

6075±251 * 33,51 ±2,58 6978±200* 34,29±1,82

Примечание: * - статистически значимые отличия от контроля (1-тест) + - статистически значимые отличия между линиями (Мстп-1У1п1пеу тест), р<0,05

Сравнение рецепторного связывания селективного агониста mGluR II в мозге контрольных групп мышей BALB/c и C57BL/6 выявило межлинейные отличия по величине Вшах, отражающей плотность рецепторов, в исследуемой структуре мозга: у C57BL/6 она оказалась выше на 15-20%. Величины Kd в мембранах коры не различались между линиями мышей BALB/c и C57BL/6 (Таб. 2), (Рис. 6).

Под воздействием ноотропов в группах мышей BALB/c эффектов в отношении Bmav для [3H]-LY354740 не было обнаружено. В группах мышей C57BL/6 после введения пирацетама. ноопепта и семакса количество мест связывания уменьшалось на 21%, 19% и 18%, соответственно. Препараты фенотропил, пантогам и нооглютил не изменяли числа мест связывания для изучаемого лиганда mGluR-рецепторов. Величина константы диссоциации (Kd) под действием всех препаратов оставалась неизменной между группами (Таб. 2), (Рис. 6).

Таблица 2. Влияние ноотропных средств на характеристики связывания с метаботропными глутаматными рецепторами коры мышей BALB/c и С57В1/6 ex vivo после субхронического введения (m±S.E.M.)

Препараты BALB/c C57BL/6

Вшах, ФМОЛЬ/МГ Kd, нМ Вщах, фмоль/мг Kd, нМ

Контроль Пирацетам Фенотропил 956±92 44,71 ± 11,39 1 1 17±118+ 45,41± 12,68

1059±72 41,90±7,75 880±62* 39,68±7,72

980±73 40,58±8,31 923±74 40,87±8,92

Контроль Ноопепт Семакс 951±69 35,33±7,21 1208±94+ 38,42±8,31

977±83 36,73±8,82 981±74* 38,07±7,96

990±78 39,36±8,54 986±79* 38,45±8,56

Контроль Пантогам Нооглютил 1052±81 38,74±8,32 1295±132+ 60,72± 15,00

1150±99 46,04± 10,45 1119±117 56,28± 14,60

1055±86 51.83±10,78 1210±121 59,65± 14,54

Примечание: * - статистически значимые отличия от контроля (1-тест) + - статистически значимые отличия между линиями (Мапп-^УИИпеу тест). р<0.05

Контроль -о- Пирацетам • Фенотропил

й со

I?

й

График Скетчарда

Bound. fmoUmg

50 100 150

Концентрация [3H]-LY 364740, нМ

га

со

II

Контроль -о- Пирацетам* в- Фенотропил

График Скетчарда

60 100 160 200 Концентрация [3H]-LY 354740, нМ

Контроль

Ноопепт

Семакс

График Скетчарда

Bound, fmol/mg

Концентрация [3H]-LY 354740, нМ

г

д

е

Рис. 6. Влияние ноотропов на связывание [3Н]-ЬУ354740 с метаботропными глутаматными рецепторами коры мышей ВА1.В/с (а,в,д) С57В1/6 (б,г,е) (кривая насыщения и график Скетчарда)

Примечание: * - статистически значимые отличия от контроля (I-/ез/'.), р<0,05

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, было установлено, что генетическая гетерогенность мышей линии BALB/c и C57BL/6 отражается не только на различной эффективности исследовательского поведения животных, тревожности и двигательной активности, но и на нейрохимическом уровне, где фиксируется ряд различий по количеству АМРА- и mGluR II рецепторов. Мыши BALB/c характеризуются меньшей исследовательской активностью, большей тревожностью и двигательной активностью в закрытом крестообразном лабиринте, что сопровождается снижением активности АМРА- и mGluR II рецепторов в коре мозга по сравнению с мышами C57BL/6. При этом наблюдаемые отличия между линиями касаются таких нейрохимических факторов (АМРА- и mGluR), которые играют важную роль в процессах нейроналыюй пластичности, а следовательно, обучения и памяти, а также нейродегенеративных расстройствах.

Полученные данные по действию субхронического введения ноотропных препаратов из различных классификационных групп па поведение п характеристики АМРА- и метаботропных рецепторов глутамата обнаруживают наличие как общих, так и специфических их свойств (Табл.3,4).

