Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка отечественных реагентов для решения задач молекулярно-генетического тестирования в клинической трансплантологии

На правах рукописи

□ □3479 ЮВ

Сергеев Илья Викторович

РАЗРАБОТКА ОТЕЧЕСТВЕННЫХ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ РЕШЕНИЯ ЗАДАЧ МОЛЖКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО ТЕСТИРОВАНИЯ В КЛИНИЧЕСКОЙ ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ

«14.00.36 - аллергология и иммунология»

- 8 0К7 2003

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2009 г.

003479106

Работа выполнена в ФГБУ «ПЩ Институт иммунологии» ФМБА России.

Научные руководители:

кандидат биологических наук Трофимов Д.Ю. доктор медицинских наук Хаитов М.Р.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Ярилин А.А.; доктор медицинских наук, профессор Кадагидзе З.Г.

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Защита состоится « 28 » октября 2009 г. в 14 ч. на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу: 115478, Москва, Каширское ш., д. 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор медицинских наук

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность работы.

Клиническая трансплантология является сегодня одной из быстро развивающихся высокотехнологичных и многопрофильных областей современной медицины. Успешность операций проводимых клиническими трансплантологами зависят во многом от эффективности внедрения современных иммуно- и молекулярно-гснетических методов. Таковыми на данный момент являются иммуногенетическое тестирование при подборе совместимых пар донор-реципиент и мониторинг вирусных инфекций в условиях постгрансплантационной иммуносупрессии.

К сожалению, на сегодняшний день количество операций по трансплантации органов в России крайне мало: за 2008 год - 29 трансплантаций сердца, 73 трансплантации печени, не более 800 трансплантаций почек, причём 4/5 общего числа операций выполняется в Москве. Потребность в подобных операциях в сотни раз выше.

Развитие клинической трансплантологии в России напрямую зависит не только от эффективной работы лечебных центров, создания единого организационного механизма обеспечения донорскими органами, от совершенствования законодательной базы, включающей организационно-правовые и этические аспекты донорства, но и от координации усилий ученых и врачей в создании отечественных реагентов, необходимых для развития данной области медицины.

Разработанный в ходе данной работы метод типирования локуса НЬАЛЖВ1 на основе метода ПЦР в реальном времени позволяет существенно сократить время анализа, снизить трудоёмкость и минимизировать риск контаминации лаборатории продуктами ПЦР. Кроме того, в отличие от существующих сегодня отечественных реагентов и большей части импортных аналогов, разработанный метод может быть полностью автоматизирован, что имеет принципиальное значение как с точки зрения снижения влияния человеческого фактора, так и при организации лабораторий ориентированных на проведение больших объемов исследований. Из этого следует, что данный метод может эффективно использоваться как в случае типирования посмертных доноров при органной трансплантации, когда требуется быстрое

получение результата, так и в случае создания регистров доноров костного мозга, когда требуются масштабные скрининговые исследования.

Проведенное генотипирование образцов ДНК, выделенных из клеток крови реципиентов листа ожидания пересадки Московского координационного центра органного донорства, показало, что результаты типирования могут нести не только практическое значение, но и являться базисом для теоретических выводов. На основании полученных результатов установлено достоверное превышение процента НЬАЛЖВ1 гомозигот среди реципиентов клиники трансплантации почки по сравнению с частотами гомозигот в популяции. В ходе данной работы обоснована целесообразность использования метода селективного подбора НЬА-ЛЖВ1 гомозиготных доноров для НЬЛ-ОИВ1 гомозиготных реципиентов.

Кроме того, на единой технологической основе разработаны реагенты, позволяющие проводить мониторинг наличия и количества возбудителей латентных инфекций, что является необходимым требованием в условиях постгрансплантационной иммуносупрессии.

В последнее время в научной литературе появляется всё больше публикаций подтверждающих, что в случае подбора пары донор-реципиент при пересадке кроветворных стволовых клеток требуется учитывать совпадение донора и реципиента по гену М1С-А, так как отсутствие такового приводит к реакции отторжения «трансплантат против хозяина». В ходе данной работы был разработан и апробирован на популяционной выборке метод типирования гена М1С-А, который в перспективе может быть внедрен в рутинную практику клинической трансплантологии.

Цель исследования.

Разработать комплекс ключевых иммуно- и молекулярно-генетических методов, необходимых для лабораторного обеспечения клинической трансплантологии.

Задачи исследования.

1. Разработать и апробировать метод типирования локуса НЪ А-БИВ1 на уровне групп аллелей на основе метода ПЦР в реальном времени.

2. Провести анализ эффективности подбора доноров почки для гомозиготных по HLA-DRB1 реципиентов.

3. Разработать и апробировать метод количественного определения латентных инфекций HSV 1 и 2, CMV, EBV, ВК.

4. Разработать и апробировать метод типирования гена МС-А на уровне групп аллелей.

Научная новизна работы.

Впервые в отечественной практике разработана методика типирования локуса DRB1 на уровне групп аллелей на основе метода ПЦР в реальном времени.

Проведено генотипирование образцов ДНК, выделенных из клеток крови реципиентов листа ожидания пересадки Московского координационного центра органного донорства. Впервые установлено достоверное превышение процента HLA-DRB1 гомозигот среди реципиентов клиники трансплантации почки по сравнению с частотой гомозигот в популяции. Обоснована целесообразность использования метода селективного подбора HLA-DRB1 гомозиготных доноров для HLA-DRB1 гомозиготных реципиентов.

Впервые в отечественной практике разработана методика комплексного количественного определения латентных инфекций HSV 1 и 2, CMV, EBV, ВК на основе метода ПЦР в реальном времени.

