Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Производство и контроль гипериммунных сывороток и иммуноглобулина против сальмонеллеза животных

Р Г 5 ОЛ

На правах рукописи

1 в мдр 1398

медведев Александр Петрович

ПРОИЗВОДСТВО И КОНТРОЛЬ ГИПЕРИММУННЫХ СЫВОРОТОК И ИММУНОГЛОБУЛИНА ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЁЗА ЖИВОТНЫХ

16 0003—Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Москва - 1998

Работа выполнена на Витебской биофабрпке и со Всеросий-ском научно-исследовательском институте контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.

Научный консультант — доктор ветеринарных наук, заслуженный деятель науки РСФСР, лауреат премии Совета Министров СССР, профессор Малахов 10. А.

Официальные оппоненты:

1. Доктор ветеринарных наук, член-корреспондент РАСХН, профессор А. Я. Самуйленко.

2. Доктор ветеринарных наук, профессор Л. С. Каврук.

3. Доктор, биологических наук, профессор Н. Д. Скнчко.

Ведущее учреждение — Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко (РАСХН).

Защита диссертации состоится <<./£*?.>> 199^г.

в часов на заседании диссертационного совета Д.120.85.01

при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов Минсельхозпрода России (123022 г. Москва, Звенигородское шоссе, д. 5, ВГНКИ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНКИ.

Автореферат диссертации разослан .

Ученый секретарь ¿уГТ^у) ■> /¿¿/¿%Р

диссертационного Совета ^/г' /^^о^то. А. Козырев

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сальмонеллёз — инфекционная бо-:зиь животных и человека, вызываемая разнообразными серова-ми бактерии рода .

Первый представитель рода был выделен в 1885 г. американ-нми ветврачами Сальмоиом и Смитом.

В настоящее время известно 2234 серовара сальмонелл и Меж-'иародный сальмонеллёзный центр регистрирует ежегодно по —20 новых сероваров.

Сальмонеллёз распространён практически во всех странах 1ра.

Возникновению болезни способствует высокая концентрация головья на ограниченной площади, неблагоприятный микрокли-1т, низкое качество кормов и их недостаток, бессистемное исполь-вание лекарственных средств п многие другие факторы.

Сальмонеллёз наносит значительный экономический ущерб, торый определяется высокой летальностью заболевающих житных, затратами на их лечение, расходами на ликвидацию и про-глактику болезни. К тому же, сальмонеллы являются наиболее стымн возбудителями пищевых токспкоинфекций у человека, ээгому борьба с сальмонеллёзом — не только ветеринарная, но и циальная проблема.

В комплексе мероприятий по борьбе с болезнью значительное ¡сто занимает антитоксическая поливалентная сыворотка против льмоиеллёза телят, поросят, ягнят, овец и птиц.

Впервые активную сыворотку против сальмопеллёза получили 1892 г. и

Сыворотку против сальмопеллёза телят в СССР получил С. К. :ззубец (1930). Затем разработкой методики получения этой [воротки занимались С. Н. Вышелесский и Д. К- Бессонов (1932), П. Борисов (1932), Н. А. Мнхин (1931—1934), Н. В. Прокопович Др.

Сыворотку против сальмонеллёза овец предложил В. С. Казан (1935). В дальнейшем работы по получению этой сыворотки сшприли и углубили А. И. Нефедьев (1953), И. Н. Никольский 953).

А. Г. Малявин (1940) получил сыворотку против сальмонеллё-, обладающую антимикробным и антитоксическим действием.

В" период с 1967 по 1970 гг. под руководством А. Г. Малявина [ла разработана методика получения от волов-продуцентов по-валентной антитоксической сыворотки против сальМонеллёза те-т, поросят, ягнят, овец и птиц, а затем им же организовано пропиленное изготовление препарата на биофабриках бывшего

:ср.

Однако, производство гипериммунных сывороток, в том чи и названной, представляет собой сложный и длительный процес< котором можно выделить следующие основные стадии: подбор i муногеиных штаммов, приготовление питательной среды для выращивания, культивирование штаммов, инактивация кыращ пых культур, отбор продуцентов, их гпперпммунизация, взятие к ви, получение сыворотки, консервация, отстой, фильтрация, рас( совка, этикетироваиие и контроль препарата.

Даже этот простой перечень основных звеньев технологичес го процесса получения сыворотки — свидетельство его длптель сти и трудоёмкости.

Учёт этого обстоятельства, анализ литературных данных, мысление многолетнего опыта изготовления нами сыворотки на I тебской биофабрнке послужили основанием для выполнения пр ставленной работы.

Наряду с гпнериммунными сыворотками для лечения и n¡ филактпки получают и применяют иммуноглобулины.

