Автореферат и диссертация по медицине (14.02.01) на тему:Разработка подходов к оценке риска возникновения бактериальных кишечных инфекций, распространяемых водным путем

ЗАГАЙНОВА АНЖЕЛИКА ВЛАДИМИРОВНА

РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ К ОЦЕНКЕ РИСКА ВОЗНИКНОВЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ, РАСПРОСТРАНЯЕМЫХ

ВОДНЫМ ПУТЕМ.

14.02.01 - Гигиена

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 КОЯ 2010

Москва-2010

004613809

Работа выполнена в лаборатории санитарной микробиологии и паразитологи Учреждения Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательски Институт экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Иванов Сергей Иванович

доктор медицинских наук, профессор Талаева Юлия Георгиевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Авалиани Семен Лнвановнч Ревазова Юлия Анатольевна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Защита диссертации состоится « 1 » декабря 2010 г. в 11-00 на заседании Диссертационного Совета Д.001.009.01 в Учреждение Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательском институте экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН по адресу: 119992, г. Москва, ул. Погодинская, дом 10/15, строение 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина Автореферат разослан « »_2010г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета .Беляева Наталия Николаев! доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Заболеваемость населения острыми кишечными нфекциями выходит далеко за рамки вопросов, решаемых здравоохранением, и апрямую связана с охраной окружающей среды, улучшением экологической обстановки , в частности, с качеством подаваемой населению питьевой воды. Одним из наиболее начимых факторов распространения инфекционных кишечных заболеваний является водный путь передачи, вероятность которого в современных условиях существенно асширяется и представляет собой серьезную эпидемиологическую проблему (Рахманин Э.А., 2006; GP Craun and other, 2002; и др.). По данным ЮНЕСКО, более 80% болезней человека связано с качеством воды. Экономический ущерб от использования недоброкачественной питьевой воды составляет сотни миллиардов долларов (Онищенко Г.Г.,2001).

Одной из актуальных проблем гигиенической науки является вероятностная оценка возникновения эпидемической опасности при изменении биологических и биохимических свойств у потенциально-патогенных микроорганизмов в результате воздействия антропогенного загрязнения.

В работах ряда авторов выявлено, что в районах с более высоким уровнем загрязнения окружающей среды чаще выделяются возбудители инфекционных заболеваний с атипичными признаками биохимических и генетических свойств (Гинсбург А.Л., 2006, Бондаренко В.М., 2004; Талаева Ю.Г. 1973-2009; Баязитова Л.Т., 2009 и др.). При этом этиологическое значение могут приобретать самые разные «оппортунистические» микроорганизмы (Емельянов И.Г., 1994). Список «узаконенных» и потенциальных возбудителей заболеваний человека непрерывно пополняется за счет вчерашних сапрофитов (Покровский В.И., 2004; Прокопьева М.В., 2004; Фиалкина C.B., 2004; Нилова Л.Ю., 2009), которые к тому же не редко проявляют патогенные, вирулентные и антибиотикорезистентные свойства.

Приобретение устойчивости микроорганизмов к лекарственным препаратам, сохранение ими патогенных свойств - яркая демонстрация их эволюционной изменчивости под влиянием факторов окружающей среды (Мамонтова Л.М. с соав., 2006), затрагивающее практически все разделы медицины. Многие возбудители инфекций стали устойчивыми к специфическим антибиотикам, приводящим к отрицательным последствиям инфекционного процесса. В работах Мамонтовой Л.М. с соавторами (2006 г.) неоднократно отмечалось, что образование устойчивых форм микроорганизмов значительно легче происходит в пробирке, чем в организме человека. На формирование инфекционного процесса и степень выраженности клинических проявлений инфекционного заболевания существенно влияет качественное проявление патогенности бактерий - вирулентность, которая способна изменяться под влиянием антимикробной терапии в зависимости от устойчивости бактерий к лекарственным препаратам и инфицирующей дозы возбудителя (Покровский В.И. с соавт. 2004).

Разработка математических моделей оценки микробного риска, связанных с распространением возбудителей патогенной и потенциально-патогенной микрофлоры с

учетом санитарно-гигиенических условий водопользования и свойств самих возбудителе а также инфицирующей дозы и временем развития инфекционного процесса являете одной из актуальных проблем как в научном, так и практическом отношении.

Целью настоящего исследования явилась разработка математических моделей г оценке риска возникновения бактериальных кишечных инфекций в зависимости с санитарно-гигиенических условий и реальной бактериальной нагрузки воды, а так же пр выделении и идентификации бактериальных возбудителей кишечных инфекций у водоисточников с учетом их патогенных и вирулентных свойств.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Провести анализ распространенности наиболее значимых патогенных и потенциально-патогенных бактерий в воде различных видов водопользования в зависимости от их патогенности, вирулентности, антибиотикорезистентности (сальмонелл, клебсиелл и псевдомонад). Установить причинно-следственные связи между уровнями микробного загрязнения воды различных водоисточников и заболеваемостью населения ОКИ.

2. Изучить основные закономерности изменения культуральных и биологических свойств (патогенности, вирулентности, устойчивости к антибиотикам) потенциально-патогенных бактерий в результате воздействия физических и химических факторов, используемых при обеззараживании воды.

3. Разработать алгоритм расчета уровня микробного риска воды при непосредственной идентификации в воде различного вида водопользования возбудителей бактериальных кишечных инфекций.

4. Разработать алгоритм расчета уровней микробного риска в зависимости от санитарно-гигиенических условий водопользования и реальной бактериальной нагрузки.

Научная новизна работы. Впервые:

- разработана математическая модель для расчета уровней микробного риска в зависимости от санитарно-гигиенических условий водопользования и реальной бактериальной нагрузки, рекомендуемая для эпидемической оценки отдельных территорий и математическая модель для расчета уровней микробного риска, основанная на идентификации по международной схеме типирования возбудителей кишечных инфекций при бактериологическом анализе воды; математические модели апробированы на материалах собственных исследований и ретроспективных данных с уровнем достоверности р<0,01-0,05;

- установлено, что потенциально-патогенные штаммы Klebsiella и Pseudomonas, обладая факторами патогенности и вирулентности, приобретают устойчивость к антибиотикам широкого спектра действия и могут являться потенциальными возбудителями бактериальных кишечных инфекций (БКИ) при водном пути передачи, сохраняя свои патогенные свойства в результате обеззараживания воды гипохлоритом натрия (остаточный хлора 2 мг/л), дезавидом 1,5мг/л, полигексаметиленгуанидин-гидрохлоридом 0,1 мг/л, методом фотообеззараживания в присутствии сенсибилизатора метиленового голубого в концетрациях 0,5, 1, 1,5 и 2 мг/л, воздействия магнитного поля

(Гц, 3 часа) и при комбинированном воздействии УФ (длина волны 254 нм, мощность 65 Вт/см2) и ультразвукового поля (частота 22+1,65 кГЦ, мощность 0,1 кВт).

модифицирован метод определения патогенности и вирулентности у потенциально-патогенных и патогенных бактерий, выделенных из воды различного вида водопользования с целью установления степени риска по цитотоксической, адгезивной, инвазивной и токсической активностям. Практическая значимость работы В результате проведенных исследований:

• модифицирован метод оценки степени патогенности и вирулентности бактерий, выделяемых из воды различного вида водопользования, с использованием биологической модели перевиваемых культуральных клеток BGM (заявка на патент №2010137025 от 07.09.2010 г.);

• подтверждена надежность использования биологической модели перевиваемых культуральных клеток BGM для определения патогенных и вирулентных свойств бактерий семейства Enterobacteriaceae (контаминантов вод различного назначения) методом ПЦР (на наличие генов патогенности);

• разработана математическая модель оценки микробного риска в зависимости от состояния санитарно-гигиенических условий водопользования и реальной бактериальной нагрузки (заявка на патент №2010137028 от 07.09.2010 г.);

• разработана математическая модель оценки микробного риска с учетом прямого выделения возбудителя из вод различного вида водопользования (заявка на патент №2010137026 от 07.09.2010 г.);

• разработан проект методических рекомендаций по оценке микробного риска распространения бактериальных кишечных инфекций, передаваемых водным путем;

• результаты исследования использованы при разработке проекта методических рекомендаций по использованию готовой питательной среды для выделения сальмонелл из водных объектов, проект Методических указаний «Санитарно-эпидемиологическая экспертиза средств дезинфекции воды», ГОСТа Р 52426 -2005 «Вода питьевая. Обнаружение и количественный учет Escherichia coli и колиформных бактерий. Часть I. Метод мембранной фильтрации» и ГОСТа Р 53415-2009 «Вода. Отбор проб для микробиологического анализа» (справка №ТК343/29 от 29.07.2010 г.);

Результаты диссертационной работы включены в программу циклов повышения квалификации, проводимых в 2007-2010 г.г. для специалистов бактериологических лабораторий водоканалов РФ по оценке качества воды различного назначения (исх. №016/591 от 06.09.2010 г.).

Апробация материалов диссертации

Материалы исследований доложены и обсуждены на: Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (г. Суздаль, 2005 г.); конгрессе «Окружающая среда и здоровье человека»(г. Санкт-Петербург, 2008 г.); международной конференции «ЭКВАТЕК-2008» (г. Москва,

2008 г.); конференции молодых ученых (г. Москва, НИИЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина РАМН, 2009 г.); конференции «Актуальные вопросы в инфекционной патологии», посвященной 100-летию ФГУН Ростов НИИМП Роспотребнадзора г. Ростов-на-Дону (2009г); Научно-практической конференции «Проблемы гигиенической безопасности и здоровье населения» ФГНЦ им. Ф.Ф Эрисмана (2009г.); Пленуме научного совета по экологии человека и гигиены окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ «Методологические проблемы изучения, оценки и регламентирования биологических факторов в гигиене окружающей среды» (г. Москва, НИИЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина РАМН, 2009); Пленум Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздрава и соцразвития РФ «Методологические проблемы изучения и оценки био- и нано- технологий в экологии человека и гигиены окружающей среды» (Москва 2010 г.). Методики расчета уровней микробного риска апробированы на материалах г. Ростова-на-Дону и Ростовской области в лаборатории микробиологии ФГУН Ростов НИИМП Роспотребнадзора г. Ростова-на-Дону. Апробация диссертации проведена в НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина РАМН 15 июля 2010 г., протокол № 7.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оценка степени риска потенциально-патогенных бактерий (Klebsiella, Pseudomonas) и патогенных энтеробактерий (сальмонелл) в возникновении бактериальных кишечных инфекций при водном пути передачи инфекции.

2. Модификация метода оценки степени риска патогенных и потенциально-патогенных бактерий, выделяемых из вод различного вида водопользования, по их токсической, адгезивной и инвазивной активностям, разработанного на основе перевиваемых культуральных клеток BGM (in vitro).

3. Математические модели расчета уровней микробного риска возникновения БКИ в зависимости: а) от санитарно-гигиенических условий водопользования и реальной бактериальной нагрузки; б) от непосредственного выделения бактериальных возбудителей БКИ из водных объектов.

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 22 работы, из них 4- в изданиях, рекомендованных ВАК, 2 - в методических документах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 325 стр. компьютерной верстки, содержит 80 таблиц, 64 рисунка и состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, 2 приложений. Библиография включает 264 источников, из них 181 отечественных авторов, 83 -иностранных авторов.

Личный вклад автора составляет более 80% и заключается в формулировании проблемы, постановке цели и задач работы, выборе методов исследования, выполнении экспериментальных и аналитических работ, а также разработке математической модели расчета микробного риска возникновения острые кишечные инфекции водной этиологии, обобщении и интерпретации полученных результатов исследований и подготовке научных

публикаций. Теоретические, экспериментальные и натурные исследования, математические расчеты выполнены в лаборатории санитарной микробиологии и паразитологии совместно с другими научными специалистами НИИЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина РАМН в рамках программ и планов НИР №№ 078,098.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Для выполнения поставленных задач был использован комплекс гигиенических, микробиологических, цитологических, генетических, математических и статистических методов, которые обеспечивали реализацию экспериментальных и натурных исследований. Выполненный объем исследований, и основные направления работы представлены в таблице 1.