Впервые получены данные о частоте встречаемости аллелей генов HLA MIC-A в русской популяции среди здоровых индивидуумов. Созданные молекулярно-генетические реагенты доступны для широкого применения в клинической трансплантологии, а также позволяют проводить исследования роли HLA-полиморфизма в таких прикладных разделах иммуногенетики как: HLA и аутоиммунные заболевания, HLA и инфекционные заболевания, HLA и репродукция. Также данные реагенты могут использоваться в популяционно-генетических исследованиях.

Практическая значимость работы.

Молекулярно-генетические компоненты для типирования локуса DRB1 на

уровне групп аллелей на основе метода ПЦР в реальном времени, как и возможность быстрого и точного определения вирусной нагрузки в образцах, взятых у пациентов трансплантологических отделений открывают принципиально новые возможности в области прикладной клинической трансплантологии. Низкая трудоёмкость и быстрота получения результатов делают первый из приведённых методов, незаменимым для быстрого подбора пар «донор-реципиент» при органной трансплантации. Возможность автоматизировать работу лаборатории для массового генотипирования послужит предпосылкой для создания крупных регистров доноров, необходимых для проведения пересадок кроветворных стволовых клеток. Именно последний вид трансплантации на сегодняшний день является не только методом радикального лечения целого ряда онкогематологических заболеваний среди взрослого и детского населения, но и методом лечения последствий радиационного и химического поражения кроветворной и иммунной систем человека.

В мире в настоящее время трансплантации кроветворных стволовых клеток проводятся при полной НЬА совместимости между донором и реципиентом. Под полной НЬА совместимостью понимается совместимость по генам НЬА класса I (А, В, С локусы); НЬА класса П генов ОКВ1, Желательна совместимость по генам

НЬА БРВ1 (класс II) и М1С-А(класс I). Анализ последних литературных данных позволяет предположить, что совместимость по гену МГС-А в ближайшее время будет также признана необходимой. В этом случае разработанный метод типирования аллелей гена М1С-А будет востребован не только иммуногенетиками и популяционными генетиками, но и клиническими трансплантологами.

Работа выполнялась в рамках заданий ФМБА по темам: «Разработка оригинальных тест-систем на основе молекулярно-генетических методов в интересах ФМБА России для обеспечения биобезопасности населения^ в условиях возможного радиационного и/или химического поражения: скринингового НЬА-генотипирования потенциальных доноров кроветворных стволовых клеток» (2006-2008гг.), «Разработка биомедицинской технологии НЬА- типирования, отвечающей международным стандартам, для использования в системе ФМБА России при лечении профессиональных заболеваний» (2007-2009гт.), а также международного проекта «Разработка иммунотерапевтических стратегий для лечения гематологических и

неопластических заболеваний на основе оптимизированных аллогенных пересадок стволовых клеток», участником которого является ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России». Работа финансово поддерживалась грантами Федеральной целевой научно-технической программы ((Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы (проекты ЖС-КП.5/002 и

2006-РИ-34.0/002/081) и «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (проекты

2007-2-2.2-04-04 и 2007-2-1.2-04-02-116).

Публикации.

Материалы диссертации изложены в 13 публикациях, в том числе 1 публикация в научном издании, рекомендованным ВАК для опубликования научных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук, 5 статьях в научной печати, 7 публикациях в материалах отечественных и зарубежных конференций и конгрессов.

Структура и объем работы.

Материалы диссертации доложены на 92 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, раздела «Материалы и методы», раздела ((Результаты и обсуждение», выводов и списка литературы. Работа включает 8 рисунков и 10 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материал для исследований. Для апробации разработанных методик генотипирования локуса ОЯВ1 использовали коллекцию ДНК, полученную из периферической крови здоровых доноров. Коллекция была предварительно типирована по локусу ОКВ1 методом мультипраймерной ПЦР [Трофимов Д.Ю., 1996].

В работе использовались образцы ДНК, выделенные из крови: 272 реципиентов трансплантата почки листа ожидания Московского координационного центра органного донорства, 300 кадровых доноров станций переливания крови г. Москвы.

Выделение ДНК. В случаях, когда целью исследования являлось типирование генов пивного комплекса гистосовместимости, ДНК выделяли из ядер лимфоцитов по методу Higuchi [Higuchi, 1989] с некоторыми модификациями. Метод основан на разрушении лимфоцитов с помощью лизирующего буфера, не влияющего на целостность мембран ядер лимфоцитов. После двух отмывок ядра разрушали буфером с протеиназой К при 37°С в течение 20 мин с последующей инактивацией фермента при 98°С. Полученные образцы ДНК сразу использовали для типирования, либо хранили при -20°С. Концентрация ДНК, определенная на ДНК-минифлуориметре (Hoefer, США), составляла в среднем 50-100 мкг/мл.

Выделение вирусных ДНК из образцов цельной крови проводили протеиназным лизисом с последующей очисткой фенольно-хлороформным методом, из образцов мочи, в случае вируса ВК, с использованием набора «Проба-НК», производства «ДНК-Технология» (Россия).

Дизайн и синтез олигонуклеотидов. При разработке олигонуклеотидов использовали базы данных нуклеотидных последовательностей GenBank, и программное обеспечение Oligo 6.0. Синтез праймеров и олигонуклеотидных флуоресцентномеченых зондов для ПЦР в реальном времени проводили на синтезаторах ДНК ASM-800 и ASM-102 (Россия, Новосибирск), позволяющих синтезировать как экспериментальные (20 нмоль), так и препаративные количества (0,5 мкмоль). Использовали флуорофоры (FAM, HEX) и гасители флуоресценции (Dabcyl, BHQ1), синтезированные в лаборатории изотопных методов анализа Института биоорганической химии им. академиков М.МШемякина и Ю.А.Овчинникова РАН. Олигонуклеотиды очищали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием обращеннофазных колонок Диасфер-110-С18 (Россия). Чистоту полученных олигонуклеотидов контролировали методом аналитического вертикального гель-электрофореза в полиакриламидном геле.

