Автореферат и диссертация по медицине (14.01.24) на тему:Роль мультиплексного анализа биомаркеров неоангиогенеза и воспаления при трансплантации сердца

На правах рукописи

СТАХАНОВА ЕКАТЕРИНА АНАТОЛЬЕВНА

РОЛЬ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО АНАЛИЗА БИОМАРКЕРОВ НЕОАНГИОГЕНЕЗА И ВОСПАЛЕНИЯ ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ СЕРДЦА

14.01.24 - ТРАНСПЛАНТОЛОГИЯ И ИСКУССТВЕННЫЕ ОРГАНЫ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 ноя т

005564328

Москва-2015

005564328

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор

Шевченко Ольга Павловна

Официальные оппоненты:

Космачева Елена Дмитриевна — доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздрава России, заведующая кафедрой терапии №1 факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов; ГБУЗ «НИИ - ККБ №1 им. профессора C.B. Очаповского» Министерства здравоохранения Краснодарского края, заместитель главного врача по медицинской части

Метельская Виктория Алексеевна - доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «Государственный научно-исследовательский центр профилактической медицины» Минздрава России, руководитель отдела изучения биомаркеров риска хронических неинфекционных заболеваний

Ведущая организация:

ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени академика E.H. Мешапкина» Минздрава России

Защита диссертации состоится «1» декабря 2015 г. в 15 — часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.055.01 при ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России по адресу: 123182, Москва, ул. Щукинская, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России, а также на сайте http://wwvv.transpl.ru.

Автореферат разослан «Â'i » 2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета Д 208.055.01

кандидат ветеринарных наук

Волкова Елена Алексеевна

Актуальность те.мы исследования

Трансплантация сердца (ТС) является эффективным методом лечения пациентов в терминальной стадии застойной сердечной недостаточности. В Российской Федерации большая часть таких операций выполняется в Федеральном научном центре трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова; за последние 5 лет число операций ТС многократно увеличилось, при этом улучшились показатели продолжительности и качества жизни [Готье C.B., 2014, 2015]. Для дальнейшего улучшения клинических результатов необходимо совершенствование тактики ведения пациентов в постгрансплантационном периоде, в том числе поиск предикторов сердечно-сосудистых осложнений у реципиентов сердца.

Несмотря на значительные достижения и существенный прогресс в лечении реципиентов сердца, острое клеточное и гуморальное (антителоопосредованное) отторжение, болезнь коронарных артерий (васкулопатия) трансплантированного сердца являются главными причинами потери трансплантата на ранних и отдаленных сроках после операции, а их диагностика производится по результатам инвазивных методов — эндомиокардиальной биопсии и коронароангиографии. В связи с этим, разработка методов прогнозирования и ранней доклинической диагностики осложнений у пациентов с трансплантированным сердцем на основе малоинвазивных лабораторных технологий является предметом интенсивных исследований последних лет [Frick M., 2010; Cohen Freue G.V., 2013].

Объективным отражением системности процессов, происходящих в организме реципиентов, является изменение концентрации в крови ряда специфических молекул - биомаркеров. Установлено прогностическое значение и выявлена связь отдельных биомаркеров неоангиогенеза, воспаления, тромбообразования, активации макрофагов с риском болезни коронарных артерий пересаженного сердца, отторжения [Шевченко О.П., 2008, 2013; Martinez-Dolz L., 2009; Dewerchin M., 2012]; показан синергизм действия различных факторов при развитии осложнений у реципиентов сердца [Шумаков В.И., 2008].

С учетом многофакторности патогенеза осложнений у реципиентов сердца и различной степени выраженности разных факторов у конкретного реципиента в настоящее время разрабатывается концепция мультимаркерного анализа, т.е. создания

панелей биомаркеров для прогнозирования, диагностики, оценки риска развития осложнений [Dengler T.J., 2007; Roedder S., 2011]. Реализации этого направления способствует создание в последние годы новых технологий мультиплексного иммунохимического анализа, позволяющих одномоментно выявлять несколько аналитов в одном образце биологического материала [Kellar K.L., 2002; Leng S.X., 2008; Wang Y., 2015].

Клиническое значение различных биомаркеров и факторов неоангиогенеза и воспаления, в особенности сравнительная характеристика их диагностической и прогностической значимости у больных после ТС, на основании которой можно сделать заключение о целесообразности их использования, по отдельности или в составе комплексного мультимаркерного теста, не изучены.

Цель исследования

Определить клиническое значение мультиплексного анализа биомаркеров неоангиогенеза и воспаления у пациентов с трансплантированным сердцем.

Задачи исследования

1. Охарактеризовать содержание биомаркеров неоангиогенеза - факторов роста эндотелия сосудов (VEGF-A, VEGF-D), плацентарного фактора роста-1 (P1GF-1), факторов роста тромбоцитов-ВВ (PDGF-BB) и воспаления — хемоатграктантного белка макрофагов-1 (МСР-1) и растворимой формы лиганда CD40 (sCD40L), измеренное с использованием мультиплексного анализа, у пациентов с застойной сердечной недостаточностью и определить связь концентраций биомаркеров с клиническими и лабораторными данными.

2. Оценить прогностическое значение уровня биомаркеров неоангиогенеза и воспаления, определяемого на этапе дотрансплантационного обследования, в отношении развития посттрансплантационных сердечно-сосудистых осложнений у реципиентов сердца.

3. Провести анализ уровней биомаркеров неоангиогенеза и воспаления в сыворотке крови пациентов с трансплантированным сердцем и его связи с наличием сердечно-сосудистых осложнений.