Таблица 1. Направления и объем исследований

Направления исследований Кол-во исследованных проб Общее число определений

Определение бактериального загрязнения источников водоснабжения различного вида водопользования (поверхностных водоемов, скважин, родников, колодцев) и воды, расфасованной в емкости. 809 14562

Определение бактериального загрязнения хозяйственно-бытовых сточных вод до и после очистки 80 1513

Установление антибиотикорезистентности условно-патогенных и патогенных бактерий, выделенных из воды различного вида водопользования, в том числе после воздействия различных обеззараживающих факторов 212 4774

Изучение ДНК-азной и гемолитической активности 28 56

Изучение патогенных и вирулентных свойств бактерий на перевиваемых культуральных клетках В ОМ и Нер-2. 157 598

Определение «островов патогенности» ПБ и ППБ семейства Е^егоЬайегтасеа методом ПЦР 28 672

ВСЕГО 1314 22175

В качестве тест-микроорганизмов использовали штаммы музейных бактериальных культур, полученные из коллекции ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича: Escherichia coli 1257, Escherichia coli 675, Salmonella enteritidis 5765 ATCC, Staphylococcus aureus 906, Pseudomonas aeruginosa 10145ATCC и микроорганизмы, выделенные из различных водных объектов РФ («дикие» штаммы) - Е. coli spp., Klebsiella spp., Salmonella spp., Pseudomonas spp.

При проведении натурных исследований определяли следующие показатели бактериальной микрофлоры: общие (ОКБ), термотолерантные (ТКБ) колиформные

бактерии, глюкозоположительные (ГКБ), клебсиеллы, эшерихии, энтерококки, сальмонеллы, псевдомонады, споры сульфитредуцирующих клостридий.

Бактериологические исследования проб воды проводили согласно утвержденным нормативно-методическим документам: МУК 4.2.1018-01; МУК 4.2.1884-04; МУ 2.1.5.800-99; МУ 2.1.4.1184-02; МУК 4.2.1890-04; ИСО 9308-1:2000, МУК 4.2.1890-04

Факторы патогенности и вирулентности (адгезивную, цитотоксическую, токсическую и инвазивную активность) бактерий определяли по стандартным методикам [Эльберта Б.Я., 1957, Isberg R.R., 1986, Ernst R.K. et all. 1990; Бахолдина С.И. с соавт., 2009.] и модифицированной методике с применением перевиваемых культуральных клеток BGM (клетки почек зеленой африканской мартышки) и Нер-2 (опухолевые клетки гортани человека).

С целью искусственного повышения вирулентности испытуемых бактериальных культур проводили их предварительное подращивание в течение суток при температуре инкубирования 37°С в мясо-пептонном бульоне (МПБ) и мясо-пептонном бульоне (МПБ) с добавлением 0,5 % глюкозы.

Метод ПЦР для определения «островов патогенности» штаммов семейства Enterobacteriaceae выполнены в соответствии с «Инструкцией по применению комплекта реагентов для выделения ДНК из клинического материала «ДНК-сорб-АМ»», утвержденной Приказом Росздравнадзора 13.07.09 г. №5534-ПР/09. Выявление нуклеотидных последовательностей, отвечающих за патогенные и вирулентные свойства бактерий, проводили с применением 4 пар синтезированных праймеров, изготовленных по заказу автора настоящей работы в НПФ «Литекс». Оценку ПЦР проводили с применением электрофоретического разделения продуктов амплификации на окрашенном бромистым этидием агарозном геле. При подборе нуклеотидных последовательностей и температуры проведения реакции амплификации использовали компьютерную программу Vector NTI Suite (США). Результаты анализа последовательностей ДНК сравнивали с результатами других авторов.

В работе использовали методы математического программирования (Гершгорн

A.C., 1968; Кузнецов Ю.Н. с соавт.,1976; Тихомиров Н.П., Попов В.А, 1993).

Пороги эпидемической безопасности рассчитывали по методике Слуцкого

B.И.(1986г.). Статистическую обработку экспериментальных и натурных исследований, проводили с использованием программного обеспечения Windows ХР, Microsoft Office (Word, Excel) 2007, Statistica 6 rus.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Условно-патогенные микроорганизмы способны при снижении иммуно-резистентности организма человека вызывать заболевания, для которых характерно отсутствие нозологической специфичности. В настоящее время для бактерий, являющихся потенциальными возбудителями бактериальных кишечных инфекций (БКИ) и обладающих агрессивными свойствами применяется термин «потенциально-патогенные микроорганизмы». Установлено, что в результате антропогенного загрязнения

водоисточников происходят как количественные, так и качественные изменения микробных биоценозов, проявление которых выражается в увеличении числа потенциально-патогенных (ППБ) и патогенных бактерий (ПБ), изменении их биологических свойств, и, как следствие, увеличение видового разнообразия этиологических агентов инфекционных заболеваний.

В связи с этим в настоящей работе проводили идентификацию микробного пейзажа вод различного вида водопользования по международной схеме типирования патогенных и потенциально-патогенных бактерий как факторов риска распространения БКИ.

Исследования 880 проб воды водоисточников различного вида водопользования за период с 1999 по 2009гг. (табл. 2) свидетельствуют о широком распространении ППБ. Так, в 31% исследованных проб качество воды не соответствовало санитарно-гигиеническим требованиям по показателю ОКБ, при этом патогенные энтеробактерии (сальмонеллы) были выделены только в 8% проб, тогда как ППБ (псевдомонады, клебсиеллы, энтерококки, клостридии,)- в 66,2%.; псевдомонады обнаружены в 30,5 % (Pseudomonas aeruginosa -50%, Pseudomonas putida -12,5%, Pseudomonas fluorescence - 37,5%), клебсиеллы - в 19,0% исследуемых проб (Klebsiella pneumonia-90% и Klebsiella oxytoca -10%).

Таблица 2. Частота обнаружения индикаторных, потенциально-патогенных и патогенных микроорганизмов в пробах воды различного вида водопользования РФ (1999г.- 2009г.)

Частота обнаружения микроорганизмов (общее число исследован ных проб 880) Микроорганизмы

индикаторные потенциально-патогенные патогенные

ОКБ ТКБ E.coli ГКБ Pseudomonas Klebsiella Entero-coccus Сульфит-редуцирующие клостридии Salmonella

число случаев (абсолютные значения) 273 255 227 295 268 167 69 78 71

Относительные значения (%) 31,0 29,0 25,8 33,8 30,5 19,0 7,8 8,9 8,0

Риск возникновения инфекционного процесса зависит от полученной человеком дозы микроорганизмов, обладающих патогенными и вирулентными свойствами. По литературным данным известно, что единичные клетки микроорганизмов, имеющие свойства патогенности, при попадании в благоприятные условия (организм человека) восстанавливают свою вирулентность (например, Salmonella typhi) и могут стать возбудителями инфекционных заболеваний. В разработанной нами модели оценки

микробной контаминации воды, при непосредственном выделении бактерий обнаруженные микроорганизмы рассматривались как факторы риска возникновения кишечных инфекций.

При проведении натурных исследований с целью выявления степени риска ПБ и ППБ в возникновении БКИ, изучались биологические и биохимические свойства 127 индикаторных, потенциально-патогенных и патогенных микроорганизмов: 1 антибиотикорезистентность, гемолитическая, ДНК-азная, цитотоксическая, адгезивная, инвазивная и токсическая активности. Выделенные микроорганизмы, обладали типичными морфологическими (S-форма) и культуральными свойствами. Лекарственную устойчивость определяли к 14 антибактериальным препаратам широкого спектра действия, которые относятся к 4 группам антибиотиков, наиболее часто используемых при лечении кишечных инфекционных заболеваний: - цефалоспорины (цефаперазон, цефипим, цефтазидим, цефтриаксон), аминогликозиды (амикацин, гентамицин 10 мкг и 120 мкг, нетилмицин), фторхинолоны (ципрофлоксацин, моксифлоксацин, левофлоксацин) и карбопенемы (амоксицилин, меропенем, ипенем). Установлено, что при одинаковой выборке (п=20) индикаторных, ППБ и патогенных бактерий, выделенных из вод различных водоисточников (пробы соответствовали НД по химическому составу), Pseudomonas и Klebsiella spp. обладали в 1,8 и 1,5 раза (соответственно) большей резистентностью по отношению к используемым антибактериальным препаратам, чем индикаторные (Escherichia coli) и в 1,3 и 1,1 (соответственно), чем патогенные (Salmonella) микроорганизмы (рис.1.).

Klebsiella Сп=20)

22°/о

9°/о

□ устой 41 о полу чувствительные ■ чувствительные _

Salmonella (п=20)

Escherichia coli (n=20)

14»/«

20%

5°/о

75%

4°/о

8 2 »/о

□ устойчивые В пояучувстрлггельные ■ чувствительные

Рис.1. Определение устойчивости к антибактериальным препаратам бактерий, выделенных из различных водоисточников. 10

При повышенной концентрации в воде меди (в 1,7 раз), нефтепродуктов (в 1,3 раза) и нитритов (в 1,4 раза) выявлено 40% ППБ устойчивых к 5-8 изученным антибиотикам.

В результате проведенной работы установлено, что 60 % исследованных бактерий были устойчивы к амоксицилину (группа карбопенемы), 72% - к моксифлоксацину(фторхинолоны), 68% - к амикацину и 52% - к цефтазидиму (цефалоспорины). Из 20 штаммов клебсиелл -11(55%) не ферментировали лактозу до кислоты и газа, 4 (20%) - ферментировали лактозу только до кислоты, что не учитывается (согласно действующим НД) при определении показателя ОКБ и представляет высокий уровень риска возникновения БКИ.

Выявлена связь между лекарственной устойчивостью к антибиотикам широкого спектра действия (3-4 поколения) ПБ и ППБ (п=28 ) и их вирулентностью: бактерии устойчивые к двум или нескольким антибактериальным препаратам обладают вирулентностью или востановливают ее до 100% (Klebsiella oxsitoca spp.) в результе попадания в благоприятные условия культивирования (МПБ+ 0,5% глюкозы).

Определение в водных объектах антибиотикорезистентных штаммов ППБ к современным лекарственным препаратам широкого спектра действия нашли подтвержение в работах Абрамовой Н.В. и др.(2010); Аветисян JI.P. и др.(2010); Агаповой Е.Д.(2010); Исхаковой Х.И. и др.(2010) при установлении этиологических антибитикорезистентных и вирулентных штаммов клебсиелл и псевдомонад в инфекционной патологии человека.

Подтверждение вирулентности патогенных штаммов сальмонелл (Яковлева О.В.,1986), выделенных из воды различных водоисточников, при прямом выделении возбудителей кишечных инфекций г. Катгакургана проводилось в эксперименте на белых беспородных мышах, в результате которого выявлено 30% лекарственно устойчивых штаммов с вирулентными свойствами.

В работах, проводимых Ю.Г. Талаевой (1970), С.А. Канарейкиной и др.(1973), С.В. Фиалкинной (2006) по выявлению патогенных и вирулентных свойств у ППБ установлена идентичность результатов, полученных в эксперименте на животных и на перевиваемых культуральных клетках. В настоящей работе модифицированы и апробированы два метода: метод определения факторов патогенности и вирулентности, основанный на использовании культуральных перевиваемых клеток BGM по сравнению с рекомендуемыми клетками Нер-2 (Тапальский Д.В., 2008), и метод определения действия бактериального токсина на перевиваемые клеточные культуры в сравнении с общепринятой методикой Эльбера Б.Я. (1957). Установлено, что использование культуральных клеток BGM (в связи с их медленным старением) вместо Нер-2 повышает чувствительность метода определения свойств патогенности у бактерий. Экспериментальным путем подобрана заражающая доза для клеток BGM, составившая 1х107 КОЕ/мл и установлено время экспозиции в зависимости от видовой принадлежности микроорганизма: псевдомонады 17-18 часов, клебсиеллы - 18-19 часов, сальмонеллы - 20-26 часов, стафилококки- 24-72 часа.

