Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Эпизоотология и диагностика морбилливирусной инфекции у тюленей

На правах рукописи

РГБ ОН

2 7 янв №7

ЗОРИН ВАДИМ ЛЕОНИДОВИЧ

УДК 619:616.988-07:639.13

ЭПИЗООТОЛОГИЯ И ДИАГНОСТИКА МОРБИЛЛИВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У ТЮЛЕНЕЙ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпи юология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Омск- 1997

Работа выполнена к лаборатории химии и биохимии нуклеиновых кислот Лимнологического института, лаборатории особо опасных вирусных инфекций Противочумного института, г.Иркутск, кафедре эпизоолигии и инфекционных болечнен животных Омского государственного аграрного университета.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор ветеринарных наук, профессор В. Г. Ошспков

доктор биологических наук Г. Н. Сидоров доктор ветеринарных наук О. А. Приступа

Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН

Защита состоится "

_____" ^и^й-'Ь*! 1997г. в № час, на

заседании диссертационного совета Д.120.48.01 при Институте ветеринарной медицины Омского агроунивсрситета по адресу: 644007, ул. Октябрьская, 92.

С диссертацией можно (Знакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан "__ I "¿¡ОЦ^и,^ ]997г.

Ученый секретарь диссертационного совета, у

доцент ~ Н. А.

. А. Королева

ОБЩ\Я ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Тюлень с полным пряном может быть отнесен к чиелу интереснейших представителей морской и озерной фауны. С древнейших времен тюлень принадлежит к обьектам зверобойного промысла и добьшаегся ради пищевого и технического жира, мяса и меховых шкур. Особенно привлекательна популяция байкальской нерпы. Эго эндемичное животное Байкала, самое высокоорганизованное существо, замыкающее вегвь экосистемы озера-моря. В последнее время нерпой заинтересовались эпидемиологи, эпизоотологи, вирусологи, бактериологи.

Интерес вызван тем, что осенью 1987г. была зарегистрирована массовая тбель байкальских тюленей. Только в осенне-зимний сезон 1987-1988 ir. погибло до 10 тыс. животных из общего числа 70 тыс. Во время штормов большое число тюленей было выброшено на восточное побережье Байкала. Часть животных в момент их обнаружения была мертва.

Быстрое распространение инфекции но всей акватории озера, клиническая картина заболевания позволили выдвинуть предположение о роли вируса чумы плотоядных. как этиологического агента данной эпизоотии.

Спустя 6 месяцев подобная эпизоотия произошла в Северном и Балтийском морях у обыкновенных и серых тюленей.

Цель исследования - выяснение причины и особенностей эпизоотии у байкальской нерпы, наблюдавшейся в 1987-1988 гг., и разработка методов диагностики данной болезни.

Основные задачи исследования:

1. Провести вирусолошческие исследования с целью подтверждения (исключения) лиолоптческой роли вирусов в эпизоотии.

2. Провести нндентификацию выделенных вирусов.

3. В случае выделения морбилливируса:

а) изучить возможность и условия применения клеточного иммуноферментного анализа, ангнгенсвязывающего иммуно-ферментного анализа, реакции нейтрализации нитопатического действия вируса и реакции непрямой иммунофлюоресценции для выявления тюленей - носителей этого вируса.

б) изучить особенное!и проявления инфекционного и эпизоотического процессов у байкальской нерпы, вызываемых

морбилливирусом.

Для проведения этих исследовании был получен международный научный грат Сороса (США).

Научная новизна. Впервые в России:

♦ Выделен из организма тюленей инфекционный агент и охарактеризован, как морбгшливирус, родственный вирусу чумы собак.

♦ Рафабоганы принципы и технология идентификации морбиллнвирусов поленей с использованием современных иммуноложческих методов и средств

(иммуноферменгного аналша. реакции непрямой иммунофлюоресцагции. реакции нейтрализации).

♦ Разработаны специфические методы и прижизненной и постморталышй диагностики морбилливирусной инфекции у байкальской нерпы.

♦ Определены особенности проявления эпизоотического процесса морбшитивпруеной инфекции у поленей разного возраста и пола.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследования биоварианта вируса, способного паразитировать в организме байкальской нерпы и других видов лаеюношх дополняют теорию эволюции пагогенов новыми научными фактами и могут быть использованы для усовершенствования таксономии и систематики семейства морбиллнвирусов.

Полученные данные составляют также основу для разработки мероприятий но профилактике и ликвидации морбшишвирусной инфекции тюленей.

Внедрение результатов исследований. Составлены рекомендации по экспресс-диагностике морбилливирусной инфекции у поленей, пригодные для применения в научных и производственных лабораториях.

Основные положения, выносимые на защиту. Особенности и закономерности проявления эпизоотического процесса, вызванною морбилливирусом у байкальской нерны. Система диагностики морбшишвирусной инфекции у тюленей.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на I Верещагинской Байкальской конференции (Иркугск, 1989), X Всесоюзном совещании по изучению, охране и рациональном использовании морских млекопитающих (Светлогорск, 1990), Международной конференции по ветеринарной медицине мелких домашних животных (Москва, 1994), на Международной конференции но акгуальным проблемам ветеринарки (Барнаул, 1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 научных статей, шесть ш них включены в коллективную монографию.

