Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Поиск веществ с ноотропной и нейропротективной активностью с использованием традиционных методов скрининга и аналитической компьютерной программы

На правах рукописи

ГАЛАЕВА ИРИНА ПЕТРОВНА

ПОИСК ВЕЩЕСТВ С НООТРОПНОЙ И НЕЙРОПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТРАДИЦИОННЫХ МЕТОДОВ СКРИНИНГА И АНАЛИТИЧЕСКОЙ КОМПЬЮТЕРНОЙ ПРОГРАММЫ

14.00.2S. - фармакология, клиническая фармакология

А в тор еферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

СЯЗАТЕПЬНЫЙ СнСПЛАГНЫЙ ЭКЗЕМПЛЯР

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Гарибова Т.Л.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Мирзоян Р.С. доктор биологических наук, профессор Каменский А.А.

Ведущая организация:

Московский государственный медико-стоматологический университет

Защита состоится « .... » марта 2004 года в .... часов .... минут на заседании диссертационного совета Д.001.024.01 в ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН по адресу: 125315 Москва, ул. Балтийская, д.8. С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН.

Автореферат разослан «....» февраля 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Вальдман ЕА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы: В последние годы в связи с ростом числа заболеваний, протекающих с нейродегенеративными изменениями и сопровождаемых нарушениями когнитивных функций, осуществляется активный скрининг новых эффективных препаратов с ноотропным и нейропротективным действием. Одним из наиболее распространенных традиционных методов является поиск, основанный на модификации молекулы уже используемого в медицинской практике препарата. Так, модификация молекулы первого ноотропа - пирацетама привела к созданию ряда новых эффективных препаратов: анирацетам, прамирацетам и др. (Gouliaev, 1994). Прогресс в определении механизмов нейродегенеративных процессов и развитие новых методических подходов способствует расширению сфер поиска, и как объект исследования в настоящее время рассматриваются антагонисты NMDA (Chazot and Hawkins, 1999; Brauner-Osborne, 2000; Hatton, 2001) и АМРА рецепторов (Воронина ТА., 1992; Ingvar et. al., 1997; Hampson, 1998; Filial et al., 1998; Brauner-Osborne, 2000) глутаматергической системы, ингибиторы холинэстеразы, лиганды мускариновых и никотиновых рецепторов холинергической системы (Levin, 1998; Eglen, 2001; Lachowicz et al., 2001), вещества, влияющие на различные стадии глутамат - кальциевого каскада, вызванного инсультом (Скворцова В.И., Гусев Е.И., 2001; Takasago et al., 1998; Danbolt, 2001; Floyd et al., 2002), блокаторы кальциевых каналов L-типа (Taya et. al., 2000; Cano-Abad et al., 2001; Bogaert et. al., 2001), ингибиторы кальций - активируемых нейрональных протеиназ (Wang and Yuen, 1994; Kinloch et. al., 1999), ингибиторы цитокинов (Kinloch et al., 1999), вещества, влияющие на нейротрофил ингибирующий фактор (Yang et al, 1999) и др. Вместе с тем большинство разрабатываемых на этой основе активных веществ не внедряются в клиническую практику из-за наличия нежелательных побочных эффектов (Brauner-Osborne, 2000).

В ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН в течение ряда лет осуществляется поиск веществ с ноотропным и нейропротективным типом действия (Середенин СБ., Воронина ТА 2000). Найдены эффективные вещества среди производных пирролидона, пептидных аналогов пирацетама, ингибиторов пролилэндопептидазы, производных 3-оксипиридина, аминокислотных производных оксиникотиноилуксусной кислоты, и ряда других химических соединений (Ostrovskaya etal, 1994; Gudasheva, Voronina, Ostrovskaya, 1996). Внедрен в клиническую практику антиоксидант мексидол, обладающий ноотропной, анксиолитической и нейропротективной активностью (Дюмаев К.М. и соавт., 1994; Гарибова ТЛ., 1998; Воронина Т.А., 2002). На стадии клинических испытаний находятся препараты нооглютил (Воронина ТА. и соавт., 1992) и дипептид ноопепт (Воронина ТА, 2000; Островская Р.У. и соавт., 2002; Гудашева ТЛ. и соавт., 2003).

Относительно новым подходом отбора наиболее перспективных потенциальных лекарственных препаратов является использование компьютерных программ, позволяющих осуществить молекулярное моделирование и прогнозирование с помощью методов молекулярного сходства и кластеризации биологической активности неограниченного количества химических соединений (Авидон В.В., 1974; Поройков В.В. и соавт., 1996; Hansch, 1993; Brown et al., 1996; Lagunin, 2000; Douglas et al., 2001). В частности, с помощью компьютерной программы PASS и биологической оценки, выявлены вещества с противоязвенным, антигипертензивным и ангиотензивным эффектами (Мартынова Н.Б. и соавт., 2000; Филимонов Д.А., 2000; Лагунин А.А, 2001). Прогноз ноотропной и нейропротективной активности для новых веществ по их структурным формулам при помощи компьютерной программы PASS не проводился.

Методология изучения фармакологической активности потенциальных ноотропов и нейропротекгоров довольно хорошо разработана и включает исследование влияния веществ на обучение и память, в том числе нарушенные различными факторами.

травмами

состояния, вызванные экспериментальными ишемиувдродцнедмвддодо

I БИБЛИОТЕКА

-1- I СИт;

ш.

09 К»

мозга, холинергическим дефицитом и др. (Мирзоян Р.С. и соавт., 2000; Voronina, 1994; Smith et. al., 1997; Camps, Munos-Torrero, 2002 и др.). Между тем, у большинства экспериментальных моделей имеются существенные недостатки, в связи с этим представляется целесообразным разработка новых методов исследования. Особенно сложно моделирование геморрагических повреждений мозга, так как они приводят к высокой летальности животных, а используемые в эксперименте субарахноидальные гематомы, не всегда адекватны состояниям, наблюдаемым при интрацеребралыных геморрагиях (Choi, 1995; Hickenbottom et al., 1998).

Целью пастоящей работы является поиск веществ с ноотропной и нейропротективной активностью при использовании различных, традиционных методов и аналитической компьютерной программы «PASS».

Были поставлены следующие задачи:

1. Осуществить поиск веществ с антиамиестическим и противогипоксическим действием среди новых N-алкильных и N-ацильных производных 4-фенилпирролидона и ингибиторов пролилэндопептидазы;

2. Исследовать ноотропную активность веществ с высокой прогностической активностью полученных с использованием программы PASS;

3. Разработать систему тестов оценки нарушений функций ЦНС при нейродегенерации, вызванной интрацеребральной постгравматической гематомой (геморрагическим инсультом);

4. Изучить нейропротективный эффект наиболее перспективных соединений на модели геморрагического инсульта;

5. Исследовать свойства веществ на модели нейродегенеративной патологии, вызванной дефицитом холинергической системы;

6. Провести изучение эффектов нооглютила на моделях интрацеребральной посттравматической гематомы и холинергического дефицита.

Научная новизна исследования: Установлено, что модификация молекулы 4-фенилпирролидона, путем введения N-алкильных и N-ацильных заместителей приводит к образованию веществ с антиамнестическим эффектом в 45% случаев. Наиболее высокой антиамнестической и противогипоксической активностью обладает соединение под шифром ГИЖ283 - N-алкильное производное 4-фенилпирролидона-2 (анилид-2-оксо-4-фенил-пирролидин- 1-уксусной кислоты).

Впервые показана высокая прогностическая значимость компьютерной программы PASS для поиска веществ с ноотропной активностью. Установлено, что из 14 синтезированных соединений, различной структуры, с выявленным при использовании PASS высоким уровнем вероятности наличия ноотропной активности (Ра>05), 12 веществ (85,7%) обладают антиамнестическими свойствами на модели амнезии УРПИ, вызванной скополамином. При этом 56% соединений удовлетворяют жесткому критерию оценки эффекта - достоверному увеличению процента животных с полным сохранением памятного следа.

Разработан новый методический подход к оценке поведения и состояния животных с интрацеребральной посттравматической гематомой (ИПГ), вызванной деструкцией мозговой ткани в области capsula interna. Показано, что наиболее значимыми и отчетливыми нарушениями являются изменение неврологического статуса, ослабление процессов обучения, памяти и гибель животных; при этом динамика нарушений характеризуется усилением патологии с 1-го по 14-й день наблюдения. Выявлены новые соединения (AG 5, AG 29, Е 4172, ИФ 8), которые при введении однократно через 4 часа после операции обладают способностью уменьшать гибель, ослаблять неврологические

дефициты, улучшать процессы обучения и памяти у животных с ИПГ, что *' * ' 1 *

->■4 • ; -2-

свидетельствует об их нейропротективном эффекте. По своей активности новые соединения не уступают, а в некоторых случаях и превышают действие нимодипина.

На модели нейродегенеративных нарушений, вызванных дефицитом холинергической системы (субхроническое введение скополамина) выявлена способность новых соединений (ГИЖ283, ИФ 8) улучшать когнитивные функции и оптимизировать эмоционально - поведенческий статус животных.

Впервые показано вовлечение серотонинергической системы в нейрохимический механизм реализации анксиолитического и ноотропного эффектов ингибитора пролилэндопептидазы ИФ 8. Вещество в дозе 1 мг/кг (ноотропной) увеличивает содержание 5-оксииндолуксусной кислоты, а в дозе 5 мг/кг (анксиолитической) снижает уровень серотонина.

Показано, что ноотропный препарат нооглютил обладает нейропротективными свойствами на моделях патологий: интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) и дефицита холинергической системы, вызванного повторным введением скополамина.

Научно-практическая значимость работы: В результате проведенного исследования среди новых соединений выявлены вещества (ГИЖ283, ИФ 8, АО 4а, АО 4Ь), которые не уступают эталонным препаратам по активности и могут быть перспективны для дальнейшей разработки в качестве ноотропных и нейропротективных лекарственных средств. Методика оценки поведения и состояния животных с интрацеребральной посттравматической гематомой позволяет оценить комплекс патологических изменений, возникающих у животных после операции и может применяться для разработки и создания современных лекарственных средств эффективных при лечении повреждений мозга. Получены данные, расширяющие показания для клинического применения нооглютила.

Апробация работы: Результаты работы были представлены и докладывались на 3-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Суздаль, 2001), IX российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002); Международном съезде фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии» (Москва, 2003).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 7 тезисов, 2 статьи, кроме того, принято к печати 2 статьи, подано в печать 1 статья.

Объем и структура диссертации: Диссертация содержит введение, обзор литературы, раздел с описанием материалов и методов исследования, глав результатов

исследования, обсуждения, выводов, списка литературы. Работа изложена на......

страницах машинописного текста, содержит 26 таблиц и 25 рисунков. Библиографический указатель включает. .... .отечественных и.....иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование фармакологической активности новых соединений проводилось в опытах на животных, с использованием стандартных методов, применяемых для скрининга нейротропных препаратов с ноотропным и нейропротективным эффектом, согласно методическим рекомендациям, утвержденным Фармакологическим комитетом МЗ РФ (Воронина ТА., Островская Р.У., 2000; Воронина Т.А., Середенин СБ., 2000).

Исследования проводились на самцах белых беспородных крыс (180 - 220 г) и мышей (18 - 22 г) и крысах линии (200 - 230 г). Животные содержались в виварии

при свободном доступе к пище и воде и естественной смене дня и ночи. В исследовании были использованы новые производные 4-фенилпирролидона, синтезированные в ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН (Глозман О.М., Жмуренко Л.А.), ингибиторы пролилэндопептидазы (Золотов Н.Н., Позднев В.Ф.) и вещества синтезированные группой химиков в рамках гранта INTAS № 00-711 (руководители: Geronikaki Athina, Воронина Т.А., Поройков В.В.). В качестве препаратов сравнения использовали пирацетам (ноотропил, фирмы Polfa, Польша), нооглютил (ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН), нимодипин (Slovakofarraa Hlohovec). Вещества вводили внутрибрюшинно в растворе с Tween-80 за 30-40 минут до эксперимента. Контрольные животные получали физиологический раствор с Tween-80. Каждая группа состояла из 10-12 животных.

Изучение антиамнестических свойств соединений проводилось на модели условной реакции пассивного избегания (УРПИ) (Ader, 1987) на крысах в установке Passive avoidance фирмы Lafauette Instrument Co (США). В качестве амнезирующего фактора использовали скополамин в дозе 2 мг/кг, который вводили внутрибрюшинно за 15 минут до обучения.

Изучение влияния веществ на обучение на модели условного рефлекса активного избегания (УРАИ) проводили в челночной камере (шаттл-бокс) в установке Ugo Basile (Италия). Условным сигналом служил звук, после 10 секундного действия которого наносилось электроболевое раздражение. Сила тока подбиралась индивидуально для каждого животного. Обучение проводилось в двух вариантах: в течение одного сеанса (50 сочетаний) или 5-ти дней (по 20 сочетаний в день).