При выявлении адгезивной и токсической активности у девяти бактериальных культур (3 музейных и 6 «диких», из которых 2 - лактозоотрицательные Klebsiella pneumonia) с применением клеток BGM и Нер-2 определили высокую адгезивную и токсическую активность у всех изученных микроорганизмов. При этом у высокоадгезивных бактерий индексы адгезии и токсичности были достаточно высокие (более 4), как на клетках BGM, так и на Нер-2, что позволило использовать перевиваемые клетки BGM в дальнейших исследованиях.

Определение действия бактериального токсина проводили с использованием общепринятой методики: -1)путем предварительного инкубирования бактерий в МПБ и среде Игла с двойным набором аминокислот в течение 7 дней с последующей фильтрацией полученной суспензии через мембранный фильтр (диаметр пор 0,22 мкм) и -2)модифицированного метода путем суточного инкубирования бактерий в монослое клеток BGM с последующей фильтрацией суспензии через мембранные фильтры. Суспензией, содержащей бактериальный токсин, заражали монослой перевиваемых клеток. Получение идентичных результатов позволило использовать модифицированную методику в дальнейших исследованиях.

При проведении натурных исследований воды различных водоисточников адгезивную активность определяли у 45 штаммов ПБ и ППБ. Индекс адгезивной активности на 100 клеток BGM находился в пределах от 0,2 (у низкоагезивных штаммов) до 19 (у высокоадгезивных). Из 45 штаммов высокая адгезия выявлена у 69,5%. Низкоадгезивные и среднеадгезивные штаммы в дальнейшей работе не использовали.

Все изученные штаммы бактерий обладали высокой степенью токсичности, которая была выявлена при определении факторов патогенности на культуральных перевиваемых клетках, как у лактозоположительных, так и лактозоотрицательных микроорганизмах семейства Enterobacteriaceae.

Инвазивной активностью обладали практически все «дикие» штаммы, выделенные из воды различных водоисточников, за исключением лактозоположительной Klebsiella oxytoca, (р. Пахра), инвазивная активность которой восстановилась после суточной инкубации в МПБ, содержащем 0,5% глюкозы. Музейные штаммы E.coli 1257 и Salmonella enteritidis 5765 не обладали инвазивной активностью, но после пассажа через питательную среду с усиленными ростовыми свойствами - МПБ, содержащую 0,5% глюкозы, происходило увеличение их инвазивной активности (вирулентности) до 2% и 5,63% соответственно.

Применение метода ПЦР по выявлению «островов патогенности» у микроорганизмов показало, что у 24 диких штаммов бактерий семейства Enterobctericeae присутствуют «острова патогенности» - специфические последовательности ДНК, ассоциирующиеся с проявлением патогенных свойств. Так, последовательность, продуктом которой является цитотоксический некротизирующий фактор cnf-1, была обнаружена у 23 штаммов (исключение составил штамм К. ocxitoca); последовательность, связанная с продукцией фибрина-1 типа (fimA) и энтерогемолизина (ehx), ответственных

за адгезивную активность, присутствовали у всех 24 штаммов. Нуклеотидные последовательности ipr-2 (железо регулируемый белок), отвечающие за инвазивную активность, были обнаружены только у десяти штаммов клебсиелл, выделенных из воды различного вида водопользования и обладающих инвазивной активностью, и не были обнаружены у четырнадцати не инвазивных штаммов, в том числе у музейных тест-микроорганизмов E.coli 1257, Е. coli 675, у 4 «диких» штаммов Klebsiella pneumonia и Klebsiella ocxitoca. Тестирование этих штаммов на культуре клеток BGM продемонстрировало наличие у всех 24 микроорганизмов адгезивной и токсической активности, из которых десять штаммов обладали инвазивной активностью.

Таким образом, доказана связь между наличием у бактерий генетического материала, ответственного за проявление факторов патогенности и вирулентности (связанных с адгезивной, инвазивной и токсической активностями) и проявлением этих свойств при бактериальном заражении культуры перевиваемых клеток BGM, что позволяет использовать данный метод для определения степени патогенности и вирулентности бактерий при оценке микробного риска.

Использование метода многофакторного анализа с применением статистической обработки данных по заболеваемости населения ОКИ г.Каттакургана выявил высокую степень риска возникновения БКИ, связанных с централизованным водоснабжением, что подтверждает водный путь передачи инфекции. Установлены достоверные корреляционные связи среднемесячных микробиологических показателей качества воды (в том числе ППБ) и заболеваемости по нозологическим формам. Регрессионный анализ и полученные линейные уравнения позволяют говорить о том, что повышение микробного загрязнения питьевой воды по относительным среднемесячным показателям на 1% приводило к росту заболеваемости брюшным тифом на 0,4%, дизентерией - на 0,6%, БКИ - на 0,4%. Вариабельность показателей заболеваемости на 25-35% обусловлена колебаниями показателей качества питьевой воды. Коэффициент множественной детерминации составил 60%, что свидетельствует о тесной связи водного фактора передачи возбудителей и заболеваемости БКИ на рассматриваемых территориях.

Анализ материалов Государственных докладов о санитарно-эпидемическом состоянии воды водоисточников на территории отдельных субъектов РФ за 1992-2007 г. также показал существенную роль ППБ в возникновении вспышек ОКИ установленной этиологии. В 2004 г. заболеваемость, вызванная ППБ, составила 10,8%; в 2006 г.- 6,6%; в 2007 г. - 7,7% . В последние десятилетия увеличивается число инфекционных заболеваний, вызванных ППБ: Enterobacter, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa и др., представляющими большую опасность для лиц с ослабленной антиинфекционной устойчивостью. По литературным данным видовой состав бактерий, выделенных из мочи и крови пациентов, показал широкое распространение указанных видов бактерий не только в водных объектах, но и их циркуляцию среди больных различными нозологическими формами заболеваний (табл. 3). При этом Klebsiella pneumonia выделялась у больных ОКИ в 30,2%, токсикосептическом

состоянием - 34,1%, инфекцией урогенитального тракта - 18%, при дисбиотическом нарушении кишечника - 17,6% (Фиалкина C.B., 2004).

Число острых кишечных инфекций, вызванных неустановленными возбудителями ОКИ в течение последних 15-ти лет, практически не менялось, при этом доля вспышек ОКИ с неустановленным возбудителем водной этиологии, начиная с 2006 г., постоянно возрастает. На основании выше изложенного можно предположить, что ППБ при их высокой численности в водах различных водоисточников, могут являться возбудителями ОКИ неустановленной этиологии, наряду с вирусами и простейшими.

Таблица 3. Видовой состав бактерий, выделенных от больных в период 2003-2009 гг.

Видовой состав бактерий, выделенных от больных (% от общего числа заболевших)

Потенциально-патогенные бактерии Патогенные энтеро-бакте-рии

Escherichia SPP- Enterobacter spp. Klebsiella pneumoniae spp. Klebsiella oxytoca spp. Pseudomonas aeruginosa spp. Enteroco- cus faecalis

31,4 5,2 29,3 3,0 20,5 2,8 7,9

Анализ результатов исследований показал, что ППБ, находящиеся в воде различного вида водопользования, сохраняют свойства патогенности и вирулентности, обладают устойчивостью к современным лекарственным препаратам и могут являться возбудителями БКИ, в связи с чем возникает необходимость их учета при оценке риска возникновения инфекций, имеющих водный путь передачи.

Изменение биологической активности ППБ под воздействием химических и физических методов, направленных на обеззараживание воды определяет степень опасности этих микроорганизмов при оценке микробного риска. Изучение биологических свойств ПБ и ППБ, выделенных из воды после воздействия обеззараживающими агентами, показало наличие изменений морфологических, биохимических и антибиотикорезистентных свойств. В лабораторных исследованиях установлено, что гемолитическая и ДНК-азная активности (признаки патогенности) определяются у бактерий при первичном выделении их из объектов внешней среды или после неоднократных пассажей через специальные питательные среды, что свидетельствует о вариабельности этих признаков.

Изучено влияния физических и химических факторов обеззараживания воды (ультразвукового и магнитного полей, гуанидинсодержащими дезинфектантами,при фотообеззараживании в присутствии сенсибилизаторов) на формирование устойчивости «диких» и музейных штаммов бактерий к 14 антибиотикам 3-4 поколения.

Установлено, что выживали в результате физических и химических методов воздействия, используемых при обеззеражвании воды модельных водоемов ПБ и ППБ, у которых отмечено повышение устойчивости к лекарственным препаратам 3-4 поколения, с применением:

- магнитного поля частотой 4 Гц и 3 ч времени экспозиции у E.coli 1257 и Klebsiella oxytoca spp. к 5 и 10 антибиотикам, соответственно;

- комбинированного действия УФ (мощность 254 нм-65 мВт/см2) и ультразвукового поля (частота ультразвуковых колебаний составляла 22+1,65 кГЦ, при мощности каждого из 2-х излучателей 0,1 кВт) у батерий Ps.aeruginosa spp. и Klebsiella pneumonia spp. на 30% к 12 антибиотикам (рис. 2). У музейной культуры Pseudomonas aeruginosa АТСС 10145 выявлено повышение устойчивости к 3 антибиотикам, но в то же время и повышение чувствительности к 8 антибиотикам, что показывает необходимость при оценке эффективности обеззараживающих средств в экспериментальных условиях использовать как культуры тест-микроорганизмов, так и культуры, выделенные из окружающей среды, или проводить эксперименты в условиях естественного микробиоценоза;

- фотообеззараживания в присутствии сенсибилизатора метиленового голубого устойчивость бактерий рода Salmonella музейного тест-микроорганизма и «дикого» штамма увеличилась на 20-30% по отношению к 13 антибиотикам (кроме цефаперазона), в концентрациях 1 мг/л и 2 мг/л: у E.coli 1257 при концентрации сенсибилизатора 0,5 мг/л на 30-40% выявлено увеличение устойчивости микроорганизма по сравнению с контролем к 13 антибиотикам (кроме ипенема);

- при обеззараживании воды модельных водоемов гуанидинсодержащими (ПГМГ, Дезавид) препаратами в различных концентрациях E.coli 1257 на 30-60% к 5-8 антибиотикам;

- после обеззараживания хлорсодержащим препаратом сточной воды ливневых колодцев выявлено 60% устойчивых штаммов бактерий семейства Enterobacteriaceae к 5-6 антибиотикам.

Рис. 2. Изучение устойчивости бактерий Pseudomonas aeruginosa spp. и Klebsiella pneumonia к антибактериальным препаратам после обеззараживания воды с применением комбинированного действия УФ и ультразвукового поля. Обозначения. Ось ОУ - зона задержки лизиса в мм; 1-амоксицилин/клавунат, 2-левофлоксацин, 3-цефтазидим, 4-амикацин, 5-ципрофлоксацин, 6-цефипим, 7-

цефаперазон, 8-гентамицин10мкг, 9-гентамицин 120 мкг, 10-цефтриаксон, 11-моксифлоксацин, 12-нетилмецин, 13-меропенем, 14-ипенему.

С целью выявления значимости клебсиелл и псевдомонад как этиологических агентов в патологии заболеваемости населения кишечными инфекциями экспериментально изучено влияние вышеперечисленных методов обеззараживания воды на выявление патогенных и вирулентных свойств этих микроорганизмов с учетом повышения их устойчивости к антибактериальным препаратам. Установлено, что под воздействием магнитного поля патогенность и вирулентность штаммов сохряняется и даже усиливается - адгезивная активность бактерий К. oxsitoca spp.(®) и E.coli 1257(®) увеличивалась (высокий индекс адгезии составлял 6,02-12,3 и 11,6-24 соответственно) по сравнению с контролем, а также увеличился индекс токсичности (15,0 - 21,4 и 12,2-24 соответственно), исключение составил грамположительный штамм S.aureus 906(®), у которого изменений не наблюдалось (патогенные и вирулентные свойства сохранились на высоком уровне - индекс адгезии - 12,7, индекс токсичности - 14,3); при комбинированном действии ультрафиолета и ультразвукового поля патогенность и вирулентность бактерий снижается - адгезивная и токсическая активность Ps. aeruginosa spp. (®) (выделенной из сточной воды) через 19 часов снизились в 3,3 и 2,8 раза соответственно, сохраняя при этом высокий уровень степени адгезии и токсичности.