Структура и объем работы. Диссертация изложена па 142 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов собственных исследовании, обсуждения нолучепных результатов, выводов, предложении, списка литературы. Работа иллюстрирована 17 рисунками, 13 таблицами. Список цитируемой литературы содержит 177 источников, из них 50 отечественных и 127 зарубежный авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы. В рабою были использованы Животные: байкальские полепи (нерпы) обоего пола (323 гол.), каспийские тюлени (50 юл.), дальневосточные тюлени (10 гол.), каланы (8 юл.), беснагогенные собаки - бигли (2 гол.), полученные нз питомника Национального инстшута здравоохранения и окружающей среды (Голландия);

Ulj аммы вирусов: морбилливирусный изолят (ВЧТ-2). выделенный из байкальской нерпы РВ-9 совместно с доктором А. Д. Остсрхаузом (1989-1990 тт.);. морбилливирусный изолят (ВЧТ-1), выделенный из североморского тюлепя совместно с доктором А. Д. Остерхаузом (19891990 it.): морбилливирусный изолят МБН, выделенный из байкальской нерпы совместно с А.М.Титснко (1990 т.); вакцинный штамм вируса чумы плотоядных (ЭПМ), полученный из московского предприятия но производству бактериальных препаратов; вакцинные штаммы вируса чумы плотоядных (Bussel и Onderstepoort), полученные из лаборатории иммунобиологии Национального института здравоохранения и окружающей среды (Голландия).

Сыворотки: 232 пробы сывороток крови от байкальских нерп различного возраста и пола, собранные во время весенне -летних экспедиций 1988-1989 гг.; 50 сывороток каспийских тюленей; 9 сывороток дальневосточных тюленей; 8 сывороток ог каланов; более 4000 образцов сывороток крови от тюленей, собак, коз, кроликов, мышей и человека.

Моноклональиые антитела: 32 мышииных образца моноклональных антител, реагирующих с вирусом чумы плотоядных (штамм Convac), полученные от доктора С. Oivell (Институт вирусолоши, Стокгольм, Швеция, 1989 г.).

Культуры клеток: стандартные клетки Vero и MDCK, Hela, ФЭК, полученные из московского предприятия по производству бактериальных препаратов. Культивировали и заражали клетки по общепринятой методике (В.Н. Сюрин и др., 1979 т.).

Изоляция морбишшвируса. В 2-х-суточные моиослойные культуры клеток Vero на ЮО-мл матрацах инокулировали но 0,5 мл 10%-иой суспензии селезенки, печени, легкого больной нерпы в присутствии 100 ЕД шптамшшна. На уровне 7-8 пассажей титр вируса в культуралъной жидкости был - 107 ТВД 50/мл. Очищенные концентраш вируса получали но схеме: а) осаждение клеток при 500 g 10 шш. б) осветление культуралъной жидкости при ÍO'OOO g, 30 шш. в) осаждение вируса, ротор TY 35 при ЗО'ООО об\мин. 120 шш. г) очистка вируса в градиенте плотности сахарозы 20-60%, ротор SW 27,1 при 24'000 об/мин., 14 часов. Фракции пика с плавучей нлошостыо - 1,18 г/см при длине волны 254нм использовали как антиген в реакции имму] гоферме iгпюго анализа.

Серологические реакции. Реакция непрямой 1емаплютинации проводилась по утвержденной Министерством здравоохранения РСФСР схеме (1980 г.) с собственной модификацией. Дня исследования одной сыворотки использовали один ряд лунок 9б-ти луночной иаиели. Каждую .сыворотку титровали на ФБР (фосфатно-буферныи раствор) рН 7,2 от 1:10 до 1:640. Сыворотки вносили в лунки по 0.05 мл. Затем вносили в каждую лунку 0,05 мл 1%-ной взвеси диагностикума эритроцитарного коревого антигенного. Ставили контроль диагаостикума на отсутствие его спонтанной агглютинации. Панель встряхивали и оставляли при комнатной температуре на 2 часа до полного оседания эритроцитов в контроле, после чего производили учет результатов.

Приготовление морбнлливирусного антигена для реакции имму-нофлюорссцетши. Клетки Vero инфицировали морбилливирусом с множественностью 0,1 ТЦЦ 50/клетка. После одного часа адсорбции монослой отмывали, к клеткам добавляли среду Игла-MEM с 1%-ной эмбриональной телячьей сывороткой и инкубировали в течении 48 часов. Удаляли культуральнуш жидкость, монослой трижды промывали ФБР рН 7,2. Контролем антигена служили иеинфицированные морбилливирусом клетки Vero. Фиксацию клеток на покровных стеклах проводили в ацетоне при -20° С 5мнн.

Приготовление морбиллигшруспого антигена для клеточного иммуио-фермен того анализа. Монослой клеток Vera Выращивали в 96-луночных планшетах при 37° С в присутствии 5% СО, и среде Игла-

MEM с 10%-noii телячьей сывороткой. Клетки инфицировали морбилливирусом с множественностью 0.1 ТЦД 50/клетка. Удаляли культуральпую жидкость, монослой трижды промывши? ФБР рН 7,2. Контрольный антиген - неиифнцированные клетки Vero. Пластины с антигеном высушивали и течении сугок при 37° С и хранили при 4° С до использования.

Постановка антиген-связанного иммуноферментного анализа. Препараты очищенного морбилливируса использовали для сенсибилизации 96-луночных планшетов антигеном в концентрации 1 мкг/ мл в течение 18 часов при 4° С в 0,01 М трис-НС 1-буфере рН 7,2 с 0,15 М NaCl по 100 мкл. Лунки отмывали 0,01 М ФБР рН 7,2 с 0.05%-ным раствором твип-20 три раза ио 5 минут. Блокировку свободных участков проводили 1%-ным раствором БСА (бычий сыворочныи альбумин). Планшеты промывали и вносили ио 100 мкл тссшрусмых сывороток кров» в ра ¡личных разведениях на ФБР с 0,05'%-ным раствором твина-20 и 1%-ным раствором БСА. Планшеты инкубировали 120 минут при комнатной температуре, отмывали и вносили меченый пероксидазой хрена белок А из Si. aureus (Sigma) в рабочем разведении 1:1000. Инкубировали 60 минут при 37° С, отмывали 5 раз по 10 кинут, затем вносит и по 100 мкл свежеприготовленного раствора ортофенилендиамина. Результаты анализа учитывали, измеряя оптическую плотность в лунках планшетов, при шише волны 492 им с иомошью прибора "Multiscan" (Flow Lab). Отрицательный контроль -лунки без морбилливируспого антигена. Положительный контроль -специфическая тесг-сьшоро1ка к морбилливирусиым антигенам.