Оборудование для проведения ПЦР в реальном времени. Полимеразную

цепную реакцию с детекцией результатов в режиме реального времени проводили с помощью детектирующих амплификаторов «ДТ-322» и «ДТ-96» («НПФ ДНК-Технология», Россия).

Дополнительный контроль результатов ПЦР в реальном времени осуществляли методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле.

Проведение ПЦР в реальном времени. Для постановки ПЦР в реальном времени использовали реагенты «НПФ ДНК-Технология», в том числе Taq-ДНК-полимеразу TexHoTaq, а также TexHoTaq-AT, позволяющую осуществить реализацию «горячего старта» без применения парафина.

Полимеразную цепную реакцию, детекцию продуктов амплификации в режиме «реального времени» и интерпретацию полученных результатов проводили с помощью детектирующих амплификаторов ДТ-322 и ДТ-96 (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Россия) и программного обеспечения к ним. Использовали следующий температурный режим амплификации: 94'С - 10 с, 64'С - 30 с в течение 50 циклов, детекция уровня флуоресценции проводилась на каждом цикле при температуре 64"С.

Определение концентрации плазмидной ДНК. Концентрация плазмидной ДНК в растворе была определена спектрофотометрически, из расчета, что А25о=1 соответствует концентрации 50мкг/мл. Количество копий плазмидной ДНК в 1 мл раствора рассчитывали по формуле:

[(концентрация плазмидной ДНК (мкг/мл))х(число Авогадро (моль"'))]/[(длина плазмидной ДНК (п.н.))х106х650]

Параметры, используемые для описания ПЦР в реальном времени.

Ср - значение характеристического цикла амплификации, автоматически определяемое детектирующим термоциклером.

Slope - разница в значениях Ср (ДСр) при разведении образца в 10 раз.

Эффективность амплификации оценивали по формуле:

Е = 1 (Т<ш°р'> или Е(%) = (Е-1)* 100% (2)

Статистика. Оценку соответствия выявленных частот генотипов закону Харди-

Вайнберга проводили по критерию х2-квадрат в сравнении с ожидаемыми частотами генотипов равновесного распределения.

Статистическую ошибку распределения частот аллелей вычисляли по формуле: sp = sqrt(p(l -p)/2N), (4)

ще р - частота аллеля, N- число индивидов в выборке.

Использованное в работе программное обеспечение и базы данных.

Программное обеспечение:

Oligo. Позволяет подбирать праймеры к нуклеотидным последовательностям, а также

рассчитывать приблизительную температуру отжига праймеров. Chromas. Позволяет переводить в текстовый формат хроматограммы, полученные в

результате секвенирования. «Арлекин», «Статистика». Позволяют проводить статистическую обработку

результатов исследования. Пакет программ Microsoft office 2000. Интернет ресурсы:

Сервер NCBI (National Center for Biotechnology Information) Национальный центр

информации по биотехнологии США http://www.ncbi.nlm.nih.gov. GcnBank - база данных генетических последовательностей, поддерживаемая NIH (National Institutes of Health), содержащая коллекцию общедоступных последовательностей ДНК, РНК и белков http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Сервер IMGT/HLA Databases - база дачных, содержащая информацию о количестве аллелей и нуклеотидных последовательностях генов системы HLA http://www.ebi.ac.uk.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Метод типирования локуса DRB1 на уровне групп аллелей па основе метода ПЦР в реальном времепи.

Для типирования локуса DRB1 системы HLA был выбран и оптимизирован метод сиквенс-специфических праймеров, реализованный в варианте ПЦР в реальном времени (real-time PCR-SSP). Метод основан на использовании праймеров,

расположенных в полиморфных участках исследуемого гена, и детекции результатов с помощью флуоресцентно-меченных олигонуклеотидных зондов типа Taqman или Beacon. Возможны два варианта реализации систем генотипирования на подобной основе. В первом случае специфичность реакции полностью определяется праймерами (или одним праймером), при этом используется универсальный флуоресцентый зонд. Во втором случае специфичность обеспечивается комбинацией типирующих праймеров и зондов. Для типирования большинства специфичностей, за исключением DR14, был реализован первый вариант; для группы аллелей DR14 -второй.

Особенностью разработанного метода является использование внутреннего эндогенного контроля с модифицированной системой амплификации. Целью модификации было решение двух связанных задач - снижение конкурентного влияния внутреннего контроля и получение референсного сигнала, относительно которого оценивается основная реакция. В этом случае интерпретация результатов осуществляется не только по наличию или отсутствию продуктов ПЦР в соответствующей реакционной смеси, но и по смещению характеристического цикла основной реакции относительно модифицированного внутреннего контроля. Такой подход особенно эффективен в тех случаях, когда отличия между типируемыми специфичностями малы, и возможна неспецифичная амплификация, но на более поздних циклах.

При проверке работоспособности созданных тест-систем, в качестве подтверждающего метода также использовали автоматическое секвенирование ДНК по Сэнгеру. Во всех случаях были получены идентичные результаты генотипирования.

В качестве материала для проведения апробации разработанной системы использовали коллекцию периферической крови здоровых индивидов (доноров первичной кроводачи, идентифицирующих себя как русские) в количестве 300 человек, из них 188 мужчин и 112 женщин. Полученные данные о распределении аллелей гена DRB1 в русской популяции (табл. 1) в целом соответствуют опубликованным ранее сведениям [Болдырева и др., 2005].

Табл. 1. Частоты групп аллелей гена ВКВ1 в русской популяции.