При предварительном подращивании бактериальных культур, выделенных при проведении натурных и экспериментальных исследований в питательных средах с улучшенными ростовыми свойствами выявлена вариабельность полученных результатов в отношении адгезивной (при сохранении высокого индекса адгезии) и инвазивной (увеличение процента инвазивности бактерий)) активности у всех изученных ППБ и ПБ.

Таким образом, изученные физические и химические факторы воздействия, применяемые при разработке методов обеззараживания воды, способствуют повышению устойчивости к антибиотикам 3^1 поколения (широкого спектра действия) и сохранению патогенных и вирулентных свойств у ППБ (клебсиелл и псевдомонад) и ПБ (сальмонелл), выделенных из различных водоисточников, подтверждая их значимость как основных показателей при идентификации опасности в оценке микробного риска.

Оценка риска уровней микробной контаминации воды при непосредственном выделении бактериальных возбудителей кишечных инфекций. В «Руководстве по питьевой воде» (Женева, 2004, том 3, раздел 7) представлена формула по расчету риска возникновения инфекционного процесса по содержанию в речной воде некоторых микроорганизмов (криптоспоридий, кампилобактеров и ротовирусов). В настоящей работе на основании проведенных исследований по выявлению видового состава (ПБ и ППБ) бактерий и их биологической активности позволили усовершенствовать формулу ВОЗ и разработать математическую модель, позволяющую прогнозировать вероятность возникновения бактериальных кишечных инфекций при непосредственном выделении бактериальных возбудителей из воды различного вида водопользования.

Расчет вероятности возникновения (расчет риска) у человека инфекционного процесса (Hpa:oge„) рассматривали как произведение опасности на экспозицию, включающую в себя:

- отношение количества (КОЕ) конкретного возбудителя, находящегося в воде ( С), к инфицирующей дозе рассматриваемого возбудителя для человека;

- объем потребляемый человеком жидкости, контаминированной возбудителями БКИ (условно по ВОЗ принято считать 1 литр);

- с учетом очистки воды от конкретного возбудителя для установления приемлемого риска ( Р,);

- генерации бактериального роста;

- временем развития инфекционного процесса Т = (t-t0) (с учетом проявления бактериями патогенных и вирулентных свойств в макроорганизме человека: адгезии, колонизации, выделения экзотоксина, инвазии).

Расчет риска производили по модифицированной формуле ВОЗ:

Hpaloge„ =(C'(100-PJ • V • v/r) • Т.

Увеличение бактериального роста в макроорганизме вычисляли по формуле: п lgN-lgN

v=-—— = ——t ^ i 2 Р"альшкин В-А.и др.., 2007), где n-число делений (генераций

бактериальных клеток), No-исходное число клеток к моменту времени t0, N- число клеток к моменту t. Бактерии, попадая в более благоприятные условия (организм человека), способны размножаться не бинарно, как в питательной среде, а с учетом защитных и адаптационных механизмов организма человека.

В результате проведения экспериментальных исследований по размножению бактерий в условиях совместного культивирования с клетками BGM при каждодневной смене среды и искусственном увеличении вирулентности бактерий путем их предварительного инкубирования в МПБ и МПБ+0,5% глюкозы (длительность эксперимента составила 7 суток), были вычислены константы генерации бактериального роста для некоторых микроорганизмов (таблица 4). Использование в расчетах константы генерации бактериального роста дало возможностью с большей надежностью рассчитать вероятность возникновения у человека инфекционного процесса с учетом свойств самого возбудителя БКИ.

Таблица 4. Константы генерации бактериального роста, рассчитанные на основании

экспериментальных исследований.

Константы генерации бактериального роста (КОЕ/сут.) Возбудители БКИ

E.coli Klebsiella Pseudomonas Salmonella S. aureus

0,18 0,15 0,62 0,28 0,19

Для расчета оценки риска развития инфекционного процесса при контаминации воды патогенной и потенциально-патогенной микрофлорой использовали инфицирующие дозы бактериальных возбудителей кишечных инфекций водного пути передачи,

полученные на волонтерах, собранные по литературным данным для Vibrio cholera, Salmonella typhi, Salmonella paratiphi А и В, Shigella Flexnera , Shigella Zonne, Salmonella, для Klebsiella в результате исследований клебсиеллезной вспышки в г. Гантиади (данные Артемовой Т.З., 1988 г.), а также в процессе исследований была вычислена заражающая доза для Pseudomonas с применением распределения Пуассона.

Расчет интегрального показателя возникновения инфекционного процесса риска Rv с учетом всех возбудителей БКИ, выделенных и идентифицированных при проведении микробиологического анализа воды, проводили по разработанной нами формуле Ä„ =— ■Нраогт1) ,где: М - число возбудителей кишечных инфекций, используемых при оценке санитарно-гигиенических условий, влияющих на качество питьевой воды; /' - порядковый номер показателя; Х„ -удельный вес показателя; Hpa,oge„ -показатель вероятности возникновения БКИ при контаминации воды патогенной и потенциально-патогенной микрофлорой; W - сумму весовых коэффициентов Xi, рассчитывали по формуле W = £ Хт

ж

Оценку риска контаминации воды патогенной и потенциально-патогеннои микрофлорой на популяционном уровне производили по формуле: Rp = Rv • 100000, где Rv- интегральный показатель риска вероятности возникновения ОКИ при контаминации воды возбудителями водно-обусловленных инфекций; Rp - популяционный риск, 100000 - расчет популяционного риска производится на 100000 тысяч населения.

Математическая модель апробирована на материалах собственных (таблица 5) и ретроспективных данных Нижегородской и Тамбовской областей.

В настоящее время согласно нормативным документам в воде определяются такие показатели качества воды, как ОКБ (грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференцированных лактозных средах, ферментирующих лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 37°С), ТКБ (рост при 44°С) и колифаги. Использование только лактозоположительных представителей семейства Enterobacteriaceae исключают из учета многие виды бактерий, в частности сальмонеллы и клебсиеллы, как показали наши исследования, большинство которых обладают свойствами патогенности и вирулентности, т.е. возможностью представлять опасность возникновения БКИ при попадании в определенных дозах в организм человека. Получение ложноположительного результата бактериологического анализа не дает возможности точного прогнозирования возникновения БКИ. Выдвинутая гипотеза подтверждает необходимость идентификации и учета клебсиелл и псевдоманад как факторов риска.

Полученные результаты экспериментальных исследований позволили подойти к принципиально новому решению вопроса взаимозависимости между уровнем бактериального загрязнения воды и степенью риска возникновения заболеваний кишечными инфекциями, распространяющимися водным путем.

Таблица 5. Расчет оценки риска при микробной контаминации воды при непосредственном выделении потенциального возбудителя из воды различного водопользования

Вероя-

Микробная тность Популяцион

Микробная Вероятность конта- возни- ный риск на

№ контаминация возникновения минация новения 100 тыс.

пробы воды клебсиеллами, БКИ,вызванная псевдо- БКИ, населения

КОЕ/ЮО мл клебсиеллами монадами, КОЕ/ЮО мл вызванная псевдомонадами (1/день)

1. Московская область,

г. Болшево (питьевой 2 7,7x10"5 1 ЬбхЮ-4 6,1

колодец)

2.Река Пахра, Московской области,

Подольский р-н, деревня Красная Пахра (ниже города, 300м от сброса сточных вод) 4 1,5x104 2 3x10" 26

3.Прудовая вода (Новодевичий монастырь) 3 1ДХ10-4 4 6х104 48

4. Сточная вода после

обеззараживания (Курьяновская станция аэрации) 19 7,3x10" 11 1,64x10"3 141,25

5.г. Воскресенск московской области 1,9x10" 0 0 5,7

(колодец на окраине поселка)

Разработка метода расчета уровней микробного риска в зависимости от состояния санитарно-гигиенических условий водопользования населения при реальной бактериальной нагрузке.

Для прогнозирования изменений санитарно-эпидемиологической обстановки, выявления основных факторов, которыми эти изменения обусловлены, а также обоснования противоэпидемических мероприятий, обеспечивающих безопасность водопользования - управления риском, разработана вторая модель расчета уровней микробного риска в зависимости от состояния санитарно-гигиенических условий водопользования населения при реальной бактериальной нагрузке.

Расчет уровней микробного риска в зависимости от санитарно-гигиенических условиями водопользования в конкретном населенном пункте проводили по 30 показателям («МУ по эпидемиологической оценке санитарно-гигиенических условий в целях профилактики кишечных инфекций», 1986). На основании экспериментальных исследований в систему показателей включен новый показатель - «потенциально-патогенные бактерии», который использовался при оценке уровней микробного риска всех санитарно-гигиенических условий водопользования населения.

Санитарно-гигиенические условия включали оценку: источников водоснабжения по 9 показателям; централизованное хозяйственно-питьевое водоснабжение - по 10; источников нецентрализованного водоснабжения - по 5; хозяйственно-бытовое водопользование населения и зоны рекреации - по 6; коммунальное благоустройство - по 5. В результате проведенных исследований разработана трехступенчатая методика оценки уровней микробного риска реальной бактериальной нагрузки, связанной с условиями водопользования населения по каждому показателю (взвешенный коэффициент риска А), санитарно-гигиеническому фактору (интегральный коэффициент риска Д/„с) и в целом с учетом всех санитарно-гигиенических условий (обобщенная оценка риска С) применительно к конкретному населенному пункту.

Разработанный алгоритм расчета уровней микробного риска заключается в определенном порядке математической свертываемости информации по расчету взвешенных, затем интегральных и обобщенных показателей.

I часть метода заключается в расчете взвешенного коэффициента уровня микробного риска, который проводился по отдельному показателю для каждого фактора по разработанной формуле:

А„=(Ц'Гг + Р2-Г2+... + Га-Ия) (1), где

А„ - взвешенный коэффициент для определения относительного показателя; Р„ -вероятность возникновения кишечных заболевания по каждому относительному показателю; У„ - весовой коэффициент, / - порядковый номер показателя, и - количество показателей. Взвешенный показатель включает санитарно-гигиенические и бактериологические показатели по каждому санитарно-гигиеническому условию водопользования населения. Например, ОМЧ, численность населения, обеспеченного централизованным водоснабжением (%), процент населения, проживающего в благоустроенных домах коммунального и частного секторов с внутренним водопроводом и канализацией, средний индекс ОКБ до и после обеззараживания воды и т.д.)

Взвешенный коэффициент оценки риска по отдельным показателям устанавливается экспертным путем и позволяет провести сравнительную оценку влияния этих показателей на интегральную оценку уровней микробного риска (Я/ас) бактериальной контаминации воды в зависимости от санитарно-гигиенических условий водопользования на контролируемой территории. Чем больше значение коэффициента, тем весомее его влияние на изучаемый фактор.

II часть методики заключается в расчете интегрального показателя уровня микробного риска который проводили по разработанной нами формуле:

К Гас + + + У4-Р4 + Г5-Р5+- + К-Р„),

где п - число показателей, используемых при оценке санитарно-гигиенических условий, влияющих на качество питьевой воды; ; - порядковый номер показателя; У„ -весовой коэффициент 1-го показателя; Р„ - вероятность возникновения кишечных заболевания по каждому относительному показателю; {V-сумма весовых коэффициентов,

N

определяемых по формуле: - £ (/ , которая устанавливает интервал измерения 20 •='

интегрального показателя оценки риска Я/ас каждого санитарно-гигиенического фактора от 0 до 1.