Постановка клеточного иммуноферментного анализа. В качестве антигена использовали монослой клетокУего, инфицированных морбиллнвнрусом. Планшеты с вирусными и контрольными антигенами промывали однократно проточной водой и трижды 0.01 М ФБР рН 7,2 с 0,05%-ным твин-20. Свободные антигенные сайты блокировали 1%-ным раствором БСА час при 37° С. Пластины промывали ФБР с твнн-20 и инкубировали час с коныогагом-нерокешша хрена с белком А из St. aureus (Sigma). Количество специфически связанного коньюгата проявляли добавлением субстратного раствора с ортофенилендиами-ном в нитратном буфере. Результаты анализа учитывали, измеряя оптическую плотность при длине волны 492 им с помощью прибора "Multiscan".

Постановка реакции непрямой и\гмунофлюоресиеиции. После фиксации клеток проводили отмывку от ацетона 0,01 М ФБР с 1%-ным БСА. Сыворотки крови от животных добавляли в двухкратном разведении и инкубировали 1 час при 37° С. Отмывали от песвязавшихся антител в 0,01 М ФБР три раза но 5 минут и добавляли меченый флюоресцин-юотиоционатом белок А из St. aureus (Sigma) в рабочем разведении 1:2000. Инкубировали 30 мппуг при 37° С. Отмывали в 0,01 М ФБР три раза по 5 минут. Препараты исследовали в люминесцентном микроскопе.

Постановка реакции внрусисйтрализации. Реакцию вирус-нейтрализации ставили в 96-луночных планшетах. Сыворотку крови от тюленей на наличие вируснейтрализующих антител к морбилливирусу, исследовали в культуре клеток Vero. Исследуемые сыворотки разводили десятикратно питательной средой Игла-MEM и в объеме 50 мкл нреицкубировалц .с равным объемом раствора морбилливируса, количество которою было в пределах 10-30 ТЦД 50, Г час при 37° С в 96-луночных планшетах/Затем в каждую лунку "вносили 2x10 клеток Vero в объеме 50 мкл. Инкубировали в течение 57 дней в питательной среде Игла-МЕМ с 2%-пои эмбриональной телячьей сьшороткой при 37° С и 7% СО,. Клеточный контроль - без сыворотки или вируса. Вирусный контроль - среда без сыворотки. Реакцию : нейтрализации учитывали микроскопически на 5-7 день, обнаруживая характерный цитопатический эффект в лупках с вирусным контролем.

... Электрофорез белков в нолиамилакридном геле проводили по стандартной методике (U. К. Laemli, 1970), используя 12,5% разделяющий гель.

Иммуноблотинг проводили но методике Н. Towbin et al. (1979). После проведения электрофореза белки переносили на 2 листка нитроцеллюлозы (ВА83Д2 мкм, Schleicher, Schuell) на приборе для полусухого переноса Semi-Phor ТЕ-70 (Hoetter, ФРГ)- Для блокировки незанятых мест связывания на нитроцеллюлозе использовали 5% обезжиренное сухое молоко или Ш%,-иьщ БСА на ФБР pH 7,2. После блокировки фильтры инкубировали с моноклональными антителами к структурным белкам вируса чумы плотоядных в течении 1 часа при комнатной температуре и постоянном покачивании. Затем фильтры отмывали ФБР и инкубировали в аналогичных условиях с антителами против мышинных иммуноглобулинов, меченных пероксидазой (Sigma, США). В качестве проявляющей системы-использовали 0,5% диаминобензшшн (Sigma, США) или 1% альфа-хлор-4-нафтол (Sicilia, США) на ФБР с 0,1%-ным раствором перекиси водорода.

Титр вируса в исследуемых объектах рассчитывали по методу Рида-Лески (Я. Е. Коляков и др., 1967). Идентификацию выделенный из тюленей вирусов осуществляли по схеме, рекомендованной А. Г.

Букршккои (1978) и Международным комитетом по таксономии вирусов с учетом их морфологии, ультраструктуры отдельных фрагментов, устойчивости к физико-химическим воздеиствггям и г. д.

Биомоделирование морбил.чпвирусной инфекции проводили на двух собаках-биглях, зараженных ВЧТ-2 под контролем иммунологического и клинического методов. Дозу и способ введения вируеосодержащего биоматерпала определяли с учетом вирулентных свойств вируса и видовых особенностей заражаемых животных.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Вирусологические исследования биоматериала, взятого от больных и павших тюленей. Вирусолопгческие исследования проводили на биоматериале, взяюм от больной байкальской нерпы РВ-б. В 2-суточные монослойные культуры клеток Vero, Hela и ФЭК инокулировали по 0,5 мл 10% суспензии селезенки, неченл. и легкого нерпы РВ-б. В течении 2-х пассажей в культурах ФЭК и Hela изменений мопослоя не отмечалось. В кулыуре клеток Vero на 2-м пассаже через 72 часа инкубации было отмечено образование симплас гов, округление клеток и разряжение мопослоя, отсутствующее в контрольных культурах. На уровне 7-8 пассажей татр вируса в кулътуральной жидкости составил Ю7 ТЦД. Вирус очшшиш в градиентах 20-60 % сахарозы. Выли отмечены 2 пика материала. Наиболее активный из них имел плавучую плотность в сахарозе 1.18 г/см\ характерную для морбгшшвирусов (D.W. Kingsburi et al.. 1978; R.E.F. Mftthews, 1982). Материал указанных фракций использовали в твердофазном иммуноферментном анализе. Вирус с плавучей плотностью 1,18 г/см3 активно взаимодействовал с человеческими иротивокоревыми иммуноглобулинами в титре 1:10240 и не взаимодействовал с антителами сыворотки от клинически здорового каспийского тюленя. Тигр антител в сыворотке больной байкальской нерпы РВ-9 - 1:640 был выше, чем тигр антител, полученных от нерпы РВ-123, у которой не отмечались клинические симптомы заболевания. Особый интерес представляет активность сыворотки обыкновенного тюленя Северного моря Phoca vitulina. код г-611 с выделенным вирусом. Сыворотка крови этого животного реагировала в иммуноферментном анализе с выделенным вирусом в титре 1:640. Эта же сыворотка, исследованная в реакции нейтрализации, содержала вирус-нейтрализуюгцие антитела против вируса чумы собак в титре 1:300. Сыворотки от байкальских тюленей РВ-9, РВ-123. обыкновенного поленя с Северного моря (Z-611) и человеческие нротивокорсвые антитела реагировали в клеточном иммуноферментном анализе с вакцинным штаммом ЭПМ в титрах 1:320 и выше. Сыворотка