Изучение противогипоксического действия соединений осуществлялось в опытах на мышах на трех моделях гипоксии: гипобарической гипоксии в барокамере, гемической гипоксии и на модели гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме (Кораблев М.В., Лукиенко П.И., 1976; Nicolov, et al., 1987; Cumin, 1982). Острую гипобарическую гипоксию моделировали в проточно-вытяжной барокамере. Оценивали продолжительность жизни и процент выживших мышей по отношению к контролю, принятому за 100%. Гемическая гипоксия создавалась подкожным введением раствора нитрита натрия в дозе 300 мг/кг через 30 минут после введения веществ. При моделировании гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме регистрировали продолжительность жизни каждого животного, помещенного в герметично закупоренную стеклянную емкость объемом 200 мл.

Для оценки анксиолитического действия в опытах на крысах были использованы метод конфликтной ситуации (КС) (Середенин СБ., 2000; Vogel et al., 1971) и приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) (Pellow et. al., 1985).

Моделирование интрацеребральной посттравматической гематомы (ИПП -локального кровоизлияния в головном мозге проводилось согласно методике Макаренко А.Н. и соавт., (1999). С этой целью крысам, наркотизированным нембуталом (50 мг/кг, в/м) при помощи специального устройства (мандрен - нож) и стереотаксиса осуществляли деструкцию мозговой ткани в области capsula interna, с последующим (через 2-3 минуты) введением, в место повреждения, крови, взятой из-под языка животного (0,02 - 0,03 мл). Наблюдение за поведением и состоянием животных с ИПГ осуществляли в течение 14-ти дней после операции по методике описанной в разделе результаты исследования. Морфоконтроль проводили через 24 часа после операции. Микропрепараты, включающие сенсомоторную область коры, область геморрагического инсульта и талачуса окрашивали гемотоксилином-эозином, а также тионином по методу Ниссля. На фронтальных срезах учитывали состояние и морфологические особенности нейронов и перинейрональных

глиоцитов в 1У-У1 слоях нсокортекса обоих полушарий головного мозга. Было исследовано 30 срезов (360 полей зрения) в каждой группе животных. Учитывались нормально нормохромные (интактные) и гипер- или гипохромные нейроны, а также нейроны, подвергшиеся деструкции «клетки-тени». Окрашенные микропрепараты изучали и оценивали с использованием световых микроскопов (МБИ-6 и МБИ-15).

Моделирование холинергического дефицита (ХД) осуществлялось по методике (Буров Ю.В. и соавт., 1991; Воронина Т.А., 2000) с использованием длительного введения скополамина (схема. 1). Скополамин (1 мг/кг) вводили крысам в течение 20-дней, внутрибрюшинно (в/б). После отмены скополамина в течение 10 дней животным опытных групп в/б вводили исследуемые соединения, а контрольной группе - физиологический раствор. Затем, в течение пяти дней осуществляли обучение УРАИ, УРПИ и тестирование в ПКЛ.

Схема 1. Моделирование холинергического дефицита.

Определение содержания моноаминов (серотонин, норадреналин, дофамин) и их метаболитов в различных структурах мозга крыс (фронтальная кора, гипоталамус, стриатум, гиппокамп) проводили совместно с к.м.н. Кудриным СВ. и к.м.н. Клодт П.М. методом ВЭЖХ с электрохимической детекцией на стеклоуглеродном электроде при потенциале +0,85 В против Ag/AgQ электрода сравнения. Скорость потока подвижной фазы составляла 0,7 мл/мин (Мирошниченко И.И., 1988; Кудрин B.C. и соавт., 1988).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ПОИСК ВЕЩЕСТВ С НООТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ИЗУЧЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ 4-ФЕНИЛ ПИРРОЛИДОНА

Среди производных 4-фенилпирролидона были изучены N-алкильные производные анилиды 2-оксо-4-фенилпирролидин-1- уксусной кислоты (ГИЖ18; ГИЖ 283; ГИЖ286), производное 1-бензил-4-фенилпирролидона-2 (ГИЖ 179) и N-ацильные производные 4~фенилпирролидонов-2 (ГИЖ 183, ГИЖ 185, ГИЖ 280, ГИЖ 281, ГИЖ 257).

Изучение антиамнестической активности производных 4-фенилпирролидона-2 на модели амнезии УРПИ, вызванной скополамином показало, что соединение ГИЖ283 -N-алкильное производное 4-фенилпирролидона-2 - в дозах 1 и 10 мг/кг обладало выраженным антиамнестическим эффектом. Сходной, но меньшей активностью обладаю вещество под шифром ГИЖ286, увеличивая в дозе 1 мг/кг латентное время рефлекса (Р<0,05), а в дозе 10 мг/кг оба показателя поведения как латентное время, проведенное на освещенной площадке, так и количество животных, не зашедших в темную камеру (рис.1). Соединения ГИЖ 179 и ГИЖ 18 в используемых дозах антиамнестической активностью не обладали.

Рис.1. Антиамнестический эффект производных4-фенилпирролтдона-2

По оси ординат: количество животных, не зашедших в темную камеру установки при воспроизведении рефлекса (%); по оси абсцисс: исследуемые соединения. Н • достоверность отличий от контроля при Р<0,05; * - достоверность отличий от контроля со скополамином при Р<0,05; • Р<0,01 (Критерий х2).

Исследование антиамнестического эффекта N-ацильных производных 4-фенилпирролидона-2 показало, что вещество под шифром ГИЖ 183 с пиперидинметильным радикалом, было эффективным в дозе 10 мг/кг, статистически достоверно увеличивая латентное время рефлекса и количество животных, не зашедших в темную камеру установки при воспроизведении рефлекса. Соединение ГИЖ 185, с морфолинометильным радикалом обладало антиамнестическими свойствами в дозе 1 мг/кг. Соединения ГИЖ280, ГИЖ281 и ГИЖ257 оказались не эффективными (рис. 1).

Изучение влияния соединений на обучение условной реакции активного избегания (УРАИ) проводили в челночной камере. Каждое животное обучали УРАИ однократно при использовании 50-ти предъявлениях. Были исследованы соединения под шифрами ГИЖ 283 и ГИЖ 185 с выраженными антиамнестическими свойствами.

Установлено, что в контрольной группе животных к концу сеанса обучения, критерия обученности (8 из 10 условных последовательно выполненных реакций) достигли 10% животных (табл.1). ГИЖ 185 в дозе 1 мг/кг статистически достоверно увеличивал число условнорефлекторных избеганий на удар током, уменьшал количество отказов от выполнения рефлексов, но не влиял на количество обучившихся животных.

Под влиянием ГИЖ 283 в дозе 1 мг/кг значительно, статистически достоверно, увеличивалось количество животных, обучившихся условному рефлексу активного избегания до 60%. Соединение ГИЖ 185 в дозе 1 мг/кг увеличивало количество условнорефлекторных реакций (Р<0,05) и уменьшаю количество отказов. Вместе с тем, вещество не оказывало существенного влияния на количество обучившихся крыс.

Таблица 1. Влияние соединений ГИЖ 185 и ГИЖ 283 на обучение крыс рефлексу активного избегания в челночной камере

Вещество Дом, мг/кг Количество условно - рефлекторных реакций избегания на звук Количество животных достигших критерия обучеиностн, в*/. Количество отказов от выполнения рефлексов

Контроль — 3,7 ± 1,3 10 10,6 ±2.3

ГИЖ 283 1 10,8 ±4,6 60 # 10.8 ±6,6

ГИЖ 185 1 11,3 ±3,1 » 20 7.2 ± 1 4

* • достоверность отличий от контроля при Р<0,05 (U-критерий Манна-Уитни). # - при Р<0,01 (Критерий х2)

Противогипоксический эффект новых производных 4-фенилпирролидона

изучали на модели гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме Показано, что соединение под шифром ГИЖ 283, в дозе 50 мг/кг увеличивало продолжительность жизни мышей в 1.4 раза (Р<0,05), а ГИЖ 183, ГИЖ 185, ГИЖ 281. ГИЖ 18 и ГИЖ 286 не оказывали значительного влияния на продолжительность жизни животных (рис 2)

Рис.2 Противогипоксический эффект соединений на модели гипоксии с гиперкап-ниией в гермообъеме

По оси ординат продотаитель-ность жизни животных, в минутах, по оси абсцисс 1-контроль, 2-ГИЖ 283 (50 мг/кг). 3-ГИЖ 18 (50 мг/кг), 4-ГИЖ 286 (50 мг/кг), 5-ГИЖ 183 (50 мг/кг). 6-ГИЖ 185 (50 мг/кг), 7-ГИЖ

* - достоверность отличий от контроля при Р<0 05 (U-критерий Манна-Уитни)

Полученные данные свидетельствуют о том, что модификация молекулы 4-фенилпирролидона с введением N-алкильных и N-ацильных заместителей приводит к образованию веществ с выраженной антиамнестической активностью 7 соединений из 9 изученных обладают антиамнестическим эффектом в дозах от 1 до 10 мг/кг на модели амнезии УРПИ, вызванной скополамином При исследовании побочных, нежелательных эффектов показано, что все соединения в диапазоне доз от 1 до 50 мг/кг не вызывали угнетения ориентировочно-исспедовательского поведения и двигательной активности в открытом поле и не нарушали координации движений в тесте вращающегося аержня Наиболее высокой антиамнестической активностью, способностью улучшать обучение УРАИ и противогипоксическим эффектом обладало вещество ГИЖ283 - анилид 2-оксо-4-фенилпирролидин-1-уксусной кислоты

ИССЛЕДОВАНИЕ ИНГИБИТОРОВ ПРОЛИЛЭНДОПЕПТИДАЗЫ

Известно, что в механизме некоторых патологических состояний, таких как нарушение когнитивных функций, тревога, наркотическая зависимость, депрессии участвуют ферменты деградации нейропептидов в частности пролилэндопептидазы (ПЭП). Ранее было показано, что ряд соединений - ингибиторов ПЭП обладают выраженной антиамнестической и анксиолитической активностью (Воронина ТА., 1986, 2002; Золотое Н.Н., 1992; Гарибова ТЛ., 1993; Крайнева В А, 1997). Целью настоящего исследования явилось изучение спектра нсйротропной активности новых дипептидных соединений под шифрами ИФ 8 и ИФ 11. Синтез новых соединений был осуществлен д.х.н. Поздневым В.Ф. В опытах in vitro была показана их способность ингибировать ПЭП (Золотов Н.Н.). Были использованы следующие дилептиды Z-Met-Prn {ИФ 8), Z-Prd (ИФ 11), где Z - карбобензокси - защитная группа по N концу; Ргп - цианопирролидин; Prd -пирролидин.

Изучение антпамнестических свойств ИФ 8 и ИФ II на модели скополаминовой амнезии. Установлено, что ИФ 8 и ИФ 11 в дозах 0,5 и 1 мг/кг обладали выраженным антиамнестическим эффектом, существенно увеличивая латентное время рефлекса и число крыс, не зашедших в темную камеру (в 2,5 раза, Р<0,05) при воспроизведении УРПИ по сравнению с животными контрольной группы, получавшими скополамин (рис.3). В дозе 5 мг/кг антиамнестические свойства соединений ослабевали.

По оси ординат: количество животных, не зашедших в темную камеру установки при воспроизведении УРПИ (%). По оси абсцисс: ^контроль; 2-скополамин (2 мг/кг) 3-8 -скополамин + вещества: 3- ИФ 11

(0,5 мг/кг), 4-ИФ II (I мг/кг), 5-ИФ II (5 мг/кг), 6-ИФ 8 (0.5 мг/кг), 7-ИФ 8 (1 мг/кг), 8-ИФ 8

# - достоверность отличий от контроля при Р<0,05; * достоверность отличий от контроля со скополамином при Р<0,05; • • - Р<0,01 (Критерий X)

Исследование анксиолитической активности ингибиторов ПЭП. Для оценки анксиолитического действия веществ были использованы методика приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) и методика конфликтной ситуации (КС).

Исследование влияния вещества на поведение крыс в условиях методики ПКЛ показало, что ИФ 11, в дозе 5 мг/кг статистически достоверно увеличивал количество заходов в светлые рукава, общую двигательную активность, (количество переходов) и основной показатель поведения - время пребывания в светлых рукавах лабиринта (в 4

раза, при Р<0,05) (рис.4). Полученные данные свидетельствуют о выраженном анксиолитическом действии вещества.

Рис 4. Анксиолитический эффект соединений на модели приподнятого крестообразного лабиринта

По оси ординат: время, проведенное в открытых рукавах (сек.).

* - достоверность отличий от контроля при Р<0,05; •• • Р<0.01 (И-критерий Манна-Уитни).

Анксиолитический эффект ИФ 8 был выражен в большей степени и характеризовался значительным увеличением основных показателей - времени, проведенного животными в открытых рукавах установки и количества заходов в них.

Оценка анксиолитического действия веществ на другой модели тревоги, основанной на столкновении (конфликте) питьевой и оборонительной мотивации показала, что под влиянием соединения ИФ 11 в дозах 1 и 5 мг/кг у животных отмечалось недостоверное увеличение количества наказуемых взятий воды. В отличие от ИФ 11 соединение под шифром ИФ 8 в дозе 5 мг/кг оказывало более отчетливое анксиолитическое действие, увеличивая количество наказуемых взятий воды в 2,2 раза (Р<0,05). Анксиолитические свойства диазепама (2 мг/кг) были выражены в большей степени (рис.5).