Группа Фенотипиче

Генотипическая частота, %

аллелей екая частота

ШШ1

%

о

0,05 0,1

0,15 0,2

01 15(2) 16(2)

03

04 11(5) 12(5) 13(6) 14(6)

07

08

09

10

22,2 11,4 ±1,3

24,2 12,7 ±1,4

11,6 6,0 ±1,0

15,6 8,3 ±1,1

19,2 10,4 ±1,2

27,2 14,7 ±1,4

3,3 1,8 ±0,5

28,8 15,7 ±1,5

3,6 1,8 ±0,5

24,8 13,4 ±1,4

4,3 2,2 ±0,6

1,3 0,8 ±0,4

1,3 0,7 ±0,3

ц | -

В ходе проводимых экспериментов независимыми исследователями отмечено удобство работы с созданными тест-системами. Использование ПЦР в реальном времени вместо распространенного ранее «классического» варианта метода 88Р, предусматривающего гель-электрофоретическую детекцию продуктов амплификации, существенно снизило трудоемкость и время генотипирования, упростило требования к организации ПЦР-лаборатории.

Анализ эффективности подбора доноров почки для гомозиготных по НЬА-Б11В1 реципиентов.

При генотипировании 272 реципиентов трансплантата почки и 300 кадровых доноров станций переливания крови г. Москвы получены данные, представленные на рис.1. Как следует из этих данных, в группе реципиентов листа ожидания выявлено двукратное превышение частоты гомозигот (25,4% Ув 11,6%).

Последнее, по-видимому, объясняется тем, что в структуре реципиентов, входящих в листы ожидания, в России наибольший процент (около 80%) занимают больные с почечной недостаточностью, являющейся результатом хронического гломерулонефрита - тяжелого аутоиммунного заболевания. Среди больных,

страдающих некоторыми аутоиммунными заболеваниями, ранее был устаношкн факт повышения процента НЬА-ВЫИ гомозигот. По-видимому, это же относится и к хроническому гломерулонефриту.

30 25

.. 20 «

| 15

V Л

т 10 5 0

I Реципиенты почки

о Контроль

Рис.1. Частоты гомозигот НЬА-БКВ! среди реципиентов трансплантата почки и в популяции.

Существенное место в структуре листа ожидания принадлежит также реципиентам, для которых причиной потери функции почки стал диабет, в том числе, диабет I типа, являющийся также аутоиммунным заболеванием. При этом известно, что НЬА-ОШ31 гомозиготность является одним из факторов, обуславливающих высокий уровень предрасположенности к развитию данного аутоиммунного заболевания.

Тот факт, что среди реципиентов листа ожидания около 1/4 являются ОЛВ1 -гомозиготами создает существенные проблемы для эффективной селекции тканесовместимых доноров, поскольку данная группа потенциальных реципиентов имеет неблагоприятные перспективы получения тканесовместимого трансплантата почки. Дело в том, что любой НЬА-ВЫЛ гетерозиготный донор, даже если в его генотипе имеется НТА-ОКВ1 специфичность идентичная таковой у реципиента, будет различаться по второй части генотипа. То есть, в этом случае для НЬА-ОКВ1 гомозиготного реципиента есть два варианта: полная несовместимость или

половинная совместимость. При этом, как указывалось выше, данная ситуация касается четверти реципиентов. Эта проблема может быть успешно решена только в том случае, если донор будет НЬА-БЯВ1 гомозиготой, естественно совместимой с реципиентом.

Полученные данные предоставили возможность решения еще одной задачи, а именно: выяснения вопроса о возможности использования НЬА-ВКВ1 гомозиготных доноров для повышения эффективности подбора тканесовместимых пар донор-реципиент при пересадке органов с целью повышения выживаемости трансплантатов.

Для анализа ситуации с распределением НЬА-БКВ1 гомозиготных доноров трансплантата, которая имеет место в клинических условиях, в табл.2 представлены данные о распределении почечных трансплантатов от 130 НЬЛ-БИВ1 гомозиготных доноров. Как следует из данных, представленных в табл.2, только 11 почечных трансплантатов были пересажены НЬА-ОКВ1 идентичным гомозиготным реципиентам. Пятилетняя выживаемость превысила 90%. Также весьма эффективной оказалась пересадка в случае НЬА-ВКВ1 гетерозиготных реципиентов, идентичных по одной из НЬЛ-йЯВ 1 специфичностей гомозиготной специфичнонсти донора. Эта группа составила 36 человек при пятилетней выживаемости 81%. Хотя уровень выживаемости трансплантата в группе 1 беспрецедентно высок, малое количество наблюдений не позволяет отделять ее от группы 2, но и общая выживаемость 83% является высокой и соответствует самым лучшим показателям ведущих трансплантационных центров мира. Отсутствие достоверных отличий между этими группами позволило нам при дальнейшем сравнении объединить их в группу НЬА-01Ф1 совместимых реципиентов.

Совершенно иная ситуация имеет место в группе 3, представленной полностью НЬА-ОЯВ1 несовместимыми гетеро- и гомозиготами (поместить их в одну группу нам позволило отсутствие статистически значимых отличий). Выживаемость в этой группе составила 52,5%, что соответствует показателям низкой выживаемости. При этом важно отметать, что из 83 полностью несовместимых реципиентов 17 являются Н1А-БкВ1 гомозиготами. То есть в данном случае трансплантат использовался с минимальной эффективностью. При подборе с учетом генотипа трансплантат от этих доноров можно было бы использовать в группах НЬА-совместимых пациентов,

обеспечив тем самым более эффективный подход к пересадке почечного трансплантата.

Табл. 2. Пятилетняя выживаемость в группах полностью и наполовину совместимых, а также несовместимых по ША-БКВ1 специфичностям реципиентов

при пересадке почечного трансплантата от гомозиготных доноров.

