Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Разработка, обоснование и оценка современной биотерапии у больных с солидными опухолями

На правах рукописи

БАЛДУЕВА Ирина Александровна

РАЗРАБОТКА, ОБОСНОВАНИЕ И ОЦЕНКА СОВРЕМЕННОЙ БИОТЕРАПИИ У БОЛЬНЫХ С СОЛИДНЫМИ ОПУХОЛЯМИ

специальность - 14.00.14 - онкология

- 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

003457810

Санкт-Петербург 2008

003457810

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научно-исследовательский институт онкологии имени H.H. Петрова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» (ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий»)

Научный консультант

доктор медицинских наук, профессор Моисеенко В.М. Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Барышников А.Ю. доктор медицинских наук, профессор Гершанович М.Л. доктор медицинских наук, профессор Максимов С.Я.

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова.

Защита состоится «_»_ 2008 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.052.01 ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий» (197758, Санкт-Петербург, Песочный-2, ул.Ленинградская, д.68).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий».

Автореферат разослан «_»_2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Р.В. Орлова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

В последнее десятилетие достигнуты несомненные успехи в лечении злокачественных опухолей, в первую очередь, вследствие прогресса лекарственной терапии. Одновременно достижения молекулярной биологии, иммунологии, углубленное понимание механизмов прогрессии опухоли и взаимоотношений иммунной системы и опухоли, а также развитие биотехнологии обусловили реальные перспективы улучшения результатов лечения опухолей с помощью методов биотерапии.

Разработка методов биотерапии у больных с солидными опухолями, основанных на иммунопатологических особенностях заболевания, является актуальным направлением в современной клинической онкологии (Семиглазов В.Ф. и соавт., 1988; Барышников А.Ю. и соавт., 1998; Якубовская Р.И. и соавт., 2004; Georgiev G.P. et al., 1998). Кроме того, понимание механизмов иммунной защиты, исследование причин их несостоятельности и разработка методов коррекции представляют также несомненный научный интерес (Кадагидзе З.Г. и соавт., 2004). Это связано с тем, что злокачественная опухоль в организме является своего рода моделью реакции «трансплантат против хозяина». Неуклонный рост частоты онкологических заболеваний, низкий уровень выживаемости у больных с IV стадией, недостаточная эффективность традиционных методов лечения у этой категории больных обуславливают социальную значимость данной проблемы (Давыдов М.И. и соавт., 1998; Чиссов В.И., Старинский В.В., 2000).

Большой научный интерес представляет изучение механизмов формирования иммунодепрессии у больных со злокачественными опухолями. Способность опухоли индуцировать анергию и апоптоз иммунокомпетентных клеток свидетельствует о том, что иммунодепрессия при опухолевом росте может являться следствием негативного исхода клеточной активации (Хансон К.П. и соавт., 1996). Происходит ли это на самом деле у больных с солидными опухолями, насколько подвержены нарушения иммунитета биотерапевтической коррекции, как изменение баланса цитокинов сказывается на течении заболевания, и, в том числе, на выраженности специфического противоопухолевого иммунного ответа - все это составляет тот спектр вопросов, который в настоящее время остается во многом не выясненным (Моисеенко В.М. и соавт., 1998).

Кроме того, в доступной литературе отсутствует обоснование режимов вакцинотерапии больных со злокачественными опухолями, что связано с недостаточным пониманием механизмов индукции оптимального иммунного ответа на каждый опухолеассоциированный антиген. Между тем, очевидно, что эффективность этого метода во многом зависит от рационального его применения.

1

Таким образом, из всего вышесказанного следует, что, несмотря на колоссальные достижения фундаментальной и прогресс клинической онкологии, остается много неясного во взаимоотношении опухоли и иммунной системы организма практически на всех этапах опухолевой прогрессии. Кроме того, появляется целый спектр вопросов, связанных с воздействием различных методов современной биотерапии на это взаимоотношение, что определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования

Повышение эффективности лечения больных с солидными опухолями на основе современных высокотехнологичных методов биотерапии.

Задачи исследования

1. Обоснование и разработка современных методов биотерапии солидных опухолей.

2. Изучение влияния на отдельные звенья иммунной системы, а также клиническую эффективность методов активной специфической иммунотерапии на основе:

• костномозговых предшественников дендритных клеток;

• ^модифицированных опухолевых клеток с иммунологическими адъювантами;

• геномодифицированных опухолевых клеток.

3. Оценка токсичности различных методов активной специфической иммунотерапии.

4. Определение показаний и противопоказаний к проведению различных вариантов вакцинотерапии.

5. Определение места современной биотерапии в комплексном лечении больных меланомой кожи и раком почки.

Научная новизна

В диссертационной работе впервые:

• разработана оригинальная методика активной специфической иммунотерапии на основе аутологичных костномозговых предшественников дендритных клеток (Патент на изобретение № 2203683 от 10.05.2003 г., Заявка на изобретение №2008115173/14, приоритет от 17.04.2008 г.);

• изучены различные способы введения костномозговых предшественников дендритных клеток с иммунологическими адъювантами больным с диссеминированным опухолевым процессом;

• разработан способ иммунотерапии аутологичными опухолевыми клетками с адъювантом lL-ip (беталейкин) больных с солидными опухолями (Патент иа изобретение № 2267326 от 10.01.2006 г.);

• разработан оригинальный способ получению культур опухолевых клеток человека на полупромышленном уровне с использованием метода автоматический дезагрегации и пассирования образцов аутологичной опухоли;

• изучены и определены решающие условия успешной генотерапии больных меланомой кожи и раком почки с использованием липосомной трансфекции гена lag?.

Практическая значимость

• Обоснована целесообразность использования высокотехнологичных методов биотерапии в комплексном лечении больных диссеминированной меланомой и раком почки.

• Оценена клиническая и иммунологическая эффективность противоопухолевых вакцин, основанных на аутологичных костномозговых предшественниках дендритных клеток и геномодифицированных опухолевых клетках.

• Внедрен в клиническую практику метод оценки реакции гипсрчувствительности замедленного типа на вакцинный препарат и на аутологичные опухолевые клетки («bystander effect»).

• Определен приоритет внутрикожного способа введения вакцины на основе дендритных клеток по сравнению с внутривенным введением и инъекциями в периферические лимфатические узлы.

• Обоснована целесообразность использования противоопухолевых вакцин в комбинации с иммунологическими адъювантами (интерлейкин -1, -2).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Биотерапия с использованием вакцин — эффективный метод лечения больных с солидными опухолями.

2. Разработанные оригинальные противоопухолевые вакцины на основе генетически модифицированных опухолевых клеток и костномозговых предшественников дендритных клеток вызывают специфический иммунный ответ, приводящий к регрессу опухоли, и могут быть рекомендованы к практическому применению.

3. Основные механизмы противоопухолевого действия вакцин связаны с нормализацией либо стимуляцией функциональной активности отдельных звеньев

иммунной системы (CD3+, CD4+, CD8+ Т-лимфоцитов, CD20+ В-лимфоцитов, HLA DR+-, CD25+-, CD38+-, CD71+-, С095+-лимфоцитов, CDI6+ NK-клеток, ФГА и КонА активированных клеток).

Апробация диссертации

Основные результаты работы обсуждались на научных конференциях ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий» совместно с кафедрой онкологии с курсом клинической радиологии и на кафедре клинической лабораторной диагностики Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования.

Результаты работы были представлены на II съезде иммунологов России (Сочи, 1999), Европейской школе по онкологии (Москва, 1999), III—XI научных конференциях с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 1999—2007) III, V и IX ежегодных российских онкологических конференциях (Москва, 1999, 2001 и 2006), I Международном конгрессе «Новые медицинские технологии» (Санкт-Петербург, 2001), I Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия рака» (Москва, 2002), Международной научно-практической конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (Санкт-Петербург, 2002), I Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия рака» (Москва, 2002), конференции «Проблемы онкоиммунологии: научные и прикладные аспекты» (Киев, 2003), 14th Inter. Congress on anti-Cancer Treatment (Paris, 2003), III съезда ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004), межрегиональной научно-практической конференции «Комбинированные и комплексные методы лечения в онкологии» (Барнаул, 2004), научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2004), конференции «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург,

2004), III и V съезде онкологов и радиологов СНГ (Минск, 2004; Ташкент, 2008), IV—VII всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2005—2008), научно-практической конференции онкологов СЗФО «Меланома кожи. Современное состояние диагностики и лечения» (Великий Новгород, 2005), I Российско-американской конференции «Биотехнология и онкология» (Санкт-Петербург, 2005), Российской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии в онкологической практике» (Барнаул, 2005), 6th World Congress on Melanoma (Vancouver,

2005), Congress «Mediated diseases from theory to therapy» (Moscow, 2005), научно-практической конференции онкологов СЗФО «Меланома кожи. Современное состояние

диагностики и лечения» (Санкт-Петербург, 2005), XXXIII Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (Rhodes, 2005), 8th International Symposium Biological Therapy of cancer from disease to targeted therapy (Dresden, 2005), Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008).

Внедрение результатов работы в практику

Результаты работы внедрены и используются в практической и научно-исследовательской работе ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий», Институте биологии гена РАН (Москва), Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (Санкт-Петербург), в учебном процессе кафедры онкологии с курсом клинической радиологии и кафедры клинической лабораторной диагностики Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования.

Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и 9 приложений. Текст изложен на 270 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 133 рисунка. Список литературы включает 412 источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы н методы исследования

Работа выполнена в ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий». Исследование проводилось в период с ноября 1998 по февраль 2008 г.

В работе использовались клинические, стандартные лабораторные, биохимические, иммунологические и нммуногистохимические методы исследования больных, позволяющие оценить функциональное состояние организма, инструментальные методы, применяемые при диагностике злокачественных опухолей и метастатических образований. Все экспериментальные исследования выполнены по решению Ученого Совета ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий».

В исследование включено 322 пациента. Клиническая оценка произведена у 214 пациентов: 121 больной мсланомой кожи, 78 больных раком почки, 8 больных раком предстательной железы, 5 больных колоректальным раком, 1 больной злокачественной шванномой, 1 больной немелкоклеточным раком легкого (рис. 1). 102 больных после

радикального хирургического лечения или полных циторедуктивных операций и 112 пациентов после частичных циторедуктивных операций.

И Меланома кожи □ Рак почки

SS Рак предстательной железы Ш Колоректальный рак Ш Злокачественная шваннома £Э Немелкоклеточный рак легкого

Рис. 1. Характеристика больных, получавших противоопухолевую вакцинотерапию.

Во всех случаях диагноз заболевания был подтвержден гистологическим исследованием, а удаленные опухоли были использованы для приготовления аутологичных культур опухолевых клеток с целью дальнейшей противоопухолевой вакцинотерапии.

В исследование включено 108 женщин и 106 мужчин. Средний возраст пациентов составил 53,7 года (от 21 года до 79 лет).

Все больные подвергались предварительному обследованию для оценки степени распространенности опухоли. В результате у 112 больных была подтверждена диссеминированная стадия заболевания. Частота поражения различных органов и систем представлена на рис. 2.

Рис. 2. Частота поражения различных органов и систем у больных, получавших вакцинотерапию с лечебной целью.

Для отбора больных использовали общепринятые в клинической практике критерии включения и исключения. Критерии включения:

1. Гистологически верифицированный диагноз солидной опухоли с очагами поражения доступными для биопсии.

2. Возраст старше 18 лет.

3. Общее удовлетворительное состояние (индекс Карновского не менее 70%).

4. Ожидаемая продолжительность жизни не менее 3 мес.

5. Отсутствие противоопухолевого лечения (химиотерапия, гормонотерапия, лучевая терапия, иммунотерапия) в течение последних 4 нед или наличие явных признаков прогрессирования после их проведения.

6. Возможность визуальной или инструментальной оценки динамики изменений метастатических очагов.

7. Абсолютное содержание в периферической крови СОЗ*-лимфоцитов >0,8х109/л, СР4+>0,52х 109/л, СЭ8">0,28х 10%.

8. Согласие больного на участие в данном исследовании.

Критерии исключения:

1. Наличие метастатического поражения центральной нервной системы.

2. Активный аутоиммунный процесс.

3. Больные с одной из перечисленных инфекций: HIV, HBV, HCV.

4. Наличие признаков системной инфекции или тяжелых заболеваний сердечнососудистой, нервной, дыхательной или эндокринной системы.

5. Нарушение функции печени и почек (билирубин > 1,5 х N, креатинин > 1,5 х N). Точкой отсчета наблюдения за больными принималась дата хирургического

лечения, в том числе с целью забора образца аутологичной опухоли для приготовления вакцины. Объективная оценка клинического эффекта (стандартные клинические, лабораторные, рентгенологические и ультразвуковые методы исследования) проводилась после 3-й и 6-й вакцинаций, а также каждые последующие 3 мес.

Во время исследования проведен анализ факторов, которые могли бы оказывать влияние на эффективность лечения - тип опухоли, состояние иммунной системы, цель вакцинации, количество вакцинаций. При оценке лечебного действия вакцинотерапии использованы единые критерии объективного эффекта. Критериями объективного эффекта при лечении солидных опухолей являются полный или частичный регресс размеров опухоли и метастазов, а также время безрецидивной выживаемости. Статус больного на момент решения вопроса о возможности проведения паллиативной вакцинотерапии оценивался по системе ВОЗ. Степень токсичности вакцин определялась по шкале СТС NCIC (расширенная шкала ВОЗ).

При оценке показателей выживаемости период наблюдения исчислялся от даты хирургического лечения первичной опухоли или метастазов, совпадающей с забором опухолевого материала для приготовления вакцины, до даты смерти или последнего контакта с больным или родственниками. Изучение косвенного влияния вакцинотерапии на выживаемость проводили путем сопоставления выживаемости больных, получавших вакцинотерапию с паллиативной и адъювантной целью, прошедших полный (6 вакцинаций) или частичный курс лечения. В табл. 1 указаны вакцины, режимы и способы введения, разработанные и оптимизированные в ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова Росмедтехнологий» с 1998 по 2008 г.

Источником информации о больных были истории болезни и амбулаторные карты ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий», заполняемые в процессе лечения и наблюдения. Оценку иммунного статуса пациентов проводили в лаборатории иммунологии СПб ГУЗ «Городская больница №31» (зав. лабораторией Улейская Г.И.). После получения данных из первичной документации и текущие сведения о больных

кодировались и фиксировались в специально разработанных бумажных формах и в программе Microsoft Excel персонального компьютера, представляя базу данных для каждой группы больных.