При вычислении Н/аС: для условий централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения учитывается: уровень бактериального загрязнения питьевой воды по частоте нестандартных проб, интенсивность загрязнения, показатели водообеспечения населения, санитарно-техническое состояние разводящей сети, регулярность подачи воды населению, обнаружение в воде ПБ (в соответствии с СанПиН 2.1.4.1074-01) и ППБ;

При расчете Я/ао для источников централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения обобщается уровень бактериального загрязнения воды в источнике с учетом ее последующего обеззараживания, наличие зон санитарной охраны (в соответствии с СанПиН 2.1.4.1074-01, СанПиН 4.2.1884-04, СанПиН 2.1.4.117502);

При расчете для источников нецентрализованного водоснабжения, учитывается не только уровень и интенсивность бактериального загрязнения воды, но и соответствие эксплуатации источника требованиям СанПиН 2.1.4.1175-02;

При вычислении Л/0<. для условий хозяйственно-бытового водопользования населения и зон рекреации учитывается степень использования населением воды поверхностных водоемов для хозяйственно-бытовых нужд, частоту проб, превышающих допустимый уровень и интенсивность загрязнения в местах купания, обнаружение в воде возбудителей инфекционных заболеваний, влияние выпусков хозяйственно-бытовых сточных вод в зоне водопользования и т.д. (в соответствии с СанПиН 2.1.5.980-00);

При расчете й/„с для условий коммунального благоустройства населенного пункта, учитывается водообеспечение и канализование жилого фонда в коммунальном и частном секторах, развитие водопроводной и канализационной сети.

III часть методики заключается в расчете обобщенного С уровня микробного риска, которую проводили с учетом всех интегральных показателей по разработанной нами

обобщенного показателя уровня микробного риска; / - порядковый номер фактора; О -весовой коэффициент; К/ас - интегральный показатель риска каждого санитарно-гигиенического фактора; IV—сумма весовых коэффициентов.

Для оценки микробного риска интегрального и обобщенного показателей были установлены уровни оценки микробного риска {табл. 6).

С целью апробации методики рассчитывали интегральные системы показателей, характеризующие каждый санитарно-гигиенический фактор г. Каттакургана (99 месяцев, 17 сезонов и 10 лет). Для апробации методики наибольший интерес представляли данные за каждый месяц, так как бактериальная нагрузка этого города резко изменялась в течение года, что позволило оценить методику в разных условиях.

N

где N - число факторов, используемых при расчете

Таблица 6. Уровни оценки микробного риска, обусловленного условиями водопользования

Пятиуровневый классификатор Трехуровневый классификатор

Вычисленное Оценка Вычисленное Оценка

значение риска значение риска

показателя показателя

0< R* <0.15 Низкий —

0.15<R<0.20 Приемлемый 0< R <0.2 Приемлемый

0.20< R <0.40 Повышенный 0.2< R <0.4 Повышенный

0.40< R <0.60 Высокий 0.4< R<1.0 Высокий

0.60<R<1.0 Очень высокий —

Примечание: *R - уровни оценки микробного риска для интегральных показателей (Rfac) и обобщенных показателей (Q.

В результате использования математического подхода бактериальная нагрузка, связанная с источником водоснабжения г. Каттакургана, имеет повышенный уровень риска Rfac (менее 0,4), возрастая до высокой в отдельные месяцы летнего периода. В сравнении по годам наблюдения наиболее неблагоприятными по уровню риска Rfac были 1981 и 1987 гг. (0,53 и 0,48, соответственно).

Интегральные показатели Rfac, рассчитанные за каждый месяц, отражают изменение бактериальной нагрузки, связанной с питьевым водопользованием населения, за 10-летний период, и выявляют временные интервалы, опасные в эпидемическом отношении, что позволяет рекомендовать оптимальные сроки проведения профилактических мероприятий. На изучаемой территории таковыми были апрель-май - начало подъема заболеваемости кишечными инфекциями населения. В зимние месяцы 1986 г., был отмечен низкий уровень риска Rfac и низкая заболеваемость, однако в декабре рассчитанный по интегральному показателю (0,44) высокий уровень риска был связан с обнаружением в питьевой воде S.paratyphi В. Находка патогенных бактерий в питьевой воде в месяцы, когда качество воды по индикаторным микроорганизмам соответствовала нормативам (апрель 1985 г., декабрь 1986 г.), были расценены как локальные очаги бактериального загрязнения, обусловленного разгерметизацией сети. Заболевших кишечными инфекциями, связанными с выделениями возбудителей из питьевой воды, не последовало.

В соответствии с полученными фактическими значениями уровней индикаторных микроорганизмов в воде были вычислены высокие уровни риска (0,8 и 0,9). Максимальные значения уровней риска реальной бактериальной нагрузки на протяжении всех лет наблюдения показывают, что в водоемах г. Каттакургана постоянно высокая степень фекального загрязнения, что говорит о присутствии в воде возбудителей кишечных инфекций. И действительно, из воды поверхностных водоемов города выделялись шигеллы (в мае-июле 1985 г.) и сальмонеллы (5 раз в разные периоды года).

В эти периоды по расчетным данным риск реальной бактериальной нагрузки (по интегральным показателям) водопользования существенно возрастал.

Динамика обобщенного показателя уровней риска С за каждый месяц 1985-1988 гг. колебалась в меньших пределах, чем интегрального показателя /?уос. Однако общая закономерность для данного населенного пункта, выражающаяся в ухудшении всех условий водопользования в летний период, оказалась свойственна и показателю обобщенного уровня риска С, так как тенденция сезонной динамики его составляющих имела одинаковый характер по всем изученным факторам (кроме фактора коммунального благоустройства) (Рис.6).

0,7 ...........................................................................-..............—....................................................- -................-..................—....................— 250

обобщенный показатель микробного риска

заболеваемость на 10 тысяч населения

1 3 579 11 1357 9 11 13579 11 13 месяцы

1985г 1986г 1987г 1938г

Рис. 6. Оценка микробного риска, связанного с водопользованием населения г. Каттакургана, по обобщенной показателю микробного риска в условиях реальной бактериальной нагрузки (С) и общей заболеваемости КИ.

Высокий обобщенный показатель уровня риска реальной бактериальной нагрузки г. Каттакургана подтверждает действие водного фактора на изучаемой территории в зависимости от условий водопользования. Наибольшая опасность возникновения ОКИ отмечена в летний период. Только благодаря непрерывной шкале показателя С видно, что в зимние месяцы оценка риска реальной бактериальной нагрузки характеризуется как повышенная (0,35-0,38), но значения близки критическому уровню линии тренда -0,4. Методика позволяет также вычленить гигиенические факторы из всех изученных, фактический вклад которых в общий показатель оценки риска реальной бактериальной нагрузки наиболее значим. Таким фактором в г. Каттакургане является состояние коммунального благоустройства. Остальные факторы имеют примерно одинаковое значение (по среднегодовым данным). Уровень достоверности прогноза составлял от 75 до 95%.

По результатам расчета интегральных и обобщенных показателей оценки микробного риска были получены достоверные корреляционные связи между водным фактором передачи бактериальных кишечных инфекций и реальной бактериальной

нагрузкой питьевой воды. На основании построения регрессионной модели по выявлению связи между интегральными и обобщенными показателями уровня микробного риска реальной бактериальной нагрузки воды и заболеваемостью населения выявлены группы повышенного риска по заболеваемости: брюшным тифом и паратифами - дети З-б лет, население старше 50 лет. Большой риск воды загрязнения имеет место в организованных коллективах (ДДУ и учебных заведениях) ОКИ - дети ясельного возраста и учащиеся, а также все изученные группы взрослого населения, дизентерия - дети ясельного возраста, неорганизованные взрослые старше 50 лет. Информативность показателей как фактических, так и расчетных также была примерно одинаковой.

Впервые с использованием разработанной методики можно дать углубленную обобщенную оценку реальной бактериальной нагрузки, обусловленной водопользованием. Таким образом, разработанная методика оценки риска реальной бактериальной нагрузки позволила не только прогнозировать изменение санитарно-эпидемической обстановки, но и вычленить основные факторы, которыми эти изменения обусловлены, обосновать противоэпидемические мероприятия, обеспечивающие безопасность водопользования.

Выводы

1. Установлено, что частота обнаружения потенциально-патогенных бактерий клебсиелл и псевдомонад из воды различных водоисточников составляет /4 (50%) от частоты обнаружения общего количества выделенных микроорганизмов (индикаторных, патогенных и других разновидностей потенциально-патогенных бактерий). Выявлено, что псевдомонады и клебсиеллы идентифицированы в качестве этиологических агентов бактериальных инфекционных заболеваний в 52,8% случаев от общего числа различных заболеваний. Изученные клебсиеллы и псевдомонады обладали свойствами адгезивной и токсической активности. Инвазивной активностью обладали 100% псевдомонад и 71,6% клебсиелл, 28,4% неинвазивных клебсиелл при благоприятных условиях восстанавливали свою инвазивную активность (вирулентность). Все клебсиеллы и псевдомонады сохраняли свои патогенные и вирулентные свойства после химических и физических методов воздействия (гипохлорит натрия (остаточное содержание хлора 2,0 мг/л), дезавид 1,5 мг/л, полигексаметиленгуанидин-гидрохлорид 0,1 мг/л, фотосенсибилизатор метиленовый голубой в концентрациях 0,5, 1, 1,5 и 2 мг/л, магнитное поле (4Гц, 3 часа), комбинированное действие УФ (254 нм мощностью 65 мВт/см2) и ультразвука (22+1,65 кГЦ мощностью 0,1 кВт)), направленные на обеззараживание воды.

2. Установлено, что 26% псевдомонад и 22 % клебсиелл, выделенные из воды различных водоисточников, обладали резистентностью к антибактериальным препаратам 3-4 поколения. После химического и физического воздействия (гипохлорит натрия (остаточное содержание хлора 2,0 мг/л), дезавид 1,5 мг/л, полигексаметиленгуанидин-гидрохлорид 0,1 мг/л, фотосенсибилизатор метиленовый голубой в концентрациях 0,5, 1, 1,5 и 2 мг/л, магнитное поле (4Гц, 3 часа), комбинированное действие УФ (254 нм мощностью 65 мВт/см2) и ультразвука (22+1,65 кГЦ мощностью 0,1 кВт)),

направленного на обеззараживание воды, выживали изученные клебсиеллы и псевдомонады, устойчивость которых к антибактериальным препаратам увеличивалась.

3. Доказано, что потенциально-патогенные клебсиеллы и псевдомонады представляют высокую степень риска возникновения бактериальных кишечных инфекций, распространяемых при питьевом и хозяйственно-бытовом водопользовании населения, и требуют непосредственного определения при проведении бактериологического анализа вод централизованного и нецентрализованного водоснабжения, а также воды поверхностных водоисточников, в которых в настоящее время их прямое определение не предусматривается.

4. Модифицирован метод определения цитотоксической, адгезивной, инвазивной и токсической активностей патогенных и потенциально-патогенных бактерий, который позволяет изучать связь между цитотоксическим действием бактерий на клетки BGM, экспозицией и заражающей дозой. Метод может быть рекомендован к использованию при анализе свойств бактерий как факторов риска.

5. Разработана математическая модель, позволяющая прогнозировать вероятность возникновения бактериальных кишечных инфекций при непосредственном выделении бактериальных возбудителей из воды различного вида водопользования, с учетом изменения их видового состава (патогенные и потенциально-патогенные бактерии) и биологических свойств.

6. Разработаны критерии оценки каждого из рассматриваемых санитарно-гигиенических и бактериологических показателей (по трехуровневой и пятиуровневой оценке микробного риска) по степени их возможного влияния на эпидемическую опасность возникновения бактериальных кишечных инфекций. Определены аналитические зависимости для каждого показателя качества воды, позволяющие перевести его фактическое значение в вероятностную величину, изменяющуюся в диапазоне риска от 0 до 1.