Рис5. Анксиолитический эффект ИФ 8, ИФ 11 и диазепама в условиях методикиконфликтной ситуации По оси ординат количество наказуемых взятий воды. По оси абсиисс: 1-контроль, 2-ИФ 11 (1 мг/кг), 3-ИФ 11 (5 мг/кг), 4-ИФ 8 (1 мг/кг), 5-ИФ 8 (5 мг/кг), 6-диазепам (2 мг/кг). * - достоверность отличий от контроля при Р<0,05; •• - Р<0,01 (U-критерий Манна-Уитни).

1 2 3 4 5 6

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что ингибиторы пролилэндопептидазы ИФ 8 и ИФ 11 в дозах 0,5 и 1 мг/кг обладают выраженным антиамнестическим эффектом на модели скополаминовой амнезии. При увеличении дозы до 5 мг/кг антиамнестические свойства вещества ослабевают, а выявляется анксиолитическая активность. В отличие от диазепама соединения ИФ 8 и ИФ 11 в дозах превышающих эффективные в 2-20 раз не проявляют седативного и

миорслаксантного эффектов. По алтиамнестическому и анксиолитичсскому действию ИФ 8 имеет большую активность, чем ИФ 11.

Определение содержания моноаминов и их метаболитов в различных структурах мозга крыс. С целью выявления участия дофамин-, норадреналин- и серотонинергической систем в механизме реализации анксиолитического и антиамнестического эффектов ИФ 8 исследовалось влияние вещества на содержание моноаминов и их метаболитов в различных отделах головного мозга. ИФ 8 вводили крысам внутрь в дозах 1 мг/кг (ноотропной) и 5 мг/кг (анксиолитической) за час до эксперимента. Определение содержания моноаминов и их метаболитов в различных структурах мозга животных (фронтальная кора, гипоталамус, стриатум, гиппокамп) проводили методом ВЭЖХ с электрохимической детекцией. Определяли содержание норадреналина (НА), дофамина (ДА), сератонина (5-ОТ), 5-оксииндолуксусной кислоты (5-ОИУК), гомованилиновой кислоты (ГВК), 3,4 диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК).

Установлено, что соединение ИФ 8 в используемых дозах повышало содержание норадреналина и дофамина в коре и серотонина в стриатуме. Однако это повышение, хотя и было отчетливо регистрируемым, имело низкий уровень достоверности. Наиболее выраженный дифференцированный по дозам эффект вещества выявлялся в гиппокампе. Так, в малой дозе, 1 мг/кг ИФ 8 достоверно увеличивал, а в дозе 5 мг/кг снижал содержание серотонина и его метаболита 5-ОИУК (табл.2). Полученные данные свидетельствуют о вовлечении серотонинер1 ичеекой системы в нейрохимический механизм реализации анксиолитического и ноотропного эффектов ИФ 8.

Таблица 2. Влияние соединения ИФ-8 на содержание моноаминов в гиппокампе

Вещество нмоль/г ткани НА ДА 5-ОИУК ГВК 5-ОТ 50ИУК/ SOT

Контроль. Mean 0.830 0.087 2.346 0.290 3.024 0.770

S.E.M. 0087 0.013 0.261 0.070 0.333 0 026

ИФ-8 Меал 0.830 0.100 1.827 0.211 2.502 0812

-5 мг S.E.M. 0.076 0.010 0.086 0.058 0.156 0 031

ИФ-8 Mean 1.226 • 0 059 2.836 • 0.240 3 868« 0 853

-I мг S.E.M. 0.132 0.013 0.237 0.063 0.180 0019

• -достоверность отличий от контроля при Р<0,05 (Критерий Стьюдента)

ИЗУЧЕНИЕ НОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ С ЗАДАННЫМИ СВОЙСТВАМИ (по программе PASS)

Настоящий фрагмент исследования выполнялся по фанту INTAS № 00-711 (руководители: Geronikaki Athina, Воронина Т.А., Поройков В.В.). Предсказание спектра биологической активности было основано на анализе взаимосвязи "структура-активность" для веществ обучающей выборки и алгоритма оценки вероятностей наличия / отсутствия у исследуемого вещества различных видов биологической активности (Poroikov at al., 2000). Отбирались соединения, у которых в прогнозе спектра биологической активности ноотропные и нейропротективные свойства определялись с вероятностью Ра>50%, по программе PASS (версия 1,603 в интерпретации Pharma Expert). Результатом предсказаний явился список названий видов биологической активности с

соответствующими значениями вероятностей проявить (Ра) или не проявить (Pi) эффект. На основе этого прогноза были синтезированы новые соединения под шифрами: АО la AG2a,AG 2b, AG За, AG 4а, AG 4b, AG 5, AG 5a, AG 6, AG 9, AG 29, E 4172. Kish 307, Kish 253. Учитывая высокий прогностический потенциал этих соединений как ноотропов, (cognitive enchancers) и церебропротекторов, в эксперименте на животных исследовались их антиамнестическая и противогипоксическая активность. Исследование токсичности и побочных эффектов соединений проводилось проф. Dearden J. (Liverpool John Moores University, UK) и целью настоящего исследования не являлось.

Антиамнестический эффект соединений. Показано, что скополамин в дозе 2 мг/кг нарушал воспроизведение рефлекса пассивного избегания у крыс. Под действием скополамина 84% крыс забывали об ударе током в темной камере и с коротким латентным временем заходили в нее. При этом количество животных помнящих о ситуации и не заходивших в темную камеру составляло 8-16% (рис.6А., Б.).

Рис.6. Антиамнестический эффект соединений с Р>0,05. По показателю количества животных, не зашедших в темную камеру при воспроизведении УРПИ А.

По оси ординат: количество животных, не зашедших в темную камеру установки, при воспроизведении УРПИ (%); по оси абсцисс: 1-контроль, 2-скополамин, с 3-17 - скополамин + вещество:3-AG Ы, 4^ 2a, 5-AG2b, 6^ За, 7-AG4a, 8^ 4Ь, 9^ 5, Ю-AG5a, II-AG6, 12-AG9, 13^ 29,14-Е 4172, 15-Kish 307, 16-Kish 253, 17-пирацетам, в дозе 400 мг/кг (А), в дозе 600 мг/кг (Б). А - вещества в дозе 1 мг/кг, Б - в дозе 10 мг/кг. # - достоверность отличий от контроля при Р<0,05; * - достоверность отличий от контроля со скополамином при Р<0.05; ** -Р<0,01 (Критерий X2).

Установлено, что наиболее эффективными были соединения под шифрами АО 4а и АО 4Ь, которые в дозах 1 и 10 мг/кг уменьпали (Р<0,05) латентное время рефлекса и увеличивали (Р<0,01; 0,05) количество животных, не зашедших в темную камеру при воспроизведении УРПИ (табл.3).

Таблица 3. Изучение антиамнестического действия соединений с Ра>0,5 на модели амнезии УРПИ, вызванной скополамином

Латентное врема рефлекса, при воспроизведении УРПИ через 24 часа после обучения, в секундах

Вещества Эффекты исследуемых веществ в дозе:

1 мг/кг 10 мг/кг

Контроль 155,3 ±16,9 (физ раствор)

Скополамин 52,6 ±83* (2 мг/кг)

Ав1а 61,5 ±9,1 123,4 ±15,1$

Ав 2а 75,5 ± 12,3 126,4 ± 10,2$

АС За 68,1 ± 10,4 140,7 ±18,5$

Ав2Ь 157,8 ±22,1 $ 88,3 ± 13,0

Ав5 97,8 ±6,5$ 40,8 ± 6,2

А69 104,2*18,31 14,8 ± 3,0

Ав29 11,7± 1,7 68,3 ± 10,4$

Контроль 155 ±16,9 (физ раствор)

Скополамин 613 ±13,1* (2 мг/кг)

АС 4а < 151,1 ± 12,3 X 110,6 ±15.2$

Контроль 137,5 ± 15,1 (физ раствор)

Скополамин 53,3 ± 13,2 ♦ (2 мг/кг)

Ав4Ь 145,1 ±12,4$ 112,1 ±18,4$

АС 5а 155,7 ±15,8$ 91 ± 14,9

АС 6 87,1 ± 16,4 118.6± 12.6

Контроль 170,1 ± 10,1 (физ раствор)

Скополамин 26,8 ±6,1 *• (2 мг/кг)

Е4172 66,7 ± 13,8 93,9± 10,1 $

Контроль 169,1 ±8,1 (физ раствор)

Скополамин 30,3 ± 63 (2 мг/кг)

Как 307 24,8 ± 4,2 103.3 ±17,4$

Кик 253 87„5 ±9,8 533 ± 8,8

Контроль 160,1 ± 12,2 (физ.раствор)

Скополамин 40 ± 6,1 (2 мг/кг)

Пирацетам 753 ± 12,6 (400 мг/кг)

Пирацетам 91,6 ± 10,9$ (600 мг/кг)

* - достоверность отличий от контроля, при Р<0,05; ** - Р<0,01 (и - Критерий Манна Уитни); $ - достоверность отличий от контроля со скополамином, при Р<0,05; $$ - Р<0,01 ^ -

Критерий Манна Уитни)

Вещества под шифрами AG 2Ь, AG 9 и AG 5а были эффективны в дозе 1 мг/кг, статистически достоверно увеличивали оба показателя поведения. Эффективность AG Ы, AG б и Kish 307 проявлялась в дозе 10 мг/кг. Соединения AG 2a, AG За. AG 29 и Е 4172 в дозе 10 мг/кг статистически достоверно увеличивали латентное время рефлекса, а AG 5 такими свойствами обладало в дозе 1 мг/кг.

Таким образом, все изученные соединения кроме Kish 253 по совокупности эффектов в малой и высокой дозах обладают антиамнестическими свойствами. По

активности изученные вещества располагаются следующим образом: АО 4а = АО 4Ь > АО 2Ь -Ай 5а 9> Ай 1а = 6 = КиИ 307 > Аб 5 > Ав 2а = АСЗа = Е4172 = АО 29

Изучение противогипоксической активности соединений проводилось на моделях острой гипобарической гипоксии в барокамере и гемической гипоксии, вызванной нитритом натрия. Показано, что в условиях барокамеры вещества под шифрами AG 4а и AG 9 в дозе 1 и, особенно 10 мг/кг обладают выраженным противогипоксическим действием и значительно увеличивают продолжительность жизни животных. AG 4Ь, AG 5а и AG 6 оказались эффективными при использовании в дозе 10 мг/кг, а соединение AG За -в дозе 1 мг/кг (рис.7). У веществ AG 2a, AG 2Ь, AG 29, Kish 307, Е 4172 противогипоксический эффект на модели острой гипобарической гипоксии в используемых дозах не выявлялся.

Рис. 7. Влияние веществ на выживание мышей в условиях гипобарической гипоксии в барокамере

По оси ординат: время жизни животных, в относительных показателях (контроль=1), по оси абсцисс: 1-Контроль, 2-ЛО За (1 мг/кг), 3-ЛО 4а (1 мг/кг), 4-ЛО 4а (10 мг/кг), 5-Лв 4Ь (10 мг/кг), 6-Лв 5а (10 мг/кг), 7-ЛО 6 (10 мг/кг), 8-ЛО 9 (1 мг/кг), 9-Лв 9(10 мг/кг) 10-Л0 2а (10 мг/кг), 11-ЛО 2Ь (10 мг/кг), 12-Лв 29 (10 мг/кг), В-ЫэИ 307 (10 мг/кг) 14-Е4172 (10 мг/кг) * -достоверность отличий от контроля при Р<0,01 (и-критерий Манна-Уитни)

В условиях гемической гипоксии способностью увеличивать продолжительность жизни на фоне нитрита натрия обладали соединения под шифрами АО 5 и АО 29 в дозах 1 и 10 мг/кг (рис.8). Вещества под шифрами АО 5а, АО 6, Шяк 307, и Е 4172, в используемых дозах не влияли на продолжительность жизни мышей.

Рис. 8. Влияние веществ на выживание мышей в условиях гемической

гипоксии

По оси абсцисс:

продолжительность жизни

животных, в минутах. * - достоверность отличий от контроля при Р<0,05 ^-критерий Манна-Уитни)

Таким образом, при изучении антиамнестического эффекта соединений имеющих прогноз Ра по ноотропной активности от 0,51 до 0,75 установлено, что 98% (13 из 14) веществ обладают антиамнестическими свойствами - ослабляют амнезию УРПИ, вызванную скополамином. При этом восемь из четырнадцати соединений (56%) удовлетворяют жесткому критерию оценки эффекта в условиях этой модели -статистически достоверному увеличению количества животных, не зашедших в темную камеру установки при воспроизведении рефлекса. Показатель 56% соответствует коэффициенту вероятности биологической активности Ра>0,5. Это свидетельствует о высокой прогностической значимости проведенного метода отбора веществ с ноотропной активностью. Показано, что ряд изученных соединений обладает противогипоксическими свойствами. При сопоставлении наличия и выраженности антиамнестических и противогипоксических свойств веществ не выявлено их взаимосвязи. Эти результаты согласуются с полученными ранее данными в отношении ряда известных ноотропов. у которых не было выявлено корреляционной зависимости и между антиамнестическими и противогипоксическими свойствами (Воронина Т.А. и соавт., 1987). Вместе с тем, ряд веществ с ноотропной активностью обладает и нейропротективными свойствами, а противогипоксическое действие вещества может быть прогностическим признаком его нейропротективного эффекта. В связи с этим некоторые из изученных соединений были отобраны для дальнейшего углубленного исследования.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВ НА МОДЕЛИ ИНТРАЦЕРЕБРАЛЬНОЙ ПОСТТРАВМАТИЧЕСКОЙ ГЕМОТОМЫ (ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА)

Целью исследования явилось изучение нейропротективных свойств новых соединений ИФ 8, АО 5, АО 29, Е 4172 и нооглютила в сравнении с нимодипином на модели интрацеребральной посттравматической гемотомы (ИПГ) геморрагического инсульта предложенной Макаренко А.Н. и соавт., (1990). Для разносторонней оценки состояния животных после инсульта была разработана система тестов, позволяющая зарегистрировать нарушение когнитивных и двигательных функций, неврологические дефициты, уровень тревожности и адекватность поведения. Исследуемые вещества вводили крысам с ИПГ внутрибрюшинно через 3-3,5 часа после операции. На 1-е, 3-й, 7-е и 14-е сутки проводили регистрацию поведения и состояния крыс.