Таблица 1

Аутологичные вакцины, режимы и способы введения

Тип вакцины Число больных Режим введения Способ введения

Немодифицированные опухолевые клетки 106 с иммунологическим адъювантом BCG (106) 48 2 введения с интервалом 14 дней, последующие 4 введения каждый 21-й день в/к паравертебрально в 4 точки с Вев х2 введения, без ВСО - 4 введения

Немодифицированные опухолевые клетки 106 с иммунологическим адъювантом IL-ip (60 нг) 57 6 введений каждый 21-й день в/к паравертебрально в 3 точки с 1Ь-1Р, 4-я точка без 1Ь-1 р - контрольная. Одновременно вводили 1Ыр в дозе 470 нг в переднюю брюшную стенку двукратно (день 0 и день 1)

Немодифицированные опухолевые клетки 106 с иммунологическим адъювантом IL-ip (60 нг) и низкими дозами циклофосфамида (300 мг) 18 6 введений каждый 21-й день, циклофосфамид в день 0 в/к паравертебрально в 3 точки с 11.-1 р, 4-я точка без 1Ь-1р - контрольная. Одновременно вводили 11.-1 р в дозе 470 нгв переднюю брюшную стенку двукратно (день 0 и день 1)

Опухолевые клетки 106, трансфецированные геном tag7 - генотерапия 54 6 введений каждый 21 -й день Проводили пролонгированные и повторные курсы от 18 до 35 введений в/к паравертебрально в 3 точки геномодифицированные клетки, в 4-й точке -немодифицированные опухолевые клетки

Дендритные клетки (3x106 14 6 введений 1) в/в капельно

кг/массы тела), каждые

нагруженные лизатом 1) 7 дней, 2) в/к паравертебралыго в

аутологичных опухолевых 7 точек, 8-я точка -

клеток без адъюванта 2) 14 или 21 день контрольная

(ненагруженные

Дендритные клетки 2 Проводили дендритные клетки)

с иммунологическим пролонгированные

адъювантом местно и повторные 3) в периферические

и 1Ь-2 системно курсы лимфатические узлы + 1

до 13 введений контрольная точка

Дендритные клетки 2 (в/к паравертебрально,

с иммуномодулирующими ненагруженные

дозами цитостатиков дендритные клетки)

Для оценки сроков жизни в различных группах больных использовали медиану выживаемости, определяемую как период времени, за который погибает половина больных исследуемой группы (Березкин Д.П., 1982), и средняя продолжительность выживания (М) с ее стандартной ошибкой (ш). Для вычисления указанных критериев использовали компьютерную программу 81аи5Иса 6.0. Графическая демонстрация осуществлена с помощью кривых Каплана-Мейера.

Методы

1. Приготовление вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток

Приготовление вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток состоит из четырех основных этапов:

1-й этап - дезагрегация образца резецированной аутологичной опухоли;

2-й этап - наращивание культуры аутологичной опухоли в условиях, соответствующих требованиям Good Laboratory Practice (GLP);

3-й этап - характеристика клеточного состава (цитологическая, иммуноцитохимическая, клоногенная и др.);

4-й этап - программное замораживание и хранение в условиях -196°С криобанка клеточных культур человека в ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий».

1.1. Дезагрегация образцов опухоли

Для получения суспензии опухолевых клеток используют механический и ферментативный способы диссоциации опухолевой массы. Традиционно предпочтение отдают ферментативной обработке тканей, которая считается наименее травматичной для

клеток. В то же время, использование этого метода приводит к трудно обнаруживаемым метаболическим нарушениям, в частности, к изменению проницаемости мембран и потере ими части белков, что не вызывает немедленной гибели клеток, но приводит к торможению роста культуры in vitro (Slocum Н.К. et al., 1981; Engelholm S.A. et al., 1985). Ряд специалистов применяют механический способ дезагрегации тканевых фрагментов с помощью различных ручных приемов, в том числе с использованием стеклянных гомогенизаторов. Достоинством этого подхода является его дешевизна, а ограничением -низкая жизнеспособность клеток механически травмированной солидной опухоли.

В настоящей работе мы использовали автоматизированный механический способ дезагрегации опухолевой ткани с помощью «Медимашины» («DAKO», Дания) (Ottosen G.L. et al., 1996) в нашей модификации.

Для этого опухолевую ткань разделяли на фрагменты 2-3 мм3, помещали в культуральную среду и медиконы (стерильные ножи) («DAKO», Дания) и дезагрегировали в течение 10 - 60 с. Время дезагрегации определяли для каждого случая эмпирически в связи с различиями в структурно-морфологической организации опухоли. Далее клеточную суспензию фильтровали с помощью филконов 70 мкм и 50 мкм («DAKO», Дания), которые позволяют максимально избавиться от стромальных и клеточных конгломератов, и отмывали центрифугированием при 1000 об./мин в течение 10 мин. Количество и жизнеспособность клеток определяли в камере Горяева с помощью трипанового синего. Далее клетки вводили в фиксированный объем полной питательной среды и переносили в индивидуальные культуральные флаконы.

1.2. Наращивание клеток опухоли в культуре

Наращивание индивидуальных клеточных культур требует пристального внимания и непрерывного совершенствования технологии культивирования. Для изучения оптимального соотношения компонентов питательной среды использовали три типа сред: DMEM («Invitrogen», США), DMEM/F12 («Биолот», РФ), RPM1-1640 («Serva», Германия). При этом добавляли разное количество сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (СЭКРС): 5, 10, 20% («Биолот», РФ). Также исследовали влияние на рост опухолевых клеток кондиционированной среды культур фибробластов легких эмбриона человека, препарата трансферрин-инсулин-селен («Invitrogen», США) (конечная концентрация в среде: 5 мкг/мл, 5 мкг/мл и 5 нг/мл соответственно). В качестве селективного агента, предотвращающего рост фибробластов, применяли 100 мкг/мл генетицина («Invitrogen», США). С целью предотвращения контаминации клеточных культур использовали 100

ЕД/мл пенициллина, 50 ЕД/мл стрептомицина или 50 мкг/мл гентамицина, 2,5 мкг/мл фунгизона («Invitrogen», США).

При наращивании первичной клеточной массы получали монослойные, суспензионные или полусуспензионные культуры, у которых в дальнейшем можно изменить адгезионные свойства, используя подложку из коллагена. При необходимости использовали культуральные флаконы, предварительно покрытые матриксом, состоящим из бычьего коллагена I типа («Sigma», США).

Эффективность добавок определяли по скорости прироста клеток. Для этого высаживали выделенные клетки по 5 х 10! на лунку в 96-луночной планшете в исследуемой питательной среде. На 3-й сутки производили подсчет клеток в камере Горяева.

1.3. Характеристика клеточного состава

Проводили цитологическую и морфологическую верификацию, изучали тип роста, у части культур исследовали скорость пролиферации. Стабильно пролиферирующие культуры меланомы и рака почки в последующем тестировали на присутствие опухолеассоциированных антигенов. Для этого опухолевые клетки: 1) выращивали на стеклах; 2) фиксировали с помощью абсолютного метанола; 3) окрашивали моноклональными антителами к белкам S100, gplOO, tyrosinase, M1TF, MAGE1, MART/MelanA, CD63 («Novocastra», Великобритания) с помощью непрямого иммуноцитохимического метода и системы визуализации Novostain Detection Kit NCL-RTU-D («Novocastra», Великобритания). Для выявления антигенов клеток рака почки применяли моноклональные антитела NCL-RCC («Novocastra», Великобритания), специфичные к гликопротеину 200 кДа, локализующемуся в клетках проксимального отдела почечных канальцев и экспрессирующему в 93% первичных опухолей почки и 84% метастатических образований, а также к CK. 18, СК8, Ki-67, EMA, PanCK.

1.4. Криоконсервация и хранение культур опухолевых клеток

Опухолевые клетки каждого пациента подсчитывали в камере Горяева и криоконсервировали в дозе 106 клеток/мл в полипропиленовых стерильных криопробирках («Sarstedt», Германия) и криосреде, содержащей 50% питательной среды, 40% СКРС, 10% диметилсульфоксида (ДМСО) («Sigma», США). Для криоконсервации использовали метод программного замораживания клеток на приборе Computer Freezer Гее Cube 1810 SY Lab (Италия) с контролируемой скоростью охлаждения, которая составляла -ГС/мин в диапазоне от +4 °С до -40°С, и -5°С/мин в диапазоне от -40° до -120°С. Затем

клетки переносили в индивидуальные контейнеры с жидким азотом (-196°С) и хранили до использования.

Для размораживания клеток пробирки помещали на 3 мин в воду с температурой +42°С, затем разводили полной питательной средой 1:10, центрифугировали при 1000 об./мин в течение 5 мин, заменяли криосреду на полную питательную среду и рассеивали для культивирования в концентрации 2-3 х 106/мл.

1.5. Блокада пролиферации опухолевых клеток

Для блокады пролиферации культуру опухолевых клеток в день вакцинации помещали в стерильные полипропиленовые пробирки в полной питательной среде и облучали в суммарной дозе 2000 сГр на терапевтическом аппарате «Рокус-у» Со60 1,25 МэВ (мощность дозы 0,99 сГр/с). Такой режим облучения полностью блокирует пролиферативную активность опухолевых клеток при сохранении синтеза белковых молекул, в том числе специфических антигенов (5о11Тег Я. е! а1., 1998).

Контроль пролиферативной активности клеток проводили по методике оценки включения Н3-тимидина в ДНК пролиферирующих клеток. Результаты анализа проб не превышали отрицательный контроль (лизат аутологичных опухолевых клеток).

После облучения опухолевые клетки троекратно отмывали от компонентов культуральной среды в 10 мл 0,9% раствора натрия хлорида центрифугированием при 1000 об./мин в течение 10 мин и приводили к концентрации 106/мл.

1.6. Обоснование числа опухолевых клеток, вводимых при вакцинации

В подавляющем большинстве протоколов, апробированных в зарубежных клиниках, минимальное количество аутологичных опухолевых клеток, вводимых с целью вакцинации при каждой инъекции, составляет 2 х 103 клеток, а максимальной - 10Ч клеток.

Глубоких обоснований именно такого количества антигенного материала в специальной литературе нет, очевидно, этот эмпирически найденный диапазон соответствует тому содержанию антигенного материала в опухолевых клетках (5-15 мкг), которое необходимо для индукции полноценного иммунного ответа при внутрикожном введении.

2. Приготовление вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток с иммунологическим адъювантом

Индивидуально для каждого больного наращивали и характеризовали культуру опухолевых клеток, криоконсервировали и хранили до использования.

2.1. Приготовление вакцины па основе аутологичных опухолевых клеток с адъювантом BCG

В день вакцинации клетки (106/клеток) (Dillman R.O. et al., 1998) размораживали, дважды отмывали в бессывороточной культуральной среде, помещали в стерильный контейнер и подвергали облучению на терапевтическом аппарате «Рокус-у» Со60 1,25 МэВ при 2000 сГр (мощность дозы 0,99 сГр/с. После облучения клетки трижды отмывали центрифугированием (1000 об./мин, 10 мин) в 0,9% растворе натрия хлорида, смешивали с 106 BCG и вводили ex tempore по 0,3 мл смеси паравертебрально в межлопаточную область в 4 точки на расстоянии 3 см с образованием «лимонной корочки». В пятую точку, а также, начиная с 3-й вакцинации, во все пять точек вводили опухолевые клетки без адъюванта. Курс вакцинотерапии состоял из 1-6 введений (в зависимости от количества полученного материала) с интервалом: 1-я и 2-я вакцинации через 2 нед., 3-я и последующие вакцинации с интервалом в 3 нед.

2.2. Приготовление вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток с адъювантом IL-lß

Размороженные и облученные аутологичные опухолевые клетки смешивали с 60 нг IL-lß («Беталейкин», РФ) в 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида и вводили ex tempore по 0,3 мл паравертебрально в межлопаточную область в 3 точки на расстоянии 3 см и образованием «лимонной корочки». В четвертую точку вводили опухолевые клетки без адъюванта. Одновременно вводили 470 нг IL-lß в 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида подкожно в переднюю брюшную стенку с целью индукции системного иммунного ответа. Подкожное введение адъюванта повторяли на следующий день после вакцинации. Полный курс вакцинотерапии состоял из 4-6 введений (в зависимости от количества полученного материала) с интервалом 21 день. Схема вакцинации была выбрана на основании анализа опубликованных протоколов клинических исследований по аналогичным видам вакцин, режим введения адъюванта - на расчетах разработчиков препарата беталейкин (проф. A.C. Симбирцев, ГНЦ Институт особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург).

3. Приготовление вакцины на основе аутологичиых опухолевых клеток, модифицированных геном tag7

Индивидуально для каждого больного наращивали и характеризовали культуру опухолевых клеток, трансфецировали геном tag 7, криоконсервировали и хранили в криобанке клеточных культур (-1%°С) до использования.

Опухолевые клетки модифицировали трансфекцией гена tag7 с использованием двух липосомных систем (Unifectin-21 и Un¡fectin-56), предоставленных канд.хим.наук А.Ю.Суровым (ИБХ РАН, Москва). Для анализа экспрессии введенных генов использовали геи (3-галактозидазы и зеленый флюоресцентный белок GFP, синтез продуктов которых выявляли через 24-72 ч после трансфекции. Эффективность трансфекции оценивали по соотношению окрашенных (трансфецированных) клеток к общему количеству клеток. После определения оптимальных условий осуществляли трансфекцию опухолевых клеток геном tag 7, максимальное значение которой составило 30%, минимальное - 4%, среднее значение - 12,0 i 6,5%.

Далее образцы тестировали на присутствие белка Tag 7 с помощью электрофореза в ДНС-ПААГ и иммуноблот-анализа.

Трансфецированные опухолевые клетки криоконсервировали и хранили в криобанке до использования. В день вакцинации 10б клеток размораживали, отмывали и облучали в вышеописанных режимах.

Приготовленную вакцину вводили строго внутрикожно паравертсбрально в 3 точки на расстоянии 3 см друг от друга. В четвертую точку вводили нетрансфецированные опухолевые клетки. Курс лечения состоял из 6 введений вакцины с интервалом 21 день.

4. Приготовление вакцины на основе аутологичиых костномозговых предшественников дендритных клеток (ДК)

Предшественники ДК мобилизовали из костного мозга в периферическую кровь ежедневным подкожным введением 8 мкг/кг массы тела гранулоцитарно-макрофагального колониестнмулирующего фактора (GM-CSF) в течение 4 дней с операцией афереза периферических стволовых клеток на 5-й день на автоматическом сепараторе клеток крови «СОВЕ Spectra». Объем периферической костномозговой клеточной взвеси составлял около 240 мл, концентрат клеточной суспензии -40-120 х 106/мл.

Мононуклеары (3 х 106/мл) помещали в свежую культуральную среду RPMI-1640 («Serva», Германия) с 2мМ L-глутамина, 5 нг/мл GM-CSF (лейкомакс) (Швейцария) или 7 нг/мл GM-CSF (лейкин) (США), 50 мг/100 мл амикина (Чехословакия) и плоскодонные культуральные флаконы 165 см3 для суспензионных культур с вентилируемыми

пробками. Культивирование проводили в бессывороточной питательной среде в течение 18 ч с целью исключения из клеточной культуры макрофагов и активации примеси тромбоцитов. Последующие 5 дней культивирования проводили в присутствии 5-10% инактивированной СЭКРС (56°С 30 мин). В дальнейшем уменьшали содержание СЭКРС и производили ее полную замену на аутологичную плазму. Весь период культивирования (12-14 дней) проводили в присутствии стабильного содержания в среде СМ-С5Р (5 нг/мл лейкомакса или 7 нг/мл лейкина). Наблюдение проводили за клетками, прикрепившимися со второго пассажа.