каспийского тюленя РС-1, тягая как отрицательный контроль, не содержала специфических антител к штрусиым антигенам этого штамма. Выделенный вирус был охарактеризован, как морбшшнвнрус.

В лаборатории доктора ветеринарии профессора А.Д.М.Е. Остерхауза из органов (головной мозг, печень, селезенка) больной байкальской нерпы РВ-9 бьи также выделен и охарактеризован вирусный агенг (ВЧТ-2). Характеристику вируса проводили с помощью панели моноклональных антител к структурным белкам вируса чумы плотоядных, любезно предоставленных доктором К. Орвелом (Швеция).

В связи с тем, что подобная эпизоотия, спустя 6 месяцев произошла в Северном и Балтийском морях, интересно было сравнить вирусные шолятъг, выделенные от байкальских и североморских больных тюленей. Сравнивали байкальский морбшшивирусный изалят с и юля гам обыкновенного тюленя Северного моря. Исследования проводили методом непрямой иммуно-флюоресценции на клеточной линии Vero, инфицированной каждым из перечисленных вирусов. Все моноклональные антитела против белков N и Р вируса чумы нлошядных реагировали с ВЧТ-2. Из 7 моноклональных антител против белка F и из 8 против белка Н реагировали с ВЧТ-2 6 и 3 моноклональных антител соответственно. Морбшишшрус, изолированный от североморскою тюленя, взаимодействовал с 5 моноклональными антителами из 9 против N белка и в таком же соотношении для белка Р. F-сненифичными оказались 5 из 8 антител и Н-специфнчиьши - 3 из 8 моноклональных антител.

Оказалось, что изолят от Phoca sibirica по эпитопному анализу вирусных белков очень близко родственен вирусу чумы плотоядных. Что касается шолят а от Phoca vitulina, то, по-видимому, он является самостоятельным подвидом или сероваром морбилливирусов, персистирующих у североморских тюленей. В Вестерн блог анализе проводили идентификацию ВЧТ-2, также используя моноклональные антитела к белкам Н, N и Р вируса чумы плотоядных. Р-белок от ВЧТ-2 обладал меньшей электрофоре гической подвижностью, чем Р-белок северомрского изолята (ВЧТ-1) и почти совпадал с белком Р вируса чумы плотоядных. Н-белок от байкальского изолята совпадал по электрофоретическои подвижности с Н-белком (ВЧТ-l) и оба мигрировали более медленно, чем белок Н вируса чумы плотоядных. Нуклеопротеины байкальского изолята и вируса чумы плотоядных обладали одинаковой элек трофоретической подвижностью. NP-белок же от североморского изолята мигрировал в отличие от них несколько медленнее. Практически нет различий но электрофоретической подвижности F-белка всех грех вирусов.

Таким образом, иммуноблотинг, проведенный с последующим

проявлением моноклониальными антителами к вирусным белкам чумы плотоядных, выявил присутствие всех морбилливирусных белков в вирусных изолятах от байкальских и североморских тюленей с характерными для них молекулярными массами. Следовательно, структурные белки, выявленные с помощью моноклональных антител, являются специфичными и характерными для морбилливирусов. Выделенный вирусный июля г oí байкальских тюленей может быть отнесен к семейству морбилливирусов и классифицирован как бновар, близкий к вирусу чумы плотоядных.

Применение серологических реакций для идентификации морбилливирусов, выделенных от байкальских тюленей, и специфических антител. Первые серолошческие исследования сывороток крови на присутствие специфических антител от 8 байкальских нерн были проведены в реакции непрямой гематтлютипации с использованием коревого эрнтроцитарного диагностикума. В результате было установлено, что в сыворотках крови исследованных тюленей содержались специфические антитела в титрах 1:20 - 1:80, реагировавшие с коревым эритроцнтарным антигеном. Положительно реагировали сыворотки от тюленей, имеющих явные клинические признаки заболевания (ринит, коньюктнвит. диарея, парезы и параличи задних ласт). Специфичность антител была подтверждена также в реакции торможения гемагтлютииании.

Для исследования специфических антител в сыворотке крови от байкальских нерп использовали также клеточный иммуноферментный анализ (ИФА) с вакшшным штаммом вируса чумы плотоядных (ЭПМ).

Всего за 1988 год исследовано 74 сыворотки от тюленей разного возраста и пола. В крови 59 животных (80%) присутствовали специфические антитела к вирусу чумы плотоядных в титрах 1:40 -1:1280. В сыворотках крови от 20 животных (27%) выявлены гитры антител от 1:40 до 1:160. У 39 животных (53%) сывороткл крови peaiпровали в титрах 1:320 и выше. Высокий процент (80%) сероноложительных животных свидетельствует о быстром распространении инфекции среди нерп. Высокие титры 1:320 - 1:1280 - об активной циркуляции морбилливируса в популяции.