N групп ы Донор Реципиент Совместимость N случаев Выжив аемость % Средняя %

1 НЬА-ТЖВ1 гомозигота Обе НЬА-Б1Ш1 специфичности общие с донором Полная совместимость И 91 83

2 НЬА-ОЯВ1 гомозигота Только одна общая с донором Н1А- специфичность Половинная совместимость 36. 81

3 Н1А-БЯВ1 гомозигота Отсутствие общих с донором Ш.А- специфичностей Полная несовместимость 83 52,5 52,5

Статистический анализ позволил выявить достоверные отличия в выживаемости реципиентов почечного трансплантата в группе, отвечающей критериям совместимости, по сравнению с группой НЬАЛЖВ1 несовместимых реципиентов (рис.2).

В целом полученные в настоящем исследовании данные свидетельствуют о следующем. Использование НЬА-ВИВ1 гомозиготных доноров для пересадки исключительно идентичным Ш^А-БКВ! гомозиготным реципиентам, а также

реципиентам, генотип которых несет соответствующую ПЬА-ВМ! 1 специфичность, открывает новые возможности повышения эффективности трансплантации органов, в том числе, почки. При этом решается вопрос эффективного подбора тканесовместимого донора для НЬА-1Л1В1 гомозиготных реципиентов, находящихся в генетически обусловленной невыгодной по сравнению с НЬА-ГЖВ1 гетерозиготными реципиентами ситуации.

Рис.2. Пятилетняя выживаемость реципиентов почечного трансплантата в группах совместимых (N=47) и несовместимых (N=83) по Н1А-ОКВ1 специфичностям индивидуумов.

В целях увеличения вероятности подбора пар донор-реципиент совместимых по НЬЛ-БКВ1 специфичностям, целесообразно модифицировать компьютерную программу подбора тканесовместимых пар донор-реципиент на основе выделения из общего листа ожидания реципиентов, гомозиготных по НЬА-ОШЗ1 специфичностям. Программа может быть основана на том, что любой донор, гомозиготный по НЬА-011В1 специфичности, первоначально скринируется через список НЬА-1ЖВ1 гомозиготных реципиентов, и в случае наличия НЬА-01Ш1 совместимой пары ей отдается приоритет по сравнению с НЬА-ВЯВ! гетерозиготами, входящими в основной список листа ожидания. Эта процедура позволит в целом увеличить количество случаев полной НЬА-ВКВ! совместимости донора и реципиента.

Методика количественного определения латентных инфекций HSV 1 и 2, CMV, EBV, ВК на основе метода ПЦР в реальном временя.

По данным многочисленных исследований [Stowe et al., 2007] более 90% людей в течение жизни инфицируются хотя бы одним из герпесвирусов (простого герпеса 1 и 2-го типов, цитомегаловирусом, Эппггейна-Барр). Также широко распространено носительство вируса ВК. Для диагностики перечисленных вирусов, особенно в случаях иммунодифицишых состояний, важен количественный анализ вирусной нагрузки. Разработаны и апробированы на клиническом материале системы для количественного определения методом ПЦР в реальном времени вирусов HSV 1и 2-го типов, CMV, EBV и вируса ВК, диагностика которых имеет важное клиническое значение в трансплантологии.

Были подобраны уникальные последовательности олигонуклеотидных праймеров и зондов. Подобраны условия проведения полимеразной цепной реакции с детекцией данных флуоресценции в режиме реального времени.

Для количественного определения вирусной нагрузки были созданы стандартные образцы, представляющие собой гснноинженерный плазмидный вектор со вставкой амплифицируемош участка генома соответствующего вируса. Калибровку стандартных образцов проводили путем измерения концентрации плазмидной ДНК спектрофотометрическим методом.

Линейный диапазон тест-систем составил 103 - 108 копий вирусной ДНК на 1 мл образца, чувствительность - 300-500 копий/мл.

Метод типирования гена MIC-A на уровне групп аллелей на основе метода фрагментного анализа.

Типирование локуса MIC-A осуществляли на основе полиморфизма длин 5-го экзона, содержащего тринуклеотидный повтор. Дтя амплификации и последующего фрагментного анализа использовали праймеры, фланкирующие 5-ый экзон и образующие фрагменты от 132 до 150 п.н., в зависимости от конкретного аллельного варианта.

mic5sl 5'- ggAAAgTgC Tgg TgC TTC AgA g -3'

mic5a2 (Cy5.5)-5'- CTg gAC CCT CTg CAg CTg ATg — 3'

Фрагментами анализ проводили на секвенаторе MicroGene Blaster фирмы Visible Genetics. Данный секвенатор позволяет одновременно проводить анализ 16 образцов, меченных флуоресцентным красителем Су5.5. Разделение происходит в одноразовых MicroCel кассетах, заполняемых фотополимеризуемым акриламидом.

Простота предложенного метода позволяет проводить типирование как на приборах, позволяющих проводить секвенирование последовательностей, так и на приборах для капиллярного электрофореза.

А4 А5 А5.1 А6 А9

Рис.3. Частоты групп аллелей гена М1С-А в русской популяции.

В качестве материала для проведения апробации разработанной системы использовали коллекцию периферической крови здоровых индивидов (доноров первичной кроводачи, идентифицирующих себя как русские) в количестве 77 человек. Полученные данные о распределении частот групп аллелей гена М1С-А в русской популяции представлены на рис.3.

Выводы.

1. Разработан и апробирован метод типирования локуса HLA DRB1 на уровне

групп аллелей на основе ПЦР в реальном времени.

2. Обоснована целесообразность использования метода селективного подбора

HLA-DRB1 гомозиготных доноров для HLA-DRB1 гомозиготных реципиентов.

3. Разработана методика комплексного количественного определения латентных

инфекций HSV 1 и 2, CMV, EBV, ВК на основе метода ПЦР в реальном времени.

4. Разработан метод типирования гена MIC-A на уровне групп аллелей.

5. Определены частоты групп аллелей гена MIC-A в русской популяции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Мальков И.Г., Трофимов Д.Ю., Петрова Т.В., Павлова О.Г., Сергеев И.В., Алексеев Л.П. Создание комплекса приборов и реагентов для диагностики и мониторинга ассоциированных с иммунологической недостаточностью инфекционных заболеваний. Аллергия, астма и клиническая иммунология, 2001, №1. С.108-109.