7. Разработана математическая модель оценки риска в зависимости от состояния санитарно-гигиенических условий водопользования и реальной бактериальной нагрузки (с уровнями достоверности прогноза р<0,01-0,05), которая позволяет дать углубленную обобщенную оценку реальной бактериальной нагрузки, обусловленной водопользованием. Разработанная методика оценки риска дает возможность не только прогнозировать изменения санитарно-эпидемической обстановки, но и оценить вклад каждого фактора, которые эти изменения обусловливают, обосновать противоэпидемические мероприятия, обеспечивающие безопасность водопользования.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

В изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Недачин А.Е., Артемова Т.З., Дмитриева P.A., ДоскинаТ.В., Талаева Ю.Г., Иванова Л.В.,

Буторина H.H., Лаврова Д.В., Санамян А.Г., Загайнова A.B.. Колбасникова И.А., Ибрагимова

Л.М., Алешня В.В, Журавлев П.В., Головина C.B., Панасовец О.П., Савилов Е.Д., Мамонтова

Л.М., Анганова Е.В. Основы эпидемической безопасности питьевого водопользования населения

России//Гигиена и санитария. - 2005.-№6.-С.14-18.

2. Недачин А.Е., Артемова Т.З., Иванова Л.В., Талаева Ю.Г., Богатырева И.А., Буторина H.H., Загайнова A.B. Совершенствование нормативной и методической базы бактериологического мониторинга качества питьевой воды// Гигиена и санитария. - 2007.-№5.-С.36-39.

3. Алешня В.В, Журавлев П.В., Головина C.B., Панасовец О.П., Недачин А.Е., Артемова Т.З., Иванова Л.В., Талаева Ю.Г., Загайнова A.B.. Буторина H.H., Ибрагимова Л.М.,Колбасникова И.А., Глухов A.A., Щеглов Н.М.,Мартынов Г.А., Ковалевская О.Л., Гордеев В.А., Белоглазова М.Д.,Субботина В.И., Черногорова Т.М. Значение индикаторных микрооганизмов при оценке микробного риска возникновения эпидемической опасности при питьевом водопорльзовании. // Гигиена и санитария. - 2008.-№2.-С.23-27.

4. Загайнова A.B.. Рахманин Ю.А., Талаева Ю.Г., Иванов С.И., Артемова Т.З., Недачин А.Е., Гипп Е.К., Буторина H.H. Использование метода вероятностной оценки для установления зависимости между качеством воды и заболеваемостью населения кишечными инфекциями при оценке микробного риска. // Гигиена и санитария - 2010.-№3.-С.28-31.

В других изданиях:

5. Загайнова A.B.. Буторина H.H. Проблема оценки риска возникновения кишечных инфекций, связанных с питьевым водопользованием населения//Сборник Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье»,-Суздаль, 2005.-С217-219.

6. Недачин А.Е., Артемова Т.З., Талаева Ю.Г., Иванова Л.В., Загайнова A.B.. Колбасникова И.А., Буторина H.H., Ибрагимова Л.М.. Сравнительное значение индикаторных бактерий в оценке потенциальной опасности возникновения кишечных инфекций при питьевом водопользовании//Сборник докладов «Итоги и перспективы научных исследований по проблеме экологии человека и гигиены окружающей среды». -М., 2005.-№6.-С.48-63.

7. Алешня В.В, Журавлев П.В., Головина C.B., Панасовец О.П., Недачин А.Е., Артемова Т.З., Иванова Л.В., Талаева Ю.Г., Загайнова A.B.. Буторина H.H., Ибрагимова Л.М., Колбасникова И.А.. Значение индикаторных микроорганизмов в оценке микробного риска при питьевом водопользовании//Материалы пленума научного совета по экологии человека и гигиены окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ «Экологически обусловленные ущербы здоровью: методология, значение и перспективы оценки».-М., 2005.-С.178-180.

8. Недачин А.Е., Артемова Т.З., Иванова Л.В., Талаева Ю.Г., Загайнова A.B.. Буторина H.H., Ибрагимова Л.М..Состояние и перспектива регламентирования качества питьевой воды по бактериологическим показателям//Материалы научно-практической конференции «Вода, напитки, соки, технологии и оборудование».-М,2006.-С25-26.

9. Недачин А.Е., Артемова Т.З., Талаева Ю.Г., Иванова Л.В., Загайнова A.B.. Колбасникова И.А., Буторина H.H., Ибрагимова Л.М.. Алешня В.В, Журавлев П.В., Головина C.B., Панасовец О.П., Кукса В.М., Костина A.B. Сравнительное значение индикаторных бактерий в оценке потенциальной опасности возникновения кишечных инфекций при питьевом водопользовании// Сборник докладов «Итоги и перспективы научных исследований по проблеме экологии человека и гигиены окружающей среды». - М., 2006.-№6.-С.87-94.

Ю.Артемова Т.З., Талаева Ю.Г., Загайнова A.B. Обоснование безопасных уровней бактериологических показателей качества питьевой воды в отношении кишечных инфекций//Сборник материалов пленума «Современные проблемы гигиены города, методология и пути решения». -М., 2006. -С.26-27.

11. Артемова Т.З., Загайнова A.B.. Совершенствование методической базы контроля бактериального загрязнения питьевой воды с целью обеспечения эпидемической безопасности// Материалы научно-практических конгрессов III Всероссийского форума «Здоровье нации -основа процветания России», Том 2, ч. 1, разделы «Здоровое питание -здоровье нации», «Питьевые воды России -2007». -М.,2007.-С. 168-169.

12. Недачин А.Е., Артемова Т.З., Талаева Ю.Г., Иванова Л.,В., Буторина H.H., Богатырев; И.А., Гипп Е.К., Загайнова A.B.. Алешня В.В, Панасовец О.П.. Оптимизация эпидемиологическо! оценки качества воды по бактериологическим показателям.//Вестник Российской военно медицинской академии.-С.-П.-2008.-Т.23.-23-№3.-Приложение 2 (часть Н).-С.445.

13. Загайнова A.B.. Талаева Ю.Г., Артемова Т.З., Иванова Л.,В- Оценка риска острых кишечных инфекций в связи с повышенной микробной обсемененностью питьевой воды.//Там же.-С.450.

14. Загайнова A.B. К вопросу оценки микробного риска острых кишечных инфекций передающихся водным путем//Сборник докладов 8-го Международного конгресса «ЭКВАТЕК-2008».-М,2008.-УДК 502.51+[628.1](082). -М34. - ББК 20.1+38.761.1. -ISBN 978-5-9900677-7-6.

15. Рахманин Ю.А., Недачин А.Е., Артемова Т.З., Дмитриева P.A., Доскина Т.В., Иванова Л.,В., Буторина H.H., Загайнова A.B.. Надежность микробиологического контроля при введении в действие технического регламента «О безопасности питьевой воды»//Журнал «Питьевая вода»,-М, 2008. -№5. - С.16-17.

16. Недачин А.Е., Артемова Т.З., Гипп Е.К., Буторина H.H., Загайнова А.В..Кузнецова H.A.. Изучение возможности реактивации Enterococcus faecalis и Staphilococcus aureus в процессе фотообеззараживания//Материалы пленума научного совета по экологии человека и гигиены окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ «Методологические проблемы изучения, оценки и регламентирования биологических факторов в гигиене окружающей среды».-М,2009,-С.191-193.

17. Алешня В.В, Журавлев П.В., Головина C.B., Панасовец О.П., Недачин А.Е., Талаева Ю.Г., Артемова Т.З.,Гипп Е.К., Загайнова A.B.. Буторина H.H.. Методические подходы к индикации сальмонелл в водных объектах//Там же.-С.30-32.

18. Загайнова A.B.. Талаева Ю.Г., Иванов С.И., Артемова Т.З., Гипп Е.К., Буторина H.H., Недачин А.Н.. Использование метода вероятностной оценки для установления зависимости между качеством воды и заболеваемостью населения кишечными инфекциями при оценке микробного риска//Там же.-С.92-95.

19. Недачин А.Е., Артемова Т.З., Дмитриева P.A., Доскина Т.В., Гипп Е.К., Загайнова A.B.. Буторина H.H., Долгин В.А.. Обеспечение эпидемической безопасности потребителей при санитарно-микробиологическом контроле в условиях реализации технического регламента «О обеззараживании питьевой воды//Сборник Всеросийской конференции «Региональные проблемы качества воды и сохранения здоровья населения».-Липецк,2009.- С 291-296.

20. Загайнова A.B.. Талаева Ю.Г., Недачин А.Е., Артемова Т.З., Гипп Е.К., Алешня В.В., Журавлев П.В., Головина C.B., Панасовец О.П. К вопросу микробного риска//Сборник «Актуальные вопросы в инфекционной патологии», посвященного 100-летию ФГУН Ростов НИИМП Роспотребнадзор. - Ростова-на-Дону, 2009. -С.207-212.

21. Панасовец О.П., Загайнова A.B. Выделение патогенных энтеробактерий из воды как показатель потенциальной эпидемической опасности при возникновении острых кишечных инфекции//Сборник докладов научно-практической конференции «Проблемы гигиенической безопасности и здоровье населения» ФГНЦ им. Ф.Ф Эрисмана. - 2009.-С.45-47.

22.3агайнова A.B. Изучение устойчивости к антибактериальным препаратам отдельных групп микроорганизмов к вопросу микробного риска кишечных инфекций водного пути передачи//Материалы 3-й Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» под редакцией академика РАМН Ю.А.Рахманина,--М., 2009. -УДК 614.3 27. - ББК 614.87 (082).

Список сокращений и обозначений:

ОКИ - острые кишечные инфекции

ОМЧ - общее микробное число

ПБ - патогенные бактерии

ППБ — потенциально-патогенные бактерии

ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения

КОЕ - колонии образующие единицы

МПБ - мясо-пептонный бульон

БКИ- бактериальные кишечные инфекции

ПГМГ- полигексаметиленгуанидин-гидрохлорид

НД - нормативные документы

©- чувствительный к лекарственным препаратам штамм ®- устойчивый к лекарственным препаратам штамм

Заказ № 227-а/10/10 Подписано в печать 28.10.2010 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,4

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-тай:т/о@с/г.ги

Актуальность проблемы

Основной целью гигиенических исследований является разработка неспецифических профилактических мероприятий по ограничению циркуляции в объектах окружающей среды микроорганизмов, патогенных для человека, при этом важная роль в передаче острых кишечных инфекционных заболеваний принадлежит водному фактору [124, 125, 197]. В соответствии с Директивой 2000/60/ЕС Совета от 23 октября 2000 года «доступ к безопасной питьевой воде имеет существенное значение для здоровья как основное право человека и компонент эффективной политики' в области охраны здоровья». В феврале 2007 г. Генеральной Ассамблеей ООН была принята резолюция, в которой период с 2005 г. по 2015 г. объявлен Международным десятилетием действий под лозунгом «Вода для жизни». По данным ЮНЕСКО, более 80% болезней человека связано с качеством воды. Экономический ущерб от использования недоброкачественной питьевой воды составляет сотни миллиардов долларов [110].

Одной из актуальных проблем гигиенической науки является вероятностная оценка возникновения эпидемической опасности при изменении биологических и биохимических свойств у потенциально-патогенных микроорганизмов в результате воздействия антропогенного загрязнения.

В работах ряда авторов выявлено, что в районах с более высоким уровнем загрязнения окружающей среды чаще выделяются возбудители инфекционных заболеваний с атипичными признаками биохимических и генетических свойств [ 17, 24, 25, 39, 153]. При этом этиологическое значение могут приобретать самые разные оппортунистические» микроорганизмы (Емельянов И.Г.) [64, 84]. Список узаконенных» и потенциальных возбудителей заболеваний человека непрерывно пополняется за счет вчерашних сапрофитов [102, 119, 121, 163], которые к тому же не редко проявляют патогенные, вирулентные и антибиотикорезистентные свойства.

Приобретение устойчивости микроорганизмов к лекарственным препаратам, сохранение ими патогенных свойств — яркая демонстрация их эволюционной изменчивости под влиянием факторов окружающей среды [83], затрагивающее практически все разделы медицины. Многие возбудители инфекций стали устойчивыми к специфическим антибиотикам, приводящим к отрицательным последствиям инфекционного процесса. В работах Мамонтовой Л.М. с соавторами (2006 г.) неоднократно отмечалось, что образование устойчивых форм микроорганизмов значительно легче происходит в пробирке, чем в организме человека. На формирование инфекционного процесса и степень выраженности клинических проявлений инфекционного заболевания существенно влияет качественное проявление патогенности бактерий - вирулентность, которая способна изменяться под влиянием антимикробной терапии в зависимости от устойчивости бактерий к лекарственным препаратам и инфицирующей дозы возбудителя [119]. .