В 1989 году проведен анализ от 150 байкальских нерн, не имевших выраженных клинических признаков болезни. Анализ проводили клеточным иммуноферментным методом с выделенным морбишшвирусом от нерпы РВ-б. Общее количество серопшюжительных животных - 58% с титрами 1:40 - 1:1280. У 65 животных (43%) выявлены специфические антитела в тиграх от 1:40 до 1:160, а у 22 животных (15%) обнаружены титры антител от 1:320 - 1:1280. Твердофазный иммуноферментный анализ 57 сывороток крови от байкальских нерп с морбилливирусом,

выделенным от нерпы РВ-9 показал, что в крови 29 тюленей (51%) присутствовали, специфические антитела в титрах 1:60 - 1:540. У 14 животных (25%) выявлены титры антител 1:60. У 10 тюленей (17%) титры антител достигали 1:180 и у 5 животных (9%) они были на уровне 1:540.

Результаты свидетельствуют о тенденции к снижению серо-положительных животных в 1989 г. и уменьшению их доли с высокими титрами антител, что позволяет сделать вывод о естественном падении титров антител, связанных с временным фактором. Разработка и применение двух типов иммуноферментного анализа, оказались эффективными для выяснения путей циркуляции морбиллшшруса в популяции байкальской нерпы и для изучения сывороток, полученных от клинически здоровых байкальских нерп.

В реакции нейтрализации (РН) .цитопатического действия вируса чумы плотоядных (штамм ЭПМ) проанализированы 65 сывороток крови от байкальских иерц (1988 г.). В 27 сыворотках вируснейтрализующие антитела были; в очень низких титрах (титр < 1:4), 7 (11%) нейтрализовали вирус в титре 1:8; в 17 (26%) реагировали в разведении 1:16, 9 сывороток (14%) содержали вируснейтрализующие антитела в титрах более,, чем 1:64. Общий процент животных, в крови которых содержались вируснейтрализующие антитела, составил 59%. Меньший процент по сравнению с процентом сероноложительных животных, выявленных в ИФА за этот же год свидетельствует о более высокой чувствительности последнего.

Используя РН выяснили также степень родства и титры вируснейтрализующие антител к изолятам, выделенных от байкальских, североморских тюленей и к вирусу чумы плотоядных. Провели сравнительный анализ 25-ти сывороток крови от байкальских нерп с ВЧТ-2 и вирусом чумы собак (штамм Bussel). Из 25 сывороток 4 реагировали с татрами 1:20 и 1:180 только с. ВЧТ-2. 6 сывороток с одинаковыми титрами реашровали как с ВЧТ-2, так и с вирусом чумы собак. Остальные сыворотки реагировали с титрами от 1:20 до 1:540 и выше как с ВЧТ-2, так и с вирусом чумы собак. 27 Сывороток от байкальских нерп ставили в реакции нейтрализации с ВЧТ-2 и ВЧТ-1. 3 оказались серонегативными (титр < 1:20) как с ВЧТ-2, так и с ВЧТ-

1. 4 реагировали с одинаковыми титрами (1:20, 1:80 и 1:540) с обоими изолятами. 6 содержали вируснейтрализующие антитела только к ВЧТ-

2, остальные 13 сывороток реагировали с большими титрами с ВЧТ-2, чем с ВЧТ-1. 26 сывороток ставили в реакции нейтрализации с ВЧТ-1 и вирусом чумы собак. Оказалось, что 10 сывороток с тиграми антител от 1:20 и до 1:540 нейтролизовали только вирус чумы собак и были серонегативны в ВЧТ-1. 8 сывороток с одинаковыми титрами от 1:20

до 1:540 и выше нейтролизовали оба вируса, остальные 8 реагировали с более высоким титрами с вирусом чумы собак, чем с ВЧТ-1. Антитела от байкальских нерп с высокими титрами нейрализовали морбилливирус, циркулирававший в их популяции, в значительно большей степени, чем близкородственный, выделенный от североморских тюленей. У сероноложительных байкальских нерп вируснейтрализующие антитела в более высоких титрах реагировали с вирусом чумы плотоядных, чем с морбилливирусным изолятом ВЧТ-1, что свидетельствует о большем антигенном родстве морбшшивирусного изолята ВЧТ-2 к вирусу чумы плотоядных, чем морбилливирусному изоляту от североморских тюленей.

Таким образом, вируснейтрализуюший анализ может быть использован для массового скрининга антител в популяции байкальской нерпы, а также для решения вопроса о таксономическом положении выделенных морбилливирусов.

Носительство морбилливируса у байкальских тюленей различного возраста и пола. В целях изучения вопроса о носительствс морбилливируса были исследованы три возрастные группы байкальских нерн, которые обитали в северной части озера Байкал. В первую группу быгш включены тюлени - первогодки в возрасте 3-4 месяца, во вторую

- в возрасте, от 1 до 3 лет, и в третью - животные старше 3-х лет. В 1988 г. первой (руппе проанализировано в иммуноферментном анализе 13 животных, 10 из которых оказались сероположительными (77%) с титрами специфических антител от 1:40 до 1:1280. Во второй возрастной группе проанализировано 13 тюленей, из которых сероноложительных

- 69%. В группе старше 3-х лет проанализировано 48 нерп, в крови 40 (83%) присутствовали специфические антитела к морбилливирусным антигенам. При сопоставлении тигров специфических антител в двух возрастных группах до 1 года и старше выявилось, что в группе первогодок практически равное количество тюленей, имевших как низкие (1:40 - 1:80), так и высокие титры (1:160 - 1:1280) антител, тогда как в группе тюленей старше года явно преобладало число .животных с высоким титром антител. Из этих данных следует, что формирование высокой иммуной прослойки приходилось на половозрелых животных и на щенков от 3 до 4 месяцев, у части которых, по-видимому, сохранились колостральные антитела. Наличие у нерп старше одного года более высоких титров антител может указывать на активную персистенцию морбилливируса у животных этого возраста. 84% самцов всех трех возрастных групп имели в сыворотке крови специфические, антитела к морбилливирусным антигенам. Среди самок число сероположительных особей достигало 75%. Сходный процент сероположителытых тюленей среди самцов и самок свидетельствует об их почти равной восприимчивости к морбилливирусной инфекции.