Таблица 3. Сопоставление фармакологических эффектов ноотропов в закрытом крестообразном лабиринте

Препараты Исследовательская Тревожность Двигательная

активность активность

C57BL/6 BALB/c C57BL/6 BALB/c C57BL/6 BALB/c

Пирацетам + + 0 - 0 0

Фенотропил 0 + + - 0 +

Ноопепт 0 + 0 - 0 0

Ссмакс 0 + + - 0 0

Пантогам 0 + 0 0 0 0

Нооглютил 0 + 0 0 0 0

Примечание: +, - и 0 - усиление, ослабление и отсутствие эффекта в сравнении с контролем

Таблица 4. Сопоставление нейрохимических эффектов ноотропов

Препараты f3H>Ro-4587 [3H1-LY354740

C57BI/6 Balb/c C57BI/6 Balb/c

Пирацетам 0 0 - 0

Фенотропил - 0 0

Ноопепт - 0 - 0

Семакс - + - 0

Пантогам 0 + 0 0

Нооглютил - - 0 0

Примечание: +, - и 0 -усиление, ослабление и отсутствие эффекта в сравнении с контролем

Все исследованные вещества оказывают положительный модулирующий эффект на спонтанное ориентировочное поведение мышей с исходно низкой эффективностью исследовательского поведения (BALB/c) в закрытом крестообразном лабиринте. Кроме

того, для некоторых из пих характерен анксиолитический компонент (пирацетам, фенотропил, ноопепт и семакс), а также усиление двигательной исследовательской активности (фенотропил). Ряд препаратов демонстрируют эффекты в отношении линии сравнения (C57BL/6): пирацетам увеличивает исследовательскую активность в тупиках, а фенотропил и семакс вызывают у этих мышей анксиогенный эффект.

По результатам радиолигандного анализа in vitro обнаружено, что нооглютил проявляет фармакологически значимую конкуренцию за рецепторные места связывания с селективным агонистом АМРА-рецепторов [3H]Ro 48-8587, у ноопепта этот эффект выражен в метшей степени (Фирстова и др., 20И). Рассматривая эти данные совместно с результатами эффектов нооглютила и ноопепта после системного введения, можно предположить, что нооглютил снижает плотность АМРА-рецепторов у мышей обеих линий C57BL/6 и BALB/c, а ноопепт - только у C57BL/6, в результате прямого воздействия на эти рецепторы. Напротив, фенотропил, семакс и пантогам имеют не прямой, а скорее опосредованный путь воздействия на АМРА-рецепторы мозга мышей.

Субхроническое введение ноотропов не приводит к изменениям характеристик рецепггорного связывания [3H]-LY354740, во улучшает эффективность исследовательского поведения у мышей BALB/c (Васильева и др., 2012), что указывает на неучастие mGluR II-рецепторов в механизме регуляции ноотропными веществами исследовательской активности (Васильева и др., 2013). Напротив, на основании полученных данных можно предположить, что метаботропные рецепторы глутамата П типа вносят вклад в осуществление эмоциотропного компонента, присутствующего у 4-х ноотропов: пирацетама, фенотропила, ноопепта и семакса (Васильева и др., 2012).

Сравнение нейрохимических результатов между двумя исследуемыми линиями животных выявляет (Табл. 4), что ноотропы снижают величину Вшах рассматриваемых групп глутаматных рецепторов у мышей C57BL/6, изначально имевших большую плотность АМРА- и mGluR II-рецепторов в коре мозга.

выводы

1. В экспериментах по радиолнгандному анализу in vitro обнаружено сродство препарата нооглютила (1С50=6.4±0.2 мкМ), и, в меньшей степени, ноопепта (1С50=80±5.6 мкМ) к АМРА- типу, а также и гептапептида семакса (1С50=33±2.4 мкМ) - к mGluR II типу глутаматных рецепторов мозга.

2. В условиях теста закрытого крестообразного лабиринта инбредные мыши линии BALB/c проявляют меньшую эффективность исследовательского поведения в новой обстановке и более высокий уровень тревожности и двигательной активности, чем мыши инбредной линии C57BL/6.

3. У инбредных мышей C57BL/6 плотность АМРА- и mGluR И-рецепторов в мембранах коры мозга на 10-20% выше, чем у инбредных мышей BALB/c.

4. Ноотропный эффект, общий для всех изученных препаратов на мышах Balb/c, может осуществляться как через избирательное влияние на когнитивные функции (пантогам, 200; нооглютил, 50 мг/кг/день), так и при участии анксиолитического компонента (пирацетам, 200; фенотропил, 100; ноопепт, 1; семакс, 0,6 мг/кг/цень).

5. У мышей BALB/c субхроническое введение семакса и пантогама вызывает увеличение, а нооглютила — уменьшение плотности АМРА-рецепторов. У линии C57BL/6 снижение количества АМРА-рецепторов происходит под влиянием фенотропила, ноопепта, семакса, нооглютила. По-видимому, проявление ноотропного эффекта не зависит от направленности изменения плотности АМРА-рецепторов в коре мозга.

6. У мышей C57BL/6 пирацетам, ноопепт и семакс снижали плотность метаботропных глутаматных рецепторов (mGlur II) в коре мозга, тогда как в группе мышей BALB/c ни один из исследуемых ноотропов не изменял характеристик связывания с этими рецепторами. Следовательно, изменения плотности mGluR П, наблюдаемые у C57BL/6, не являются типичными для формирования ноотропного эффекта препаратов.

Практические рекомендации

Рекомендуется дальнейшее доклиническое изучение компонентов ноотропного эффекта изученных препаратов для оптимизации их практического применения в клинике психо- и неврологических расстройств.