4. Выполнить сравнительный анализ содержания биомаркеров неоангиогенеза и воспаления у пациентов с острым клеточным, гуморальным отторжением,

васкулопатией трансплантата и выявить аналиты, концентрации которых потенциально значимы для диагностики постгрансплантационных осложнений.

5. Определить диагностически значимые пороговые концентрации УЕСР-А, РКЗР-1 и зСБ40Ь при остром клеточном отторжении трансплантированного сердца.

6. Охарактеризовать диагностическое значение различных комбинаций тестов на УЕСР-А, РГСР-1 и бС040Ь при остром клеточном отторжении трансплантированного сердца.

Научная новизна

Впервые на основании результатов мультиплексного анализа биомаркеров неоангиогенеза и воспаления, потенциально значимых при повреждении трансплантата, охарактеризовано их диагностическое значение у больных сердечной недостаточностью и пациентов с трансплантированным сердцем в отношении посттрансплантационных сердечно-сосудистых осложнений.

Новыми являются данные о связи фактора роста эндотелия сосудов (УЕСР-А), плацентарного фактора роста (РЮР-1), растворимой формы лиганда СБ40 (бСВ40Ь) с острым клеточным отторжением трансплантированного сердца.

Пороговые концентрации УЕОР-А (317 пг/мл), РЮР-1 (5,33 пг/мл), бС040Ь (671 пг/мл), значимые при оценке риска острого клеточного отторжения у пациентов с трансплантированным сердцем, определены впервые.

Впервые сформирована и валидазирована мультимаркерная панель, позволяющая выявлять пациентов с повышенным (в 4,5 раза) риском отторжения трансплантированного сердца.

Теоретическая и практическая значимость

Выявленная связь содержания факторов роста эндотелия сосудов, плацентарного фактора роста, растворимой формы лиганда С040 в сыворотке крови реципиентов сердца с развитием острого клеточного отторжения трансплантата указывает на потенциальную роль процессов неоангиогенеза, воспаления, костимуляции Т-лимфоцитов в патогенезе постгрансплантационных осложнений и может служить обоснованием разработки направленных методов диагностики, прогноза, терапии при ведении пациентов с трансплантированным сердцем.

Практическое значение имеют полученные в настоящей работе данные о принципиальной возможности и методических особенностях мультиплексного анализа - одномоментного определения в одном образце концентрации нескольких индивидуальных биомаркеров неоангиогенеза и воспаления.

Измерение уровней УЕвР-А, РЮР-1 и $СБ40Ь может служить неинвазивным лабораторным индикатором для скрининга пациентов с высоким риском острого клеточного отторжения.

Важным для практического использования являются рассчитанные диагностически значимые пороговые значения концентрации трех биомаркеров -УЕвЕ-А, РЮЕ-1 и яС040Ь.

Мультиплексный тест с одновременной оценкой уровней панели биомаркеров имеет наилучшие диагностические характеристики и, таким образом, наибольшее практическое значение при наблюдении пациентов с трансплантированным сердцем. Одномоментное определение концентрации в сыворотке крови нескольких биомаркеров в перспективе может иметь значение для выявления индивидуальных особенностей и персонифицированного ведения пациентов до и после трансплантации сердца.

Методология и методы исследования

В ходе выполнения исследования использована мультиплексная технология, сочетающая принципы проточной цитометрии и иммуноферментного анализа.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Содержание биомаркеров неоангиогенеза и воспаления в сыворотке крови пациентов с сердечной недостаточностью определяется методом мультиплексного анализа в широком диапазоне индивидуальных вариаций. Уровень отдельных биомаркеров коррелирует с лабораторными индикаторами риска сердечнососудистых заболеваний, но не имеет прогностического значения в отношении развития сердечно-сосудистых осложнений после трансплантации.

2. У пациентов с трансплантированным сердцем выявление уровня биомаркеров неоангиогенеза и воспаления выше рассчитанных пороговых значений (УЕвЕ-А >317 пг/мл, РЮЕ-1 > 5,33 пг/мл, 5СБ40Ь > 671 пг/мл) указывает на

повышенный риск острого клеточного отторжения и не связано с гуморальным отторжением, васкулопатией трансплантата.

3. Наибольшей диагностической значимостью в отношении острого клеточного отторжения трансплантированного сердца обладает мультимаркерная панель, составленная из трех тестов: УЕвР-А, РЮР-1, бСБ^ЮЬ.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность результатов определяется объемом проведенных исследований (103 пациента, обследованных до и после трансплантации сердца) с использованием современных методов иммунохимического анализа и статистической обработки.

Работа выполнена в рамках государственных заданий Минздрава России на осуществление научных исследований и разработок по темам: «Биохимические, биофизические, иммунные механизмы поражения и обратного ремоделирования миокарда при застойной сердечной недостаточности и после трансплантации сердца» (2012-2014 гг.) и «Разработка биотехнологических, биомедицинских, клинических подходов к повышению эффективности трансплантации сердца и легких» (2015-2017 гг.).

Апробация работы состоялась 26 июня 2015 года на совместной конференции научных и клинических подразделений ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова, кафедры трансплантологии и искусственных органов лечебного факультета ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Первый МГМУ им. И.М. Сеченова), кафедры кардиологии факультета дополнительного профессионального образования ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России (РНИМУ им. Н.И. Пирогова).