При тестировании сывороток крови у байкальских нерп, собранных в мае - июне 1989 года, вновь было выявлено значительное количество сероноложительных животных. Б группе первогодок из 50 животных 45 (90%) были сероположительньтми. В возрастной 1рушю 1-3 года количество серо-положительных животных снизилось до 48%. В груше старше 3-х лет доля сероноложительных животных составила 38%. Приблизительно равное соотношение сероноложительных животных среда самцов (38%) и самок (42%) всех возрастов, как и в 1988 г. свидетельствует об их одинаковой чувствительное™ к морбилливирусам. В 1989 году наибольшее количество животных в возрастной фугпге до 1 года имели титры антител от 1:40 до 1:640. В возрастной группе старше одного года возросла доля сероотрицательных животных и снизилось количество тюленей с высокими титрами антител (1:640 - 1:1280). Анализ уровня антител у нерп в возрасте ЗА месяца и старше 1 года показал высокие титры антител у первогодок и резкое снижение количества сероноложительных животных старше 1 года, что может' быть связано с гибелью части детенышей в возрасте до одного года в следствии высокой восприимчивости их к инфекции. Снижение доли сероноложительных животных (58%) в 1989 г. по сравнению с 1988г. (80%), вероятно, связано с естественным затуханием инфекциошюго процесса, а также с I и белью живогшлх во время эпизоотии. Увеличение же доли сероположительньгх животных в возрасте 3-4 месяцев (90%) в 1989 г. по сравнению с долей сероноложительных животных (77%) в 1988г.; а также увеличение доли животных с высокими титрами антител в 1989г . по сравнению с 1988 г, связано, по-видимому, с активной персистешгией вируса в популяции и высокой восприимчивостью к иему щенков в этом возрасте.

Серологические исследования иммунной прослойки байкальских тюленей за 1988 - 1989 гг. позволяют считать морбилливируспую инфекцию установленным фактом и сделать вывод о том, что морбилливирус, как минимум, с 1987 г. циркулирует в популяции байкальской нерны.

Сравнительная характеристика инфекционного процесса, вызванного морбилливирусом, у собак-биглей и байкальской нерпы. Для заражения 2-х собак-биглей использовали инфекционный материал от больной нерпы РВ-10. При заражении у собак развилась типичная для чумы плотоядных клиническая картина - повышение температуры тела, респираторные симптомы, лейкоцитоз. С 7-го дня инфицирования наблюдался прирост титров вируснейтрализуюшйх антител как к тюленьему морбилливирусу (1:20 - 1:160), так и к вакцинному штамму чумы плотоядных (1:20 - 1:80). Такая динамика нарастания титров антител свидетельствует о развитии инфекционного процесса у зараженных животных.

Выделенные oí собак морбодишвирусы при совместном кулыивировашш с клетками Veio и MDCK стимулировали образование симгшастов в культуре клеток Vero, также как и в конрольном опыте - вирус чумы плотоядных. С клетками MDCK нитонатическото действия как морбшишвирусов, так и вируса чумы плотоядных не наблюдалось, что указывает на одинаковую природу этих вирусов. Низкая же вирулентное ib тюленьего морбилливируса может быть связана с использованием животных, свободных от патогенов.

Для окончательного подтверждения роли морбиллнвирусов в эпизоотии воспроизвели экспериментальную инфекцию и а чувствительном животном - клинически здоровой нерпе в возрасте 5 месяцев, в сыворотке крови которой не содержались специфические антитела к вирусу чумы плотоядных. Инфицирование проводилось культуральным вирусом в гит pe 107 ТЦД 5О/мл. Через несколько дней после заражения развились клинические симптомы, характерные для чумы плотоядных. На 10-й день после инфицирования в сыворотке крови выявлялись в ИФА специфические антитела как к морбилливирусному изоляту (1:160), так и к вакцинному штамму вируса чумы плотоядных (1:40). К последнему ти тры антител были значительно ниже, что свидетельствует о большей специфичности ашител к морбилливирусному изоляту. Вируснейтрализующие антитела выявились позднее - между 16-20 днями после инфицирования, достигнув практически сразу высоких титров (1:320 - 1:640). Динамика титров антител указывала на развитие инфекционного процесса. Нерпа погибла через-3 месяца после инфицирования, т.е. можно было говорил) о хроническом течении инфекционного процесса, которое у плотоядных длится 2-3 месяца (К.Н. Груздев, A.B. Селиванов, 1985). Стертая клиническая картина морбилливирусной инфекции может быть связана с индивидуальной устойчивостью животного или с тем, что для инокуляции использовали вирус, прошедший десять пассажей в культуре клеток.

Таким образом, выделенный морбиллнвирус может вызывать у тюленей инфекцию и гибель при экспериментальном заражении.