Разработка математических моделей оценки микробного риска, связанных с распространением возбудителей патогенной и потенциально-патогенной микрофлоры с учетом санитарно-гигиенических условий водопользования и свойств самих возбудителей, а также инфицирующей дозы и временем развития инфекционного процесса является одной из актуальных проблем, как в научном, так и практическом отношении.

Целью работы являлась разработка экспериментального подхода к оценке уровней риска в зависимости от санитарно-гигиенических условий и реальной бактериальной нагрузки воды, а так же при выделении и идентификации бактериальных возбудителей кишечных инфекций из водоисточников с учетом их патогенных и вирулентных свойств.

Для достижения поставленной цели решены следующие задачи:

1. Проведен анализ распространенности наиболее значимых патогенных и потенциально-патогенных бактерий в воде различных видов водопользования, в зависимости от их патогенности, вирулентности, антибиотикорезистентности (сальмонелл, клебсиелл и псевдомонад). Установить причинно-следственные связи между уровнями микробного загрязнения воды различных водоисточников и заболеваемостью населения ОКИ.

2. Изучены основные закономерности изменения кулътуралытых и биологических свойств (патогенности, вирулентности, устойчивости к антибиотикам) потенциально-патогенных бактерий в результате воздействия физических и химических факторов, используемых при обеззараживании воды.

3. Разработан алгоритм расчета уровня микробного риска воды при непосредственной идентификации в воде различного вида водопользования возбудителей бактериальных кишечных инфекций.

4. Разработан алгоритм расчета уровней микробного риска в зависимости от санитарно-гигиенических условий водопользования и реальной бактериальной нагрузки.

Научная новизна работы.

На основании проведенных исследований впервые:

- разработана математическая модель для расчета уровней микробного риска в зависимости от санитарно-гигиенических условий водопользования и реальной бактериальной нагрузки, рекомендуемая для эпидемической оценки отдельных территорий и математическая модель для расчета уровней микробного риска, основанная на идентификации по международной схеме типирования возбудителей кишечных инфекций при бактериологическом анализе воды; математические модели апробированы на материалах собственных исследований и ретроспективных данных с уровнем достоверности р<0,01-0,05;

- установлено, что потенциально-патогенные штаммы Klebsiella и Pseudomonas, обладая факторами патогенности и вирулентности приобретают устойчивость к антибиотикам широкого спектра действия и могут являться потенциальными возбудителями БКИ при водном пути передачи сохраняя свои патогенные свойства в результате обеззараживания воды гипохлоритом натрия (остаточный хлора 2 мг/л), дезавидом 1,5мг/л, полигексаметиленгуанидин-гидрохлоридом 0,1 мг/л, методом фотообеззараживания в присутствии сенсибилизатора метиленового голубого 1мг/л, воздействия , магнитного поля (4Гц, 3 часа) и при комбинированном воздействии УФ (длина волны 254 нм, мощность 65 ч мВт/см ) и ультразвукового поля (частота 22+1,65 кГД, мощность 0,1 кВт).

- модифицирован метод определения патогенности и вирулентности у потенциально-патогенных и патогенных бактерий, выделенных из воды различного вида водопользования с целью установления степени риска по цитотоксической, адгезивной, инвазивной и токсической активностям.

Практическая значимость работы

В результате проведенных исследований:

• модифицирован метод оценки степени патогенности и вирулентности бактерий, выделяемых из воды различного вида водопользования, с использованием биологической модели перевиваемых культуральных клеток BGM (заявка на патент №2010137025 от 07.09.2010 г.);

• подтверждена надежность использования биологической модели перевиваемых культуральных клеток BGM для определения патогенных и вирулентных свойств бактерий семейства Enterobacteriaceae (контаминантов вод различного назначения) методом ПЦР (на наличие генов патогенности);

• разработана математическая модель оценки микробного риска в зависимости от состояния санитарно-гигиенических условий водопользования и реальной бактериальной нагрузке(заявка на патент №2010137028 от 07.09.2010 г.);

• разработана математическая модель оценки микробного риска с учетом прямого выделения возбудителя из вод различного вида водопользования(заявка на патент №2010137026 от 07.09.2010 г.); разработан проект методических рекомендаций по оценке микробного риска распространения бактериальных кишечных инфекций, передаваемых водным путем; результаты исследования использованы при разработке проекта методических рекомендаций по использованию готовой питательной среды для выделения сальмонелл из водных объектов, проект Методических указаний «Санитарно-эпидемиологическая экспертиза средств дезинфекции воды», ГОСТа Р 52426 -2005 «Вода питьевая. Обнаружение и количественный учет Escherichia coli и колиформных бактерий. Часть I. Метод мембранной фильтрации» и ГОСТ Р 53415-2009 «Вода. Отбор проб для микробиологического анализа»;

Результаты диссертационной работы включены в программу циклов повышения квалификации, проводимых в 2007-2010 г.г. для специалистов бактериологических лабораторий водоканалов РФ по оценке качества воды различного назначения (исх. №01-6/591 от 06.09.2010 г.).

Апробация материалов диссертации: Материалы исследований доложены и обсуждены на: Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (г. Суздаль, 2005 г.); конгрессе «Климат и здоровье человека» (г. Санкт-Петербург, 2008 г.); международной конференции «ЭКВАТЕК-2008» (г. Москва, 2008 г.); конференции молодых ученых (г. Москва, НИИЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина РАМН, 2009 г.); конференции «Актуальные вопросы в инфекционной патологии», посвященной 100-летию ФГУН Ростов НИИМП Роспотребнадзора г. Ростов-на-Дону (2009г); Научно-практической конференции «Проблемы гигиенической безопасности и здоровье населения» ФГНЦ им. Ф.Ф Эрисмана (2009г.); Пленуме научного совета по экологии человека и гигиены окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития РФ «Методологические проблемы изучения, оценки и регламентирования биологических факторов в гигиене окружающей среды» (г. Москва, НИИЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина РАМН, 2009).

Методики расчета уровней микробного риска апробированы на материалах г. Ростова-на-Дону и Ростовской области в лаборатории микробиологии ФГУН Ростов НИИМП Роспотребнадзора г. Ростов-на

Дону. Апробация диссертации состоялась на заседании апрабационного совента в НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. ысина РАМН 15 июля 2010 г., протокол №7.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оценка степени риска потенциально-патогенных бактерий (Klebsiella, Pseudomonas) и патогенных энтеробактерий (сальмонелл) в возникновении бактериальных кишечных инфекций при водном пути передачи инфекции.

2. Модификация метода оценки степени риска патогенных и потенциально-патогенных бактерий, выделяемых из вод различного вида водопользования по их токсической, адгезивной и инвазивной активностям разработанного на основе перевиваемых культуральных клеток BGM (in vitro).

3. Математические модели расчета уровней микробного риска возникновения БКИ в зависимости: а) от санитарно-гигиенических условий водопользования и реальной бактериальной нагрузки; б) от непосредственного выделения бактериальных возбудителей БКИ из водных объектов.

Внедрение результатов работы В результате проведенных исследований: проект методических рекомендаций по определению цитопатогенного эффекта бактерий на культуре клеток; разработан проект методических рекомендаций по оценке микробного риска распространения бактериальных кишечных инфекций, передаваемых водным путем; результаты исследования использованы при разработке проекта методических рекомендаций по использованию готовой питательной среды для выделения сальмонелл из водных объектов; результаты исследования использованы при разработке ГОСТа Р 52426/ -2005 «Вода'питьевая. Обнаружение и количественный учет Escherichia coli и колиформных бактерий. Часть I. Метод мембранной фильтрации»; результаты исследования использованы при разработке ГОСТа Р по отбору проб;

Результаты диссертационной работы включены в программу циклов повышения квалификации, проводимых в 2007-2010 г.г. для специалистов бактериологических лабораторий водоканалов РФ по оценке качества воды различного назначения (исх. №01-6/591 от 06.09.2010 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 325 стр. компьютерной верстки, содержит 80 таблиц, 62 рисунка и состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, обсуждение результатов, выводов, списка литературы, приложение. Библиография включает 264 источников, из них 181 отечественных авторов, 83 -иностранных авторов.

выводы

1. Установлено, что частота выделениям потенциально-патогенных бактерий клебсиелл и псевдомонад, из воды различных водоисточников составляет Уг (50%) от частоты выделения других микроорганизмов (индикаторных, патогенных и других потенциально-патогенных бактерий). Выявлено, что псевдомонады и клебсиеллы идентифицированы в качестве этиологических агентов в 52,8% случаев от общего числа различных заболеваний. Изученные клебсиеллы и псевдомонады обладали свойствами адгезивной и токсической активности. Инвазивной активности обладали все псевдомонады и 71,6% клебсиелл, 28,6% неинвазивных клебсиелл при благоприятных условиях восстанавливали свою инвазивную активность (вирулентность). Все клебсиеллы, и псевдомонады сохраняли свои патогенные и-вирулентные свойства после химических и физических методов* воздействия^ (гипохлорит натрия (остаточное содержание хлора 2,0 мг/л), дезавид 1,5 мг/л, полигексаметиленгуанидин-гидрохлорид 0,1 мг/л, фотосенсибилизатор метиленовый голубой в концентрациях 0,5, 1, 1,5 и 2 мг/л, магнитное поле (4Гц, 3 часа), комбинированное действие УФ (254 нм мощностью 65 мВт/см2) и* ультразвука (22+1,65 кГЦ мощностью 0,1 кВт)), направленных на обеззараживание воды.

2. Установлено, что 26% псевдомонад и 22 % клебсиелл, выделенных из воды различных водоисточников обладали резистентностью к антибактериальным препаратам. После химического и физического воздействия (гипохлорит натрия (остаточное содержание хлора 2,0 мг/л), дезавид 1,5 мг/л, полигексаметиленгуанидин-гидрохлорид 0,1 мг/л, фотосенсибилизатор метиленовый голубой в< концентрациях 0,5, 1, 1,5 и 2 мг/л, магнитное поле (4Гц, 3 часа), комбинированное действие УФ (254 нм мощностью 65 мВт/см2) и ультразвука (22+1,65 кГЦ мощностью 0,1 кВт)), направленного на обеззараживание воды, содержащей изученные клебсиеллы и псевдомонады, их устойчивость к антибактериальным препаратам увеличивается.

3. Доказано, что потенциально-патогенные клебсиеллы и псевдомонады представляют высокую степень риска возникновения бактериальных, кишечных инфекций распространяемых при питьевом и хозяйственно-бытовом водопользовании населения, и требуют непосредственного определения при проведении бактериологического анализа вод централизованного и нецентрализованного водоснабжения, а также воды поверхностных водоисточников, в которых в настоящее время их определение не предусматривается.

4. Разработана математическая модель, позволяющая прогнозировать вероятность возникновения бактериальных кишечных инфекций при непосредственном выделении' бактериальных возбудителей из воды различного вида водопользования, с учетом изменения их-видового состава (патогенные и потенциально-патогенные бактерии) и биологических свойств;

5. Разработаны критерии оценки, каждого показателя (по трехуровневой и пятиуровневой оценки микробного риска) по степени возможного влияния.на эпидемическую опасность возникновения бактериальных кишечных инфекций. Определены аналитические зависимости для каждого* показателя качества воды, позволяющие перевести его фактическое значение в, вероятностную величину, изменяющуюся в диапазоне риска от 0 до 1.