В результате вышеописанных приемов нами была разработана методика выращивания ДК (С011с+, СШа+, НЬА СОИ, СИЗ", С020") из аутологичных

костномозговых предшественников.

Активация ДК. Нами оптимизирована разработанная методика активации костномозговых ДК (Патент на изобретение № 2203683 «Способ иммунотерапии костномозговыми дендритными клетками больных с солидными опухолями» по заявке от 20.09.2001 г. Авторы изобретения: Моисеенко В.М., Балдуева И.А., Орлова Р.В., Семенова А.И.), которая заключалась в оценке способности к захвату нативных опухолеассоциированных антигенов ДК в присутствии Т№-а и 1Ь-1р.

Установили, что ДК при созревании и активации открепляются от пластика и легко удаляются вместе с питательной средой, незрелые ДК остаются прикрепленными или полуприкрепленными. Максимальное открепление клеток (~80%) наблюдалось при использовании лизата из 0,4 х 106/мл, ТОТ-а (25 нг/мл) и 1Ь-1 [) (30 нг/мл). Увеличение количества антигенного материала (0,8 х 106/мл, 1,6 х 10б/мл, 3,2 х 106/мл) и введение в культуру ДК ТЫ [-'-а (50 нг/мл) или 1Ь-1р (60 нг/мл) не влияло на их созревание и активацию. Вместе с тем, использование только одного из изучаемых цитокинов потребовало увеличения количества антигенного материала до 1,6 х 10б/мл. Увеличение антигенного материала до 3,2 х 106/мл не приводило к существенному различию в количестве открепляющихся от пластика ДК. Маркеры активированных ДК (НЬА ОЯ.1"^, С01а'°", С0831,-'1\ С0861"^) экспрессировали 65-80% открепившихся клеток.

Нагруженные и активированные вакцинные ДК криоконсервировали и хранили в криобанке клеточных культур.

В день вакцинации клетки Зх10б/кг массы тела пациента размораживали, отмывали и помещали в изотонический раствор №С1 с 10% раствором альбумина человека. Приготовленную вакцину вводили: 1) внутривенно капельно еженедельно, 2) внутрикожно каждый 14-й или 21-й день, 3) в периферические лимфатические узлы с интервалом 14 дней. Полный курс лечения состоял из 6 вакцинаций.

5. Характеристика приготовленной вакцины

Стерильность. Вакцинный препарат был стерильным. Контроль проводили после приготовления вакцины по методике, изложенной в Сборнике инструкций, утвержденных приказом Минздрава СССР от 13.01.83 г. №31.

Токсичность. Вакцинный препарат был безвреден для больного. Контроль проводили в соответствии с критериями токсичности, рекомендованными ВОЗ. Основные жизненные параметры (общее состояние, пульс, АД) измеряли через 10, 30 и 60 мин после каждой вакцинации. Особое внимание уделялось местным кожным реакциям, лихорадке, гастроинтестинальной и гематологической токсичности, а также функции печени, почек и нервной системы. В случае развития выраженных токсических реакций, которые могут угрожать жизни больных, последующие вакцинации не применялись. Больные исключались из исследования, однако, тщательное динамическое наблюдение за ними продолжалось.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оценка токсичности и клинической эффективности вакцинотерапии на основе аутологичных опухолевых клеток в сочетании с адъювантом ВСС у больных с диссеминнрованными солидными опухолями

Лечение начинали спустя 3-6 нед после удаления первичного очага или метастазов опухоли. Шесть вакцинаций получили 16 больных из 45 (36%), 5 введений вакцины - 5 пациентов (11%), 4 введения - 15 пациентов (33%), 3 введения - 4 пациента (9%), 2 введения - 3 пациента (7%) и 1 введение аутологичной вакцины - 2 пациента (4%). Преждевременное завершение лечения у 29 больных было обусловлено прогрессированием заболевания или отсутствием необходимого количества выращенных в культуре опухолевых клеток, что препятствовало продолжению лечения.

Основным осложнением, выявленным у 3 (7%) больных, была некротизация папул в местах введения вакцины с ВСв.

Полный регресс опухоли не зарегистрирован ни у одного из 20 пациентов, получавших лечебную вакцинотерапию. У 1 больной раком почки зарегистрирован частичный регресс метастазов в шейные лимфатические узлы после 6 введений вакцины, продолжительность которого составила 3 мес. Стабилизация процесса характеризовалась большой продолжительностью и наблюдалась у 10 больных (5 больных раком почки, 3 больных меланомой кожи, 1 больной раком предстательной железы, 1 больной раком легкого). Средняя продолжительность времени до прогрессирования составила 6,4 мес (от 2 до 26 мес).

У больных, получавших адъювантную вакцинотерапию (п=25), средняя продолжительность безрецидивного периода составила 39,6 мес (от 3 до 65 мес). У 1 больного зарегистрировано прогрессирование заболевания после завершения курса вакцинотерапии. У 13 больных (8 больных раком почки, 3 - раком предстательной железы, 1 - меланомой кожи, 1 - раком прямой кишки) на момент анализа безрецидивный период продолжается.

При характеристике показателей выживаемости в этих двух группах больных выявлено, что медиана выживаемости пациентов, получавших вакцинотерапию с лечебной целью, составила 11,5 мес от начала лечения, средняя продолжительность жизни 19 мес (95% С1 10,4-27,9мес). Средняя продолжительность жизни больных, получавших вакцинотерапию с адъювантной целью, составила 44,2 мес (95% С1 36,5-51,8 мес). Медиана выживаемости не достигнута (рис. 3).

Кумулятивная выживаемость (Кар1ап-Меюг) • Нецензурированы Цензурированы

1.0

0,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 Время, мес

-Группа 1,

- Группа 2.

Рис. 3. Выживаемость пациентов, получавших вакцинотерапию на основе аутологичных опухолевых клеток в сочетании с ВСв с адьювантной (группа 1) и лечебной целью (группа 2) (метод Каплана-Мейера).

Иммуномодулирующие эффекты вакцинотерапии, зарегистрированные в лабораторных тестах in vitro у 96% больных, проявляются в активации моноцитов, лимфоцитов, сенсибилизации CD4+ и CD8+ Т-клеток.

В то же время, иммунная система больных с диссемннированным заболеванием отвечает на злокачественный процесс неоднозначно. С одной стороны, как показывает наше исследование, увеличивается содержание антигенпрезентируюших клеток (АПК) в периферической крови, а с другой, в результате нарушений гомеостатических механизмов наблюдается снижение их функциональной активности, которое, однако, устраняется в процессе лечения.

Иммунный ответ организма на опухоль, по-видимому, мало чем отличается от реакции на какие-либо другие антигены, то есть, основными во всех случаях являются процессы регуляции иммунного ответа. В то же время, процесс регуляции -положительный или отрицательный по отношению к опухолевому росту - зависит от комплекса взаимодействующих эффекторных и регуляторных клеток. Очевидно, что для обеспечения максимальной эффективности контроля регуляторные механизмы должны воздействовать на различные субпопуляции клеток-эффекторов, вовлекаемых в иммунный ответ. Особое значение в этой регуляции играют NK-клетки.

Большинство проведенных исследований у онкологических больных показали снижение NK-активности в исследуемых группах по сравнению со здоровыми донорами, причем, по данным различных авторов, они выявлялись как на ранних стадиях, так и при диссеминации опухолевого процесса. С другой стороны, имеются данные об отсутствии подавления NK-активности у онкологических больных, а также данные, связывающие низкие показатели NK с плохим прогнозом заболевания.

Наши исследования показали, что у больных, получавших вакцину на основе аутологичных опухолевых клеток с адъювантом BCG с лечебной целью, содержание CD 16* NK-клеток было сниженным по сравнению с больными, вакцинированными с адъювантной целью, как до начала вакцинотерапии, так и после окончания лечения. Тенденция к увеличению этого показателя наблюдалась после 1-й, 2-й, 3-й и 6-й вакцинации со статистически значимым снижением р<0,01 после 4-й вакцинации и через 3 нед после 6-й вакцинации.

Разнонаправленность данных связана, по-видимому, с функциональной гетерогенностью NK-популяции, а именно, с существованием известных в настоящее время пяти клеточных субтипов и блокадой созревания NK-клеток в костном мозге онкологических больных (Richards J.O. et al., 2006).

Таким образом, вакцинотерапия аутологичными опухолевыми клетками в сочетании с иммунологическим адъювантом ВСО у больных с солидными опухолями не сопровождается выраженными побочными эффектами, хорошо переносится больными, обладает иммуномодулирующей и клинической эффективностью.

2. Оценка токсичности и клинической эффективности вакцинотерапии на основе аутологичных опухолевых клеток в сочетании с адъювантом 1Ь-1р у больных с диссеминированными солидными опухолями

Многочисленные экспериментальные исследования и отдельные клинические наблюдения свидетельствуют о перспективности использования цитокинов в качестве адъювантов. Вопрос о том, какое значение имеют цитокины в противоопухолевой вакцине, еще не решен (Оо1 К.С. е( а!., 2006). Противоопухолевая вакцина может содержать провоспалительные цитокины (1Ь-1, 1Ь-6, ТОТ), которые в высокой концентрации могут увеличивать ее реактогенность.

В исследовании представлены результаты клинической оценки ([/II фаза) и иммунологической эффективности активной специфической иммунотерапии с помощью вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток в сочетании с адъювантом 1Ь-1р у больных с солидными опухолями.

В зависимости от клинического состояния больных и количества материала для вакцинации больные распределились следующим образом: 6 вакцинаций получили 17 больных (32,1%), 5 введений вакцины - 12 пациентов (22,6%), 4 введения - 12 пациентов (22,6%), 3 введения - 3 пациента (5,7%), 2 введения - 8 пациентов (15,1%) и 1 введение аутологичной вакцины - 1 пациент (1,9%).

Основным осложнением, наблюдавшимся в ходе лечения, была лихорадка, которая наблюдалась в дни введения IЬ-1 р у 19 больных (35,2%) из 54. Лихорадка II степени зарегистрирована у 16 пациентов (84,2%), I степени - у 3 пациентов (15,8%), сопровождалась кратковременным ухудшением самочувствия, купировалась приемом парацетамола 0,5 г. Осложнения Ш-1У степени не наблюдались. У 1 больной отмечался зуд кожи в месте введения 1Ь-1р. Других побочных явлений (регионарной лимфаденопатии, изъязвлений в месте инъекций, аллергических и аутоиммунных реакций) не было.

Был зарегистрирован полный регресс у пациента 55 лет с почечноклеточным раком почки, метастазами в легком. Стабилизация процесса наблюдалась у 10 из 20 больных (50%), получавших лечебную вакцинотерапию (3 больных раком почки, 7 больных

меланомой кожи). Средняя продолжительность эффекта составила 6 мес (от 3 до 14 мес). У 6 пациентов эффект продолжается в течение 3-10 мес+. В группе пациентов, получавших адыовантную вакцинотерапию, у 21 больного (61,8%) из 34 время до прогрессирования заболевания составило в среднем 16,4 мес (от 4,5 до 43 мес).

При изучении показателей выживаемости в этих двух группах больных выявлено, что медиана выживаемости пациентов, получавших вакцинотерапию с лечебной целью, составила 7 мес от начала лечения, средняя продолжительность жизни 8 мес (95% С1 4,8-11,2 мес). Медиана выживаемости больных, получавших вакцинотерапию с адьювантной целью, составила 13 мес от начала лечения, а средняя продолжительность жизни 14,7 мес (95% С1 11,4-17,9 мес) (рис. 4).

Кумулятивная выживаемость (Кар1ап-Меюг) о Нецензурированы ♦ Цензурированы

15 20 25 Время, мес

40 ~ Группа 1 Группа 2

Рис. 4. Выживаемость пациентов, получавших вакцинотерапию на основе опухолевых клеток в сочетании с IЬ-1 р с адьювантной (группа 1) и лечебной целью (группа 2) (метод Каплана-Мейера).

Оценку иммунологической активности препарата проводили на основе анализа показателей иммунного статуса и реакции ГЗТ, которая была зарегистрирована у 90,0% (45 из 50) первично вакцинированных пациентов.

Четверо больных не проходили иммунологическое обследование из-за тяжести состояния. Выявлены различия в динамике абсолютного содержания основных популяций и субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных меланомой кожи и раком

почки, получавших вакцинотерапию с лечебной (1-я группа) и адъювантной целью (2-я группа), которые в большинстве случаев коррелировали с результатами лечения.

Для больных 1-й группы до лечения типичным было низкое абсолютное содержание лимфоцитов (1,42±0,66) по сравнению с 1,99±0,8 (р<0,04) у больных 2-й группы, а также СОЗ+, С04+ и СЭ8+ Т-лимфоцитов. В процессе лечебной и адъювантной вакцинотерапии у пациентов наблюдалось: увеличение содержания лимфоцитов с 1,42±0,66 до 1,52±0,59 и 1,62±0,44 после 1-й и 3-й вакцинации у первых и с 1,99±0,8 до 2,24±0,96 и 2,2±0,82 у вторых (р<0,00 и р<0,01), а также увеличение количества СОЗ+, С04+ и С08+ Т-клеток у больных, получавших вакцину с адъювантной целью. Выраженную Т-клеточную иммунодепрессию у больных, получавших вакцину с лечебной целью, вполне можно объяснить хронической активацией иммунитета в процессе опухолевого роста и ограничением вследствие этого его компенсаторных возможностей.

В группе больных с адъювантной вакцинотерапией до лечения и последующей вакцинотерапией наблюдалось достаточно сохранное исходное содержание СЭ4+ и Сй8' Т-клеток, которое имело тенденцию к увеличению в процессе лечения и увеличенное содержание с 0,84±0,41 до 1,20±0,41 и с 0,55±0,29 до 0,66±0,19 после лечения, что является хорошим прогностическим фактором у этой категории больных.

В процессе вакцинотерапии аутологичными опухолевыми клетками в сочетании с адъювантом 1Ир у больных, получавших вакцину с адъювантной целью, также наблюдалось увеличение клеток, экспрессирующих НЬА БЯ-антиген, С025- и С071-маркеры активации уже после 1-й вакцинации (с 0,46±0,31 до 0,62±0,33, с 0,17±0,16 до 0,28±0,29 и с 0,1±0,07 до 0,24±0,23 соответственно) по сравнению с низким содержанием этих клеток у больных, получавших лечебную вакцинотерапию [соответственно 0,37±0,18 (р<0,01), 0,11±0,11 (р<0,05) и 0,14±0,15]. Исключение составило количество С038+ и СЭ95+ активированных клеток, которое было повышенным до лечения у больных 2-й группы.

После курса вакцинотерапии число НЬА и С025+-клеток практически

вернулось к исходным величинам в обеих группах, количество С038+- и С071 '-клеток возрасло с 0,10±0,07 до 0,68±0,56 и с 0,10 до 0,19±0,17 у больных, получавших вакцинотерапию с адъювантной целью, и С095+-клеток с 0,09±0,09 до 0,19±0,17 - у больных с лечебной целью.