Источники и возможные пути распространения морбилливирусной инфекции. Ретроспективный эпизоотолопгческий анализ и Экспедиционные исследования показали, что основным источником морбилливируса являются взрослые больные тюлени, способные выделять сю с истечениям! из глаз, носа и выдыхаемым воздухом, а т акже, вероятно, с фекалиями и мочой. Самки могут выделять вирус и с молоком, о чем свидетельствует высокий уровень инфицированных гценят. Наблюдения в аквариальной и в полевых условиях выявили, что передача возбудителя может происходить как

при непосредственном копчика: больных со здоровыми животными, особенно во время крупных весенних залежек на льду, так и опосредованно, через объекты внешней среды (воду, во ¡дух и др.). Отмеченные случаи заражения и гибели собак после погрызашы трупов, павших от чумы нерп, указывает на возможность передачи морбилливирусов от тюленей наземным видам животных (собакам, пушным зверям и другим видам плотоядных).

Клинические проявления морбилливнрусной инфекции у байкальских нерп в период эпизоотии. У отловленных больных поленсй наблюдали следующие симптомы: ринит и коныоктивит серозного, а затем гнойного характера, напряженное дыхание, обильное истечение из носа, фырканье, чихание, отказ от еды, диарею. Нерпы были вялыми, большее время проводили на помосте, практически не заныривали в воду. Поражение ценралыюй нервной системы обычно наблюдалось перед гибелью животного и проявлялось дрожью, подергиванием отдельных групп мышц, судорогами с выгибанием шен и туловища через равные промежутки времени, параличом конечностей.

Сопоставление клинических признаков заболевания морбилливнрусной инфекцией у собак и байкальской нерпы показывает, что из основных клинических признаков для чумы нлоюядных у байкальской нерпы отсутствует только два: рвота и характерная для чумы плотоядных сыпь на бесшерстных участках тела. По остальным клиническим признакам - полное совпадение, что указывает на одинаковую природу инфекционного агента.

Распространение морбилливнрусной инфекции у каспийских, дальневосточных тюленей и каланов Командорских островов. Установив довольно широкое распространение морбилливнрусной инфекции в акватории озера Байкал, мы с целью определения ареала этой инфекции на территории Российской Федерации, провели предварительные серологические исследования популяции тюленей, обитающих в Каспийском море, на Камчатке, а также каланов (морских выдр) с Командорских островов. Для исследования специфических антител в сыворотке крови тюленей использовали реакцию нейтрализации с вирусом чумы плотоядных (штамм Onderstepoort). Было исследовано 47 сывороток крови от каспийских тюленей старше одного года, собранных во время экспедиции 1989 г. Результаты показали, что 44% образцов содержали вируснейтрализуюпдае антитела с титрами антител от 1:20 до 1:540. За этот же год с помощью иммуноферментного анализа было исследовано 9 сывороток от обыкновенных тюленей (старше 2-х лет), обитающих у восточного побережья Камчатки. Образцы 6 сывороток крови этих тюленей содержали специфические антитела к вирусу чумы плотоядных (штамм Onderstepoort) с титрами антител от

1:20 до 1:1280.

В 1990 I. специфические антитела к вирусу чумы плотоядных были обнаружены в 2 сыворотках из 8 у каланов, погибших у Командорских островов.

Таким образом, морбиллнвируеная ииф'екиия имеет широкое распространение не только у наземных животных, по и у ластоногих (тюленей) и даже, возможно, у каланов.

ВЫВОДЫ

1. Эпигоотия, возникшая в популяции байкальских поленей (нерп) и приведшая к массовой шбели этого вида животных в 1987-1988 п .. была вызвана вирусом рода МогЫШ\пик.

2:-.Выделенный от байкальских тюленей морбилливирус, имеет близкое антигенное и структурное родство с вирусом чумы плотоядных, но в то же время отличается ог последнего по ряду молекулярно-биохнмических признаков и является, видимо, самостоятельным биолоптческим вариантом (биоваром).

3. Сравнительное молекулярно-биохимическое и сероло1Ическое исследование изолятов морбштливирусов, выделенных от байкальских и североморских тюленей, показало, что они имеют некоторые различия в антигенном спектре белков.

4. Источником морбилливнруса в акватории озера Байкал являются больные тюлени, способные передавать возбудитель здоровым особям как при непосредственном контакте, так и опосредованно через объекты внешней среды.

5. Серологические исследования, проведенные в 1989-1990 тт. у тюленей, обитающих в Каспийском и Охотском морях, показали их восприимчивость к морбилливирусной инфекции.

6. Морбиллнвируеная инфекция имеет широкое распространение не только среди наземных животных, но и среди ластоношх и, возможно, каланов.

7. Индекс зараженности полепей в озере Байкал в 1988-1989 п . был более высоким, чем в Каспийском и Охотском морях и составлял в среднем 58-80 (на 100 исследованных животных). Наиболее часто внрусоносителями были щепки в возрасте до одною года.

8. В сыворотке крови экспериментально и естественно зараженных морбилливнрусом поленей появляются специфические антитела, которые можно выявить в иммуноферментном анализе, реакциях нейтрализации и непрямой гемашнотинации, используя антигены как морбилливнруса тюленей, так и вирусов кори человека и чумы плотоядных. Лучшие результаты показывает реакция с гомологичным антигеном.

9. Разработанная модификация постановки и учета результатов иммунофермеитного анализа с применением живого морбилливируса и монослоя клеток Vero, обладает требуемой специфичностью, высокой чувствительностью н может применяться для экспресс-диашостики морбилливирусной инфекции у тюленей и других видов животных.

10. Основными клиническими признаками, пригодными для диагностики морбилливирусной инфекции у тюленей, являются: коныоктивит, ринит, диарея, нарезы и параличи. Особо характерный симптом - стремление больных тюленей к выходу (выбросу) из воды на побережье.

11. У собак, заразившихся при поедании органов и тканей тюленей, и собак-бишей, зараженных экспериментально "байкальским" морбилливирусом, развиваются симптомы болезни, характерные для чумы плотоядных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Методические рекомендации "Экспресс-диагностика морбилливирусной инфекции у тюленей". Одобрены подсекцией "Проблемы инфекционной патолоши животных в рептонах Сибири и Дальнего Востока", СО РАСХН, 1995 г.