Влияние веществ на выживаемость животных с ИПГ. Установлено, что в группе крыс с геморрагическим инсультом в течение первых суток погибло 30%

животных, а к 14-му дню этот показатель достиг 64%. Высокой эффективностью при влиянии на выживаемость животных обладал нооглютил, который в дозе 10 мг/кг почти полностью предупреждал гибель крыс с геморрагическим инсультом. ИФ 8 уменьшал гибель животных с первых по седьмые сутки после операции, а на 14-е сутки число погибших крыс приблизилось к показателям в контрольной группе с ИПГ. Нимодипин, в дозе 0,1 мг/кг в значительной степени сокращал гибель животных. Наибольшей эффективностью среди исследованных веществ обладало соединение Е 4172, которое предупреждало гибель крыс на протяжении всего времени наблюдения. Таким образом, все исследуемые вещества обладали в разной степени выраженным эффектом, предупреждая гибель крыс с ИПГ (рис.9).

Рис 9. Влияние веществ на выживаемость крыс с ИПГ

По оси ординат: количество выживших крыс, % По оси абсцисс, дни после инсульта. • - достоверность отличий от группы животных и ГИ.

Влияние веществ на показатели неврологического дсфицита по шкале Stroke-index McGrow в модификации Ганушкиной И.В., (1977). Тяжесть состояния определялась по сумме соответствующих баллов. Отмечалось количество крыс с легкой симптоматикой до 2,5 баллов (вялость движений, слабость конечностей, односторонний полуптоз, тремор) и тяжелыми проявлениями неврологических нарушений от 3 до 10 баллов (манежные движения, парезы и параличи конечностей, а также боковое положение).

При оценке неврологических отклонений показано, что у всех животных с ИПГ и у 50% ложно оперированных крыс наблюдались легкие нарушения 1-й степени - вялость, замедленность движений, слабость конечностей. Тяжелые неврологические симптомы 2-й степени, проявляющиеся в виде манежных движений, парезов и параличей конечностей в группе ложно оперированных крыс не наблюдались, а у животных с ИПГ отмечались в 30-40% случаев. Нооглютил в дозе 10 мг/кг полностью предотвращал развитие тяжелых неврологических нарушений, а в дозе 20 мг/кг существенно ослаблял как легкие, так и тяжелые проявления. Нимодипин (0,1 мг/кг) значительно ослаблял тяжелые проявления неврологических нарушений и уменьшал выраженность слабых нарушений, которые, однако, регистрировались у 50% животных. ИФ 8 в дозе 1 мг/кг почти полностью устранял тяжелые проявления и ослаблял легкие. Соединение Е 4172 (10 мг/кг)

уменьшало слабые проявления неврологического дефицита и практически не оказывало влияния на тяжелые. Соединения под шифром AG 29 и AG 5 в одинаковой степени достоверно ослабляли выраженность неврологического дефицита первой степени у крыс (табл.4).

Таблица 4. Влияние веществ на неврологический дефицит у крыс после ИПГ (по шкале МсСгоу/)_

Неврологические симптомы Количество животных с различной неврологической симптоматикой, %

1 сутки после операции

Ложно опериро ванные ИПГ Ноогл. Нимод. ИФ8 Е 4172 АС 29 * АС 5

Дош, мг/кг

10 20 0,03 0,1 1 5 10 1 5

Вялость, замедленность движений 50 100 # 70 40* 70 50* 40* 20* 30* 20* 50*

Слабость конечностей > 50 80 50 50 60 20* 40* 50 80 20* 40*

Манежные движения 0 40 0 5* 40 20 10 0 30 10 30

Парез 1-4 конечностей 0 30 0 10 0 20 0 0 30 0 0

Паралич 1-4 конечностей 0 30 0 10 0 0 0 0 0 0 10

# - достоверность отличии от ложно оперированных крыс при Р<0,05 ф); * - достоверность отличий от животных с ГИ при Р<0,05 (х?)

Изучение влияния веществ на обучение и память крыс с ИПГ. Обучение УРПИ крыс с геморрагическим инсультом осуществляли через сутки после операции. Установлено, что при воспроизведении рефлекса через 24 часа после обучения ни в одной из исследованных групп животных (интактные, ложно оперированные и крысы с ИПГ) не наблюдалось нарушение рефлекса (табл.5).

Таблица 5. Влияние веществ^на воспроизведение УРПИу крыс с ИПГ

Воспроизведение УРПИ через:

Группа крыс Доза, мг/кг 24 часа (2-е сутки после операпни) 14 суток

Латентное время захода в темную камеру, (с) Количество животных, не зашедших в темную камеру, % Латентное время захода в темную камеру, (с) Количество животных, не зашедших в темную камеру, %

1 2 3 4 5 6

Интакгные - 164,1 ±23,5 80 126,4 ±28,1 60

Ложно оперированные - 142,1 ± 17,8 70 109,3 ±22,7 57

Инсульт - 128,8 ±17,2 60 30,1 ±8,1 № 8 л

Инсульт + нооглютил 10 129,2 ±19,7 60 52,2 ± 8.2 15

1 2 3 4 5 6

Инсульт + нооглютил 20 127,» ±17,8 62 60,2 ± 11,3 * 25

Инсульт + нимодипин 0.1 163 ±17 90 77,5 ± 12.8 * 33

Инсульт-»- ИФ8 1 121.2 ±28,8 62 30,8 ±10,0 20

Инсульт + Е 4172 10 139,0 ±21,1 70 72,5 ± 24,2 * 30

# - достоверность отличий от ложно оперированных животных при Р<0,05 (^критерий Манна-Уитни); Л - при Р<0,05 (х2). * - достоверность отличий от животных с ГИ при Р<0,05 (U-критерий Манна-Уитни)

При воспроизведении УРПИ через 14 сутох у крыс с ИПГ отмечалась почти полная амнезия навыка; только 8% крыс осуществляли рефлекс. В группе ложно оперированных животных этот показатель составлял 57% (табл.5). Все изученные вещества в используемых дозах не оказывали влияния на воспроизведение УРПИ через сутки, а через 14 суток у животных наблюдалось статистически достоверное увеличение латентного времени рефлекса - группы крыс, получавших нооглютил (20 мг/кг), нимодипин (0,1 мг/кг) и Е 4172 (10 мг/кг). ИФ 8 в дозе 1 мг/кг не проявлял антиамнестической активности в данном тесте.

Морфологический контроль показал, что у крыс с ИПГ с обеих сторон в области внутренней капсулы были обнаружены геморрагии, а в области неокортекса - обширные зоны ишемически измененных пикноморфных нейронов (клеток-теней). Нооглютил (введенный в дозе 10 мг/кг, в/б, через 3,5 часа) через сутки после операции хотя и не влиял на размер зоны поражения в области capsula interna, но заметно ослаблял ишемические изменения нейронов коры у крыс с геморрагическим инсультом. Гистологически в зоне ИПГ наблюдалось увеличение количества глиальных клеток и появление многочисленных нейтрофильных гранулоцитов.

Таким образом, проведенные исследования показали, что у крыс с ИПГ наблюдается выраженный неврологический дефицит, нарушение координации движений, ослабление процессов обучения и памяти, гибель животных. При этом отмечается углубление патологической симптоматики к 14-му дню наблюдения. Динамика ухудшения состояния и гибели крыс с ГИ может свидетельствовать о скрытой недостаточности компенсаторных реакций организма, нарастающих в определенные критические дни (3, 7, 14 сутки) послеоперационного периода и развитии сопутствующих осложнений (отек, набухание тканей, нарушение интрацеребралыюй гемодинамики, повышенного внутричерепного давления, ишемии мозга). Наибольшей эффективностью среди исследованных веществ на модели интрацеребральной посттравматической гематомы обладали новое соединение Е 4172 и нооглютил, которые снижали проявления неврологического дефицита, улучшали процессы обучения УРПИ и предупреждали гибель крыс с инсультом. Их эффект был сопоставим с действием нимодипина.

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ВЕЩЕСТВ НА ПОВЕДЕНИЕ И ПАМЯТЬ КРЫС С ДЕФИЦИТОМ ХОЛИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

Целью настоящего раздела работы явилось изучение влияния нооглютила и новых соединений ГИЖ 283, ИФ 8 (наиболее эффективные в тесте амнезии УРПИ при однократном введении скополамина) в сравнении с пирацетамом на нарушение когнитивных функций и эмоционально-поведенческого статуса в условиях экспериментальной модели холинергического дефицита, вызванного повторным ведением скополамина по специальной схеме.

Влияние веществ на обучение условному рефлексу активного избегания (УРАИ крыс с холинергическим дефицитом (ХД). Обучение животных УРАИ проводили в течение 5-ти дней. Установлено, что в контрольной группе крыс, получавших в течение всего эксперимента только физиологический раствор (пассивный контроль), количество условных избеганий в 1-й день обучения составило 5,6%, затем постепенно возрастало и к 5-му дню достигло 67,8% (табл.б.А., Б). При этом критерия обученности (семь условных реакций из 10) достигли 77% крыс.

Обучение УРАИ животных, получавших скополамин (группа активного контроля), проходило значительно медленнее. Так, если в первый день показатели поведения у этих животных не отличалась от показателей крыс пассивного контроля, то начиная со 2 дня у животных после скополамина происходило очень медленное нарастание числа условных избеганий. В результате к 5-му дню только 20% крыс достигали критерия обученности. Кроме того, у животных с холинергическим дефицитом, в процессе обучения не наблюдалось уменьшения количества отказов от выполнения рефлекса, как это было характерно для поведения крыс группы пассивного контроля (табл.б.А., Б).

Таблица 6. Влияние веществ на обучение УРАИ крыс схолинергическим дефицитом

ГРУППА ЖИВОТНЫХ ДНИ ОБУЧЕНИЯ

1 2 3 4 5

Л. РЕАКЦИИ ИЗБЕГАНИЯ, •/.

Пассивный контроль (физ. раствор) 5,6 ±3,1 32,8 ±8,7 46,7 ±10,2 57,2 ±8,4 67,3 ± 10,8

Активный контроль (после скополамина) 5,0 ±1,2 4,2 ± 1,7 ## 11,1 ±3,5* 222 ± 0,9 # 27.2 ± 6.8 ##

ГИЖ 283,1 мг/кг (после скополамина) 4,8 ±2,1 7,4 ±2,3 29.6 ± 7,5 46.5 ± 7.0 ♦ 59,4 ± 8.1 *

ИФ 8,0,5 мг/кг (после скополамина) 5.8 ±2^ 12,5 ±3,1 •* 38,0 ± 10,6* 48,3 ± 9,4 63.0 ± 10,7*

Пооглютил, 40 мг/кг (после скополамина) 5,5 ±2,7 23,0 ±7,0» 31,5 ±8,1 53,5 ± 11,2 * 58.0 ± 10,1 •

Пирацетам, 300 мг/кг (после скополамина) 4,3 ± 2,0 6,8 ±2,0 32,4 ± 9,0 50,1 ±12,4* 5б.4± 11,3 *

К РЕАКЦИИ ОТКАЗА,»/.

Пассивный контроль (фиг. раствор) 22,2 ± 6,6 23,3 ±6,1 114,6 ±5,0 5,7 ±2,0 3,9 ± 1,9

Активный контроль (после скополамина)- 49,0 ± 9,3 ЗбД ± 1 ОД 36,0 ± 10,1 35,0 ± 13,2 # 38,6 ± 12,1 #

ГИЖ-283,1 мг/кг (после скополамина) 33,1 ± 8,3 34,1 ± 12,0 16,8 ± 4,3 * 184 ±5,2 12,1 ±4,3»

ИФ 8,0,5 мг/кг (после скополамина) 25,0 ± 5,2 17,0 ±8,1 14,5 ±5,4 14,0 ±6,0» 10,6 ±4.1 •

Нооглютнл, 40 мг/кг (после скополамина) 31,5 ± 11,2 15,0 ±7,7 17,5 ±8,3 17,0 ±6,9 15,5 ±6,0*

Пирацетам, 300 мг/кг (после скополамина) 34,6 ± 10,4 30,1 ± 10,0 23,7 ±8,6 16,9 ±8,0 14,9 ±5,4*

# - достоверность отличий от пассивного контроля, при Р<0,05; ## - при Р<0,01. * - достоверность отличий от активного контроля, при Р<0,05; ** - при Р<0,01 (и-критерий Манна-Уитни)

ГИЖ 283 способствовал более быстрому обучению крыс с холинергическим дефицитом. На 3-й день количество условных реакций у этих животных значительно превышало показатели в группе активного контроля, а на 4 и 5 дни обучения отмечалось статистически достоверное увеличение реакций (в 2 раза, Р<0,05). Существенно возрастало и количество обучившихся крыс. ИФ 8 вызывал у крыс с холинергическим дефицитом улучшение обучения начиная со 2-го дня (Р<0,01). Достоверность отличий от

активного контроля регистрировалась также на 3 и 5-й дни обучения. Критерия обучепности на пятый день достигли 80% крыс. В процессе всего обучения у животных, получавших ИФ 8 отмечалось уменьшение количества отказов от выполнения рефлекса, особенио выраженное в последние два дня (Р<0,05) (табл.б.А., Б).