Основные результаты работы доложены и обсуждены на Семнадцатом всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2011 г.), VI, VII Всероссийских съездах трансплантологов (Москва, 2012, 2014 гг.), Втором российском национальном конгрессе «Трансплантация и донорство органов» (Москва, 2015 г.), XX Всероссийской юбилейной научно-практической конференции «Достижения и перспективы развития лабораторной службы России» (Москва, 2015 г.), 6-й Научно-практической конференции «Московская трансплантология: Трансплантация органов. Инфекционные осложнения» (Москва, 2015 г.), 34-й

международной конференции Международного общества трансплантации сердца и легких (ISHLT) (Сан-Диего, США, 2014 г.), Конгрессе Европейского общества кардиологов (ESC) (Барселона, Испания, 2014 г.), Европейском Конгрессе клинической химии и лабораторной медицины (IFCC-EFLM Euromedlab) (Париж, Франция, 2015 г.), 17 Международном конгрессе Европейского общества трансплантологов (ESOT) (Брюссель, Бельгия, 2015 г.).

Внедрение в практику

Результаты исследования используются в кардиологическом отделении ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова, в учебном процессе на кафедре трансплантологии и искусственных органов лечебного факультета Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, в лечебно-диагностическом процессе ГБУЗ «Волгоградский клинический кардиологический центр».

Личный вклад автора

Автор принимала непосредственное участие в разработке концепции и постановке задач исследования; самостоятельно осуществляла сбор материала для исследования, выполнила определение концентрации биомаркеров с помощью мультиплексной технологии. Автором самостоятельно сформирована база данных, проведены статистическая обработка, анализ и интерпретация полученных результатов.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, из них 3 статьи в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 3 главы в книгах, 4 публикации в зарубежных изданиях, свидетельство о государственной регистрации базы данных.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной характеристике пациентов и методов исследования, трех глав результатов собственных исследований, обсуждения, 7 выводов, практических рекомендаций и указателя используемой литературы, включающего 41 отечественный и 131 зарубежный источники. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирована 13 таблицами и 44 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В исследование включены 103 пациента с сердечной недостаточностью III - IV функционального класса по классификации Нью-Йоркской ассоциации кардиологов (NYHA), ожидающих ТС, в возрасте от 16 до 73 (47±14) лет, из них 85 (82,5 %) мужчин. У 65 реципиентов (47 мужчин и 18 женщин, от 16 до 73; 42±13, лет) причиной развития сердечной недостаточности была дилатационная кардиомиопатия (ДКМП), у 38 (все мужчины, от 28 до 67, 55±9 лет) - ишемическая болезнь сердца (ИБС).

Все пациенты с сердечной недостаточностью до ТС получали медикаментозную терапию в соответствии с индивидуальными показаниями и тяжестью состояния. Реципиенты сердца получали трехкомпонентную иммуносупрессивную терапию, включающую такролимус, метилпреднизолон и микофенолата мофетил.

В период с марта 2011 года по июнь 2014 года всем пациентам была выполнена ТС. Длительность наблюдения реципиентов после трансплантации составила от 215 до 1122 (366 ± 278) суток.

Плановое обследование пациентов включало клинический осмотр, термометрию, вирусологическое и бактериологическое исследования, динамику изменений общих и биохимических показателей крови, общий анализ мочи, коагулограмму. Всем реципиентам сердца проводили электрокардиограмму в 12 отведениях и выполняли эхокардиографическое обследования. Измерение концентрации такролимуса проводили автоматизированным методом (ARCHITECT, Abbott, США).

Верификацию острого клеточного отторжения производили на основан™ гистологического, гуморального - иммуногистохимического исследования эндомиокардиальных биоптатов. Верификация васкулопатии трансплантата проводилась по результатам коронароангиографического и внутрисосудистого ультразвукового исследования.

Концентрацию факторов роста эндотелия сосудов (VEGF-A, VEGF-D, плацентарного фактора роста, P1GF-1), факторов роста тромбоцитов (PDGF-BB) и

фибробластов (FGF-1), растворимой формы лиганда CD40 (sCD40L), хемоаттрактантного белка макрофагов МСР-1 измеряли одномоментно в одном образце с использованием технологии хМАР, сочетающей принципы проточной цитометрии и иммуноферментного анализа, с применением флуоресцентно-окрашенных магнитных микросфер, нагруженных специфическими антителами (наборы реагентов Simplex ProcartaPlex™, Asymetrix, США). Для детекции результатов мультиплексных анализов использована двухлазерная система и цифровая обработка сигналов (Luminex Corporation, США); для обработки результатов - программное обеспечение xPONENT 3.1.

Для оценки клинической значимости тестов определяли чувствительность, специфичность и точность; вычисляли диагностически значимые пороговые значения; площадь под кривыми ROC (Receiver operating characteristic curve). Для оценки выживаемости без нежелательных событий применялся метод Каплана-Мейера; сравнение выживаемости проводили с помощью логрангового (log-rank) критерия.

Для анализа полученных данных применяли стандартные методы статистической обработки с использованием программного обеспечения Microsoft Office Excel и пакета прикладных программ для научно- технических расчетов IBM SPSS STATISTICS 20 (IBM SPSS Inc., США). Для проверки нормальности распределения использовался критерий Шапиро-Уилка. Данные представлены как среднее арифметическое и стандартное отклонение (M±SD), верхние и нижние границы 95%-го доверительного интервала (95% ДИ) для параметрических и как медиана и интерквартильный размах для непараметрических переменных; при сравнении зависимых выборок рассчитывали парный критерий Вилкоксона, для сравнения независимых переменных применяли U-критерий Манна-Уитни или Краскал-Уоллиса. Для оценки связи количественных и качественных порядковых признаков рассчитывался коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Для всех критериев и тестов критический уровень значимости принимался равным 5%, т.е. нулевая гипотеза отвергалась при р < 0,05.