Увеличенное содержание С095+ иммунокомпетентных клеток обычно связывают с апоптозом, который вовлечен во все фундаментальные процессы иммунной системы, такие как механизм иммунного ответа, формирование иммунологической памяти, иммунологической толерантности и др. Поствакцинальный антиген-специфический

иммунный ответ предполагает экспансию активированных Т-клеток и их последующую элиминацию для поддержания гомеостаза с помощью апоптоза. Вместе с тем, установлено, что некоторые CD95+ клетки образуют С095-резистентный фенотип [экспрсссируют высокий уровень Bcl-x(L) и Вс1-2], дифференцируются в клетки-памяти и образуют выраженный вторичный иммунный ответ (Fas S.C. et al., 2006).

Таким образом, поствакцинальное увеличение содержания С095+-клеток у больных, получавших вакцинотерапию с лечебной целью, не поддается однозначной трактовке и требует дальнейшего изучения. Вместе с тем, этот показатель и представленные выше маркеры активации могут рассматриваться нами как суррогатные маркеры иммунного ответа на проводимую иммунотерапию.

Значительный интерес представило изучение динамики содержания В-клеток, основных классов иммуноглобулинов (Ig) и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в процессе вакцинотерапии в зависимости от цели вакцинации. Больные, получавшие вакцинотерапию с лечебной целью, часто были с распространенным опухолевым процессом, прежде леченные. Больным с начальными стадиями заболевания после операции дополнительное лечение не проводилось. Вместе с тем, в обеих группах до лечения было увеличено содержание иммуноглобулинов IgM, IgG и IgA по сравнению с контрольной группой (доноры). Ответом на вакцинотерапию у больных с лечебной целью было снижение содержания IgM после лечения с 2,37±1,49 до 1,23±0,3 по сравнению с больными 2-й группы [соответственно 2,19±1,49 и 2,07±0,12 (р<0,05)] и тенденция к снижению содержания IgG и IgA.

У больных 2-й группы в процессе вакцинотерапии наблюдалось снижение IgA с 2,45±1,29 до 1,67±1,24 и тенденция к снижению IgM после 3-й и 4-й вакцинации, однако, оставалось увеличенным содержание IgG. Кроме того, увеличилось количество CD20+ В-клеток, отражающее активацию гуморального компонента иммунного ответа. Содержание ЦИК у этой группы больных снизилось после 2-й вакцинации и имело статистически значимые различия после 3-й и 4-й вакцинации по сравнению с больными, получавшими вакцинотерапию с лечебной целью. После 5-й вакцинации и окончания лечения эти показатели практически не различались. Выявленные изменения могут свидетельствовать о снижении содержания антигенного материала в кровотоке больных, которые сочетались со снижением концентрации IgM и IgA. Кроме того, в этот период у больных, получавших вакцину с адъювантной целью, наблюдалась активация Т-клеточного звена иммунной системы, зарегистрированная по увеличению содержания CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов и клеток, экспрессирующих маркеры активации HLA DR, CD38 и CD71.

Таким образом, из полученных данных можно сделать вывод о дисфункции противоопухолевого иммунитета у больных с солидными опухолями до вакцинотерапии, положительной динамике показателей у пациентов, получавших вакцинотерапию с адъювантной целью, и недостаточной активности изучаемого вида вакцинотерапии у больных с диссеминированным опухолевым процессом. Дисфункция противоопухолевого иммунитета (снижение активности одного звена и активация другого) требует дальнейшего изучения, например, у пациентов с «иммуногенными» и «слабоиммуногенными» опухолями. Восстановление функции противоопухолевого иммунного ответа будет эффективным, по-видимому, лишь в случае нормализации равновесия в системе, и, особенно, в механизме уклонения опухоли от иммунобиологического надзора. Избирательное воздействие на отдельные субпопуляции иммунорегуляторных клеток в нужном для клинического эффекта направлении может обеспечить излечение пациентов.

3. Оценка токсичности и клинической эффективности вакцинотерапии на основе аутологичных опухолевых клеток, модифицированных геном tag7, у больных с диссеминированиыми солидными опухолями

Низкая иммуногенность является основным недостатком аутологичных и аллогенных вакцин, в связи с чем производится поиск способов повышения их антигенной специфичности. Наиболее подходящим представляется трансфекция генов (генотерапия). С этой целью используются трансформированные плазмиды, экспрессирующие гены иммуномодуляторов, в частности, лимфокинов (Киселёв О.И. и соавт., 2002). После трансфекции иммуногенность опухолевых клеток повышается в связи с продукцией нехарактерных для них белков и цитокинов, привлекающих и активирующих АПК. В результате наблюдается активация цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), Т-хелперов 1-го типа (Thl) клеток, Т-клеток памяти, иммунологически наивных Т-лимфоцитов, конечной целью которых является развитие устойчивого антиген-специфического противоопухолевого «bystander effect» («эффект свидетеля»).

В экспериментах было показано, что продукт гена tag7, выделенный из клеток аденокарциномы молочной железы мыши, обладает свойством подавлять рост опухоли, причем, степень подавления роста опухоли коррелирует со степенью экспрессии этого гена (Greten T.F., Jafee Е.М., 1999). В 1998 г. в Институте биологии гена РАН клонирован человеческий аналог гена tag7, белок которого на 70% гомологичен с белком Tag7 мыши. Этот протеин обладает выраженной гомологией с каталитическим доменом лизоцима и слабой гомологией с членами семейства фактора некроза опухолей.

В исследование включено 59 больных с морфологически верифицированным диагнозом меланомы кожи (45 больных) и раком почки (14 больных), получавших лечение в ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий» с 2001 по 2008 г. 41 пациент (31 больной меланомой кожи и 10 - раком почки) получил паллиативную вакцинотерапию (69%) и 18 больных - адъювантную (31%), из них 14 больных меланомой кожи после полных циторедуктивных операций и 4 больных раком почки после радикальной нефрэктомни.

На момент начала вакцинотерапии у 24 больных (58%) диагностированы висцеральные метастазы, невисцеральные поражения выявлены у 17 пациентов (42%).

Таблица 2

Клинический эффект лечебной вакцинотерапии аутологичными опухолевыми клетками, модифицированными геном tag 7, у больных меланомой кожи и раком почки

Эффект лечения Меланома кожи (п=31) Рак почки (п=10)

Полный регресс 0 0

Частичный регресс (>50%) 1 (36 мес)* 2 (23 мес+ и 9 мес+)*

Стабилизация процесса, в том числе минимальный регресс (<50%) 8 0 1 (3 мес)* 2(12 мес и 4 мес)

Прогрессирование заболевания 22 5

* Продолжительность эффекта.

Медиана безрецидивной выживаемости больных меланомой кожи составила 8 мес. При этом 3 больных в настоящее время продолжают лечение. Медиана безрецидивной выживаемости больных раком почки не достигнута.

При анализе показателей общей выживаемости выявлено, что медиана выживаемости всех пациентов, получавших вакцинотерапию, составила 8 мес от начала лечения.

Выполнен сравнительный анализ общей выживаемости пациентов, получивших полный курс вакцинотерапии (6 и более введений), и больных, преждевременно выбывших из исследования по причине прогрессирования заболевания. Медиана выживаемости в первой группе составила 19 мес от начала терапии, во второй - 5 мес (р<0,05) (рис. 5).

Кумулятивная выживаемость (Kaplan-Meier) О Умер •:■ Жив

0,2 8

Gehan's Wilcoxon Test

WW = 607,00 Sum = 52872, Var = 13441,

Test statistic = 5,231334 p = ,00000

0,1 о

о

0,0

— Группа 1

— Группа 2

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Время, мес

Рис. 5. Общая выживаемость пациентов, получивших вакцинотерапию на основе

опухолевых клеток, модифицированных геном tag!, в зависимости от количества введений вакцины (метод Каплана-Мейера): 1 -я группа - пациенты, получившие 6 и более введений вакцины; 2-я группа - пациенты, получившие менее 6 введений вакцины.

В местах инъекции модифицированных геном lag7 аутологичных опухолевых клеток в течение 48 ч регистрировалась местная реакция в виде участков гиперемии, которая расценивалась как реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) при размере этих участков не менее 5-10 мм.

Реакция ГЗТ в ответ на введение вакцины развилась у 74% (31 из 42) больных меланомой кожи и 93% (13 из 14) больных раком почки. При этом, размер гиперемированного участка увеличился в среднем на 3-4 мм в процессе лечения. У 3 больных (5%) меланомой кожи во время проведения 1/2 цикла вакцинотерапии зарегистрирована реакция ГЗТ в контрольной точке - месте введения аутологичных немодифицированных опухолевых клеток («bystander effect»).

В большинстве случаев выявили корреляцию между интенсивностью местной

иммунной реакции в месте введения вакцины (ГЗТ) и наблюдаемыми клиническими эффектами.

Установлена взаимосвязь между размером и выраженностью выявляемых гиперемированных участков и эффектом лечения. Так, у пациентов со стабилизацией процесса наблюдали реакцию ГЗТ в среднем 15-20 мм, причем, имела место тенденция к

их увеличению. Больные с прогресснрованием заболевания отвечали недостаточно на вводимый вакцинный препарат, реакция ГЗТ была невыраженной или отсутствовала.

Для более детального изучения иммунологической эффективности данного вида терапии проводили биопсии места введения вакцины и в качестве контроля - участков неизмененных кожных покровов пациентов. На гистологических срезах был обнаружен лимфоидный инфильтрат, который положительно окрашивался при выполнении иммуиогистохимических тестов с помощью моноклональных антител к CD3, CD4, CD8, CD14, CDla, CD83. Это подтверждало присутствие Т-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток разной степени зрелости в месте появления реакции ГЗТ. В контрольных участках (неизмененные кожные покровы) подобная картина не наблюдалась.

Практически у всех пациентов с положительной клинической динамикой в процессе вакцинации нарастало абсолютное содержание в периферической крови CD3+-, CD4+-, CD8+-, С016+-лкмфош1тон. К концу каждого курса вакцинотерапии наблюдалось увеличение функциональной активности преимущественно CD8+ Т-клеток. Одновременно выявляли увеличение размеров реакции ГЗТ. У пациентов, не ответивших на проводимое лечение, показатели содержания Т-лимфоцитов, NK-клеток, активированных Т- и В-лимфоцитов практически не изменились.

Таким образом, у больных диссеминированной меланомой кожи и метастатическим раком почки вакцинотерапия аутологичными опухолевыми клетками, модифицированными геном tag7, безопасна и не сопровождается клинически значимыми побочными эффектами. Введение ^^-модифицированной вакцины вызывает: 1) развитие реакции ГЗТ у 78,6% больных; 2) «bystander effect» - у 5% вакцинированных; 3) частичный регресс метастазов у 3 (7,3%) пациентов [у 2 больных раком почки (продолжительность эффекта 23 мес+ и 9 мес+) и у 1 больного меланомой кожи (продолжительность эффекта 36 мес)]; 4) минимальный регресс метастазов (регресс <50%) - у 2 больных раком почки (продолжительность эффекта 12 мес и 4 мес) и стабилизацию процесса - у 11 (27%) пациентов (8 больных меланомой кожи и 3 больных раком почки), средняя продолжительность эффекта составила 6 мес (от 2 до 24 мес). Положительная динамика в иммунологических тестах in vitro в процессе вакцинотерапии зарегистрирована у 95% пациентов. Вместе с тем, индукция Т-клеточного иммунного ответа происходила на фоне увеличенной продукции основных классов Ig во все сроки наблюдения, что, несомненно, тормозит устойчивость поствакцинальных цитотоксических реакций. Для повышения эффективности геномодифицированной вакцины перспективным представляется использование аутологичных опухолевых клеток

с высоким индексом трансфецированных клеток (>50%) у больных после радикального лечения или циторедуктивных операций с минимальной резидуальной болезнью.

4. Оценка токсичности и клинической эффективности вакцинотерапии на основе аутологичных костномозговых предшественников дендритных клеток у больных с диссеминированными солидными опухолям

Всего вакцинотерапию на основе аутологичных костномозговых дендритных ДК получил 21 пациент. Шесть больных (29%) получили от 1 до 4 внутривенных введений ДК-вакцины. Полный или частичный регресс зарегистрирован не был (табл. 3). Стабилизация опухолевого процесса в этой группе наблюдалась у 1 пациента продолжительностью 4 мес, прогрессирование - у 5 больных. В процессе лечения зарегистрированы следующие виды осложнений: лихорадка I степени в дни введения вакцины - у 1 больного, лихорадка II степени в течение 4 дней после введения вакцины -у 3 больных, гипотония II степени в дни введения - у 1 больного, слабость II степени на протяжении всего курса лечения - у 1 больного, повышение уровня тромбоцитов в периферической крови I степени в течение 14 дней - у 1 больного, повышение уровня трансаминаз (AJIT, ACT) I степени в течение 6 дней - у 1 больного и повышение уровня трансаминаз (AJIT, ACT) II степени, сохранявшееся в течение 14 дней - у 1 больного. Осложнения 111 и IV степени зарегистрированы не были.

Восемь больных (38%) получили от 2 до 12 подкожных и/или внутрикожных инъекций ДК-вакцины. Из них 4 больных (50%) получали введения с декабря 2006 г. по ноябрь 2007 г. Осложнения наблюдались только в последней группе в виде повышения температуры тела 1 степени - у 1 больного, повышения температуры тела И степени - у 2 больных, миалгии I степени - у 2 больных, болезненности в месте введения вакцины I степени - у 2 пациентов. Реакция ГЗТ зарегистрирована у 7 больных (88%), в том числе у

4 больных в контрольной точке («bystander effect»). Стабилизация опухолевого процесса - у 3 пациентов (38%) продолжительностью от 3 до 5 мес. У 2 больных меланомой кожи зарегистрирован минимальный регресс (<50%) метастазов в легких продолжительностью

5 мес+.

Двум пациентам (9%) внутрикожные инъекции аутологичной вакцины комбинировали с низкими дозами цитостатиков (5-фторурацил 500 мг + цисплатина 20 мг в/в 1-5-й дни, с последующим введением ДК-вакцины или циклофосфан 300 мг/м2 за 3 дня до введения вакцины). Выполнено 4 введения ДК-вакцины. Осложнения и реакция

ГЗТ не наблюдались. У больных в обоих случаях зарегистрировано прогрессирование заболевания.

Один больной (5%) получал внутрикожные введения ДК-вакцины в комбинации с 1Ь-1р. Осложнения (лихорадка I степени, астения I степени) наблюдались в течение первых часов после инъекции, купировались самостоятельно. После каждого введения вакцины в течение 48 ч регистрировалась выраженная реакция ГЗТ от 2 до 14 мм в диаметре. В результате лечения достигнут минимальный регресс метастазов в легких и плевре (<50%), который продолжался в течение 10 мес.