2. Болдырева М.Н., Грудакова Е.Г., Кабдулова Д.О., Гуськова И.А., Богатова О.В., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П. Создание ПЦР-наборов для молекулярно-генетического типирования генов главного комплекса гистосовместимости человека (HLA) разного уровня разрешения. Аллергия, астма и клиническая иммунология, 2001, №1. С.161-162.

3. Sechkin A.V., Alexeev L.P., Dolbin A.G., Boldyreva M.N., Dmitrieva N.G., Sergeev I.V., Trofimov D.Yu., Smimov V.L. Effective use of a regional limited waiting list fro renal transplants at the selection based on HLA DRB1 genotyping. Europ. J. of Immungen., Vol.28 N.2. P.261.

4. Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Грудакова Е.Г., Алексеев Л.П. Изучение полиморфизма неклассических генов HLA в русской популяции. 5-й конгресс РААКИ Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. 12-14 ноября 2002 г. Сборник трудов, том2. С. 197.

5. Trofimov D.Yu., Sergeev I.V., Groudakova E.G., Alexeev L.P. The MIC-A alleles' frequencies in healthy Russians and in type I diabetic patients. Europ. J. of Immungen., Vol.29. N2. P.147.

6. Boldyreva M., Kabdulova D., Zelov A., Evseeva I., Rahimova D., Osokina I., Sergeev I., Dedov I., Alexeev L. HLA haplotypes determined among Caucasians and Orients correlated to Type I diabetes. Europ. J. of Immungen., Vol.29. N2. P.146

7. Sergeev I.V., Trofimov D.Yu., Groudakova E.G., Alexeev L.P. Nonclassic HLA genes polymorphism in Russian population. 15th European Immunology Congress EFIS 2003. Rhodes, Greece. June 8-12,2003. P.154.

8. Boldyreva M.N., Trofimov D.Yu., Yankevich Т.Е., Bogatova O.V., Gouskova I.A., Philippova E.V., Sergeev I.V., Alexeev L.P. HLA-genes diversity among 5 Russian groups from different regions of Russian European part May 2003. Vol.4, Suppl.l, P.S29. 17"' European Histocompatibility Conference. 11 Annual Meeting. German Society of Immunogenetics. Baden-Baden, Germany May 6-9,2003. PJ29.

9. Sergeev I.V., Trofimov D.Yu., Groudakova E.G., Alexeev L.P. Diversity of nonclassical HLA genes among Russians. 17"1 European Histocompatibility Conference. 11 Annual Meeting. German Society of Immunogenetics. Baden-Baden, Germany. May 6-9,2003. P.29.

10. Болдырева M.H., Хаитов P.M., Барцева ОБ., Гузов И.И., Барко И.Ю., Померанцева Е.И., Богатова О.В., Гуськова И.А., Янкевич Т.Э., Хромова Н.А., Сергеев И.В., Филиппова Е.В., Алексеев Л.П. Исследование роли HLA-DRB1-генов при невынашивании беременности неясного генеза. Иммунология, 2004, №1, Т.25, С.4-8.

П.Трофимов Д.Ю., Рагимов А.А., Абрамов Д.Д., Кадочникова В.В., Гончарова Е.В., Сергеев И.В., Хаитов P.M., Алексеев Л.П. Популяционно-иммуногенетическая характеристика русской популяции в части генетических полиморфизмов, значимых для иммунного статуса человека. Физиология и

патология иммунной системы, 2009, №2, С.3-7.

12. Борисова Л.В., Яздовский В.В., Болдырева М.Н., Сергеев И.В. Особенности распределения НЬА-аллелей I и II классов в чувашской популяции. Физиология и патология иммунной системы, 2009, №3, С.28-35.

13. Долбин А.Г., Минина М.Г., Сергеев И.В., Кофиади И.А., Хаитов М.Р., Трофимов Д.Ю., Болдырева М.Н., Алексеев Л.П. Новые возможности поиска НЬА-совместимых доноров для реципиентов листа ожидания почечного трансплантата. Физиология и патология иммунной системы, 2009, №4, С.21-26.

Подписано в печать:

23.09.2009

Заказ № 2577 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность работы.

Клиническая трансплантология является сегодня одной из быстро развивающихся высокотехнологичных и многопрофильных областей современной медицины. Успешность операций, проводимых клиническими трансплантологами, зависит во многом от эффективности внедрения современных иммуно- и молекулярно-генетических методов. Такими методами на данный момент являются иммуногенетическое тестирование при подборе совместимых пар донор-реципиент и мониторинг вирусных инфекций в условиях посттрансплантационной иммуносупрессии.

К сожалению, на сегодняшний день количество операций по трансплантации органов в России крайне мало: за 2008 год - 29 трансплантаций сердца, 73 трансплантации печени, не более 800 трансплантаций почек [66], причём 4/5 общего числа операций выполняется в Москве. Потребность в подобных операциях в сотни раз выше.

Развитие клинической трансплантологии в России напрямую зависит не только от эффективной работы лечебных центров, создания единого организационного механизма обеспечения донорскими органами, совершенствования законодательной базы, включающей организационно-правовые и этические аспекты донорства, но и от координации усилий ученых и врачей в создании отечественных реагентов, необходимых для развития данной области медицины.