и

Результаты исследования

Мультиплексный анализ биомаркеров неоангиогенеза и воспаления у пациентов с сердечной недостаточностью, ожидающих трансплантацию сердца

На основании результатов предварительной апробации метода одновременного

- мультиплексного, - измерения концентрации отобранных для исследования биомаркеров в одном образце сыворотки крови была составлена панель из шести биомаркеров: УЕОР-А, УЕОР-В, Р10Р-1, РООР-ВВ, МСР-1, зСБ40В

Диапазон концентраций исследуемых аналитов у пациентов, ожидающих ТС, достаточно широк; данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (Таблица 1).

Не выявлено значимых различий уровней каждого из биомаркеров в зависимости от возраста, у мужчин и женщин, у пациентов с ДКМП и ИБС.

Таблица 1.

Результаты анализа уровней биомаркеров неоангиогенеза и воспаления

Биомаркеры Медиана, пг/мл Интерквартильный размах

\EGF-A 624,0 245,9; 1004,2

УЕСР-О 41,0 18,1; 109,4

Р1СР-1 2,2 0,7; 6,9

РБСР-ВВ 986,48 437,8; 1938,5

МСР-1 206,9 123,1; 373,0

вС040Ь 888,9 175,8; 2472,8

У 9 (8,7%) пациентов с сахарным диабетом II типа (все мужчины, 54±8 лет, среди которых 3 страдали ДКМП, 6 - ИБС) уровень УЕОР-А ниже, чем у пациентов без сахарного диабета (Рисунок 1); концентрация УЕОР-А не коррелировала с уровнями глюкозы в крови (г=- 0,007, р = 0,961). Уровни других биомаркеров у пациентов с диабетом не отличались от таковых у остальных пациентов.

Рисунок 1.

Сравнительный анализ уровня УЕСР-А у пациентов с сахарным диабетом (СД) и без СД

Ось ординат: шкала в виде десятичного логарифма

Анализ связи уровней биомаркеров неоангиогенеза и воспаления с данными рутинных лабораторных исследований показал, что уровень P1GF-1 позитивно коррелирует с содержанием общего белка (г=0,314, р=0,007), негативно - с содержанием липопротеинов высокой плотности (i=-0,345, р=0,045). Установлена положительная корреляция между содержанием sCD40L и уровнем фибриногена (г=0,277, р=0,015) и отрицательная - с уровнем билирубина (i=0,295, р=0,009). Концентрация МСР-1 коррелирует с содержанием холестерина (r=0,333, р=0,033).

Изучение связи уровня биомаркеров неоангиогенеза и воспаления, определяемого на этапе дотрансплантационного обследования, с развитием посттрансплантационных сердечно-сосудистых осложнений

После трансплантации сердца у 44 из 103 включенных в исследование пациентов были верифицированы следующие сердечно-сосудистые осложнения: острое клеточное (ОКО, п=17) или гуморальное (AMR, п=19) отторжение, васкулопатия трансплантата (БКАПС, п=8). У 59 пациентов в течение периода наблюдения по данным эндомиокардиальных биопсий не было обнаружено морфологических и иммуногистохимических признаков отторжения и по данным коронароангиографии - признаков васкулопатии трансплантата.

Сравнительный анализ уровня биомаркеров, определяемого на этапе дотрансплантационного обследования, у пациентов с развившимися после трансплантации сердца сердечно-сосудистыми осложнениями и без таковых показал, что уровень фактора роста тромбоцитов PDGF-BB достоверно ниже у пациентов с развившимися в посттрансплантационном периоде осложнениями (Рисунок 2).

1400 Ш без осложнений р=0,022 р=0Д11

1200 ■ к" 1- 800 (а & х 600 -=г | 400 -200 - □ с осложнен пямн

р=0,399 1 Я I р =0,7 64 L

VEGF-A VEGF-D PiGF-1* PDGF-BB МСР-1 SCD40L

Рисунок 2. Сравнительный анализ уровней биомаркеров, определяемых на этапе дотрансплантационного обследования, у пациентов с развившимися таге трансплантации сердечно-сосудистыми осложнениями и без таковых

* - кот^ентрация РЮР-1 х 10

Более того, уровень PDGF-BB достоверно ниже (р=0,019 в сравнении с пациентами без осложнений) только у пациентов, у которых после трансплантации развилось ОКО, в отличие от пациентов с гуморальным отторжением и васкулопатией трансплантата.

С целью оценки прогностической значимости уровня PDGF-BB, определяемого на этапе дотрансплантационного обследования, в отношении риска развития после трансплантации ОКО был проведен анализ кривой ROC (Рисунок 3).

Значение площади под кривой ROC для PDGF-BB хотя и отличалось от величины 0,5, но различие было статистически незначимым (р=0,07). Очевидно, последнее объясняется широким диапазоном вариаций концентрации биомаркера и, соответственно, низкой чувствительностью (59%) и специфичностью (59%) теста

Диагностически значимое пороговое значение PDGF-BB как маркера риска развития ОКО, найденное в точке пересечения кривых зависимостей чувствительности и специфичности теста от значений концентрации PDGF-BB в сыворотке крови, составило 840,0 пг/мл. Из 45 пациентов с уровнем PDGF-BB ниже определенного порогового значения после ТС ОКО развилось у 10 (22,2 %); из 58 пациентов с уровнем выше порогового значения - только у 7 (12,1%). У пациентов с концентрацией PDGF-BB ниже 840,0 пг/мл риск ОКО составил: RR=1,8 ± 0,5 [95% ДИ 0,76 - 4,5], т.е. различия между пациентами с уровнем PDGF-BB выше и ниже порогового значения статистически незначимы.

Результаты проведенного анализа показали, что тест на PDGF-BB, как и на другие исследуемые биомаркеры, до ТС не имеет прогностического значения для оценки риска развития посттрансплантационных осложнений.

/

PDGF-BB:

AUC=0,64±0,07 (р=0,07)

Рисунок 3.