Двое больных (9%) (1 больная раком сигмовидной кишки и 1 больной меланомой кожи) получали внутрикожное введение вакцины в сочетании с 1Ь-2. Осложнения наблюдались у 1 больного в виде головной боли I степени, лихорадки I степени, артралгии I степени, оссалгии I степени в течение нескольких часов после введения вакцины. Реакция ГЗТ регистрировалась у обоих пациентов от 2 до 20 мм в диаметре. Эффект лечения оценен как стабилизация процесса продолжительностью 7 мес у 1 больной раком толстой кишки. У больного меланомой кожи зарегистрирован частичный регресс продолжительностью 20 мес.

Один больной (5%) меланомой кожи получал введение вакцины в периферические лимфатические узлы в сочетании с системным введением 1Ь-2. Осложнения, связанные с введением вакцины, зарегистрированы не были. Эффект - прогрессирование заболевания.

Один больной меланомой кожи (5%) получал введение вакцины в периферические лимфатические узлы. Осложнений введения не было. Эффект лечения оценен как прогрессирование.

Полный регресс зарегистрирован не был. Частичный регресс метастазов в мягких тканях выявлен у 1 больного меланомой кожи (5%) из 21, сохранявшийся в течение 20 мес. Стабилизация процесса наблюдалась у 6 больных (29%), продолжительностью от 3 до 7 мес. У 1 больного раком почки и 2 больных меланомой кожи зарегистрирован минимальный регресс (уменьшение размеров метастазов в легких на 30%), сохранявшийся в течение 10 мес и 5 мес+ соответственно.

Таблица 3

Эффективность вакцинотерапии аутологичными костномозговыми предшественниками ДК

Эффект/продолжительность, мес Рак почки Меланома кожи Рак толстой кишки

Полный регресс 0 0 0

Частичный регресс 0 1(20) 0

Минимальный регресс 1(10) 2(5+) 0

Стабилизация 2 (4 и 5) 2 (3 и 4) 1(7)

Прогрессирование 6 5 1

Всего 9 10 2

Медиана выживаемости на фоне проведения вакцинотерапии составила 9,5 мес (95% CI 5,5-14,4 мес) от начала лечения.

Медиана выживаемости пациентов, получивших полный курс вакцинотерапии, составила 12,5 мес (95% CI 2,9-26,4 мес). Медиана выживаемости пациентов преждевременно выбывших из исследования по причине прогрессирования заболевания составила 4 мес (95% CI 4,2-9,8 мес) (р<0,05).

Уровень иммунологической реактивности больных с диссеминированными солидными опухолями, получавших данный вид вакцинотерапии, до начала лечения, как это было показано в предыдущих разделах настоящего исследования, в значительной мере индивидуален, а все последующие изменения иммунологических показателей под влиянием активной специфической иммунотерапии происходят, естественно, исходя из первоначальных величин. Последнее, поэтому, имеет принципиальное значение для иммунологического мониторинга, если иметь в виду под этим термином оценку эффективности лечения и прогноза диссеминированной солидной опухоли на основании результатов анализа тех или иных параметров иммунитета в динамике паллиативной вакцинотеарпии.

В этом разделе работы исследование иммунологических показателей у больных с диссеминированными опухолями проводили до начала вакцинотерапии, в процессе специфической иммунотерапии и через 3 нед после завершения лечения.

До лечения установлено снижение абсолютного содержания лимфоцитов, CD3+, CD4+, CD8+ Т-клеток, снижение их функциональной активности в нагрузочных тестах с митогеном ФГА и КонА и увеличенное содержание IgM, IgG, IgA, ЦИК по сравнению со здоровыми лицами. Однако уже после первой вакцинации у этой категории больных выявлена тенденция к увеличению содержания CD3+ Т-лимфоцитов и клеток, экспрессирующих маркеры активации: HLA DR, CD25, CD38, CD71, маркер апоптоза CD95. Одновременно у этих же больных наблюдалась тенденция к увеличению функциональной активности Т-клеток в нагрузочных тестах с митогеном ФГА и КонА и снижение содержания основных классов Ig в периферической крови. Несомненно, это является хорошим прогностическим фактором, так как свидетельствует об

иммуногенности приготовленной ex vivo вакцины и отсутствии у больных глубокого Т-клеточного иммунодефицита.

Таким образом, наше исследование показало, что вакцинотерапия аутологичными костномозговыми предшественниками ДК обладает иммунологическим и клиническим эффектом, хорошо переносится больными.

Обсуждение результатов исследования

В настоящее время известны результаты клинических и иммунологических исследований I-II фазы вакцин, приготовленных на основе опухолевых клеток, модифицированных генами цитокинов, таких как GM-CSF, IL-2, -7, -12, применяющихся для лечения больных меланомой кожи и раком почки. Геномодифицированные вакцины формировали у ряда больных реакцию ГЗТ и вызывали активацию противоопухолевого клеточного и гуморального иммунитета, однако их клиническая эффективность не была значительной. В частности, применение вакцины, модифицированной геном GM-CSF для лечения больных меланомой кожи, характеризовалось стабилизацией процесса продолжительностью от 20 до 36 мес у 3 из 33 пациентов, в случае лечения рака почки, и у 1 из 16 больных зафиксирован частичный регресс множественных метастазов в легких.

В нашем исследовании небольшое число объективных клинических эффектов от проводимой терапии [частичный регресс у 3 (7,3%) из 41 больных, продолжительность эффекта 9+, 23+ и 36 мес] может быть связано с рядом причин: распространенностью опухолевого процесса, наличием метастатического поражения жизненно важных органов (61,9%), ослабленным общим статусом больных (на момент начала лечения 42,9% пациентов имели статус 2 в соответствии с критериями ВОЗ), предшествующим лечением (химио- или лучевой терапией). Кроме того, известно, что эффективность использования модифицированных цитокином опухолевых клеток для индукции противоопухолевого иммунитета зависит от количества продуцируемого цитокина. Поэтому одной из причин отсутствия выраженных клинических эффектов от проводимой терапии может быть недостаточная эффективность применявшегося липосомного метода трансфекции опухолевых клеток геном tag 7.

Очевидно, что иммунотерапия аутологичной вакциной будет более эффективна у больных с небольшой опухолевой массой, а также у больных с высоким риском развития рецидива после хирургического лечения. Учитывая наличие соответствующего иммунологического эффекта, именно эта группа больных должна быть объектом для

вакцинотерапии с помощью геномодифицированных опухолевых клеток, например, модифицированных геном tog7.

Вместе с тем, сравнительный анализ иммунологической активности вакцин на основе аутологичных немодифицированных опухолевых клеток с адъювантом BCG и IL-1Р, ?а£7-геномодифицированных клеток у больных меланомой кожи и раком почки, получавших вакцинотерапию с адъювантной или лечебной целью, при прогрессировании или стабилизации опухолевого процесса выявил незначительные различия в наблюдаемой активации различных субпопуляций Т-клеточного звена иммунной системы, которые практически нивелировались после окончания курса лечения.

Хотя различий в усредненных величинах иммунокомпетентных клеток в процессе вакцинотерапии немодифицированными и геномодифицированными опухолевыми клетками у больных сопоставимых групп по типу опухоли, распространенности и ответу на лечение не установлено, по мере распространенности процесса отмечено их снижение. Кроме того, при полной циторедукции и адъювантном лечении рака показатели в пределах нормы обнаруживались чаще, чем при диссеминированных формах.

Положение о том, что прогрессирующе растущая опухоль является следствием иммунологической недостаточности и что своевременная коррекция такой недостаточности может обеспечить контроль над опухолевым ростом, открывает реальные перспективы эффективной иммунотерапии при злокачественных опухолях у человека. Учитывая центральную роль ДК и CD8+ ЦТЛ в противоопухолевом иммунном ответе в организме, наиболее подходящими для этой цели могут оказаться вакцины на основе геномодифицированных опухолевых клеток и ДК пациента с генетически индивидуальной опухолью (Bergman P.J., 2007; Kawakami Y. et al., 2008).

Правила безопасности требуют, чтобы новые иммунотерапевтические методы изучались у пациентов с распространенным опухолевым процессом, устойчивых к стандартным методам лечения или в случае их отсутствия. Эти исследования определяют токсичность, иммунологическую и клиническую эффективность. Однако даже самый оптимальный иммунный ответ, в конечном счете, может не преодолеть опухолевую прогрессию. Поэтому важным является проведение безопасных исследований у пациентов с наименьшим распространением опухолевого процесса, у которых реально можно оценить клиническую и иммунологическую эффективность, разработать дальнейшую тактику использования противоопухолевых вакцин.

Трудным аспектом иммунологических протоколов является идентификация иммунологических маркеров, которые коррелируют с клинической эффективностью. Показателем эффективности является объективный клинический ответ, безрецидивная

выживаемость и время до прогрессирования, но для этого требуется достаточно много времени. Поэтому возникает необходимость в поиске «суррогатных маркеров», коррелирующих с клинической эффективностью.

Прогрессу вакцинации против инфекционных болезней способствовало определение уровня антител как «суррогатных маркеров», видимо, прогресс вакцинации против рака может быть связан с углубленным изучением "суррогатных маркеров" Т-клеточных реакций вакцинированных лиц. Кроме того, клиническая оценка эффективности вакцинотерапии злокачественных опухолей еще недостаточно изучена и нуждается в разработке критериев включения и исключения в исследование, большей градации в оценке клинического эффекта. Например, увеличение времени до прогрессирования у ряда пациентов с IV стадией меланомы кожи может быть менее претенциозным, но более существенным клиническим признаком, чем совсем небольшое число пациентов с полным регрессом опухоли.

Кроме того, еще остаются неизученными механизмы, способствующие разрушению опухоли у пациентов с полным объективным ответом. Нет ответа на два вопроса: 1) почему у некоторых пациентов не развивается иммунный ответ и 2) почему у большинства пациентов не выявляется клинический эффект? Возможно, объяснение заключается в качестве вакцин, включая тип ДК. Другое объяснение может заключаться в том, что Т-клетки некоторых пациентов не могут развивать адекватный иммунный ответ на сложные опухолеассоциированные антигены in vivo. Однако эксперименты in vitro демонстрируют, что Т-клетки большинства пациентов отвечают на индукцию сложных меланомаассоциированных антигенов и дифференцируются в ЦТЛ. В то же время, даже если Т-клетки отвечают in vivo, у пациентов с прогрессированием заболевания опухолевое микроокружение может увеличить агрессивность и способствовать элиминации опухоль-специфических Т-клеток in situ (Mantovani A. et al., 2008). Ответом на этот вопрос может быть дальнейшее изучение CD4+ Т-клеточного иммунитета. Не исключено, что у пациентов с прогрессирующим опухолевым ростом могут быть нарушения в системе CD4+ Т-клеток, которые влияют на индукцию антиген-специфических CD8+ Т-клеток. В противоположность этому, прогрессия опухоли может быть ассоциирована с регуляторными клетками, такими как NKT- или Trl-клетки (Zhang С. et al., 2006; Terable М., Berzofsky J.A., 2007). Предполагается, что эти иммунокомпетентные клетки регулируются различными субпопуляциями ДК (Ullrich Е. et al., 2008). Поэтому крайне важно дальнейшее изучение генерации субпопуляций ДК с различными линейными признаками (миелоидные, плазмоцитоидные), полученных из моноцитов в присутствии

GM-CSF, IL-4, IL-6, IFN-a или выращенных из костномозговых предшественников в присутствии GM-CSF.

Вместе с тем, ДК, генерированные ex vivo как вакцина с помощью различных методов, представляют собой различные клеточные популяции, и это, несомненно, затрудняет оценку клинической и иммунологической эффективности ДК-вакцины (Guida M., Colucci G., 2007; Kochenderfer J.N., Gress R.E., 2007; Kawakami Y. et al., 2008). Прогресс в области эффективного клинического использования ДК требует стандартизации апробированных методов с целью дальнейшего изучения у больных с максимальным уменьшением объема опухолевой массы (циторедуктивные операции), минимальной остаточной болезнью, достаточной иммунокомпетентностью.

В заключение, следует еще раз подчеркнуть, что изученные нами современные противоопухолевые вакцины у больных диссеминированными солидными опухолями вызывают иммунологический и объективный клинический ответ. С практической точки зрения принципиально важным является тот факт, что иммунная система пациентов с распространенным опухолевым процессом отвечает, в определенной степени, на индукцию цитотоксических Т-клеточных реакций. В связи с этим становится возможным перестройка иммунной системы онкологических больных с помощью высокоспецифичных противоопухолевых вакцин.

Более того, в настоящее время ведется поиск средств и способов избирательного воздействия на отдельные звенья и регуляторные субпопуляции клеток иммунной системы. Это современное направление, получившее в зарубежной литературе термин «биотерапия» (DeVita et. al., 1996), подразумевает коррекцию иммунного ответа на опухоль с помощью различных молекулярно-биологических и иммунологических методов. Имеющийся в рамках этого клинического исследования материал уже сейчас позволяет считать, что каждое новообразование обладает специфическими особенностями взаимодействия с клетками иммунной системы, зависящими от огромного количества факторов, характеризующих опухолевый процесс у конкретного индивидуума. Поэтому, накопление сведений, характеризующих особенности реакций иммунокомпетентных клеток на опухоль той или иной локализации в динамике процесса, является необходимым этапом для разработки иммуногенетических методов лечения злокачественного новообразования и, как следствие, повышения выживаемости онкологических больных.

Выводы

1. Вакцинотерапия на основе немодифицированных и геномодифицированных опухолевых клеток, а также костномозговых предшественников дендритных клеток, является эффективным методом биотерапии и оказывает клинически

значимый противоопухолевый эффект у 46,2% больных с распространенными солидными опухолями (полный и частичный регресс - 5,9%, минимальный регресс и стабилизация опухолевого процесса - 40,2%).

2. Противоопухолевая вакцинотерапия хорошо переносится больными и не вызывает тяжелых местных и общих токсических реакций. Осложнения I—11 степени отмечены у 57,)% пациентов.

3. Введение генетически модифицированной вакцины и вакцины на основе дендритных клеток сопровождается развитием гиперчувствительности замедленного типа у 79% больных, «bystander effect» - у 10%, иммунологическим ответом в лабораторных тестах in vitro - у 95%, клиническим ответом - у 42%, средней продолжительностью 6 мес.

4. Вакцинотерапия немодифицированными аутологичными опухолевыми клетками с иммунологическим адъювантом BCG или IL-lp обеспечивает иммунологический ответ у 90% пациентов, однако, объективный регресс опухоли достигается только у 5% больных средней продолжительностью 6,4 мес.

5. Внутрикожное введение вакцины на основе дендритных клеток имеет преимущество перед внутривенным, так как не вызывает выраженных побочных эффектов и сопровождается клиническим ответом у 66,7% больных, средней продолжительностью 5 мес.

6. Адъювантная вакцинотерапия немодифицированными опухолевыми клетками больных меланомой кожи и раком почки с высоким риском рецидива опухоли сопровождается иммунологическим эффектом у 98% пациентов и позволяет достичь медианы безрецидивной выживаемости в 39,6 мес.