Позитивный эффект нооглютила на обучение УРАИ крыс с холинергическим дефицитом также был достаточно высок и характеризовался ускорением обучения по критериям количества реакций избегания и числа обучившихся крыс (70%). Эффект пирацетама в этих условиях был выражен в меньшей степени. Препарат ускорял обучение крыс, особенно на 4 и 5-й (Р<0,05). Вместе с тем, количество животных, достигших критерия обученности, составляло лишь 50%, и было статистически не достоверно. Нооглютил и пирацетам уменьшали количество отказов от выполнения рефлекса в процессе обучения УРАИ, однако этот эффект препаратов был выражен в меньшей степени в сравнении с ИФ 8 и ГИЖ 283.

Таким образом, длительное введение скополамина приводит к нарушению обучения УРАИ в челночной камере. Нооглютил, пирацетам и вещества ГИЖ 283 и ИФ 8 ослабляли эти нарушения.

Изучение влияния веществ на обучение УРПИ крыс с дефицитом холинергической системы. Установлено, что в контрольной группе крыс (пассивный контроль), при воспроизведении УРПИ через 24 часа после обучения 80% животных помнили об ударе током и не заходили в темную «опасную» камеру в течение всего времени наблюдения. Скополамин - хронически введенный (активный контроль) оказывал амнезирующее действие. При этом статистически достоверно уменьшалось латентное время рефлекса и количество животных не зашедших в темную камеру (40%, Р<0,05) (табл.7). В группе крыс, получавших после отмены скополамина ГИЖ 283, наблюдалось увеличение латентного времени рефлекса при воспроизведении УРПИ в 1,3 раза, а процент животных, не зашедших в темную камеру, увеличился в 1,5 раза. Вместе с тем, статистический анализ показал отсутствие различий между активным контролем и опытной группой с препаратом (табл.7).

Таблица 7. Влияние веществ на обучение УРПИ крыс с дефицитом холинергической системы

Вещество Воспроизведение рефлекса

Латентное время рефлекса, в сек. Количество животных, ие зашедших в темную камеру, */• (п-10)

Пассивный контроль 160,0 ± 14,8 90

Активный контроль (скополамнн) 78,9±19,6# 40 Ш

ГИЖ 283 (скополамнн) !04± 16,0 60

ИФ8 (скополамнн) 180 * 100**

Нооглютил (скополамнн) 149 ±20,7 80"

Пирацетам (скополамнн) 124,5 ±20,1 60

# - достоверность отличий от пассивного контроля при Р<0,05 (И-критерий Манна-Ушни); ## -при Р<0,05 (з^); * - достоверность отличий от активного контроля при Р<0,05 (И-кригерий Манна-Уитни); • *-при Р<0,05 {¿).

Соединение под шифром ИФ 8 обладало более выраженным эффектом, статистически достоверно увеличивая как латентное время рефлекса, так и количество животных, не

вошедших в темную камеру. Нооглютил, ослаблял амнезию УРПИ у крыс с дефицитом холинергической системы, значительно (в 2 раза, при Р<0,05) увеличивая число помнящих животных. Эффект пирацетама был выражен в меньшей степени.

Влияние веществ на эмоциональное состояние и анксиогенез у крыс с дефицитом холинергической системы в условиях методики ПКЛ показало, что субхроническое введение скополамина приводит к изменепию поведения. Так, у крыс активного контроля в сравнение с пассивным контролем наблюдалось уменьшение (в 10 раз, при Р<0,05) основного показателя - времени проведенного крысами в открытых рукавах при увеличении времени в закрытых рукавах и наблюдалось уменьшение двигательной активности регистрируемой по числу переходов. Комплекс этих изменений свидетельствует о повышенной тревожности крыс с холинергическим дефицитом. ГИЖ 283 не оказывал существенного влияния на поведение крыс с холинергическим дефицитом. Наблюдалось лишь увеличение двигательной активности, регистрируемой по количеству переходов в рукава (табл.8). Эффект соединения ИФ 8 характеризовался значительным увеличением (Р<0,05) основного показателя поведения крыс в ПКЛ -времени, проведенного животным в открытых рукавах, а пирацетам не оказывал статистически достоверных изменений поведения. В группе получавшей нооглютил по абсолютным величинам наблюдалось восстановление поведения нарушенного субхронически введенным скополамином, но эти показатели были статистически не достоверны.

Таблица 8. Влияние новых соединений на тревожность животных схолинергическим дефицитом вусловияхметодики ПКЛ

Показатели поведения Пассивный контроль Активный контроль ГИЖ 283 (1 мг/кг) ИФ 8 (0,5 мг/кг) Нооглютил (40 мг/кг) Пирацетам (300 мг/кг)

Латентное время перехода в любой из рукавов 8,4 ±3,1 11,1 ±1,4 9,2 ±2,6 7,8 ± 3,2 7,3 ±3,1 10,4 ± 1,9

Время, проведенное на центральной площадке 31,4 ±8,5 10,9 ± 4,0 # 26,1 ± 12Д 22,3 ± 10.1 22,7 ±8,4 29,3 ± 10,8»

Время, проведенное в закрытых рукавах 241,4± 10,9 277,4 ±4,8 257,8 ± 20,5 247,9 ± 30,9 264 ± 19,3 259,5 ±9,8

Время,проведенное в открытых рукавах 11,8 ±2,9 0,5 ±0,2» 5.1 ±2,0 16,6 ±3,1 • 6,3 ± 2,0 0,8 ± 0,5

Общее число переходов 6,3 ±2,0 2,6 ± 0,7 # 5,3 ± 1,9 • 6,5 ± 3,4 4,3 ± 0,7 * 4,8 ± 1,8

# - достоверность отличий от пассивного контроля, при Р<0,05 (U-критерий Манна-Уитни). • -достоверность отличий от активного контроля, при Р<0,05; * • - при Р<0,01 ^-критерий Манна-Уитни).

Таким образом, проведенные исследования позволили установить, что у крыс с дефицитом холинергической системы регистрируются нарушения обучения и памяти и повышенная тревожность. ГИЖ 283, ИФ 8 и нооглютил оказывают позитивное действие на нарушенные когнитивные функции на моделях УРАИ и УРПИ у крыс с холинергическим дефицитом, а ИФ 8 устраняет тревожность животных при тестировании в ПКЛ.

ВЫВОДЫ: 1.

Установлено, что среди новых производных 4-фенилпирролидона с N-алкильными и N-ацильными заместителями 45% соединений обладают антиамнестической активностью в дозах 1 и 10 мг/кг на модели амнезии условной реакции пассивного избегания, вызванной скополамином. Показано, что среди выявленных с помощью компьютерной программы PASS (версия 1,603 в интерпретации Pharma Expert) четырнадцати соединений с уровнем вероятности наличия ноотропной активности (Ра>0,5) 85,7% веществ в дозах 1 и 10 мг/кг обладают антиамнестическими свойствами.

Разработан новый методический подход оценки поведения и состояния животных с интрацеребральной посттравматической гематомой (геморрагическим инсультом). Показано, что у крыс после инсульта, вызванного деструкцией мозговой ткани в области capsula interna, наиболее выраженными нарушениями являются дефициты неврологического статуса, ослабление процессов обучения и памяти и гибель животных. При этом динамика нарушений характеризуется усилением патологии с 1-го по 14-й день наблюдения.

Выявлено, что новые соединения под шифрами AG 5,AG 29, Е4172, ИФ 8, а также нимодипин снижают гибель, ослабляют неврологический дефицит, улучшают процессы обучения и памяти у животных с интрацеребральной посттравматической гематомой, что свидетельствует об их нейропротективном эффекте.

Установлено, что соединения ГИЖ 283, ИФ 8 позитивно влияют на нарушения когнитивных функций в условиях методики амнезии условного рефлекса активного и пассивного избегания, а также на тревожность в приподнятом крестообразном лабиринте у крыс с дефицитом холинергической системы.

Показано вовлечение серотонинергической системы в нейрохимический механизм реализации анксиолитического и ноотропного эффектов ингибитора пролилэндопептидазы ИФ 8.

Экспериментально установлено, что ноотропный препарат нооглютил обладает нейропротективными свойствами на моделях интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) и дефицита холинергической системы.

2

3

4

5

6

7

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гелаева И П.. Гарибова ТЛ., Воронина Т.А., Бурд С.Г., Крайнева В.А., Кузнецова Е.А., Авакян Г.Н. Нарушение обучения и памяти крыс различных возрастных групп и возможности их коррекции // 3-я Международная конференция «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» 15-18 мая, Суздаль, 2001, стр. 43

2. Гарибова ТЛ., Воронина Т.А., Крайнева В.А., Гелаева И П.. Золотое Н.Н. Бенздиазепиновый синдром отмены и возможности его предупреждения и коррекции с помощью пептидергических веществ // 3-я Международная конференция «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» 15-18 мая, Суздаль, 2001, стр. 44

3. Крайнева В.А., Золотое Н.Н., Гачаева ИП.. Воронина Т.А., Гарибова Т.Л., Ингибиторы пролилэндопептидазы, обладающие аяксиолитической и антиамнестической активностью // 3-я Международная конференция «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» 15-18 мая, Суздаль, 2001, стр. 83

4. Капица И.Г., Гачаева ИП, Бурд С.Г., Гарибова ТЛ., Иноземцев А.Н., Крайнева В.А., Воронина Т.А., Авакян Г.Н. Коррекция нооглютилом нарушений поведения и памяти у крыс с дефицитом холинергической системы // Тезисы докладов IX российского национального конгресса «Человек и лекарство» 8-10 апреля, 2002, стр. 624

5. Крайнева В.А., Воронина Т.А., Гарибова ТЛ., Гачаева И П.. Капица И.Г., Иноземцев А.Н., Кузнецова Е.А. Влияние нооглютила на обучение и память крыс с дефицитом холинергической системы // Психофармакология и биологическая наркология. Итоги Всероссийской научной конференции «Нейрофармакология в XXI веке» посвященной 110-ти летаю со дня рождения СВ. Аничкова. Санкт-Петербург, 19-20 сентября № 3-4,2002,стр.410

6. Воронина Т.А., Гарибова ТЛ., Смирнов Л.Д., Кузнецова Е.А., Неробкова Л.Н., Гачаева ИП.. Крайнева В.А. Нооглютил - новый препарат с ноотропным и нейропротективным действием // Материалы XI международной конференции и дискуссионного научного клуба. Приложение к журналу «Открытое образование» «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», 2003г. Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 1-10 июня, 2003, стр. 83-85

7. Гарибова ТЛ., Воронина Т.А., Гачаева ИП., Крайнева В.А., Кудрин B.C., Клодт П.М., Золотое Н.Н. Изучение нейрохимического механизма анксиолитического и ноотропного эффектов ингибитора пролилэндопептидазы // «Фундаментальные проблемы фармакологии». Сборник тезисов 2-го Съезда Российского Научного Общества фармакологов, 21-25 апреля, Москва, 2003, стр. 120

8. Крайнева В.А., Воронина Т.А., Гачаева И.П.. Гарибова ТЛ., Мирзоян Г.Р. Изучение нейропротективного действия нимодипина на модели интрацеребральной гематомы (геморрагического инсульта), // «Фундаментальные проблемы фармакологии». Сборник тезисов 2-го Съезда Российского Научного Общества фармакологов, 21-25 апреля, Москва, 2003, стр. 272

9. Гарибова ТЛ., Гачаева И П.. Воронина Т.А., Крайнева В.А., Капица И.Г., Кириченко СВ., Макаренко А.Н., Мирзоян Г.Р., Кузнецова Е.А. Эффект нооглютила у крыс с интрацеребральной постравматической гематомой (геморрагическим инсультом) // Эксперим. и клин. Фармакол., Т. 66. № 2,2003, стр. 45-48

10. Поварова О.В., Гарибова ТЛ., Калсникова Е.И., Гачаева ИП.. Крайнева В. А., Медведев О.С, Воронина Т.А. Влияние фенил-Ьбутилнитрона (PBN), мексидола и нооглютила на зону ишемического поражения головного мозга и память у крыс с окклюзией средней мозговой артерии // «Экспериментальная и клиническая фармакология» принято к печати. 2003

11. Athina Geronikaki, John Deardcn, Dmitrii Filimonov, bring Galaeva. Taissia Garibova, Tatiana Gloriozova, Valentina Krajneva, Alexey Lagunin, Flinr Macaev, Guinadij Molodavkin, Vladimir Poroikov, Tatiana Voronina. Design of new anxiolytics: from computer prediction to synthesis and biological evaluation // J. Med. Chemistry, принято к печати. 2003

12. Athina Geonikaki, Evgueni Babaev, John Dearden, Wim Dehaen, Dmitrii Filimonov, Taissia Garibova, Irina Galaeva. Valentina Krajneva, Alexey Lagunin, Fliur Macaev, Guinadij Molodavkin, Vladimir Poroikov, Victor Soloutin, Alia Stepanchikova, Tatiana Voronina «Design of new cognition enhancers: from computer prediction to synthesis and biological evaluation // J. MedChemistry, 2003, подано в печать.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

ГВК - гомованилиновая кислота ГИ - геморрагический инсульт ДА - дофамин

ДОФУК - 3,4 диоксифенилуксусная кислота

ИПГ - интрацеребральная посттравматическая гематома

КС - конфликтная ситуация

НА - норадреналин

5-ОИУК - 5-оксииндолуксусная кислота 5-ОТ - серотонин (5-окситриптамин) ПКЛ - приподнятый крестообразный лабиринт УРАИ - условная реакция активного избегания УРПИ - условная реакция пассивного избегания ХД - холинергический дефицит

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 05.02.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,5. Тираж 120 экз. Заказ 146. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.