Анализ площади под кривой ROC

(U 0,4 0,6 0,8 1,0

1-сиецифнчиость_

Анализ биомаркеров неоангиогенеза и воспаления у пациентов с трансплантированным сердцем

У пациентов с трансплантированным сердцем концентрации четырех из шести исследованных показателей оказались достоверно ниже, чем до ТС: УТЮГ-А (р=0,000), РБСР-ВВ (р=0,002), МСР-1 (р=0,000), зСБ40Ь (р=0,003).

У пациентов без развившихся в течение периода наблюдения сердечнососудистых осложнений имело место снижение уровней УЕСР-А, РБвР-ВВ, МСР-1, вСБДОЬ в сравнении с исходным, определяемым до ТС (Рисунок 4).

1400

1200

с 1000

ЕС

800

О.

X ш 600

=г

X 400

200

0

В до ТС О после ТС

р=0,000

р=0,305 р=0,357

/Ж

\EGF-A УЕСГ-И РЮР-Г РПОГ-ВВ МСР-1 бС040Ь

Рисунок 4. Динамика биомаркеров неоангиогенеза и воспаления у пациентов без развившихся сердечно-сосудистых осложнений

* - концентрация РЮР-1 х 10

У пациентов с развившимися после ТС сердечно-сосудистыми осложнениями ниже уровень УЕвР-А и МСР-1 в сравнении с исходным, определяемым на этапе дотрансплантационного обследования (Таблица 2).

Таблица 2.

Динамика биомаркеров неоангиогенеза и воспаления у пациентов с сердечно-сосудистъши осложнениями после трансплантации_

Биомаркеры Концентрация, пг/мл Достоверность различий (р)

До ТС После ТС

УЕСР-А 631,5 262,6 0,023

УЕСЛ<-0 44,9 50,2 0,621

РЮР-1 2,8 5,3 0,552

РПСР-ВВ 677,2 671,6 0,641

МСР-1 207,4 87,6 0,004

$СГ)40Ь 417,4 737,4 0,972

Представленные данные показывают, что у пациентов с сердечно-сосудистыми осложнениями после трансплантации и у пациентов без сердечно-сосудистых

осложнений концентрация биомаркеров неоангиогенеза и воспаления отличается от

таковой до ТС, но в различной степени.

Сравнительный анализ содержания уровней биомаркеров неоангиогенеза и воспаления у реципиентов сердца с острым клеточным, гуморальным отторжением и васкулопатией трансплантата

Пациенты с острым клеточным и гуморальным отторжением были моложе пациентов без осложнений; женщин среди них было относительно больше (24% и 32%, соотв.), чем во всей исследуемой группе (17%) и чем среди пациентов без осложнений (12%). Среди пациентов с АМН и ОКО было относительно больше больных, страдающих ДКМП (84% и 76%, соотв.), чем среди пациентов без осложнений (53%) (Таблица 3).

Таблица 3.

Сравнительная характеристика пациентов с развившимися после трансплантации сердца сердечно-сосудистыми осложнениями

и без таковых

Без осложнений Острое клеточное отторжение (ОКО) Гуморальное отторжение (АМК) Васкулопатия трансплантата (БКАПС)

Количество пациентов, п 59 17 19 8

Возраст, лет диапазон вариаций ср. зн. ± Ст. откл. Достоверность различий (р)* 17-73 50 ± 14 16-58 43 ± 11,5 0,035 24-65 44 ± 12,5 0,074 25-58 42 ± 10 0,092

Пол: число пациентов (%) мужчины женщины 52 (88%) 7 (12%) 13 (74%) 4 (26%) 13(70%) 6 (30%) 7 (87,5%) 1 (12,5%)

Диагноз до ТС: число пациентов (%) ДКМП ИБС 31 (52%) 28 (48%) 13 (74%) 4 (26%) 16(84%) 3(16%) 5 (62,5%) 3 (37,5%)

* - в сравнении с группой пациентов «без осложнений»

Анализ показал, что концентрация УЕвР-А, РЮР-1 и 5СБ40Ь выше у пациентов с ОКО по сравнению с пациентами без осложнений (р=0,001, р=0,038, р=0,012, соотв.) (Рисунок 5).

с 1000

S

LT с 800

с;

S ыш

=Г

го

а. 400

ш

Я X 200

о

ас

0

В без осложнений □ ОКО

р=0,001

р=0,012

р=0,278

р=0,215 р=0,038

п

h

VEGF-A VEGF-D PIGF-1 PDGF-BB МСР-1 SCD40L

Рисунок 5. Сравнительный анализ уровней биомаркеров неоангиогенеза и воспаления у пациентов без сердечно-сосудистых осложнений и пациентов с ОКО

* - концентрация PIGF-1 х 10

Учитывая, что концентрации указанных биомаркеров не зависят от возраста, пола и диагноза, допустимо заключить, что повышенные концентрации связаны с ОКО. В то же время, не выявлено различий в содержании указанных биомаркеров у пациентов с AMR, БКАПС и пациентов без осложнений.

Анализ диагностической значимости биомаркеров неоангиогенеза и воспаления при остром клеточном отторжении транатантированного сердца

Анализ характеристических кривых ROC показал, что в качестве потенциальных маркеров ОКО могут рассматриваться VEGF-A, P1GF-1 и sCD40L, у которых величина значения площади под кривой ROC достоверно превышает 0,5 (Таблица 4).

Таблица 4.