7. Специфическое влияние вакцинотерапии в лабораторных тестах in vitro выявлено у 95% обследованных пациентов. Это может быть связано с увеличением абсолютного содержания CD3+ и CD8* цитотоксических Т-лимфоцитов (р<0,01), снижением количества функционально неполноценных Т-лимфоцитов (р<0,02), устранением дисбаланса основных иммунорегуляторных субпопуляций лимфоцитов (р<0,04).

Практические рекомендации

1. При планировании лечения больных диссеминированной меланомой кожи и метастатическим раком почки целесообразно рассматривать возможность использования вакцинотерапии.

2. Вакцинотерапия может рассматриваться как метод адъювантной терапии больных меланомой кожи и раком почки с высоким риском рецидива заболевания.

3. Вакцины на основе костномозговых ДК рекомендуется вводить внутрикожно.

4. Обязательным условием вакцинотерапии злокачественных опухолей является клинический и иммунологический мониторинг больных.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Балдуева И.А.. Моисеенко В.М., Хансон К.П. Дендритные клетки: происхождение, созревание, функциональная активность // Материалы II съезда иммунологов России,—М„ 1999,—С.37.

2. Моисеенко В.М., Балдуева И.А.. Хансон К.П., Орлова Р.В., Проценко С.А., Семёнова А.И., Ермакова H.A., Михайличенко Т.Д., Старикова Э.А., Ржевцева Т.А., Мухина М.С., Щёкина Л.А. Активная специфическая иммунотерапия предшественниками дендритных клеток больных со злокачественными опухолями // Материалы II съезда иммунологов России. — М., 1999.— С.252.

3. Моисеенко В.М., Балдуева И.А.. Хансон К.П., Орлова Р.В., Ржевцева Т.А., Семёнова А.И., Мухина М.С., Щёкина Л.А., Ермакова H.A., Проценко С.А., Михайличенко Т.Д., Старикова Э.А. Иммунотерапия аутологичными вакцинами больных со злокачественными опухолями // Материалы II съезда иммунологов России, —М., 1999,—С.338.

4. Балдуева И.А., Моисеенко В.М., Хансон К.П. Система дендритных клеток и её роль в регуляции функциональтной активности Т- и B-лимфоцитов человека // Вопр. онкол,—1999,—Т.45 (5).—С. 473—483.

5. Балдуева И.А.. Моисеенко В.М., Хансон К.П. Противоопухолевые дендритные вакцины // Материалы Европейской школы по онкологии.— М., 1999.—С.25—28.

6. Моисеенко В.М., Балдуева И.А.. Хансон К.П. Вакцинотерапия больных с солидными опухолями // Вопр. онкол.—1999.—Т.45 (3).—С.327—332.

7. Моисеенко В.М., Балдуева И.А.. Хансон К.П., Орлова Р.В., Проценко С.А., Семёнова А.И., Кочнев В.А., Щукин В.В., Гафтон Г.И., Воробьёв A.B., Петров В.Г., Михайличенко Т.Д., Ермакова H.A., Старикова Э.А., Ржевцева Т.А., Щёкина Л.А. Применение активной специфической иммунотерапии аутологичными предшественниками дендритных клеток у больных с солидными опухолями // Тез. III ежегодн. Рос. онкол. конф. — СПб., 1999,—С.191—192.

8. Тоталян A.A., Балдуева И.А.. Бубнова Л.Н., Закревская A.B., Зуева Е.Е., Калинина Н.М., Лисицина З.Н. Стандартизация методов иммунофенотипирования клеток крови и костного мозга человека // Мед. иммунология.—1999.—Т.1 (5).—С.21—43.

9. Балдуева И.А., Моисеенко В.М., Хансон К.П. Система дендритных клеток и ее роль в регуляции функциональной активности Т- и B-лимфоцитов человека // Материалы III научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге'99» // Мед. иммунология.—1999.— Т.1 (3—4).— С.8.

10. Моисеенко В.М., Балдуева И.А.. Хансон К.П. Клинические аспекты современной биотерапии у больных со злокачественными опухолями // Материалы IV научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге'2000» //Мед. иммунология—2000.— Т.2 (2).—С.225—226.

11. Моисеенко В.М., Балдуева И.А.. Хансон К.П., Орлова Р.В., Проценко С.А., Семёнова А.И., Солдатенков В.Е., Кочнев В.А., Щукин В.В., Гафтон Г.И., Воробьёв A.B., Петров В.Г., Сердюк О.П., Михайличенко Т.Д., Ермакова H.A.,

Старикова Э.А., Ржевцева Т.А., Щёкина J1.A. Лечебные противоопухолевые вакцины на основе дендритных клеток // Материалы IV научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге'2000» // Мед. иммунология,—2000,—Т.2 (2).—С.226—227.

12. Балдуева И.А. Вакцины на основе дендритных клеток в лечении злокачественных опухолей // Материалы V Рос. онкол. конф,-—М., 2001.—С. 55—56.

13. Балдуева И.А. Иммунологические особенности взаимоотношения опухоли и организма при меланоме кожи // Практ. онкол.—2001.—Т. 4(8).—С.37—41.

14. Балдуева H.A.. Моисеенко В.М., Хансон К.П. Иммунология опухолей: достижения, перспективы // Материалы V научн. конф. с междунар. участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге'2001» // Мед. иммунология.—2001.—Т.З (2).— С.263.

15. Моисеенко В.М., Хансон К.П., Балдуева H.A. Современная биотерапия солидных опухолей // Сб. докл. I Междунар. Конгр. «Новые медицинские технологии». — СПб., 2001,—С. 81—83.

16. Моисеенко В.М., Орлова Р.В., Балдуева И.А., Антимоник Н.Ю. Применение интерферона-альфа в лечении онкологических больных. Пособие для врачей. — СПб., 2001—17 с.

17. Тоталян A.A., Балдуева И.А.. Бубнова Л.Н. и др. Стандартизация методов иммунофенотипирования клеток крови и костного мозга человека. 4.1. Доаналитический этап. Ч. 2. Метод непрямой иммунофлюоресценции // Клин. лаб. диагностика,— 2001. № 8,— С.38—45.

18. Балдуева И.А. Особенности формирования противоопухолевого иммунного ответа при меланоме // Материалы VI научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге'2002» // Мед. иммунология.—2002. —Т.4 (2).—С.290.

19. Балдуева И.А. Противоопухолевые вакцины на основе дендритных клеток. Опыт НИИ онкологии им.проф.Н.Н.Петрова // Материалы I Всерос. научн.-практ. конф. «Биотерапия рака». — М., 2002.—С. 10—12.

20. Балдуева И.А. Роль цитокинов в онкогенезе // Материалы междунар. научн.-практ. конф. «Цитокины. Воспаление. Иммунитет». — СПб., 2002.—С. 158.

21. Данилов А.О., Данилова А.Б., Балдуева H.A.. Моисеенко В.М. Современные технологии получения противоопухолевых вакцин // Материалы I Всерос. научн.-практ. конф. «Биотерапия рака». — М., 2002.—С.26—27.

22. Моисеенко В.М., Орлова Р.В., Балдуева И.А., Михайличенко Т.Д., Савина И.А., Антимоник Н.Ю. Применение интерлейкина-2 в лечении онкологических больных. Пособие для врачей. — СПб., 2002.—16 с.

23. Моисеенко В.М., Балдуева И.А.. Орлова Р.В., Семёнова А.И., Данилов А.О., Данилова А.Б., Проценко С.А., Михайличенко Т.Д., Щёкина Л.А., Улейская Г.И., Хансон К.П. Активная специфическая иммунотерапия аутологичными предшественниками дендритных клеток больных диссеминированной меланомой кожи, раком почки и толстой кишки. Опыт НИИ онкологии им.проф.Н.Н.Петрова // Тезисы конференции «Проблемы онкоиммунологии: научные и прикладные аспекты» // Онкология.—2003. —Т.5 (2).—С. 175—176.

24. Моисеенко В.М., Данилов А.О., Ларин С.С., Балдуева И.А.. Киселёв С.Л., Щёкина Л.А., Барчук A.C., Анисимов В.В., Гафтон Г.И., Кочнев В.А., Хансон К.П. Активная специфическая иммунотерапия с помощью вакцин на основе аутологичных модифицированных опухолевых клеток у больных диссеминированной меланомой кожи и метастатическим раком почки // Тезисы конференции «Проблемы онкоиммунологии: научные и прикладные аспекты» // Онкология,—2003,—Т.5 (2).—С. 176.

25. Щёкина Л.А., Балдуева И.А.. Моисеенко В.М., Хансон К.П., Орлова Р.В., Проценко С.А., Семёнова А.И., Данилов А.О., Данилова А.Б., Гафтон Г.И., Кочнев В.А., Щукин В.В., Барчук A.C., Анисимов В.В., Моисеенко В.М., Улейская Г.И. Динамика иммунологических показателей в процессе активной специфической иммунотерапии больных с солидными опухолями // Тезисы конференции «Проблемы онкоиммунологии: научные и прикладные аспекты» // Онкология.— 2003. —Т.5 (2).—С. 176.

26. Моисеенко В.М., Балдуева И.А.. Данилов А.О., Щёкина Л.А., Орлова Р.В., Семёнова А.И., Проценко С.А., Михайличенко Т.Д., Кочнев В.А., Гафтон Г.И., Молчанов O.E., Хансон К.П. Иммунотерапия аутологичными предшественниками дендритных клеток больных диссеминированной меланомой кожи и метастатическим раком почки: опыт НИИ онкологии им.проф.Н.Н.Петрова // Материалы VII Всероссийского форума с международным участием им. акад. Иоффе В.И. «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге'2003» // Мед. иммунология.— 2003. —Т.5 (3-4).—С.359—360.

27. Щёкина Л.А., Балдуева И.А.. Моисеенко В.М., Данилов А.О., Данилова А.Б., Улейская Г.И., Хансон К.П. Динамика иммунологических показателей в процессе активной специфической иммунотерапии больных с солидными опухолями // Материалы VII Всероссийского форума с международным участием им. акад. Иоффе В.И. «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге'2003» // Мед. иммунология.— 2003. —Т.5 (3-4).—С.370—371.

28. Моисеенко В.М., Данилов А.О., Балдуева И.А.. Ларин С.С., Данилова А.Б., Семёнова А.И., Щёкина Л.А., Киселёв С.Л., Барчук A.C., Анисимов В.В., Гафтон Г.И., Кочнев В.А., Молчанов O.E., Хансон К.П. Применение вакцин на основе аутологичных генетически модифицированных опухолевых клеток для лечения больных диссеминированной меланомой кожи и метастатическим раком почки // Материалы VII Всероссийского форума с международным участием им. акад. Иоффе В.И. «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге'2003» // Мед. иммунология.— 2003. —Т.5 (3-4).—С.360—361.

29. Балдуева И.А. Противоопухолевые вакцины // Практ. онкол.—2003.—Т.4(3).— С. 157—166.

30. Hanson K.P., Moiseyenko V.M., Baldueva I.A.. Orlova R,V., Semenova A.I., Protcenko S.A., Mikhajlichenko T.D., Danilov A.O., Danilova A.B. Active specific immunotherapy of advanced malignant melanoma, renal and colon cancer with using autologous dendritic cell precursors // Proc.book 14th Inter Congress on anti-Cancer Treatment. — 2003—P.236.

31. Данилов A.O., Ларин C.C., Данилова А.Б, Моисеенко В.М., Балдуева И.А.. Киселёв С.Л., Барчук A.C., Анисимов В.В., Гафтон Г.И., Кочнев В.А., Хансон К.П. Оптимизация метода приготовления вакцин на основе аутологичных генетически модифицированных опухолевых клеток для лечения больных диссеминированной меланомой кожи // Рос. биотер. журн.—2003.— Т.2 (3).—С.47—53.

32. Данилов А.О., Ларин С.С., Данилова А.Б., Моисеенко В.М. Балдуева И.А.. Киселёв С.Л., Туркевич Е.А., Барчук A.C., Анисимов В.В., Гафтон Г.И., Кочнев В.А., Хансон К.П. Усовершенствование метода приготовления аутологичных модифицированных противоопухолевых вакцин для активной специфической иммунотерапии больных с диссеминированными солидными опухолями // Вопр. онкол,—2004. —Т.50 (2).—С.219—227.

33. Моисеенко В.М., Данилов А.О., Ларин С.С., Данилова А.Б., Балдуева И.А.. Тюкавина Н.В., Киселёв С.Л., Семёнова А.И., Орлова Р.В., Анисимов В.В., Гафтон Г.И., Кочнев В.А., Барчук A.C., Канаев C.B., Хансон К.П., Георгиев Г.П. Генотерапия больных с диссеминированными солидными опухолями на основе аутологичных опухолевых клеток, модифицированных геном TAG7 // Материалы

111 съезда ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». — М., 2004.—С.34.

34. Моисеенко В.М., Данилов А.О., Балдуева И.А., Данилова А.Б., Тюкавина Н.В., Ларин С.С., Киселёв С.Л., Орлова Р.В., Семёнова А.И., Туркевич Е.А., Щёкина Л.А., Анисимов В.В., Гафтон Г.И., Кочнев В.А., Барчук A.C., Канаев C.B., Хансон К.П., Георгиев Г.П. I-II фаза клинической оценки эффективности генотерапии на основе аутологичных опухолевых клеток, модифицированных геном tag!, у больных с диссеминированными солидными опухолями // Вопр. онкол.— 2004.— Т.50 (3).—С.293—303.

35. Хансон К.П., Моисеенко В.М., Балдуева И.А. Использование клеточных технологий в онкологии // Вестн. РАМН.—2004.— №9.—С.58—61.

36. Балдуева И.А.. Данилова А.Б., Данилов А.О., Тюкавина Н.В., Семёнова А.И., Орлова Р.В., Туркевич Е.А., Анисимов В.В., Гафтон Г.И., Кочнев A.B., Барчук A.C., Канаев C.B., Хансон К.П., Щёкина Л.А., Моисеенко В.М. I—II фаза клинической оценки эффективности вакцинотерапии на основе аутологичных опухолевых клеток с иммунологическим адъювантом интерлейкин-lß у больных меланомой кожи и раком почки // Материалы межрегион, научн.-практ. конф. «Комбинированные и комплексные методы лечения в онкологии».— Барнаул, 2004.—С. 14—16.

37. Моисеенко В.М., Балдуева И.А.. Данилова А.Б., Данилов А.О. Шестилетний опыт вакцинотерапии злокачественных опухолей // Мед. иммунология.—2004.—Т.6 (3-5).—С.458.

38. Моисеенко В.М., Балдуева И.А.. Данилова А.Б., Данилов А.О., Тюкавина Н.В., Ларин С.С., Киселёв С.Л., Орлова Р.В., Анисимов В.В., Семёнова А.И., Щёкина Л.А., Гафтон Г.И., Кочнев В.А., Барчук A.C., Канаев C.B., Хансон К.П., Георгиев Г.П. Генотерапия больных диссеминированной меланомой кожи и метастатическим раком почки с помощью аутологичных опухолевых клеток, модифицированных геном tag7 // Сибир. онкол. журн.—2004. —Т.2-3 (10-11).— С.55—65.