Разработанный в ходе данной работы метод типирования локуса НЬЛ-ЭКВ1 на основе метода ПЦР в реальном времени позволяет существенно сократить время анализа, снизить трудоёмкость и минимизировать риск контаминации лаборатории продуктами ПЦР. Кроме того, в отличие от существующих сегодня отечественных реагентов и большей части их импортных аналогов, разработанный метод может быть полностью автоматизирован, что имеет принципиальное значение как с точки зрения снижения влияния человеческого фактора, так и при организации лабораторий, ориентированных на проведение больших объемов исследований. Из этого следует, что данный метод может эффективно использоваться как в случае типирования посмертных доноров при органной трансплантации, когда требуется быстрое получение результата, так и в случае создания регистров доноров костного мозга, когда требуются масштабные скрининговые исследования.

Проведенное генотипирование образцов ДНК, выделенных из клеток крови реципиентов листа ожидания пересадки Московского координационного центра органного донорства, показало, что результаты типирования могут нести не только практическое значение, но и являться базисом для теоретических выводов. На основании полученных результатов установлено достоверное превышение процента ША-БИМ гомозигот среди реципиентов клиники трансплантации почки по сравнению с частотами гомозигот в популяции. В ходе данной работы обоснована целесообразность использования метода селективного подбора НЬА-011В1 гомозиготных доноров для НЬА-Б11В1 гомозиготных реципиентов.

Кроме того, на единой технологической основе разработаны реагенты, позволяющие проводить мониторинг наличия и количества возбудителей латентных инфекций, что является необходимым требованием в условиях посттрансплантационной иммуносупрессии.

В последнее время в научной литературе появляется всё больше публикаций, подтверждающих, что в случае подбора пары донор-реципиент при пересадке кроветворных стволовых клеток требуется учитывать совпадение донора и реципиента по гену М1С-А, так как отсутствие такового приводит к реакции отторжения «трансплантат против хозяина». В ходе данной работы был разработан и апробирован на популяционной выборке метод типирования гена М1С-А, который в перспективе может быть внедрен в рутинную практику клинической трансплантологии.

Цель исследования.

Разработать комплекс ключевых иммуно- и молекулярно-генетических методов, необходимых для лабораторного обеспечения клинической трансплантологии.

Задачи исследования.

1. Разработать и апробировать метод типирования локуса НЬА-1ЖВ1 на уровне групп аллелей на основе метода ПЦР в реальном времени.

2. Провести анализ эффективности подбора доноров почки для гомозиготных по НЬА-ОКВ1 реципиентов.

3. Разработать и апробировать метод количественного определения латентных инфекций HSV 1 и 2, CMV, EBV, ВК.

4. Разработать и апробировать метод типирования гена MIC-A на уровне групп аллелей.

Научная новизна работы.

Впервые в отечественной практике разработана методика типирования локуса DRB1 на уровне групп аллелей на основе метода ПЦР в реальном времени.

Проведено генотипирование образцов ДНК, выделенных из клеток крови реципиентов листа ожндания пересадки Московского координационного центра органного донорства. Впервые установлено достоверное превышение процента HLA-DRB1 гомозигот среди реципиентов клиники трансплантации почки по сравнению с частотой гомозигот в популяции. Обоснована целесообразность использования метода селективного подбора HLA-DRB1 гомозиготных доноров для HLA-DRB1 гомозиготных реципиентов.

Впервые в отечественной практике разработана методика комплексного количественного определения латентных инфекций HSV 1 и 2, CMV, EBV, ВК на основе метода ПЦР в реальном времени.

Впервые получены данные о частоте встречаемости аллелей генов HLA MIC-A в русской популяции среди здоровых индивидуумов. Созданные молекулярно-генетические реагенты доступны для широкого применения в клинической трансплантологии, а также позволяют проводить исследования роли HLA-полиморфизма в таких прикладных разделах иммуногенетики, как «HLA и аутоиммунные заболевания», «HLA и инфекционные заболевания», «HLA и репродукция». Также данные реагенты могут использоваться в популяцнонно-генетических исследованиях.

Практическая значимость работы.

Молекулярно-генетические компоненты для типирования локуса DRB1 на уровне групп аллелей на основе метода ПЦР в реальном времени, как и возможность быстрого и точного определения вирусной нагрузки в образцах, взятых у пациентов трансплантологических отделений, открывают принципиально новые возможности в области прикладной клинической трансплантологии. Низкая трудоёмкость и быстрота получения результатов делают первый из приведённых методов незаменимым для быстрого подбора пар «донор-реципиент» при органной трансплантации. Возможность автоматизировать работу лаборатории для массового генотипирования послужит предпосылкой для создания крупных регистров доноров, необходимых для проведения пересадок кроветворных стволовых клеток. Именно последний вид трансплантации на сегодняшний день является не только методом радикального лечения целого ряда онкогематологических заболеваний среди взрослого и детского населения, но и методом лечения последствий радиационного и химического поражения кроветворной и иммунной систем человека.

В мире в настоящее время трансплантации кроветворных стволовых клеток проводятся при полной НЬА совместимости между донором и реципиентом. Под полной НЬА совместимостью понимается совместимость по генам НЬА класса I (А, В, С локусы), НЬА класса II генов БКВ1, Б0В1. Желательна совместимость по генам НЬА БРВ1 (класс II) и М1С-А(класс I). Анализ последних литературных данных позволяет предположить, что совместимость по гену М1С-А в ближайшее время будет также признана необходимой. В этом случае разработанный метод типирования аллелей гена М1С-А будет востребован не только иммуногенетиками и популяционными генетиками, но и клиническими трансплантологами.

Работа выполнялась в рамках заданий ФМБА по темам: «Разработка оригинальных тест-систем на основе молекулярно-генетических методов в интересах ФМБА России для обеспечения биобезопасности населения, в условиях возможного радиационного и/или химического поражения: скринингового НЬА-генотипирования потенциальных доноров кроветворных стволовых клеток» (2006-2008гг.), «Разработка биомедицинской технологии НЬА- типирования, отвечающей международным стандартам, для использования в системе ФМБА России при лечении профессиональных заболеваний» (2007-2009гг.), а также международного проекта «Разработка иммунотерапевтических стратегий для лечения гематологических и неопластических заболеваний на основе оптимизированных аллогенных пересадок стволовых клеток», участником которого является ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России». Работа финансово поддерживалась грантами Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы (проекты ЖС-КП.5/002 и 2006-РИ-34.0/002/081) и «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (проекты 2007-2-2.2-04-04 и 2007-2-1.2-04-02-116).