Маркер Площадь под кривой ROC, ед2 Достоверность*, р

VEGF-A 0,773 ± 0,055 [0,67 - 0,88] 0,000

VEGF-D 0,632 ±0,070 [0,49-0,77] 0,086

P1GF-1 0,654 ±0,080 [0,50-0,81] 0,045

PDGF-BB 0,573 ±0,075 [0,43-0,72] 0,342

МСР-1 0,513 ±0,071 [0,37-0,65] 0,862

SCD40L 0,677 ± 0,082 [0,52 - 0,84] 0,021

*Вероятность того, что площадь под кривой КОС >0,5

Среди сравниваемых биомаркеров наибольшей диагностической значимостью обладает тот, у которого площадь под ROC-кpивoй больше, т.е. УЕвР-А (Рисунок 6).

Диагностически значимое пороговое значение при ОКО для УБвР-А составило 317 пг/мл; для РЮР-1 - 5,33 пг/мл; для бСВ40Ь - 671,0 пг/мл (Рисунок 7).

РЮР-1, бС040Ь при ОКО трансплантированного сердца

Уровень УБвР-А выше порогового значения был у 37 пациентов с трансплантированным сердцем, из них у 12 (32,4 %) развилось ОКО. Уровень УЕвР-А ниже порогового значения был у 66 реципиентов сердца, из них у 5 (7,6 %) развилось ОКО. Относительный риск (Ш1) ОКО у пациентов с уровнем УЕвР-А выше порогового значения оказался равен 4,28 ± 0,49 [95 % ДИ 1,64 - 11,21], чувствительность и специфичность составили 71%, 71%, соответственно.

Уровень РЮР-1 выше порогового значения был у 41 пациента, из них у 11 (26,8 %) развилось ОКО. Уровень РЮР-1 ниже порогового значения был у 62 пациентов с трансплантированным сердцем, из них у 6 (9,7 %) развилось ОКО. Относительный риск ОКО у пациентов с уровнем РЮР-1 выше порогового значения оказался равен 2,77 ± 0,47 [95% ДИ 1,11 - 6,91], чувствительность и специфичность составили 65%, 65%, соответственно.

Уровень бС040Ь выше порогового значения был у 42 пациентов с трансплантированным сердцем, из них у 11 (26,2 %) развилось ОКО. Уровень 5С040Ь ниже порогового значения был у 61 пациента с трансплантированным сердцем, из

них у 6 (9,8 %) развилось ОКО. Относительный риск ОКО у пациентов с уровнем 5СЭ40Ь выше порогового значения оказался равен 2,66 ± 0,47 [95 % ДИ 1,07 - 6,64], чувствительность и специфичность составили 65%, 64 %, соответственно.

Сравнительный анализ выживаемости без ОКО с использованием метода Каплан-Мейера показал достоверные различия в группе пациентов с исходными уровнями УБОР-А (р = 0,001), РЮР-1 (р = 0,021), зСБ40Ь (р=0,023) выше и ниже определенного порогового значения (Рисунок 8).

g 1.0

X о § 0,8 с

£ о.б

0

Ч

« 0,4

х ш

1 0.2

г: i. 0.0

ц <317 пг\мл 1.0 < 5.33 rtr/мл 1,0

. i ft. .

р = 0,001 ; 0.8 р = 0,021 Т -----------1—--i. 0.8-

I-} > 5.33 nr/мл 1

> 317 пг\мл 0.6 0.6-

0,4 0,4-

0,2 0.2

VEGF-A PIGF-1

0.0 0.0

< 671 nr/мл

р = 0,023

SCD40L

0 100 200 300 400 0 100 200 300 400 О

длительность наблюдения после ТС, дни

100 200 300 400

Рисунок 8. Сравнение выживаемости без нежелательных событий (ОКО) у реципиентов с уровнем УРСР-А, РЮР-1, вСТМОЬ выше и ниже определенных

пороговых значений

У пациентов с низкими уровнями (ниже определенных пороговых значений) УТЮГ-А, РЮР-1 и зСБ40Ь выживаемость без нежелательных событий (ОКО) выше по сравнению с пациентами, у которых был высокий уровень вышеперечисленных маркеров.

\ТЮР-А обладает наибольшей, среди трех представленных маркеров, диагностической значимостью при остром клеточном отторжении, что полностью соответствует результатам, полученным при анализе ЯОС-кривых.

Оценка диагностической значимости сочетания тестов на УЕСР-А, РЮР-1 и $С1)40Ь при остром клеточном отторжении трансплантированного сердца

У 17 из 103 пациентов уровни УЕвР-А, РЮР-1 и бСВ40Ь были выше их пороговых значений, среди этих пациентов у 8 (47,1%) было диагностировано ОКО. Риск развития ОКО у пациентов (п= 17) с уровнем и УЕвР-А, и РЮР-1, и 5СБ40Ь, превышающим пороговое значение, оказался в 4,5 раза выше, чем у остальных

пациентов (п= 86) (1111=4,5 ± 0,41 [95% ДИ 2,03 - 9,99], чувствительность - 47 %, специфичность - 90 %).

На рисунке 9 представлены данные о величине относительного риска ОКО для различных сочетаний биомаркеров УРЮР-А, РЮР-1 и зСБ40Ь, рассчитанного с учетом определенных пороговых уровней.

УЕОР-А+РЮР-1 ЛИ-4,14 ± 0,42 ¡95%ДИ 1.81 - 9,45]

Ш1-4,02± 0,44/95% ДИ 1,70-9,51/

УЕОР-А+вСОЛО!. 1.............

РЮР-1+зС0401_ 4 Ш-4,14± 0,42 [95%ДИ 1.81 - 9,45]

ЛЯ-4,5 ± 0,41 /95%ДП 2,03-9,99]

УЕОР-А+РЮР-1 + 5С040Ь -, 1-.