По лечебно-профилактическому действию иммуног л обул значительно превосходит сыворотки. Но получение их, так же, i< и сывороток, многоэтапный, сложный и длительный процесс. П] мышлепное получение протнвосальмонеллёзпого иммуноглобулг до сих пор не освоено. Учитывая это, мы решили разработать щ емлемую для биопромышленпостп схему его получения.

Эффективность сыворотки и иммуноглобулина определяе'1 их специфической активностью. Вместе с тем, регламентированн нормативной документацией методы контроля активности сывор! ки не позволяют с достаточной степенью достоверности судить лечебно-профилактической эффективности препарата. \Контро иммуноглобулина на активность также требует разработки бо; достоверного метода.

Очевидна необходимость изучения многих аспектов пронзвс ства сыворотки. Так, до настоящего времени недостаточно изучен влияние возраста и сроков эксплуатации продуцентов на нмму! генность препарата, гематологические показатели, динамика Т-В-лнмфоцнтов, белковый спектр сыворотки крови волов, влиян адъюваптов, места, дозы, метода введения антигена на активное получаемой сыворотки, пе предложены способы отбора жнвотш для сывороточного производства, рациональный способ гннерпмк низацпи волов и оптимальный режим их эксплуатации, не найде! методы очистки сыворотки от липидов, не предложено более сове шенпого способа консервации её, не изучена возможность полу1 ния ассоциированной сыворотки против сальмонеллёза и друг болезней.

Всё вышеотмеченное послужило основанием для проведен; исследований, представленных в данной работе.

Цель работы. — Разработка новой технологии изготовления лворотки, получение из нее специфического иммуноглобулина, азработка методов контроля активности этих препаратов, получепе ассоциированной сыворотки против сальмонеллёза, пастереллё-1, парагрнппа-3 и инфекционного рннотрахента крупного рогатого <ота.

П. ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Оценить достоверность применяемого метода контроля ак-шности сыворотки протпв сальмонеллёза животных.

2. Усовершенствовать метод контроля активности сыворотки Пхммуноглобулина.

3. Изучить иммунный ответ организма волов на сальмонеллёз-ый антиген.

4. Определить содержание кальция, фосфора и каротина в кро-[ продуцентов сыворотки.

5. Разработать способ отбора волов для производства сыво-эткп.

6. Оптимизировать схему гипериммунизации и режим эксплуа-щпп волов-продуцентов.

7. Изучить возможность повышения выхода сыворотки из кро-I продуцентов.

8. Усовершенствовать способы консервации, осветления и очи--ки сыворотки от липидов.

9. Разработать промышленную технологию получения специ-нческого иммуноглобулина и метод контроля его активности.

10. Получить поливалентную сыворотку против сальмонелле-1, пастереллеза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита оупного рогатого скота.

11. Изучить лечебно-профилактическую активность сыворотки иммуноглобулина для телят и поросят.

Научная новизна. Новизна работы в следующем.

Разработан метод контроля активности сыворотки в отноше-.

Ш ¿'.¿^^г'-и-, ^¿ур^г ^ъе-ъУ^з»* гг

1 белых мышах массой 18—20 г, а в отношении а взрослых голубях, включающий:

— иммунизацию сывороткой белых мышей подкожно, голубей 1утрпмышечно в дозе 0,004 см3, с использованием на каждый се-звар 10 животных;

— заражение мышеи и голубей 2—3 ЛДбо соответствующего фовара спустя 2—3 часа после введения сыворотки.

Сыворотка является активной при выживании не менее 8 осо-:й из 10 иммунизированных и гибели 8—10 в контроле

Установлено, Что волы, имеющие специфические антитела сальмонеллам до гипериммупнзацни, являются продуцентами н иболее активной сыворотки по сравнению с неннфицированным животными.

Разработана новая технология получения гипериммунной ci воротки против сальмонеллеза животных, включающая:

■— гипериммунизацшо антигеном из 4 штаммов сальмонел. вместо 18;

— цикл гппериммунизации из 7 инъекций, вместо 22;

— концентрация антигена 10 млрд/см3, вместо 3 млрд/см3 mi кробных тел;

■— введение антигена внутрибрюшинно, вместо подкожного;

— доза антигена на инъекцию от 2 до 20 см3 на животное, bmi сто 50—400 см3;

— срок отстоя сыворотки до 10 суток, вместо 60.

Получен протпвосальмонеллезный иммуноглобулин методо осаждения иммуноглобулинов «ПЭГ-115».

Разработан способ контроля активности иммуноглобулина г величине ИДбо для белых мышей й голубей.

Получена ассоциированная сыворотка против сальмонеллез пастереллеза, парагриппа-3 и инфекционного рннотрахента кру] иого рогатого скота.

Установлено отсутствие конкуренции антигенов пз названии микроорганизмов при гппериммунизации волов-продуцентов асс< циированной сыворотки.