Актуальность темы: В последние годы в связи с ростом числа заболеваний, протекающих с нейродегенеративными изменениями и сопровождаемых нарушениями когнитивных функций (инсульты, сенильные деменции, в том числе болезнь Альцгеймера, старческое слабоумие, травмы мозга, интоксикации, инфекционные поражения центральной нервной системы) осуществляется активный поиск новых эффективных препаратов с ноотропным и нейропротективным действием. Одним из наиболее распространенных методов поиска является модификация структуры пирацетама (родоначальника группы ноотропов), путем изменения размеров цикла, строения боковой цепи, заместителей при экзоциклическом азоте (Воронина Т.А., 2000; Gumine, 1987), поиск среди антагонистов NMDA (Chazot and Hawkins, 1999; Brauner-Osborne, 2000; Hatton, 2001) и AMPA (Filial et. al., 1998; Brauner-Osborne, 2000) рецепторов глутаматергической системы, модуляторов AMPA рецепторов (ампакины) (Раевский К.С., 2002; Ingvar et. al., 1997; Hampson, 1998), среди лигандов мускариновых и никотиновых рецепторов холинергической системы (Levin, 1998; Hglen, 2001; Lachowicz et. al., 2001). Исследуются вещества, влияющие на различные стадии глутамат - кальциевого каскада, вызванного инсультом (Скворцова В.И., Гусев Е.И., 2001; Takasago et. al., 1998; Danbolt, 2001; Floyd et. al., 2002), в том числе антагонисты глутаматергической системы, блокаторы кальциевых каналов L-типа (Taya et. al., 2000; Cano-Abad et. al., 2001; Bogaert et. al., 2001), ингибиторы кальций -активируемых нейрональных протеиназ (Wang and Yuen, 1994; Kinloch et. al., 1999), ингибиторы цитокинов (Kinloch et. al., 1999), вещества, влияющие на нейротрофил ингибирующий фактор (Yiang et. al, 1999) и др.

В ГУ НИИ фармакологии в течение ряда лет осуществляется поиск веществ с ноотропным и церебропротективным типом действия (Середенин С.Б., Воронина Т.А 2000). Найдены эффективные вещества среди производных пирролидона, пептидных аналогов пирацетама, ингибиторов пролилэндопептидазы, производных 3-оксипиридина, аминокислотных производных оксиникотиноилуксусной кислоты, и ряда других химических соединений. (Воронина Т.А., 2000; Гудашева Т.А. и соавт., 2002; Островская Р.У. и соавт., 1994; Середенин С.Б., Воронина Т.А 2000). Внедрен в клиническую практику антиоксидант мексидол, обладающий ноотропной, анксиолитической и нейропротективной активностью (Дюмаев К.М. и соавт., 1994; Воронина Т.А., 2002). На стадии клинических испытаний находятся препараты нооглютил (Воронина Т.А. и соавт., 1992; Гарибова Т.Л., 2000) и дипептид ноопепт (Ostrovskaya et.al, 1994; Gudasheva, Voronina, Ostrovskaya, 1996).

Последнее десятилетие для отбора наиболее перспективных потенциальных лекарственных препаратов используются разнообразные компьютерные программы. В частности с помощью QSAR, 3D молекулярного моделирования, методов молекулярного сходства и кластеризации, успешно прогнозируют биологическую активность химических соединений. Одной из таких программ является PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) (Авидон В.В., 1974; Поройков В.В. и соавт., 1996; Hansch, 1993; Brown et. al., 1996; Lagunin, 2000; Douglas et. al., 2001). Прогноз компьютерной системы PASS основан на анализе взаимосвязей «структура-активность» (structure-activity relationships - SAR) с использованием обучающей выборки, содержащей большое количество разнородных химических соединений с различными видами биологической активности (более 1000 видов, включая основные фармакологические эффекты, механизмы действия и нежелательные свойства -мутагенность, канцерогенность, тератогенность и др.). Будучи обученной, PASS позволяет прогнозировать спектры биологической активности для новых веществ по их структурным формулам. С помощью программы PASS и биологической оценки, выявлены вещества с противоязвенным, антигипертензивным и ангиогензивным эффектами (Мартынова Н.Б. и соавт., 2000; Филимонов Д.А., 2000; Лагунин А.А, 2001).

Методология изучения фармакологической активности потенциальных ноотропов и нейропротекторов хорошо разработана и включает исследование влияния веществ на обучение и память, в том числе нарушенные различными факторами; гипоксии; состояния, вызванные экспериментальными ишемическими нарушениями и травмами мозга, холинергическим дефицитом и другие (Воронина Т.А., 2000; Мирзоян Р.С., 2000; Voronina, 1994; Smith et al., 1997; Camps, 2002). Между тем, у большинства экспериментальных моделей имеются существенные недостатки, в связи с этим представляется целесообразным разработка новых методов исследования. Особенно сложно моделирование геморрагических повреждений мозга, так как они приводят к высокой летальности животных, а используемые в эксперименте субарахноидальные геморрагии, не всегда адекватны патологиям, наблюдаемым у людей с интрацеребральными геморрагиями (Choi, 1995; Hickenbottom et. al., 1998).

Целью настоящей работы является поиск веществ с ноотропной и пейропротективной активностью при использовании традиционных методов и аналитической компьютерной программы.

Были поставлены следующие задачи:

1. Осуществить поиск веществ с антиамнестическим и противогипоксическим действием среди новых N-алкильных и N-ацильных производных 4-фенилпирролидона и ингибиторов пролилэндопептидазы;

2. Исследовать ноотропную активность веществ с высокой прогностической активностью полученных с использованием программы PASS;

3. Разработать систему тестов оценки нарушений функций ЦНС при нейродегенерации, вызванной интрацеребральной посттравматической гематомой (геморрагическим инсультом);

4. Изучить нейропротективный эффект наиболее перспективных соединений на модели геморрагического инсульта;

5. Исследовать свойства веществ на модели нейродегенеративпой патологии, вызванной дефицитом холинергической системы;

6. Провести изучение эффектов нооглютила на моделях интрацеребральной посттравматической гематомы и холинергического дефицита.

Научная новизна исследования: Модификация молекулы 4-фенилпирролидона, путем введения N-алкильных и N-ацильных заместителей приводит к образованию веществ с антиамнестическим эффектом в 45% случаев. Наиболее высокой антиамнестической и противогипоксической активностью обладает соединение под шифром ГИЖ 283 - N-алкильное производное 4-фенилпирролидона-2 (анилид-2-оксо-4-фенил-пирролидин-1-уксусной кислоты).

Впервые показана высокая прогностическая значимость компьютерной программы PASS, для поиска веществ с ноотропной активностью. Показано, что из 14 синтезированных соединений, различной структуры, с выявленным при использовании PASS высоким уровнем вероятности, наличия ноотропной активности (Pi<05), 12 веществ (85,7 %) обладают антиамнестическими свойствами на модели амнезии УРПИ, вызванной скополамином. При этом 56 % соединений удовлетворяли жесткому критерию оценки антиамнестического эффекта — достоверному увеличению процента животных с полным сохранением памятного следа.

Разработан новый методический подход к оценке поведения и состояния животных с интрацеребральной посттравматической гематомой, вызванной деструкцией мозговой ткани в области capsula interna. Показано, что наиболее значимыми и отчетливыми нарушениями являются изменение неврологического статуса, ослабление процессов обучения, памяти и гибель животных; при этом 7 динамика нарушений характеризуется усилением патологии с 1-го по 14-й день наблюдения. Выявлены новые соединения (AG 5, AG 29, Е 4172, ИФ 8), которые введенные однократно через 4 часа после операции обладают способностью уменьшать гибель, ослаблять неврологические дефициты, улучшать процессы обучения и памяти у животных с ИПГ, что свидетельствует об их нейропротективном эффекте. По своей активности новые соединения не уступают, а в некоторых случаях и превышают действие нимодипина.

На модели нейродегенеративных нарушений, вызванных дефицитом холинергической системы (субхроническое введение скополамина) показана способность новых соединений (ГИЖ 283, ИФ 8) улучшать когнитивные функции и устранять тревожность животных.

Впервые показано, вовлечение серотонинергической системы в нейрохимический механизм анксиолитического и ноотропного эффектов ингибитора пролилэндопептидазы ИФ8. Вещество в дозе 1 мг/кг (ноотропной) увеличивало содержание 5-ОИУК, а в дозе 5 мг/кг (анксиолитической) снижал уровень метаболита.

Впервые показано, что ноотропный препарат нооглютил обладает нейропротективными свойствами на моделях патологий: интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) и дефицита холинергической системы, вызванной повторным введением скополамина.

Научно-практическая значимость работы: В результате проведенного исследования выявлены новые перспективные соединения, различной структуры (ГИЖ 283, ИФ 8, AG 4а, AG 4b), обладающие антиамнестическими свойствами. Методика оценки поведения и состояния животных с интрацеребральной посттравматической гематомой позволяет оценить комплекс патологических изменений возникающих у животных после операции и может применяться для разработки и создания современных лекарственных средств, эффективных при лечении повреждений мозга. Получены данные, расширяющие показания для клинического применения нооглютила.

выводы

1. Установлено, что среди новых производных 4-фенилпирролидона с N-алкильными и N-ацильными заместителями 45% соединений обладают антиамнестической активностью в дозах 1 и 10 мг/кг на модели амнезии условной реакции пассивного избегания, вызванной скополамином.

2. Показано, что среди выявленных с помощью компьютерной программы PASS (версия 1,603 в интерпретации Pharma Expert) четырнадцати соединений с уровнем вероятности наличия ноотропной активности (Ра>0,5) 85,7% веществ в дозах 1 и 10 мг/кг обладают антиамнестическими свойствами.

3. Разработан новый методический подход оценки поведения и состояния животных с интрацеребральной посттравматической гематомой (геморрагическим инсультом). Показано, что у крыс после инсульта, вызванного деструкцией мозговой ткани в области capsula interna, наиболее выраженными нарушениями являются дефициты неврологического статуса, ослабление процессов обучения и памяти и гибель животных. При этом динамика нарушений характеризуется усилением патологии с 1-го по 14-й день наблюдения.

4. Выявлено, что новые соединения под шифрами AG 5, AG 29, Е 4172, ИФ 8, а также нимодипин снижают гибель, ослабляют неврологический дефицит, улучшают процессы обучения и памяти у животных с интрацеребральной посттравматической гематомой, что свидетельствует об их нейропротективном эффекте.

5. Установлено, что соединения ГИЖ 283, ИФ 8 позитивно влияют на нарушения когнитивных функций в условиях методики амнезии условного рефлекса активного и пассивного избегания, а также на тревожность в приподнятом крестообразном лабиринте у крыс с дефицитом холинергической системы.

6. Показано вовлечение серотонинергической системы в нейрохимический механизм реализации анксиолитического и ноотропного эффектов ингибитора пролилэндопептидазы ИФ 8.

7. Экспериментально установлено, что ноотропный препарат нооглютил обладает нейропротективными свойствами на моделях интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) и дефицита холинергической системы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В проведенном исследовании были использованы три подхода для поиска веществ и ноотропной и нейропротективной активностью. Это модификация молекулы родоначальника группы ноотропов пирацетама, исследование ингибиторов пролилэндопептидазы - веществ, воздействующих на одно из патогенетических звеньев нарушений мнестических и эмоционально - поведенческих функций, а именно пептидергического механизма, а также поиск эффективных веществ на основе компьютерного прогнозирования с использованием программы PASS.

Показано, что модификация молекулы 4-фенилпирролидона с введением N-алкильных и N-ацильных заместителей приводит к образованию веществ с выраженной антиамнестической активностью. Установлено, что 7 из 9 (77 %) изученных соединений обладают в дозах от 1 до 10 мг/кг антиамнестическим эффектом на модели амнезии УРПИ, вызванной скополамииом. При исследовании побочных, нежелательных эффектов в диапазоне доз от 1 до 50 мг/кг у соединений не было выявлено угнетения ориентировочно-исследовательского поведения, двигательной активности, нарушений координации движений. Наиболее высокой антиамнестической активностью, способностью улучшать обучение УРАИ и противогипоксическим эффектом обладало вещество ГИЖ 283 - анилид 2-оксо-4-фенилпирролидин-1-уксусной кислоты. Эффект этого вещества как потенциального ноотропа выявлялся в дозе 1-5 мг/кг, что значительно превосходит эффект пирацетама и не уступает анирацетаму.