0 1 2 3 4 5 6 7

Относительный риск острого клеточного отторжения (1414)

Рисунок 9. Относительный риск развития ОКО при различном сочетании УЕСР-А, РЮР-1 и зСЭ40Ь в концентрации, превышающей их пороговые значения

Сравнительный анализ выживаемости без нежелательных событий с использованием метода Каплан-Мейера показал достоверные различия у пациентов при сочетании трех биомаркеров в концентрации выше определенного порогового уровня (Рисунок 10).

а 1'°

Г 1

£ 0,8-я ~1 р=0.000

к 0,6-

|

| 0,4 > 317, 5,33, 671 пг/мл

¡с ¡2

| 0,2-

Л 0,0- \-EGF-A, ГК;Р1 и яС1)401.

0 100 200 300 400 Длительность наблюдения после ТС, ДНИ

Рисунок 10.

Сравнение выживаемости без ОКО у пациентов с концентрацией УЕСР-А, РЮР-1 и $С040Е выше порогового уровня

Результаты настоящего исследования позволили установить, что сочетание одновременно высоких уровней биомаркеров УЕОР-А, РЮР-1, зСВ40Ь - выше их пороговых значений, определяемых у пациентов в постгрансплантационном периоде, имеет наибольшее диагностическое значение в отношении развития ОКО.

20

ВЫВОДЫ

1. Содержание биомаркеров неоангиогенеза - факторов роста эндотелия сосудов (УЕСР-А, УЕОР-Б), плацентарного фактора роста-1 (РЮЕ-1), факторов роста тромбоцитов-ВВ (РБСЕ-ВВ) и воспаления - хемоаттрактантного белка макрофагов-1 (МСР-1) и растворимой формы лиганда СБ40 (бСБДОЬ), измеренное с использованием мультиплексного анализа у пациентов с застойной сердечной недостаточностью, варьирует в широких пределах. Содержание в сыворотке крови каждого из маркеров не коррелирует с полом, возрастом пациентов и этиологией сердечной недостаточности.

2. У пациентов, ожидающих трансплантацию сердца, уровень отдельных биомаркеров коррелирует с лабораторными индикаторами риска сердечнососудистых заболеваний: увеличением концентрации холестерина (МСР-1), фибриногена (бС040Ь), снижением содержания липопротеинов высокой плотности (РЮР-1); наличием сахарного диабета II (УБвР-А), но не имеет прогностического значения в отношении развития сердечно-сосудистых осложнений после трансплантации.

3. Уровень РОСИ-ВВ, определяемый до трансплантации, достоверно различается у пациентов с развившимся после трансплантации сердца острым клеточным отторжением и больных без постгрансплантационных осложнений (р=0,019), что может указывать на участие этого цитокина в регуляции иммунного гомеостаза при трансплантации сердца. Анализ содержания РБОЕ-ВВ не имеет клинического значения для прогноза посттрансплантационных сердечно-сосудистых осложнений.

4. Содержание биомаркеров \ТЮР-А, РБОЕ-ВВ, МСР-1, бСБ40Ь у пациентов с трансплантированным сердцем достоверно ниже, чем у больных сердечной недостаточностью, ожидающих трансплантацию; концентрация УЕвР-А и зСБ40Ь выше у пациентов с сердечно-сосудистыми осложнениями, чем без таковых (р=0,049, р=0,013, соотв.).

5. У пациентов с острым клеточным отторжением концентрация УЕОР-А, РЮЕ-1 и зСБ40Ь достоверно выше, чем у пациентов без осложнений (р=0,001, р=0,038 и р=0,012, соотв.). Концентрация биомаркеров неоангиогенеза и воспаления не

различается у пациентов с гуморальным отторжением, васкулопатией трансплантата и без осложнений.

6. При уровне УЕСР-А, превышающем найденное пороговое значение (317 пг/мл), риск развития острого клеточного отторжения у реципиентов трансплантированного сердца выше в 4,3 раза; при уровне РЮР-1, превышающем пороговое значение (5,33 пг/мл), - в 2,8 раза; при уровне бСВ40Ь, превышающем пороговое значение (671 пг/мл), - в 2,7 раза.

7. Комплексный тест на УЕСР-А, РЮР-1, 5СБ40Ь имеет лучшие диагностические характеристики в отношении острого клеточного отторжения, чем каждый биомаркер в отдельности, или любое сочетание двух из указанных биомаркеров. При уровне всех трех биомаркеров, превышающем определенные пороговые значения, риск развития острого клеточного отторжения в 4,5 раза выше, чем у остальных пациентов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для персонифицированного мониторинга пациентов до и после трансплантации сердца целесообразно использование мультиплексной технологии с одновременным определением концентрации нескольких аналитов.

Контроль лабораторных биомаркеров неоангиогенеза и воспаления при текущем наблюдении реципиентов сердца может быть полезен для выявления пациентов с высоким риском сердечно-сосудистых осложнений, подбора индивидуальной патогенетически обоснованной терапии и оценке ее эффективности.

Измерение в сыворотке крови уровней УЕСР-А, РЮР-1 и 5СБ40Ь позволяет выявлять реципиентов сердца с высоким риском развития острого клеточного отторжения.

Сочетание тестов на УЕСР-А, РЮР-1 и бСБ40Ь в составе мультиплексной панели обладает наибольшей диагностической эффективностью у пациентов с риском острого клеточного отторжения трансплантированного сердца.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шевченко О.П., Честухин В.В., Миронков Б.Я, Казаков Э.Н., Кормер АЛ., Орлова О.В., Стаханова Е.А. Связь уровня sCD40L с прогнозом сердечно-сосудистых осложнений у реципиентов сердца //Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. - 2011. -Т. 12.-№6,-С. 154.