Публикации.

Материалы диссертации изложены в 13 публикациях, в том числе 1 публикация в научном издании, рекомендованном ВАК для опубликования научных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук, 5 статьей в научной печати, 7 публикаций в материалах отечественных и зарубежных конференций и конгрессов.

Структура и объем работы.

Материалы диссертации доложены на 92 страницах машинописного текста. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, раздела «Материалы и методы», раздела «Результаты и обсуждение», выводов и списка литературы. Работа включает 8 рисунков и 10 таблиц.

5. ВЫВОДЫ.

Разработан и апробирован метод типирования локуса HLA DRB1 на уровне групп аллелей на основе ПЦР в реальном времени.

Обоснована целесообразность использования метода селективного подбора HLA-DRB1 гомозиготных доноров для HLA-DRB1 гомозиготных реципиентов.

Разработана методика комплексного количественного определения латентных инфекций HSV 1 и 2, CMV, EBV, ВК на основе метода ПЦР в реальном времени.

Разработан метод типирования гена М1С-А на уровне групп аллелей.

Определены частоты групп аллелей гена MIC-A в русской популяции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Мальков И.Г., Трофимов Д.Ю., Петрова Т.В., Павлова О.Г., Сергеев И.В., Алексеев Л.П. Создание комплекса приборов и реагентов для диагностики и мониторинга ассоциированных с иммунологической недостаточностью инфекционных заболеваний. Аллергия, астма и клиническая иммунология, 2001, №1. С.108-109.

Болдырева М.Н., Грудакова Е.Г., Кабдулова Д.О., Гуськова И.А., Богатова О.В., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П. Создание ПЦР-наборов для молекулярно-генетического типирования генов главного комплекса гистосовместимости человека (HLA) разного уровня разрешения. Аллергия, астма и клиническая иммунология, 2001, №1. С.161-162.

Sechkin А.V., Alexeev L.P., Dolbin A.G., Boldyreva M.N., Dmitrieva N.G., Sergeev I.V., Trofimov D.Yu., Smirnov V.L. Effective use of a regional limited waiting list fro renal transplants at the selection based on HLA DRB1 genotyping. Europ. J. of Immungen., Vol.28 N.2. P.261.

Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Грудакова Е.Г., Алексеев Л.П. Изучение полиморфизма неклассических генов HLA в русской популяции. 5-п конгресс РААКИ Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. 12-14 ноября 2002 г. Сборник трудов, том2. С. 197.

Trofimov D.Yu., Sergeev I.V., Groudakova E.G., Alexeev L.P. The MIC-A alleles' frequencies in healthy Russians and in type I diabetic patients. Europ. J. of Immungen., Vol.29. N2. P. 147.

Boldyreva M., Kabdulova D., Zelov A., Evseeva I., Rahimova D., Osokina I., Sergeev I., Dedov I., Alexeev L. HLA haplotypes determined among Caucasians and Orients correlated to Type I diabetes. Europ. J. of Immungen., Vol.29. N2. P. 146

Sergeev I.V., Trofimov D.Yu., Groudakova E.G., Alexeev L.P. Nonclassic HLA genes polymorphism in Russian population. 15th European Immunology Congress EFIS 2003. Rhodes, Greece. June 8-12, 2003. P.154.

Boldyreva M.N., Trofimov D.Yu., Yankevich Т.Е., Bogatova O.V., Gouskova I.A., Philippova E.V., Sergeev I.V., Alexeev L.P. HLA-genes diversity among 5 Russian groups from different regions of Russian European part. May 2003. Vol.4, Suppl.l, P.S29. 17th European Histocompatibility Conference. 11 Annual Meeting. German Society of Immunogenetics. Baden-Baden, Germany May 6-9, 2003. P.29.

Sergeev I.V., Trofimov D.Yu., Groudakova E.G., Alexeev L.P. Diversity of nonclassical HLA genes among Russians. 17th European Histocompatibility Conference. 11 Annual Meeting. German Society of Immunogenetics. Baden-Baden, Germany. May 6-9, 2003. P.29.

Болдырева M.H., Хаитов P.M., Барцева О.Б., Гузов И.И., Барко И.Ю., Померанцева Е.И., Богатова О.В., Гуськова И.А., Янкевич Т.Э., Хромова Н.А., Сергеев И.В., Филиппова Е.В., Алексеев Л.П. Исследование роли HLA-DRB1-генов при невынашивании беременности неясного генеза. Иммунология, 2004, №1, Т.25, С.4-8.

Трофимов Д.Ю., Рагимов А.А., Абрамов Д.Д., Кадочникова В.В., Гончарова Е.В., Сергеев И.В., Хаитов P.M., Алексеев Л.П. Популяционно-иммуногенетическая характеристика русской популяции в части генетических полиморфизмов, значимых для иммунного статуса человека. Физиология и патология иммунной системы, 2009, №2, С.3-7.

Борисова Л.В., Яздовский В.В., Болдырева М.Н., Сергеев И.В. Особенности распределения HLA-аллелей I и II классов в чувашской популяции. Физиология и патология иммунной системы, 2009, №3, С.28-35.

Долбин А.Г., Минина М.Г., Сергеев И.В., Кофиади И.А., Хаитов М.Р., Трофимов Д.Ю., Болдырева М.Н., Алексеев Л.П. Новые возможности поиска HLA-совместимых доноров для реципиентов листа ожидания почечного трансплантата. Физиология патология иммунной системы, 2009, №4, С.21-26. I