2. При выяснении причин массовой гибели поленей в акваториях озера Байкал, Каспийского, Северного и Охотского морей следует учитывать, что одной из них может быть морбилливирусная инфекция.

3. Проводя оценку эпизоотической ситуации и разработку мер борьбы с чумой плотоядных в питомниках служебных собак, в звероводческих хозяйствах, расположенных на побережье, нужно иметь в виду, чго возбудитель (морбилливирус) может попадать в водную среду озер и морей, длительное время персистировать в организме тюленей и затем передаваться от них собакам и друпш видам животных.

4. Для идентификации морбилливирусов, выделенных из тюленей целесообразно применять иммуноблотинг, а также иммунофлюоресценцию с моноклональными антителами к поверхностным антигенам структурных белков (Н, Р. NP, F) вируса чумы плотоядных.

5. Специфическую диагностику морбилливирусной инфекции у тюленей необходимо осуществлять с помощью иммунофермеитного анализа, реакции нейтрализации и непрямой гемаплютинации, применяя в них гомологичный антиген.

6. В целях уточнения диагноза на морбилливирусную инфекцию у тюленей, а также изучения се патогенеза и вакцинопрофилактики

можно использовать местных "беспородных" собак н собак-биглей в возрасте 4-18 месяцев.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Grachev М.А., Kumaiev V.P., Mamaev L.V., Zoiín V.L. cl a!. Distemper vims in Baikal seals // Nairn.-1989.-P.209.

2. Zonii V.L., Kotenko YU.G., Kumaiev V.P. Immunochemical analisis ot the viral infection of Baikal seals // The first Vereshcagin baikal international conference.-Irkutsk, 1989. - P. 80-81.

3. Ostcrhaus A.D.M.E.. Breeders H.W., Groen J., UytdeHaag F.G., Visser 1.К., van de Bildt M.W.. Orvel C„ Kimiarcv V.P., Zorin V.L. Different niorbillivinises in European and Siberian seals // Veterinary Record. -1989. -125.-P.647-648.

4. Колесник B.C., Дорофеев В.M., Бенм A.M., Зорин В.Л. и др. Чума нлоюядных в популяции байкальской нерпы // ЖМЭИ. -1990. -N9. -С. 52-56.

5. Титенко A.M., Борисова Т.Н., Зорин В.Л., Кумарев В.П. Эпизоотия у байкальских тюленей: изоляция морбилливируса и его возможная роль в заболеваемости животных // Тез. докл. X Всесогоз. совет, по изучению, охране и рацион, использовании морских млскопиг. -Светлогорск, 1990. -С. 297-298.

6. Титенко A.M., Зорин В.Л. и др. Серологические исследования сывороток нерп Plioca sibirica на присутствие антител к морбнлливирусу байкальской нерпы. -Денонир. ВИНИТИ. -1990, № 3297. В-90

7. Титенко A.M., Борисова Т.И., Зорин В.Л. и др. Антитела к морбнлливирусу байкальской нерпы у природного хозяина // Вопросы вирусологии. -1990. -№ 6. -С 502-503.

8. Титенко A.M., Борисова Т.И., Зорин В.Л. Выделение морбилливируса от байкальской нерны Phoca sibirica и его предварительная харак!сристика//Вопросы вирусологии. -1991. -№1. -С. 57-59.

9. Титенко A.M., Борисова Т.И., Бейм A.M., Новожилов С.С., Куделип В.Н., Зорин В.Л. и др. Экспериментальное инфицирование нерпы Phoca sibirica морбиллнвирусом // Вопросы вирусолопти. -1991. -№ 6. -С. 511-512.

10. Мамаев Л.В., Беликов С.И., Баранова Л.В., Деникина Н.И., Зорин В.Л. и др. Обнаружение морбилливирусных РНК в тканях навпптх нерп // В кн. Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы. -Новосибирск: Наука, 1992. -С. 40-44.

11. Зорин В.Л., Нашева Ф.Г., Дорофеев В.М. и др. Антитела

против вируса чумы плотоядных в популяции байкальской нерпы // В кн. Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы. -Новосибирск: Наука, 1992. -С. 45-47.

12. Титенко A.M., Борисова Т.Н., Зорин В Л. и др. Изоляция морбилливируса от нерпы // В ки. Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы. - Новосибирск: Наука, 1992. -С. 47-52.

13. Остерхауз А.Д.М.Н., Визер И.К.Г., Зорин В.Л. и др. Заражение собак чумой плотоядных материалом or байкальской нерпы // В кн. Вспышка чумы плотоядных у байк;ш>екой нерпы. - Новосибирск: Наука, 1992. -С.52-53.

14. Тигенко A.M., Зорин B.J1. и др. Серологическое исследование сывороток байкальской верны на присутствие антител к ее мо рб ил лив и рус у// В кн. Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы. - Новосибирск: Наука, 1992. -С.53-60.

15.0стерхауз А.Д.М.Е., Визер И.К.Г., Зорин В.Л., Кумарев В.П. Сравнительная характеристика морбиллнвирусов, изолированных oi Phoca Vitulina и Phoca sibirica // В ки. Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы. - Новосибирск: Наука, 1992. -С. 60-61.

16. Зорин B.J1-, Зорина А.И., Щербакова Л.Б. Лечение собак при чуме плотоядных //Тез. докл. Межд. конф. по вет. медицине мелких домашних животных. -Москва, 1994. -С. 5-8.

17. Зорин В.Л. Вирус чумы плотоядных у ластоногих // Тез. докл. Межд. конф. но актуальным проблемам ветеринарии. -Барнаул, 1995. -С. 109.