6. Разработана математическая модель оценки риска в зависимости от состояния санитарно-гигиенических условий водопользования и реальной бактериальной нагрузки (с уровнями достоверности прогноза р<0,01-0,05), которая позволяет дать углубленную обобщенную оценку реальной бактериальной нагрузки, обусловленной водопользованием. Разработанная методика оценки риска позволяет не только прогнозировать изменение санитарно-эпидемиологической обстановки, но и оценить вклад каждого фактора, которыми эти изменения обусловлены, обосновать противоэпидемические мероприятия, обеспечивающие безопасность водопользования.

7. Модифицирован метод определения цитотоксической, адгезивной, инвазивной и токсической активностей патогенных и потенциально-патогенных бактерий, который позволяет изучать связь между цитотоксическим действием бактерий на клетки БЮМ, экспозицией и заражающей дозой. Метод может быть рекомендован к использованию при анализе свойств бактерий как факторов риска.

1.6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Анализ литературных данных многочисленных научных исследований и практики контроля качества воды, как в нашей стране, так и за рубежом, свидетельствует о том, что многочисленные факторы природного, биологического и социального характера влияют на эпидемическую опасность заболеваемости населения ОКИ при контаминации питьевой воды патогенными и потенциально-патогенными бактериями. В связи с этим представляет определенный интерес более детальное изучение биологических свойств микроорганизмов: морфология; биохимическая аквтивность, лекарственная устойчивость, адгезивность, цитотоксичность, патогенность, вирулентность с целью разработки единого подхода к оценке микробного риска возникновению вспышек и спорадической заболеваемости ОКИ, распространяемых водным путем. Оценка микробнгого риска позволит: - выявить потенциальную опасность возникновения острых кишечных инфекций водного пути распространения в качественных и количественных показателях; - выявить факторы внешней среды, способствующие или препятствующие возникновению и распространению острых кишечных инфекций водной этиологии; определить степень реальной бактериальной нагрузки в оценке микробного риска возникновения острых кишечных инфекций и возможность реализации водного пути передачи инфекции; - прогнозировать эпидемическую ситуацию на основании полученных обобщенных данных; -разрабатывать мероприятия по устранению или максимально возможному ослаблению действия неблагоприятных факторов; - определять приоритетность мероприятий по улучшению санитарно-гигиенических условий водопользования в конкретном населенном пункте в целях профилактики кишечных инфекций, обусловленных водным фактором передачи.

Таким образом, анализ литературных данных показывает, что общий подход к оценке риска, включающий в себя оценку реальной бактериальной нагрузки питьевой воды, инфицируемой патогенными и потенциально-патогенными бактериями с учетом санитарно-гигиенических факторов влияющих на заболеваемость населения ОКИ в настоящее время является первостепенной весьма актуальной задачей.

Глава 1. ОЪЕКГЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1.1 .МОДЕЛЬНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ, МАТЕРИАЛЫ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО РАЗДЕЛА ИССЛЕДОВАНИЙ.

В качестве тест-микроорганизмов были выбраны музейные штаммы Escherichia coli 1257, Escherichia coli 675, Salmonella enteritidis 5765 ATCC, Staphylococcus aureus 906, Pseudomonas aeruginosa 10145 ATCC и «дикие» штаммы, выделенные из воды различного вида водопользования Escherichia coli, Klebsiella oxsitoka spp, Klebsiella pneumonia spp., Salmonella infantis spp, Salmonella enteritidis spp, Pseudomonas aeruginosa spp., Yesinia rodey spp, Pseudomonas putida spp. которые являются приоритетными', показателями при оценке качества воды различного вида водопользования^ имеют различную индикаторную значимость, форму, размер клеток.

Кишечные палочки (Escherichia coli) - нормируемый показатель, определяемый по двум признакам - ферментации лактозы и образованию индола при температуре 44°С. Наличие E.coli в воде является достоверным признаком недавнего поступления фекального загрязнения и свидетельствует о потенциальной эпидемической опасности воды. E.coli являются нормальными обитателями толстого кишечника человека и теплокровных животных. Используются в качестве классических индикаторных микроорганизмов при оценке фекального загрязнения воды различного вида водопользования. Среди представителей этого вида имеются патогенные антигенные группы. По морфологическим свойствам Escherichia - грамотрицательные прямые палочки, имеющие величину 1,1 х 2,0-6,0 мкм, отдельные или в парах, подвижные за счет перитрихальных жгутиков, встречаются неподвижные формы. Эти бактерии не образуют капсулы и споры, имеют факультативно-анаэробный тип дыхания. По биохимическим свойствам E.coli относятся к типу ферментирующих бактерий. Штамм 1257 рекомендован в документах Министерства здравоохранения РФ в качестве тест-микроорганизма при оценке дезинфицирующих средств [107].

Staphilococcus aureus — золотистый стафилококк, относится к патогенным микроорганизмам, вызывает различные заболевания кожных покровов, верхних дыхательных путей, половых органов, органов слуха, конъюнктивиты. Иногда присутствует в организме здоровых людей, которые являются носителями этого микроорганизма. Staphilococcus aureus нормируется в воде плавательных бассейнов (СанПиН 2.1.2.1188-03) и в водоемах в местах рекреации (ГОСТ 17.1.5.02-80) как показатель загрязнения воды микрофлорой кожи, верхних дыхательных путей и других полостей человека. Staphilococcus aureus - грамположительные каталазоположительные сферические кокки, размером клеток 0,5 - 1,5 мкм, факультативные анаэробы, но лучше развиваются в аэробных условиях. Обычно растут в присутствии 10% NaCl. На поверхности плотных питательных сред образуют круглые, выпуклые, пигментированные (золотистые, палевые, лимонно-желтые, белые) колонии с ровными краями. Основные биохимические свойства - обладают коагулазной и лецитовителлазной активностью, ферментируют манит в анаэробных условиях. Имеются материалы, свидетельствующие о большей» резистентности стафилококков к обеззараживающим агентам по сравнению с колиформными бактериями - индикаторами фекального загрязнения[107].

Salmonella. Klebsiella. Yesinia - показатели эпидемического неблагополучия при оценке качества воды, использовали как наиболее устойчивые представители семейства Enterobacteriaceae.

Salmonella - патогенны для человека и многих видов животных, вызывает кишечные инфекции, гастроэнтерит и септицимию. Род сальмонелл грамотрицательные прямые палочки размером 0,7-1,5 х 2-5 мкм. Подвижные за счет перитрихиальных жгутиков. Факультативные анаэробы. Оптимальная температура инкубации 37°С. Катаболизирует D-глюкозу и другие углеводы с образованием кислоты и газа. Оксидазоотрицательные, катал азогюложительные, индолоотрицательные, декарбоксилируют лизин и орнитин, образуют сероводород, мочевину не гидрализуют, восстанавливают нитраты.

Klebsiella - вызывают оппортунистические инфекции у человека, в том числе бактериемию, пневмонию, инфекцию мочевых путей. Встречаются в фекалиях человека и клинических материалах, почве, воде, на фруктах и овощах. Известно более 80 капсульных антигенов, используемых для серотипирования клебсиелл. Клебсиелла прямые палочки размером 0,3-1,Ох 0,6-6,0 мкм, одиночные, в парах или коротких цепочках. Клетки имеют капсулу. Грамотрицательные, неподвижные, факультативные анаэробы. Катаболизирует D-глюкозу и другие углеводы с образованием кислоты и газа, однако встречаются и не образующие газ, штаммы. Оксидазоотрицательные, каталазоположительные. Большинство видов сбраживают все обычно тестируемые углеводы, за сключением дульцитола и эритритола.

Yesinia - встречаются в разнообразных местах обитания, включая человека, животных, особенно грызунов и птиц, почву воду, продуктах питания. Отдельные виды патогенны для многих видов животных и иногда для человека, вызывают мезентеральный лимфаденит, хроническое желудочно-кишечное расстройство и тяжелую септицемию, другие виды в отдельных случаях вызывают оппортунистические инфекции у человека или непатогенны. Бактерии рода иерсиния прямые палочки, иногда приобретающие сферическую форму, диаметром 0,5-0,8 и длиной 1-3 мкм. Грамотрицательные. Неподвижные при температуре 37°С и подвижные при температуре ниже 30°С за счет перитрихиальных жгутиков, факультативные анаэробы. Оптимальная температура инкубации 28-30°С. Катаболизирует D-глюкозу и другие углеводы с образованием кислоты и газа, отдельные представители иерсии газ не образуют.

Pseudomonas aeruginosa - потенциально-патогенный микроорганизм, наиболее эпидемически значимый для питьевых вод, подлежащих хранению, в том числе воды расфасованной в емкости. Представляет опасность при водопользовании из-за высокой способности размножаться в воде, поскольку не требователен к наличию в воде органических веществ, а использующий в процессах метаболизма минеральные вещества, растворенные в воде.

Общее микробное число - нормируемый показатель, обобщающий большую группу аэробных и факультативно аэробных микроорганизмов, выявляемых по способности роста на питательном агаре при температуре 37°С в течение 24 часов с образованием колоний, видимых при увеличении в два раза» и является показателем уровня общего микробного загрязнения питьевой1 воды и не только дополняет характеристику фекального загрязнения^ полученную по индикаторным показателям^ но и позволяет выявить загрязнение, связанное с иными источниками.

Общие колиформные бактерии (ОКБ) - нормируемый показатель, определяющий группу колиформных бактерий, ферментирующих- лактозу при 37°С. Лактозооотрицательные бактерии семейства Еп1егоЬас1епасеае, среди которых ¡эпидемически значимые патогенные и потенциально-патогенные виды, вызывающие кишечные инфекции, (например, сальмонеллы^ гафнии, эдвардсиеллы, морганеллы, протеи, серрации, провиденции и др.) остаются не учтенными.

Глюкозоположительные бактерии (ТКБ) -нормируемый показатель в воде, расфасованной в емкости. Этот показатель контролирует в воде широкую группу микроорганизмов семейства Еп(егоЬас1епасеае, чем колиформы, ферментирующих глюкозу и лактозу при 37°С. Группа ГКБ. гарантирует отсутствие в исследуемом объеме воды как лактозоположительных показателей (Е.соН, ОКБ, ТКБ), так и патогенных (сальмонеллы) и потенциально-патогенных видов бактерий, не ферментирующих лактозу.

Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) — нормируемый показатель, но исключен из международных документов ЕС и стандартов

Проведенный нами статистический анализ данных зарубежных стран по вспышечной заболеваемости, связанной с водным путем передачи ОКИ, показал, что источники питьевого водоснабжения, связанные с грунтовыми водами в значительно большей степени обсеменены патогенными бактериями по сравнению с поверхностными водоисточниками и частными колодцами, особенно в теплое время года (рис. 2.1.1.). Анализируя роль воды, как рискообразующего фактора распространения острых кишечных инфекций, выявлено, что наиболее часто вспышки ОКИ обусловлены появлением в местах водозабора (например, грунтовые воды) Cryptosporidium parvum (68,2%), в поверхностных водоемах Escherichia coli О 157: Н7 (21,4%) и Salmonella sonne.

Таким образом, проведенные статистические исследования доказывают непосредственную роль водного фактора в возникновении ОКИ, а также актуальность разработки математического метода оценки риска при микробной контаминации воды различного назначения и водного фактора распространения кишечных инфекций.

Рис.2.1.1 Частота установленных вспышек острых кишечных инфекций, вызванных патогенными бактериями при употреблении воды из различных типов водоисточников (%).

У-66

2.2. ОЦЕНКА ФАКТОРОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА СТЕПЕНЬ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОДЫ В МЕСТАХ ВОДОПОЛЬЗОВАНИЯ НАСЕЛЕНИЯ НОВГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ.

Анализ качества водоснабжения Новгородской области был проведен по ретроспективным данным за 13 лет (1995-2008). Проанализировано качество воды водоемов I и II категории по показателю % нестандартных проб по 166 контрольным створам, в том числе 43 — на водоемах I категории и 123 - на водоемах П категории (таблица 2.2.1.) в сравнении с показателями по РФ [41,42,43,44,45,46,47,48,108]. Совершенно очевидно, что санитарное состояние рассмотренных водных объектов, использующихся в качестве источников питьевого и хозяйственно-бытового водопользования населения с каждым годом ухудшается в среднем на 2,3 %.