39. Моисеенко В.М., Данилов А.О., Данилова А.Б., Балдуева И.А.. Тюкавина Н.В., Орлова Р.В., Гафтон Г.И., Кочнев В.А., Анисимов В.В., Барчук A.C., Канаев C.B., Ларин С.С., Киселёв С.Л., Георгиев Г.П., Хансон К.П. Применение генотерапии на основе аутологичных опухолевых клеток, модифицированных геном tag7, для лечения больных диссеминированной меланомой кожи и метастатическим раком почки // Материалы научн.-практ. конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии».—Томск, 2004.—СЛ40—141.

40. Моисеенко В.М., Балдуева И.А.. Данилов А.О., Данилова А.Б. Получение дендритных клеток из костномозговых предшественников у больных диссеминированными злокачественными опухолями // Материалы конф. «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия».— СПб., 2004.—С.930.

41. Моисеенко В.М., Балдуева И.А.. Данилов А.О., Тюкавина Н.В., Семёнова А.И., Орлова Р.В., Туркевич Е.А., Анисимов В.В., Гафтон Г.И., Кочнев В.А., Барчук A.C., Канаев C.B., Хансон К.П., Щёкина Л.А. I-II фаза клинической оценки эффективности вакцинотерапии на основе аутологичных опухолевых клеток с иммунологическим адъювантом интерлейкин-lß у больных меланомой кожи и раком почки // Рос. онкол. журн.—2004. —№6.—С. 12—18.

42. Хансон К.П., Моисеенко В.М., Балдуева И.А.. Данилов А.О., Данилова А.Б. Вакцинотерапия злокачественных опухолей // Материалы III съезда онкол. и радиол. СНГ. — Минск, 2004,— С.420.

43. Данилов А.О., Данилова А.Б., Ларин С.С., Балдуева И.А., Бычкова Н.В., Киселёв С.Л., Колосов М.Л., Канаев C.B., Моисеенко В.М., Хансон К.П. Оптимизация

методов получения культур клеток меланоы кожи и рака почки для приготовления аутологичных и аллогенных противоопухолевых вакцин // Материалы VIII Всероссийского форума с международным участием им. акад. Иоффе В.И. «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге'2004» // Мед. иммунология.—2004. —Т.6 (3-5).—С.445—446.

44. Моисеенко В.М., Балдуева И.А.. Данилов А.О., Данилова А.Б., Орлова Р.В., Тюкавина Н.В., Семёнова А.И., Киселёв С.Л., Ларин С.С., Щёкина Л.А., Улейская Г.И., Проценко С.А., Барчук A.C., Анисиов В.В. Шестилетний опыт вакцинотерапии злокачественных опухолей // Материалы VIII Всероссийского форума с международным участием им. акад. Иоффе В.И. «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге'2004» // Мед. иммунология.—2004. — Т.6 (3-5).—С.458.

45. Моисеенко В.М., Балдуева И.А.. Щёкина Л.А., Тюкавина Н.В., Данилова А.Б., Данилов А.О., Орлова Р.В., Семёнова А.И., Анисимов В.В., Гафтон Г.И., Кочнев

B.А., Барчук A.C., Пожарисский K.M., Канаев C.B., Хансон К.П. I/II фаза клинической эффективности вакцинотерапии на основе аутологичных опухолевых клеток в сочетании с адъювантом BCG у больных с диссеминированными солидными опухолями // Рос. биотер. журн.—2005. —Т.4 (3).—С.122—130.

46. Моисеенко В.М., Данилов А.О., Данилова А.Б., Ларин С.С., Тюкавина Н.В., Балдуева И.А.. Киселёв С.Л., Орлова Р.В., Туркевич Е.А., Анисимов В.В., Гафтон Г.И., Кочнев В.А., Барчук A.C., Канаев C.B., Хансон К.П., Георгиев Г.П. Применение аутологичных вакцин на основе цельных опухолевых клеток, модифицированных геном tag7, для лечения больных диссеминированной меланомой кожи и метастатическим раком почки // Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 2005 // Рос. биотер. журн.—2005.—Т.4 (1).— С.14—15.

47. Моисеенко В.М., Балдуева И.А., Данилова А.Б., Данилов А.О., Тюкавина Н.В., Семёнова А.И., Орлова Р.В., Проценко С.А., Киселёв С.Л., Ларин С.С., Щёкина Л.А., Улейская Г.И., Барчук A.C., Анисимов В.В., Гафтон Г.И., Кочнев В.А., Канаев C.B., Хансон К.П., Георгиев Г.П. Эффективность вакцинотерапии меланомы кожи // Материалы научн.-практ. конф. онкол. СЗФО «Меланома кожи. Современное состояние диагностики и лечения». — Великий Новгород, 2005.—

C.49—52.

48. Моисеенко В.М., Балдуева И.А... Данилова А.Б., Данилов А.О., Тюкавина Н.В., Орлова Р.В., Туркевич Е.А., Анисимов В.В., Гафтон Г.И., Кочнев В.А., Барчук A.C., Канаев C.B., Хансон К.П. Оценка клинической эффективности вакцин на основе аутологичных опухолевых клеток с иммунологическим адъювантом интерлейкин-lß у больных меланомой кожи и раком почки // Материалы IX Всероссийского форума с международным участием им.акад.Иоффе В.И. «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге'2005» // Мед. иммунология.—2005.—Т.7 (2-3).— С.205—206.

49. Данилова А.Б., Данилов А.О., Бычкова Н.В., Туркевич Е.А., Балдуева И.А.. Моисеенко В.М. Изучение экспрессии антигенов и пролиферативной активности клетками меланомы кожи, культивируемых для приготовления противоопухолевых вакцин // Материалы I Рос.-амер. конф. «Биотехнология и онкология», Сб. тезисов. — СПб., 2005.—С.96—98.

50. Данилов А.О., Данилова А.Б., Ларин С.С., Моисеенко В.М., Балдуева И.А.. Киселёв С.Л., Барчук A.C., Анисимов В.В., Гафтон Г.И., Кочнев В.А., Канаев C.B., Хансон К.П., Георгиев Г.П. Оптимизация методов приготовления генетически модифицированных вакцин для лечения диссеминированной меланомы кожи и метастатического рака почки // Материалы I Рос.-амер. конф. «Биотехнология и онкология», Сб. тезисов.— СПб., 2005. —С.98—99.

51.Моисеенко В.М., Данилов А.О., Тюкавина Н.В., Балдуева И.А.. Киселёв СЛ., Ларин С.С., Орлова Р.В., Туркевич Е.А., Анисимов В.В., Гафтон Г.И., Кочнев В.А., Барчук А.С., Канаев С.В., Хансон К.П., Георгиев Г.П. Исследование эффективности аутологичных вакцин на основе цельных опухолевых клеток, модифицированных геном tag!, у больных диссеминированной меланомой кожи и раком почки // Материалы I Рос.-амер. конф. «Биотехнология и онкология». — Сб. тезисов, СПб., 2005. —С. 119—120.

52. Балдуева И.А.. Моисеенко В.М., Данилов А.О., Данилова А.Б., Тюкавина Н.В., Щёкина Л.А., Семёнова А.И., Орлова Р.В., Проценко С.А., Анисимов В.В., Гафтон Г.И., Хансон К.П. Приготовление вакцин на основе аутологичных костномозговых предшественников дендритных клеток для лечения больных злокачественными опухолями // Материалы 1 Рос.-амер. конф. «Биотехнология и онкология», Сб. тезисов,—СПб., 2005,— С.118—119.

53. Моисеенко В.М., Балдуева И.А.. Данилова А.Б., Данилов А.О., Орлова Р.В., Тюкавина Н.В., Семёнова А.И., Киселёв С.Л., Ларин С.С., Щёкина Л.А., Улейская Г.И., Проценко С.А., Анисимов В.В., Барчук А.С., Кочнев В.А., Канаев С.В., Хансон К.П., Георгиев Г.П. Семилетний опыт вакцинотерапии злокачественных опухолей // Материалы Рос. науч.-практ. конф. с междунар. участием «Новые технологии в онкологической практике».—Барнаул, 2005.—С.91—92.

54. Данилова А.Б., Данилов А.О., Туркевич Е.А., Балдуева И.А.. Моисеенко В.М. Особенности антигенной экспрессии клеток меланомы кожи, культивируемых для приготовления противоопухолевых вакцин // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии в онкологической практике».—Барнаул, 2005. —С.218.

55. Moiseyenko V.M., Baldueva 1.А.. Danilov А.О., Danilova A.B. Xenovaccination of patients with skin melanoma: phase 11 clinical trial // The 6lh World Congress on Melanoma. —Vancouver, Canada, 2005. — P.24.

56. Моисеенко B.M., Балдуева И.А., Данилова А.Б. Иммунотерапия опухолей: результаты клинических исследований // Immune-mediated diseases from theory to therapy, Moscow, 2005 // J. Association Pediatric Allergists & Immunologists of Russia. — 2005,—Vol.6.— P.259—260.

57. Moiseyenko V.M., Danilov A.O., Baldueva 1.А., Tyukavina N.V., Larin S.S., Kiselev S.L., Orlova R.V., Anisimov V.V., Semenova A.I., Shchekina L.A., Gafton G.I., Kochnev V.A., Barchuk A.S., Kanaev S.V., Hanson K.P., Georgiev G.P. Phase I/1I Trial of Gene Therapy with the Autologous Tumor Cells Modified with the tag7/PGRP-S Gene in Patients with the Disseminated Solid Tumors // Ann. Oncol.—2005.—Vol.16.— P. 162—168.

58. Моисеенко B.M., Балдуева И.А.. Орлова P.В., Семёнова А.И. Патент на изобретение №2203683 «Способ иммунотерапии костномозговыми дендритными клетками больных с солидными опухолями». Приоритет от 20.09.2001 г. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ, Москва, 10.05.2003 г.

59. Моисеенко В.М., Балдуева И.А.. Орлова Р.В., Семёнова А.И., Симбирцев А.С. Патент на изобретение № 2267326 «Способ иммунотерапии опухолевым лизатом с адъювантом беталейкин больных с солидными опухолями». Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ, Москва, 10.01.2006 г.

60. Данилова А.Б., Данилов А.О., Туркевич Е.А., Бычкова Н.В., Балдуева И.А.. Моисеенко В.М. Изучение антигенных и пролиферативных свойств опухолевых клеток в культуре для приготовления аллогенной вакцины меланомы кожи // Вопр. онкол,—2005,—Т.51 (1).— Р.8—9.

61. Моисеенко В.М., Балдуева И.А., Данилова А.Б., Данилов А.О., Тюкавина Н.В., Семёнова А.И., Орлова Р.В., Проценко С.А., Киселёв С.Л., Ларин С.С., Щёкина

Л.А., Улейская Г.И., Барчук А.С., Анисимов В.В., Гафтон Г.И., Кочнев В.А., Канаев С.В., Хансон К.П., Георгиев Г.П. Эффективность вакцинотерапии меланомы кожи // Материалы научн.-практ. конф. онкол. СЗФО «Меланова кожи. Современное состояние диагностики и лечения». —СПб., 2005. —С.49—52.

62. Moiseyenko V., Baldueva I.. Danilov A., Danilova A. Xenovaccination of patients with skin melanoma: phase I/II clinical trial // Abstracts XXXIII Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM).—Rhodes (Greece). — 2005—P.44,abstr. 0-81.

63. Балдуева И.А., Моисеенко B.M. Вакцинотерапия злокачественных опухолей (молекулярно-генетические аспекты). Лекция // Материалы IX Рос. онкол. конгр. — М„ 2006. —С. 14—16.

64. Moiseyenko V.M., Danilov А.О., Baldueva I.A.. Danilova А.В., Tyukavina N.V., Larin S.S., Kiselev S.L., Orlova R.V., Anisimov V.V., Shchekina L.A., Gafton G.I., Kochnev V.A., Barchuk A.S., Kanaev S.V., Georgiev G.P. Vaccine therapy of malignant melanoma // 8th International Symposium Biological Therapy of cancer from disease to targeted therapy. — Dresden (Germany), 2006.

65. Моисеенко B.M., Данилов A.O., Данилова А.Б., Ларин С.Л., Балдуева И.А.. Тюкавина Н.В., Фахрутдинова О.Л., Орлова Р.В., Туркевич Е.А., Анисимов В.В., Гафтон Г.И., Кочнев В.А., Барчук А.С., Канаев С.В., Гнучев Н.В., Георгиев Г.П. Вакцинотерапия аутологичными цельными опухолевыми клетками, модифицированными геном tag7, больных солидными опухолями // Материалы XI Всероссийского форума с международным участием им. акад. Иоффе В.И. «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге'2007» // Мед. иммунология. —2007. Т.9 — (2—3). —С.280—281.

66. Данилова А.Б., Моисеенко В.М., Данилов А.О., Балдуева И.А. Иммуноцитохимический анализ антигенного состава клеток меланомы кожи, культивируемых для приготовления вакцин // Материалы XI Всероссийского форума с международным участием им. акад. Иоффе В.И. «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге'2007» // Мед. иммунология. —2007. —Т.9 (2—3). —С.281.

67. Moiseyenko V., lmyanitov Е., Danilova A., Danilov A., Baldueva 1. Cell technologies in immunotherapy of cancer//Adv. Exp. Med. Biol. —2007. —Vol.601.—P.387—393.

68. Моисеенко B.M., Балдуева И.А. Проблемы иммунологии опухолевого роста и возможности вакцинотерапии И Мед. акад. жури.—2007. —Т.7 (4).— С.17—34.

69. Моисеенко В.М., Данилова А.Б., Данилов А.О., Туркевич Е.А., Балдуева И.А.. Мацко Д.Е. Иммуноцитохимическое изучение экспрессии антигенов клетками меланомы кожи, культивируемыми для приготовления вакцины // Вопр. онкол.— 2008,—Т.54 (3).— С.303—314.

70. Данилова А.Б., Данилов А.О., Балдуева И.А.. Моисеенко В.М. Культивирование клеток солидных опухолей для приготовления противоопухолевых вакцин // Материалы V съезда онкол. и радиол. СНГ. — Ташкент, 2008.— С.531.

71. Моисеенко В.М., Балдуева И.А. Иммунологические аспекты опухолевого роста и возможности вакцинотерапии // Материалы VII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 2008 // Рос. биотер. журнал.—2008. —Т.4 (1).—С.5.

72. Новик А.В., Орлова Р.В., Балдуева И.А.. Проценко С.А., Михайличенко Т.Д., Семенова А.И., Телетаева Г.М., Тюкавина Н.В., Моисеенко В.М. Оценка факторов прогноза токсичности монотерапии рекомбинантным интерлейкином-2 больных диссеминированной меланомой кожи // Материалы VII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 2008 // Рос. биотер. журн,—2008. —Т.4 (1). —С.48.

73. Новик А.В., Орлова Р.В., Балдуева И.А.. Проценко С.А., Михайличенко Т.Д., Семёнова А.И., Телетаева Г.М., Тюкавина Н.В., Моисеенко В.М. Оценка факторов

прогноза эффективности монотерапии рекомбинантным интерлейкином-2 больных диссеминированной меланомой кожи // Материалы VII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 2008 // Рос. биотер. журн,—2008. —Т.4 (1). —С.48.