2. Шевченко О.П., Миронков Б.Л., Честухин В.В., Орлова О.В., Халилулин Т.А., Казаков Э.Н., Кормер АЛ., Стаханова Е.А. Прогнозирование распространенности стенотического поражения коронарного русла трансплантата у реципиентов сердца //Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. - 2011. - Т. 12. - №6. - С. 154.

3. Орлова О.В., Миронков Б .Л., Честухин В.В., Халилулин Т.А., Казаков Э.Н., Кормер АЛ., Стаханова Е.А., Шевченко О.П. Роль предсуществующих HLA-антител класса 1 в прогнозировании сердечно-сосудистых осложнений у реципиентов сердца //Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2012. - T. XIV. - С. 207.

4. Кунцевич Н.В., Стаханова Е.А., Шевченко О.П. Оксидативный стресс -универсальный механизм повреждения клеток // Биомаркеры в лабораторной диагностике / под ред. Долгова В.В., Шевченко О.П., Шевченко А.О. - М. - Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2014. - С. 224-228.

5. Shevchenko O.P., Khalilulin Т.А., Shevchenko А.О., Apanasenko N.V., Stakhanova E.A.., Kormer A.J., Mironkov B.L., Kupriyanova A.G., Gautier S.V. Predictive Value of PAPP-A, sCD40L, Anti-HLA Antibodies Detected by ELISA and Luminex in Heart Transplant Recipients // The Journal of Heart and Lung Transplantation. - 2014. - Vol. 33. - № 4S. - P. S135.

6. Shevchenko A.O., Shevchenko O.P., Kurabekova R.M., Stakhanova E.A. Triple biomarker index added to the troponin test improves laboratory diagnosis of acute coronary syndromes // European Heart Journal - 2014. - Vol. 35. - Suppl. 1. - P. 887.

7. Стаханова E.A., Шевченко A.O. Мультимаркерный анализ у реципиентов сердца и больных острым коронарным синдромом //Вестник трансплантологии и искусственных органов. -2014. -T. XVI. -С. 197-198.

8. Шевченко О.П., Халилулин Т.А., Шевченко А.О., Апанасенко Н.В., Стаханова Е.А., Великий Д.А., Кормер АЛ., Миронков БЛ., Куприянова А.Г. Характеристика предиктивного значения РАРР-А, sCD40L и анти-HLA антител у реципиентов трансплантированного сердца // Вестник трансплантологии и искусственных органов. -2014.-T. XVI.-С. 179-180.

9. Шевченко О.П., Миронков Б.Л., Шевченко А.О., Кормер АЛ., Олефиренко Г.А., Халилулин Т.А., Стаханова Е.А. Молекулярные механизмы развития и прогрессирования болезни коронарных артерий сердца и сердечного трансплантата //Трансплантология: итоги и перспективы. Том V. 2013 год / Под ред. C.B. Готье. - М. -Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2014. - С. 76-88.

10. Шевченко О.П., Стаханова Е.А-, Гичкун O.E., Курабекова P.M., Муминов И.И., Шевченко А.О. Мультиплексный анализ биомаркеров неоангиогенеза и воспаления у реципиентов сердца // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2015. - Том ХУЛ. - №1. - С.12-17.

11. Shevchenko A.O., Stakhanova E.A., Olefirenko G.A., Shevchenko O.P. The plasma level of soluble receptor for advanced glycation end products associates with concentration of placenta growth factor in heart transplant recipients // Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. - 2015. - Vol. 53. - Iss. S1. - P. 1224.

12. Shevchenko A.O. Triplex biomarker test in laboratory diagnosis of acute coronary syndromes / A.O. Shevchenko, E.A. Stakhanova, L.M. Ginzburg, O.P. Shevchenko // Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. - 2015. - Vol. 53. - Iss. SI. - P. 495.

13. Шевченко О.П., Стаханова E.A., Шевченко A.O., Можейко Н.П., Гичкуп О.Е. Факторы роста эндотелия сосудов при отторжении трансплантированного сердца // Вестник трансплантологии и искусственных оргапов. - 2015. - Том XVII. -№2. — С.23-29.

14. Шевченко O.IL, Стаханова Е.А. Мультимаркерный (мультиплексный) анализ - инструмент персонифицированной медицины // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2015. - Том XVII. - №2. - С. 90-92.

15. Шевченко О.П., Стаханова ЕА. Инновации в области трансплантологии, искусственных органов, регенеративной медицины // Трансплантология: итоги и перспекшвы. Том VI. 2014 год / Под ред. С.В. Готье. - М. - Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2015. - С. 78-83.

Свидетельство о государственной регистрации базы данных Биомаркеры у реципиентов сердца / О.П. Шевченко, P.M. Курабекова, А.О. Шевченко, Г.А. Олефиренко, JI.B. Макарова, ИИ. Муминов, Е.А. Стаханова, С.В. Готье. - № 2015620209 от 06.02.2015.

БКАПС

ДКМП

ИБС

ОКО ТС ФК ЭМБ

FGF-2

МСР-1

PDGF-BB

P1GF-1

SCD40L

VEGF-A

VEGF-D

AMR

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Болезнь коронарных артерий пересаженного сердца

Дилатационная кардимиопатия

Ишемическая болезнь сердца

Острое клеточное отторжение

Трансплантация сердца

Функциональный класс

Эндомиокардиальная биопсия

Гуморальное (антителоопосредованное) отторжение

Фактор роста фибробластов

Хемоаттрактантный белок макрофагов

Фактор роста тромбоцитов

Плацентарный фактор роста -1

Растворимая форма лиганда СБ40

Факторы роста эндотелия сосудов - А

Факторы роста эндотелия сосудов - В

Подписано в печать: 16.10.2015 Тираж: 100 экз. Заказ № 1442 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д. 74 (495) 790-47-77 www.reglet.ru