Предлагается дальнейшее изучение нейрохимических механизмов действия ноотропных веществ с целью совершенствования алгоритмов направленного создания новых препаратов, улучшающих когнитивную деятельность.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Фирстова, Ю.Ю. Изучение специфичности действия ноотропных препаратов на глутаматные рецепторы мозга крыс [Текст] / Ю.Ю. Фирстова, Е.В. Васильева, Г.И. Ковалев // Экспериментальная и клиническая фармакология. — 2010. - Т. 74, №1. -С. 6-10.

2. Фирстова, Ю.Ю. Влияние субхронического введения ноотропных препаратов на характеристики связывания 5НТ2А рецепторов в мозге мышей, разделенных по исследовательскому поведению в крестообразном лабиринте [Текст] / Ю.Ю. Фирстова, Е.В. Васильева, H.A. Сухорукова, И.А. Зимин, Г.И. Ковалев // Тезисы 5-й международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным веществам», 1-4 июня 2010, Москва. — М., 2010. -С. 90.

3. Васильева, Е.В. Влияние нооглютияа на АМРА-рецепторы мозга грызунов in vitro и ex vivo [Текст] / Е.В. Васильева, Ю.Ю. Фирстова, Г.И. Ковалев // Материалы Научно-практической конференции с международным участием «Нейрохимические подходы к исследованию функционирования мозга», 28-30 сентября 2011, Ростов-на-Дону. - Ростов-на-Дону: ИПО ПИ ЮФУ, 2011. - С. 32-33.

4. Васильева, Е.В. Влияние ноотропных средств на поведение мышей BALB/c и C57BL/6 в крестообразном лабиринте [Текст] / Е.В. Васильева, P.M. Салимов, Г.И. Ковалёв // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2012. - Т.75, №7. -С. 32-37.

5. Васильева, Е.В. Влияние ноотропных препаратов на поведенческий спектр мышей линий BALB/c и C57BL/6 в крестообразном лабиринте [Текст] / Е.В. Васильева, P.M. Салимов, Г.И. Ковалёв // Тезисы 4-го съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологию), 18-21 сентября 2012, Казань. — М.: Фолиум, 2012. - С. 34.

6. Васильева, Е.В. Влияние ноотропов на ионотропные глутаматные рецепторы мозга мышей BALB/c и C57BL/6 [Текст] / ЕЛВ. Васильева, Е.А. Кондрахин , Г.И. Ковалев // Материалы П всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», 12-14 ноября, 2012, Санкт-Петербург. - СПб., 2012. - С. 112-114.

7. Васильева, Е.В. Действие ноотропов на нейрохимические характеристики метаботропных глутаматных рецепторов мозга мышей BALB/c и C57BL/6 [Текст]./ Е.В. Васильева, Г.И. Ковалёв // Материалы 4-го Всероссийского научно-практического семинара молодых учёных с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств», 29-31 октября 2012, Волгоград. - Волгоград, 2012. - С. 103-104.

8. Васильева, Е.В. Влияние ноотропных препаратов на мегаботропные глутаматные рецепторы мозга мышей BALB/c и C57BL/6 [Текст] / Е.В. Васильева, Ю.А. Золотарёв, Г.И. Ковалёв // Нейрохимия. - 2013. - Т.30, №2. - С. 135-141.

9. Васильева, Е.В. Влияние ноопепта и нооглютила на поведение и глутаматные рецепторы мозга мышей линий BALB/c и C57BL/6 [Текст] / Е.В. Васильева, P.M. Салимов, Ю.А. Золотарёв, Г.И Ковалёв // Материалы Первой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств», 3-5 июня 2013, Москва. М., 2013. - С. 18.

Ю.Васильева, Е.В. Влияние семакса на поведение и глутаматные рецепторы мозга мышей линий BALB/c и C57BL/6 [Текст] / Е.В. Васильева, P.M. Салимов, Ю.А. Золотарёв, Г.И. Ковалёв // Тезисы Всероссийской научной конференции «Экспериментальная и клиническая фармакология: научные чтения», 25 октября 2013, Рязань. - Рязань: РИО-РязГМУ, 2013. - С. 50-52.

Список используемых сокращений

ЗКЛ - тест «закрытый крестообразный лабиринт» УРПИ - тест «условный рефлекс пассивного избегания» АМРА — а-амино-З-гидроксил-5-метил^-изоксазол-пропионовая кислота мозговой ростовой фактор

- длина первого цикла патрулирования (количество заходов) Г СЬТт - латентный период продолжительность первого визита в боковой отсек Р_С1Тга - продолжительность первого визита в боковой отсек Ра1г№ - число циклов патрулирования

Т_СЬТт - общее время пребывания животного в центральном отсеке лабиринта Т_С1Тт - общее время пребывания животного в боковых отсеках лабиринта тЯиК- метаботропные глутаматные рецепторы N141ОЛ - Ц-метил-В-аспарагиновая кислота

Подписано в печать 11.11.2013 г.

Заказ № 39 Типография ООО "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, Тел. (499)152-00-16 Тираж 100 шт.