Исследование ингибиторов пролилэндопептидазы показало, что вещества под шифрами ИФ 8 и ИФ 11 в дозах 0,5 и 1 мг/кг обладают выраженным антиамнестическим эффектом, а при увеличении дозы до 5 мг/кг антиамиестические свойства вещества ослабевают, а выявляется анксиолитическая активность. В отличие от бензодиазепиновых анксиолитиков соединения ИФ 8 и ИФ 11 в дозах превышающих эффективные в 2-20 раз не проявляют седативного и миорелаксантного эффектов. Более эффективным по антиамнестическому и анксиолитическому действию оказалось соединение ИФ 8. Подобное сочетание антиамнестического и анксиолитического действия отмечается и у ряда других препаратов. Например, антиоксидант производное 3-оксипиридина мексидол (Дюмаев и соавт., 1995), дипептид ноопепт (Островская Р.У., 2001; Гудашева Т.А., 2002). Механизм ноотропного и нейропротективиого действия мексидола, в значительной степени определяется его антиоксидантными свойствами, а анксиолитический эффект связан с модулирующим влиянием на ГАМК бензодиазепиновый рецепторный комплекс за

105 счет мембранотроиного действия препарата (Воронина Т.Л., 1998). Известно, что серотонинергическая система участвует в реализации анксиолитического эффекта ряда препаратов. В проведенных исследованиях показано, что соединение ИФ 8 повышало содержание норадреналина и дофамина в коре и серотонина в стриатуме. Однако это повышение, хотя и было отчетливо регистрируемым, имело низкий уровень достоверности. Наиболее выраженный дифференцированный по дозам эффект вещества выявлялся в гипиокампе. Так, в малой дозе, 1 мг/кг ИФ 8 достоверно увеличивал, а в дозе 5 мг/кг снижал содержание серотонина и его метаболита 5-ОИУК. Полученные данные свидетельствуют о вовлечении серотонинергической системы в нейрохимический механизм реализации анксиолитического и ноотропного эффектов ИФ 8.

Как отмечалось в обзоре литературы, для отбора соединений наиболее перспективных в качестве лекарственных средств используется разнообразные компьютерные методы. В частности для прогноза биологической активности и отбора веществ используют методы QSAR и 3D, методы молекулярного сходства и кластеризации. В настоящем исследовании применялась компьютерная программа PASS версия 1,603, основными составляющими которой являются: предоставление биологической активности, описание структуры химических соединений, база данных и знаний взаимосвязей структура - активность, алгоритм прогноза спектров биологической активности (Поройков и соавт., 2000). Предсказание спектра биологической активности осуществлялось группой исследователей во главе с профессором Поройковым В.В. на основе анализа взаимосвязей структура -активность, данные о которых хранятся в базе знаний SAR Base программы PASS. В рамках этой программы все соединения обучающей выборки представлены в виде набора MNA дескрипторов, и перечня видов биологической активности, проявляемых у каждого соединения. Для тестируемого соединения, в соответствии с набором его дескрипторов, вычислялись вероятности принадлежности к классу веществ, проявляющих / не проявляющих определенный вид биологической активности. Обучающая выборка PASS 1,603 включает 35154 химических соединений, описываемых 35712 различными MNA дескрипторами. Результат предсказания выдавался в виде списка названий видов биологической активности с соответствующими значениями вероятностей проявить (Ра) или не проявить (Pi) определенный вид активности. При этом если в прогнозе некоторый вид биологической активности был предсказан с вероятностью Ра>0,7, то, скорее всего, данное соединение проявит этот вид биологической активности в эксперименте, однако шанс, что это вещество является анатогом известного лекарственного

106 соединения, может оказаться также значительным. Если 0,5<Ра<0,7, то существует большая вероятность, что данное соединение проявит определенный вид биологической активности в эксперименте, но она будет меньшей, чем в первом случае, и это вещество менее схоже с известными лекарственными соединениями. Если Ра<0,5, то вероятность того, данное вещество проявит заданный вид биологической активности в эксперименте - меньше, но если ее наличие экспериментально подтвердится, то такое вещество может оказаться принципиально новой базовой структурой. В качестве тестовой выборки в программе была использована база данных биологически активных соединений MDDR (MDL Drug Data Report) 99,2 фирмы MDL Information System Inc, которая содержит структуры и данные по биологической активности веществ, используемых и разрабатываемых в качестве потенциальных лекарственных средств. В MDDR представлена информация из патентов, конференций, журналов и сообщений компаний о 105372 соединениях, которые включают 98184 оригинальных структур. Согласно программе гранта INTAS (№ 00-711) химиками синтетиками были предложены около 1000 структур соединений, с предполагаемой иоотропной и нейропротективной активностью, а аналитики осуществили с помощью программы PASS прогноз их спектров биологической активности. Были отобраны и синтезированы 14 соединений различной структуры с заданными ноотропными и нейропротективными свойствами с Ра от 0,51 до 0,75. При изучении антиамнестического эффекта этих соединений установлено, что 98% (13 из 14) веществ обладают антиамнестическими свойствами - ослабляют амнезию УРПИ, вызванную скополамином. При этом восемь из четырнадцати соединений (56%) удовлетворяют жесткому критерию оценки эффекта в условиях этой модели - статистически достоверному увеличению количества животных, не зашедших в темную камеру установки при воспроизведении рефлекса. Показатель 56% соответствует коэффициенту вероятности биологической активности Ра>0,5.

Анализ возможного механизма, антиамнестического эффекта изученных соединений, с помощью PASS показал, что все соединения имеют структурное сходство с веществами, механизм действия которых опосредуется через холинергическую систему, с уровнем вероятности от 15 до 47%. Однако корреляционной зависимости между выраженностью антиамнестического эффекта и показателями уровня вероятности участия. холинергической системы в механизме антиамнестического действия соединений не было выявлено (г=0,25). Вместе с тем, согласно прогнозу PASS в механизме антиамнестического действия изученных соединений могут принимать участие и другие системы, ответственные за процессы обучения и памяти, например ГАМК-ергическая и глутаматергическая.

107

Как отмечалось в обзоре литературы, наиболее распространенной формой когнитивных расстройств являются деменции альцгеймеровского типа. Болезнь Лльцгеймера характеризуется хронически прогрессирующим течением и проявляется неукоснительным снижением когнитивных функций и умственных способностей. В процессе течения болезни морфологически регистрируется атрофия головного мозга, отложение сенильных бляшек, состоящих, в основном, из р-амилоида, нейрофибриллярные клубки, утрата синоптических связей, дегенерация преимущественно холинергических нейронов в ядрах базальных отделов переднего мозга. Согласно современной литературе предполагается, что процесс дегенерации нейронов запускается в результате нарушения регуляции различных нейротрофических факторов или их рецепторов, и это приводит к прекращению нейротрофической стимуляции определенных популяций нейронов. Факторы роста нейронов представляют собой белки, которые обладают способностью вызывать дифференцировку нейронов и поддерживать специфические функции нервных клеток. Отсутствие поступления в клетку таких факторов приводит к стимуляции экспрессии генов, которые запускают активный процесс клеточной смерти (апоптоз).

В связи с ключевой ролью холинергической системы в патогенезе ряда когнитивных расстройств, в экспериментальной медицине для моделирования амнезии используются различные модели нарушения функций этой системы, одной из наиболее адекватных моделей болезни Лльцгеймера может быть билатеральное повреждение ядер Мейнерта с помощью нейротоксина AF-64, различные модели скополаминовой амнезии (Prestor et al., 1988; Molchan et al., 1992). В настоящем исследовании для моделирования амнезии был использован М-холиноблокатор скополамин, который как при однократном, так и при субхроническом двухнедельном применении вызывал нарушение обучения и памяти, это согласуется с данными литературы (Izquierdo, 1989; Magnani et al., 1992). В настоящее время выявлено пять подтипов мускариновых рецепторов М1-М5 (Wess, 1996). Многие исследования, основанные на поведении животных свидетельствуют о том, что изменения обучения и памяти опосредуются через М| подтип мускариновых рецепторов (Hanter,. 1988;

Messer et al., 1990). Известно, что мускариновые М| рецепторы локализованы постсинаптически и их активация прямыми или не прямыми агонистами уменьшает ослабление когнитивных функций, связанных с ранними признаками болезни

Лльцгеймера (Farlow et al., 1992; Soncrant et al., 1993). В ЦНС мускариновые рецепторы Мг подтипа распространены преимущественно на пресинаптических терминалях ацетилхолиновых рецепторов и являются ауторецепторами (регулируют высвобождение ацетилхолина), т.е. их стимуляция приводит к уменьшению

108 холинергической нейропередачи (Pohorecki et.al., 1988; Stillman et.al., 1996). Альтернативный механизм через который можно осуществить усиление холинергической нейропередачи это облегчение высвобождения ацетилхолина из пресинаптических терминалей путем блокады Мг подтипа мускариновых рецепторов селективными антагонистами, в частности, ингибиторами обратного захвата. Показано, что блокада мускариновых рецепторов М2 подтипа вызывает увеличение выброса ацетилхолина и тем сильнее, чем большим аффинитетом к Мг рецептору обладает антагонист (в мозге крыс) (Billard et al., 1995). Скополамин - неселективный мускариновый антагонист в дозах (0,1-10 мг/кг, в/б.) вызывает дозо-зависимое увеличение выброса ацетилхолина в сриатуме (показано с помощью микродиализа) (Carey et al., 2001). Хотя скополамин и увеличивает выброс ацетилхолина он вызывает нарушение когнитивных функций за счет блокады постсинаптических М| рецепторов (Garey et al., 2001).

В настоящем исследовании была использована методика получения дефицита холинергической системы путем длительного двадцатидневного введения скополамина с последующей десятидневной отменой (схема 2.2, материалы и методы). Согласно данным Бурова Ю.В. и соавторы, (1991) пик снижения функций холинергической системы наблюдается только через десять дней после отмены скополамина, а непосредственно после окончания длительного введения скополамина отмечалось не ухудшение, а улучшение памятного следа. Существует предположение (Островская Р.У., 1995), что происходит это в связи с тем, что вследствие длительной блокады холинергических рецепторов, в результате включения механизмов обратной связи, развивается повышение плотности и афинности холинорецепторов, а к 10-му дню, после отмены скополамина, в результате ускоренного связывания наличного ацетилхолина развивается холинергический дефицит, приводящий к выраженному длительному нарушению познавательных функций и, как показано в нашем эксперименте, к ухудшению условно-рефлекторной деятельности. Не исключено, что в этом процессе принимают участие не только постсинаптические, но и пресинаптические М2 рецепторы, блокада которых скополамином (Carey, 2001) приводит к нарушению захвата ацетилхолина.

В проведенных исследованиях на модели длительного применения скополамина было показано, что у крыс с дефицитом холинергической системы регистрируются нарушения обучения, памяти и повышенная тревожность. Нооглютил, пирацетам и его аналог новое соединения ГИЖ 283, а также ингибитор пролилэндопептидазы ИФ 8 оказывали позитивное действие на нарушенные когнитивные функции на моделях УРПИ и УРАИ у крыс с холинергическим

109 дефицитом. Кроме того, ИФ 8 устранял тревожность животных при тестировании в ПКЛ.

Известно, что пирацетам широко применяется в комплексной терапии у больных с ишемическим инсультом (Nikenbottom, 1998; Orgagozo, 1999; Ricci et.al., 2000), черепно-мозговой травмой (Goscinsski et al., 1998) и при последующей реабилитационной терапии (Huber, 1999; Kessler et.al., 2000), а также в качестве поддерживающей терапии при некоторых нейродегенеративных процессах (старческом слабоумии, болезни Альцгеймера и др.). Экспериментальные исследования подтверждают способность пирацетама оказывать нейропротективный эффект, механизм которого, в основном, связан с увеличением под его влиянием потребления глюкозы и кислорода в ишемизированной поврежденной зоне ЦНС (Goscinski et al., 1998; Gulieave, 1998). С другой стороны предполагается, что причиной нейродегенеративных заболеваний, подобных деменциям альцгеймеровского типа могут быть нарушения энергетического метаболизма. Эта теория подтверждается тем, что у больных страдающих болезнью Альцгеймера определяется пониженный уровень экспрессии гена GLUT-1 - соединения, которое является транспортером глюкозы через гематоэнцефалический барьер. Это приводит к снижению уровня доставки глюкозы к головному мозгу, т.е., к дефициту питатеьного субстрата, который необходим для его нормального функционирования. Устойчивый дефицит энергии может привести к продолжительному высвобождению возбуждающих нейротрансмиторов, таких как глутамат. И это в свою очередь может вызвать возникновение ряда эксайтотоксических реакций, связанных, например, с внутриклеточным накоплением кальция и с избыточной продукцией свободных радикалов и, в конечном счете, может привести к гибели клеток. В связи с вышеизложенным, помимо терапии f направленной на восполнение дефицита ацетилхолина при деменциях альцгеймеровского типа используют ноотроиные препараты, в частности пирацетам и родственные ему соединения, которые повышают интенсивность церебрального метаболизма глюкозы и за счет снабжения головного мозга энергией происходит улучшение ряда когнитивных характеристик.