74. Балдуева И.А.. Моисеенко В.М., Данилова А.Б., Данилов А.О., Нехаева Т.Л., Георгиев Г.П., Гнучев Н.В., Ларин С.С., Киселёв С.Л. Клеточные технологии в терапии злокачественных опухолей // Материалы объединенного иммунологического форума, СПб., 2008 // Рос. иммунол. журн.—2008.—Т.2(11). №2-3,—С.303—304.

75. Данилова А.Б., Данилов А.О., Балдуева И.А.. Моисеенко В.М. Изучение механизмов «уклонения» клеток солидных опухолей от иммунного контроля в контексте противоопухолевой терапии // Материалы объединенного иммунологического форума, СПб., 2008 // Рос. иммунол. журн.—2008.—Т.2(11). №2-3,—С.306.

76. Моисеенко В.М., Балдуева И.А.. Данилова А.Б., Орлова Р.В., Семёнова А.И., Тюкавина Н.В., Фахрутдинова О.Л., Нехаева Т.Л., Новик A.B., Георгиев Г.П., Гнучев Н.В., Ларин С.С., Киселёв С.Л. Опыт и перспективы вакцинотерапии злокачественных опухолей // Материалы объединенного иммунологического форума, СПб., 2008 // Рос. иммунол. журн,—2008. Т.2(11). №2-3,—C.311.

77. Moiseyenko V.M., Baldueva I.A.. Gelfond M.L., Fahrutdinova O.L., Novik A.V., Nehayeva T.L., Danilova A.B., Danilov A.O., Imyanitov E.N. Combination of dendritic cells (DC) vaccine and photodynamic therapy (PDT) shows promising results in patients with disseminated melanoma // The Melanoma XII Congress.—Hague, Netherlands, 2008. —in print.

78. Данилова А.Б., Данилов A.O., Моисеенко B.M., Фахрутдинова О.Л., Балдуева И.А. Исследование факторов, влияющих на эффективность противоопухолевых вакцин: 1. Иммунохимический анализ продукции MICA in vitro и у онкологических больных // Вопр. онкол.—2009. —в печати.

79. Балдуева И.А.. Моисеенко В.М. Активная специфическая иммунотерапия больных некоторыми солидными опухолями с использованием вакцины на основе предшественников дендритных клеток // Вопр. онкол.—2009. —в печати.

80. Моисеенко В.М., Балдуева И.А.. Гельфонд М.Л., Фахрутдинова О.Л., Новик A.B., Нехаева Т.Л., Данилов А.О., Данилова А.Б. «Способ иммунотерапии костномозговыми предшественниками дендритных клеток, сенсибилизированных фотомодифицированными опухолевыми клетками in vivo, больных с диссеминированными солидными опухолями» // Заявка на изобретение №2008115173/14, приоритет от 17.04.2008 г.

Диссертационное исследование частично выполнено на средства грантов правительства Москвы по программе «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний» в разделе «Генотерапия и диагностика онкологических заболеваний», НИОПИК (2000-2008 г.).

Отпечатано в ООО «Константиновский» -Центр полиграфических услуг «РИФ Print». Санкт-Петербург, ул. Мира, д. 34, тел. 334-35-59. Подписано в печать 5.11.08. Тираж 100 экз.

Актуальность темы. В последнее десятилетие достигнуты несомненные успехи в лечении злокачественных опухолей, в первую очередь, вследствие прогресса лекарственной терапии. Одновременно достижения молекулярной биологии, иммунологии, углубленное понимание механизмов прогрессии опухоли и взаимоотношений иммунной системы и опухоли, а также развитие биотехнологии обусловили реальные перспективы улучшения результатов лечения опухолей с помощью методов биотерапии.

Биологическая терапия рака — это иммунотерапевтический подход с использованием естественных полимерных молекул (моноклональных антител, цитокинов, факторов роста, индукторов созревания и дифференцировки клеток и т.д.), аутологичных и аллогенных эффекторных клеток (цитотоксических Т-лимфоцитов, дендритных клеток, лимфокинактивированных киллеров, опухольинфильтрирующих лимфоцитов и др.), опухолеассоциированных антигенов (противоопухолевых вакцин), непрямых методов (низких доз цитостатиков, высоких доз антиэстрогенов) и др.

Разработка методов биотерапии у больных с солидными опухолями, основанных на иммунопатологических особенностях заболевания, с целью поиска новых подходов к стандартному лечению злокачественных опухолей является актуальным направлением исследований в современной клинической онкологии (Семиглазов В.Ф. и соавт., 1988; Барышников АЛО. и соавт., 1998; Якубовская Р.И. и соавт., 2002; Georgiev G.P. et al., 1998). Неуклонный рост частоты онкологических заболеваний, низкий уровень выживаемости у больных с IV стадией заболевания, недостаточная эффективность традиционных методов лечения у этой категории больных обуславливают социальную значимость данной проблемы (Давыдов М.И. и соавт., 1998; Чиссов В.И., Старинский В.В., 2000). С другой стороны, понимание механизмов иммунной защиты, исследование причин их несостоятельности и разработка методов коррекции представляет также несомненный научный интерес (Кадагидзе З.Г. и соавт., 2004). Это связано с тем, что злокачественная опухоль в организме является своего рода моделью реакции «трансплантат против хозяина».

Ведущая роль в отторжении сингенного или аллогенного трансплантата традиционно отводится цитотоксическим Т-клеткам, от активности которых во многом зависит характер клинического течения и исход заболевания. Неудивительно, что большое число исследований в экспериментальной и клинической онкологии посвящено изучению механизмов прогрессирования злокачественной опухоли и влияния на этот процесс лекарственной терапии. При этом противоопухолевая роль иммунокомпетентных клеток под воздействием современных методов биотерапии исследована в значительно меньшей степени. Общепризнанным является только тот факт, что развитие злокачественной опухоли тесно связано с наличием вторичного иммунодефицита. Иммунодефицит с одной стороны, является фоном, на котором начинает «ослабевать» известная реакция «хозяин против трансплантата», а с другой - следствием реакции «трансплантат против хозяина». Между тем, остаются неясными многие вопросы. Например, какие иммунные нарушения могут восстанавливаться с помощью современных методов биотерапии (активной специфической и неспецифической иммунотерапии) в комплексном лечении онкологических больных? Какое влияние оказывают методы биотерапии на отдельные звенья иммунной системы (антигенпрезентирующие клетки, Т-лимфоциты, В-лимфоциты, NK-клетки) у больных с солидными опухолями?

Реакция «хозяин против трансплантата» осуществляется высокоспецифичным Т-клеточным звеном иммунной системы с непосредственным участием цитотоксических Т-клеток. В то же время, имеется немало фактов о важной роли в этой реакции «профессиональных» антигенпрезентирующих клеток, в частности высокопрофессиональных» дендритных клеток, которые, как сейчас признается, контролируют интенсивность иммунного ответа цитотоксических Т-лимфоцитов. Кроме того, показано участие цитокинов, продуцируемых Т-хелперами 1-го типа (Thl), в образовании и регуляции активности специфического противоопухолевого клона цитотоксических Т-клеток. С этих позиций оценка эффективности современных методов биотерапии у больных с солидными опухолями представляет интересный объект для изучения роли баланса активности Thl и Th2 в реакции «хозяин против трансплантата».

Большой научный интерес представляет также раскрытие механизмов формирования иммунодепрессии у больных с солидными опухолями. Способность опухоли индуцировать анергию и апоптоз иммунекомпетентных клеток свидетельствует о том, что иммунодепрессия при опухолевом росте может являться следствием негативного исхода клеточной активации (Хансон К.П. и соавт., 1996). Происходит ли это на самом деле у больных с солидными опухолями, насколько подвержены нарушения иммунитета биотерапевтической коррекции, как изменение баланса цитокинов сказывается на течении заболевания, и, в том числе, на выраженности специфического противоопухолевого ответа — все это составляет тот спектр вопросов, который в настоящее время остается во многом не выясненным (Моисеенко В.М., 1998).

Кроме того, в доступной литературе отсутствует обоснование режимов вакцинотерапии больных со злокачественными опухолями, что, как нам кажется, связано с недостаточным пониманием механизмов индукции оптимального иммунного ответа на каждый опухолеассоциированный антиген. Между тем, очевидно, что эффективность этого метода во многом зависит от рационального его применения. Таким образом, высокоактуальным становится разработка и обоснование режимов активной специфической иммунотерапии в связи с особенностями противоопухолевого иммунитета у больных с солидными опухолями.

Несомненно, актуальным является также внедрение существующих методов биотерапии, разработка новых методов и препаратов неспецифического и специфического воздействия на систему иммунного гомеостаза и опухолевый процесс, что может существенно повысить эффективность лечения больных с солидными опухолями. Несмотря на очевидную эффективность некоторых неспецифических модификаторов биологического ответа, методика их применения (доза, режим, пути введения) нуждается в доработке. Особенно важно это при сочетанном использовании нескольких модификаторов биологического ответа, что достаточно часто является клинически обоснованным (Кетлинский С.А. и соавт., 1998). Дальнейший прогресс этого направления может быть связан с оптимизацией выбора препаратов и схем их применения с учетом ряда факторов. При этом, помимо иммунологических показателей, следует учитывать состояние всех органов и систем, степень истощения адаптационных резервов и др.

Таким образом, из всего вышесказанного следует, что, несмотря на колоссальные достижения фундаментальной и прогресс клинической онкологии, остается много неясного во взаимоотношении опухоли и иммунной системы организма практически на всех этапах опухолевой прогрессии. Кроме того, появляется целый спектр вопросов, связанных с воздействием различных методов современной биотерапии на это взаимоотношение, что определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования

Повышение эффективности лечения больных с солидными опухолями на основе современных высокотехнологичных методов биотерапии.

Задачи исследования

1. Обоснование и разработка современных методов биотерапии солидных опухолей.

2. Изучение влияния на отдельные звенья иммунной системы, а также клиническую эффективность методов активной специфической иммунотерапии на основе:

• костномозговых предшественников дендритных клеток;

• немодифицированных опухолевых клеток с иммунологическими адъювантами;

• геномодифицированных опухолевых клеток.

3. Оценка токсичности различных методов активной специфической иммунотерапии.

4. Определение показаний и противопоказаний к проведению различных вариантов вакцинотерапии.

5. Определение места современной биотерапии в комплексном лечении больных меланомой кожи и раком почки.

Научная новизна

В диссертационной работе впервые:

• разработана оригинальная методика активной специфической иммунотерапии на основе аутологичных костномозговых предшественников дендритных клеток (.Патент на изобретение № 2203683 от 10.05.2003 г.; Заявка на изобретение №2008115173/14, приоритет от 17.04.2008 г.);

• изучены различные способы введения костномозговых предшественников дендритных клеток с иммунологическими адъювантами больным с диссеминированным опухолевым процессом;

• разработан способ иммунотерапии аутологичными опухолевыми клетками с адъювантом IL-ip (беталейкин) больных с солидными опухолями {Патент на изобретение № 2267326 от 10.01.2006 г.);

• разработан оригинальный способ получения культур опухолевых клеток человека на полупромышленном уровне с использованием метода автоматической дезагрегации и пассирования образцов аутологичной опухоли;

• изучены и определены решающие условия успешной генотерапии больных меланомой кожи и раком почки с использованием липосомной трансфекции гена tag7.

Практическая значимость

• Обоснована целесообразность использования высокотехнологичных методов биотерапии в комплексном лечении больных диссеминированной меланомой кожи и раком почки.

• Оценена клиническая и иммунологическая эффективность противоопухолевых вакцин, основанных на аутологичных костномозговых предшественниках дендритных клеток и геномодифицированных опухолевых клетках.

• Внедрен в клиническую практику метод оценки реакции гиперчувствительности замедленного типа на вакцинный препарат и на аутологичные опухолевые клетки («bystander effect»).

• Определен приоритет внутрикожного способа введения вакцины на основе дендритных клеток по сравнению с внутривенным введением и инъекциями в периферические лимфатические узлы.

• Обоснована целесообразность использования противоопухолевых вакцин в комбинации с иммунологическими адъювантами (интерлейкин -1, -2).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Биотерапия с использованием вакцин - эффективный метод лечения больных с солидными опухолями.

2. Разработанные оригинальные противоопухолевые вакцины на основе генетически модифицированных опухолевых клеток и костномозговых предшественников дендритных клеток вызывают специфический иммунный ответ, приводящий к регрессу опухоли, и могут быть рекомендованы к практическому применению.

3. Основные механизмы противоопухолевого действия вакцин связаны с нормализацией либо стимуляцией функциональной активности отдельных звеньев иммунной системы (CD3+, CD4+, CD8+ Т-лимфоцитов, CD20+ В-лимфоцитов, HLA

DR+-, CD254-, CD384-, CD71+-, С095+-лимфоцитов, CD16+ NK-клеток, ФГА и КонА активированных клеток).

выводы

1. Вакцинотерапии на основе немодифицированных и геномодифицированных опухолевых клеток, а также костномозговых предшественников дендритных клеток является эффективным методом биотерапии и оказывает клинически значимый противоопухолевый эффект у 46,2% больных распространенными солидными опухолями (полный и частичный регресс - 5,9%, минимальный регресс и стабилизация опухолевого процесса - 40,2 %).

2. Противоопухолевая вакцинотерапия хорошо переносится больными и не вызывает тяжелых местных и общих токсических реакций. Осложнения I-II степени отмечены у 57,1% пациентов.

3. Введение генетически модифицированной вакцины и вакцины на основе дендритных клеток сопровождается развитием реакции гиперчувствительности замедленного типа у 79% больных, «bystander effect» - у 10%, иммунологическим ответом в лабораторных тестах in vitro — у 95%, клиническим ответом — у 42% пациентов, средней продолжительности 6 мес.

4. Вакцинотерапия немодифицированными аутологичными опухолевыми клетками с иммунологическим адъювантом BCG или IL-ip обеспечивает иммунологический ответ у 90% пациентов, однако, объективный регресс опухоли достигается только у 5% больных средней продолжительностью 6,4 мес.

5. Внутрикожное введение вакцины на основе дендритных клеток имеет преимущество перед внутривенным, так как не вызывает выраженных побочных эффектов и сопровождается клиническим ответом у 66,7% больных, средней продолжительности 5 мес.

6. Адъювантная вакцинотерапия немодифицированными опухолевыми клетками больных меланомой кожи, раком почки и раком предстательной железы с высоким риском рецидива опухоли сопровождается иммунологическим эффектом у 98% пациентов и безрецидивной выживаемостью в течение 39,6 мес. у 61,8% больных (среднее значение времени до прогрессирования — 16,4 мес.).

7. Специфическое влияние вакцинотерапии в лабораторных тестах in vitro выявлено у 95% обследованных пациентов. Это может выражаться в увеличении абсолютного содержания CD3+ и CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов (р<0,01), снижении количества функционально неполноценных Т-лимфоцитов (р<0,02), устранении дисбаланса основных иммунорегуляторных субпопуляций лимфоцитов (р<0,04).