Клинический эффект пирацетама реализуется, как правило в больших дозах (до 24 гр./день). В экспериментальных исследованиях в опытах на животных, в основном используются дозы от 200 до 800 мг/день. Наиболее эффективным соединением из группы производных 4-фенилпирролидона было вещество под шифром ГИЖ 283. Помимо выраженных антиамнестического и противогипоксического эффектов это соединение ослабляло нарушения поведения и памяти крыс на фоне холинергического дефицита. Причем позитивный эффект регистрировался в дозе 1 мг/кг. Таким образом,

НО полученные данные свидетельствуют о преимуществах нового соединения перед пирацетамом, как потенциального ноотропа и нейропротектора.

Известно, что процесс нейродегенерации при болезни Лльцгеймера распространяется на корковые глутаматергические нейроны, а также на различные пептидергические нервные клетки. Несмотря на то, что установлена прямая связь между утратой холинергической инервации и расстройствами обучения и памяти, есть доказательства возможности возникновения на ранних этапах болезни первичной дегенерации корковых глутаматергических нейронов, что может привести к вторичной дегенерации холинергической системы (Maragos 1987; Terry 1994; Jellinger, 1994). Вследствие этих представлений, можно предположить почему нооглютил, механизм действия которого опосредуется глутаматергической системой эффективен на модели холинергического дефицита. Эффективность ИФ 8 в этих условиях, по-видимому, обусловлена его взаимодействием с пролилэндопептидазой. Об этом свидетельствуют данные, полученные Золотовым Н.Н. и соавторами (1992, 1995) в которых показано повышение активности ПЭП в коре и гиппокампе мозга крыс, а также установлена связь между этим явлением и состоянием холинергической системы (Zolotov, 1993).

Как отмечалось в обзоре литературы, для оценки нейропротективного действия веществ разработаны и используются модели глобальной, локальной ишемии мозга, модели геморрагического инсульта, различных травм мозга. (Воронина Т.Д., 2000; Мирзоян Р.С., 2000; Yackowski et al., 1990; Smith et al., 1997). В настоящем исследовании была использована новая модель оценки нейропротективного действия веществ - модель интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта), разработанная Макаренко Л.Н. и соавторами (1990). В результате проведенных исследований показано, что у крыс с ГИ наблюдались выраженный неврологический дефицит, нарушение координации движений, ослабление процессов обучения и памяти, гибель животных. При этом отмечалось углубление патологической симптоматики к 14-му дню наблюдения. Динамика ухудшения состояния и гибели крыс с ГИ может свидетельствовать о скрытой недостаточности компенсаторных реакций организма, нарастающих в определенные критические дни (3, 7, 14 сутки) послеоперационного периода и развитии сопутствующих осложнений (отек, набухание тканей, нарушение интрацеребральной гемодинамики, повышенного внутричерепного давления, ишемии мозга), (Макаренко Л.Н., 1990; Jackowski et al., 1990). В настоящем исследовании, ложно оперированные животные демонстрировали существенные отличия почти по всем регистрируемым показателям, как от интактньгх животных, так и от крыс с ГИ что связано, по-видимому, с реакцией на травмирование покровных тканей и черепа, при проведении

III ложной операции. Вместе с тем, при сравнении ложно оперированных животных и крыс с ГИ, у последних отмечалось существенной ухудшение состояния и нарастание тяжести симптоматики. Это подтверждает определяющее значение геморрагического компонента в общей картине моделируемой патологии. Морфологические показатели также свидетельствовали о нейродегенеративных изменениях в зоне поражения.

Нооглютил, при введении животным однократно через 3-3,5 часа после операции обладал выраженным нейропротективным действием, предотвращая гибель крыс и существенно ослабляя нарушения неврологического статуса, улучшая память животных с посттравматической гематомой. При этом в дозе 20 мг/кг препарат обладал более отчетливым эффектом, предупреждая нарушения, памяти, а в дозе 10 мг/кг - сильным протективным действием в отношении неврологического дефицита и гибели животных, что сочеталось с менее выраженным влиянием на процессы обучения и памяти. Расслоение эффектов нооглютила в зависимости от дозы у животных с ГИ может свидетельствовать об особенностях моделируемой патологии, стадийности процесса и о наличии у нооглютила широкого спектра нейропротективного действия.

В неврологической клинике фармакотерапия последствий ГИ направлена на нормализацию гемокаогуляции и гемореологии, защиту нервной ткани в условиях нарастающей гипоксии, предотвращение нейротоксического действия медиаторов, предупреждение развития дезинтеграции головного мозга, восстановление баланса нейромедиаторов и другие (Е.И. Гусев, 2001; Jackowski, 1990; Choi, 1995; Obrenovitch, 1996). Нооглютил в условиях различных моделей церебральной патологии (ишемия мозга, черепно-мозговая травма, гипоксии мозга, вызванные различными факторами) обладает противоотечным действием, нормализует кровоснабжение мозга, устраняет межполушарную асимметрию кровоснабжения, корректирует биоэлектрическую активность при ишемии (Новиков В.Е, 1997; Алиев И.И., 1999; Воронина Т.А, 2000). Совокупность имеющихся в литературе данных и полученных в настоящем исследовании результатов позволяет заключить, что нооглютил осуществляет свой нейропротективный эффект, воздействуя различные звенья патологической системы, формирующейся вследствие острых нарушений мозгового кровообращения при ишемических и геморрагических инсультах. Нейропротективное действие нооглютила подтверждено в исследованиях срезов головного мозга крыс с ГИ, получавших нооглютил.

Как отмечалось в обзоре литературы нейрохимический, механизм действия нооглютила опосредован взаимодействием с глутаматергической системой. Широкое представительство глутаматергических рецепторов в гиппокампе и новой коре

112 структурах напрямую связанных с формированием, хранением и извлечением следа памяти и механизмами обучения, явилось основой изучения влияния глутаматергических соединений на процессы обучения и память (Абрамец И.И., 1994, Lisman, 1999; Lee et al., 2000). Показано, что преимущественная активизация не NMDA рецепторов при низкочастотной стимуляции, соответствует «нормальным» условиям деятельности мозга, в то время как высокочастотная стимуляция приводит к активации NMDA рецепторного комплекса и связанна с переходом нейрона к иному уровню функциональной зависимости, необходимому для фиксации памяти. Было установлено так же, что высокочастотная спайковая активность афферентных волокон гиппокампа наблюдается: и в естественных условиях, когда требуется пластическая перестройка нейрона (фиксация новой информации, эмоциональная реакция и т.д.). В экспериментах с использованием селективных антагонистов различных подтипов глутаматных рецепторов выявлено преимущественное участие в этом процессе NMDA рецепторного комплекса (Collingridge, 1990). Характер ответов нейронов на высокочастотную стимуляцию носит двоякий характер: часть клеток (физического типа) на длительное время (часы, минуты) переходит в состояние эпилептиформной активности, более характерное для работы в условиях отсутствия факторов, подавляющих активность NMDA рецептора (ионы Mg2+, ингибирующие влияние ГАМК). У другой части нейронов (тонического типа) после нескольких спайковых разрядов возникала стойкая деполяризация мембраны, сохраняющаяся на протяжении нескольких часов и даже суток. Этот тип реакции клеток гиппокампа получил название долговременной потенциации (LTP) и лег в основу объяснения процессов нейрональной пластичности и фиксации памятного следа (Мотин В., 2000; Burgard, 1993, Danysz et al., 1995, Parsons et al., 1998).

Позитивное фармакологическое воздействие ноотропных препаратов на когнитивные функции в опытах на; поведенческих моделях имеет электрофизиологические корреляты не только в форме усиления транскаллозальных вызванных потенциалов, но и в виде облегчения потенциации и пролонгирования LTP в гиппокампе. Нооглютил, как и ряд других ноотропов (пирацетам, этимизол) в срезах гиппокампа пролонгировал NMDA - зависимую LTP в синапсах, образованных аксонами перфорантного пути и на нейронах зубчатой извилины (Абрамец И.И., 1994; Комиссаров И.В., 2001). Этими же авторами выявлен АМРА модулирующий эффект нооглютила. Так, под влиянием препарата, в концентрациях близких к эффективным антиамнестическим (4, 6, 30 мкМ) при записи возбуждающего постсинаптического потенциала нейронов зубчатой извилины, вызванного электростимуляцией перфорантного пути, регистрировался существенный прирост максимальных амплитуд

113 потенциала. В этом отношении нооглютил сходен с рацетамами: пирацетамом, анирацетамом (Абрамец И.И., 1994; Gouliaev, 1994).

Таким образом, основной механизм действия нооглюгила опосредован влиянием на АМРА подтип глутаматных рецепторов и неспецифическим связыванием с NMDA подтипом. АМРА потенциирующий эффект ноотропов зависит от концентрации и при достижении максиматьных позитивных значений снижается. В связи с этим, в высоких концентрациях ноотропы обладают депотенциирующим действием и этим исследователи объясняют, почему эти препараты не только не усиливают, но и противодействуют нейродегенеративным (эксайтотоксическим) повреждениям мозга, наблюдаемым при избыточной функции глутаматергических процессов (Комиссаров И.В., 2001).

Согласно данным литературы вещества, механизм действия которых связан с модулирующим влиянием на АМРА рецепторы глутаматной системы ампакины, обладают в эксперименте на животных ноотропными свойствами, Улучшают процессы обучения и памяти (Arai et al., 1994; Hampson et al., 1998). Нооглютил условно можно также отнести к препаратам такого типа действия. Выявленный у нооглютила нейропротекторный эффект открывает перспективу поиска нейропротективной активности у известных ампакииов.

Показано, что выраженным нейротропным эффектном обладает и ингибитор пролилэндопептидазы, соединение под шифром ИФ 8. Вещество ослабляло, вызванные интрацеребральной посттравматической гематомой нарушения обучения и памяти и неврологический дефицит. Кроме того, ИФ 8 улучшат память и уменьшат повышенную тревожность у крыс с холинергическим дефицитом. Полученные результаты позволяют предполагать, что у этого соединения помимо ноотропного определяется и нейропротекторное действие. Согласно данным литературы релизинг фактор тиротропного гормона, являющийся одним из физиологических субстратов пролилэндопептидазы оказывает положительное влияние на течение болезни Альцгеймера через взаимодействие с холинергической системой. Взаимодействие TRH с холинергическими нейронами включает, по-видимому, как пре-, так и постсинаптические эффекты: на пресинаптическом уровне пептид облегчает холинергическую нейропередачу, стимулируя скорость оборота ацетилхолина, на постсинаптическом - TRH усиливает возбуждающий эффект ацетилхолина на уровне нейронов коры (Winokur, 1978; Renaudet al., 1979). По данным Nikajima и соавторов, (1992) стимулирующий эффект ингибиторов пролилэндопептидазы на TRH -индуцированное высвобождение ацетилхолина может оказывать положительное влияние при пониженной функции ацетилхолинергической системы мозга. В свете

114 этих представлений, позитивный эффект ИФ 8 на модели холинергического дефицита может быть связан с его опосредованным влиянием через пролилэндопептидазы, на TRH индуцированное высвобождение ацетилхолина. Кроме того, среди препаратов, которые оказывают положительный эффект на течение болезни Альцгеймера есть и эндогенные нейропептиды - вещество Р и TRH (Kowall et al., 1990; Nakajima et al, 1992). Последние, являются еще и субстратом для пролилэндопептидазы и дипептидилпептидаз (Bauer, 1987).

В полученных в настоящем исследовании результатах существенный нейропротективный эффект отмечался на модели интрацеребральной посттравматической гематомы у известного препарата нимодипина. Нейропротективный эффект нимодипина отмечается как в клинических условиях, так и на различных экспериментальных моделях, сопровождающихся нейродегенеративными процессами (Yacewicz et al., 1990; Korenkov et al., 2000). По данным ряда авторов эффект препарата обусловлен его способностью блокировать кальциевые каналы и таким способом осуществлять нейропротекцию (Triggle, 1991; Casno-Abad et al., 2001). Эффективность нимодипина на модели интрацеребральной посттравматической гематомы может косвенно свидетельствовать об адекватности этой модели для анализа состояния и поведения животных после геморрагического инсульта.

Таким образом, проведенные исследования показали, что все три использованных подхода для поиска препаратов с ноотропным типом действия результативны и позволили выявить активные соединения, обладающие избирательным антиамнестическим эффектом. Кроме того, у ряда веществ обнаружена противогипоксическая активность, которая может быть прогностическим признаком нейропротективного действия (Воронина Т.А., 2000). Исследование возможного нейропротективного эффекта новых соединений, а также пирацетама, нооглютила и нимодипина на новой модели интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) и в условиях скополаминовой модели холинергического дефицита позволило выявить у новых соединений (ГИЖ 283, ИФ 8), а также пирацетама, нооглютила и нимодипина. в разной степени выраженную способность ослаблять гибель, неврологический дефицит, нарушения обучения и воспроизведения памятного следа, повышенную тревожность животных.