Новизна работы подтверждена авторскими свидетельствам]

— «Способ осветления гипернммуной сыворотки против сал: монеллеза» (авт. св. № 1637088, зарег. в Гос. реестре пзобр. ССС 22 ноября 1990 г.);

•— «Способ отбора волов-продуцентов противосальмопелле: ной сыворотки» (авт. св. № 1655979, зарег. в Гос. реестре пзоб: СССР 15 февраля 1991 г.);

— «Способ получения гипернммунной сыворотки против сал] монеллеза животных» (авт. св. № 1754114, зарег. в Гос. реестр

• изобр. СССР 15 апреля 1992 г.);

— «Способ консервации сыворотки против сальмонеллеза Ж1 вотных» (авт. св. № 1777886, зарег. в Гос. реестре изобр. ССС 1 августа 1992 г.) ;

— «Способ получения гипериммунной сыворотки против ра< пираторных заболеваний крупного рогатого скота» (авт. с: № 1795582, зарег. в Гос. реестре изобр. СССР 8 октября 1992 г.).

На изобретение «Способ осветления гипериммунной сыворотк против сальмонеллеза животных» Госкомизобретений выдал патег № 1793929, зарег. в Гос. реестре пзобр. СССР 8 октября 1992 г.

Практическая значимость. Внедрена новая питательная среда для культивирования штаммов, включающая гидролизат крови животных, 40%-ный раствор пшОкозы, 10%-ный раствор экстракта дрожжей, 05%-иый раствор биогенного стимулятора торфа. Инактивация антигена проводится 0,2-0,3%-ным формалином и 0,1%-ной перекисью водорода.

Дополнения в инструкцию в форме извещений №№ 1, 2, 3, 4, 5 утв. Генеральным директором Республиканского объединения «Белзооветспабпром».

Нами изменен режим эксплуатации продуцентов и вместо двух инъекций после каждого очередного крововзятия предложено антиген вводить однократно. Это предложение в форме изменений к инструкции утверждено ГУВ при Государственной комиссии Совета Министров СССР по продовольствию и закупкам 13 февраля 1990 г.

Документация, касающаяся схемы гипериммунизации волов и способа контроля активности сыворотки, в виде дополнений к инструкции, утв. ГУВ Республики Беларусь 19 января 1992 г.

Результаты исследований позволили предложить новую «Инструкцию по изготовлению и контролю сыворотки против сальмо-пеллеза животных», а также новые технические условия (ТУ), утв. Генеральным директором Республиканского гособъединения «Белзооветспабпром» и начальником ГУВ Республики Беларусь.

Исключение инъекций антигена в половинной дозе позволило уменьшить расход его на 600 л, дополнительно провести 10 крово-взятий п получить 56 ООО л сыворотки в год. В денежном -выражении стоимость сэкономленного антигена и полученной сыворотки составила 22 млрд. 480 млн. белорусских рублей из расчета на 1000 продуцентов (в ценах 1997 года).

Внутрибрюшинное введение антигена сократило расход его в 22 раза — экономия денежных средств составила 240 млн. бела-русских рублей в год.

Взятие крови из расчета 17 см3 на 1 кг массы вола позволила получить дополнительно в год 12 000 л сыворотки, стоимость которой составляет 4 млрд. 800 млн. беларусских рублей.

Применение содо-солевого раствора для повышения выхода сыворотки из плазмы дает возможность получить дополнительно только от одного крововзятия 270 л сыворотки, стоимость которой составляет 5 млн. рублей.

П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на Витебской биофабрике и в лаборатории контроля и стандартизации коли-сальмонеллезных и лептоспироз-ных препаратов ВГНКИ.

В работе использованы штаммы:

— сА<? 370;

— ¿/к^с&с- 373;

— 371; ¿г г £ о-/^г 372 ;

В экспериментах Применялись питательные среды:

— бульон Хотннгера но ГОСТ 29730-75;

— мясо-ИептОиный агар по ТУ 46-12-252-78;

— мясо-пептонный печеночный бульон с кусочками печени под вазелиновым маслом (среда Китт-Тароцци);

— полужидкий мясо-пептонный агар с 0,2-0,3%-ным содержанием агар-агара;

— дифференцнйльно^диагностические среды Эндро и Плоски-рева (плотные);

— среда Сабуро;

— среда Гнсса с индикатором Андрэдэ с сахарамн, глюкозн-дами и многоатомными спиртами.

В работе использовали оборудование Витебской биофабрнкн и ВГНК.И: реакторы для выращивания сальмонелл производственные термостаты, холодильники, микроскопы биологические мби-1, МбИ-2, гемометры Сали, камеру Горяева, термометры, предметные и покровные стекла, пробирки, шприцы, иглы, пипетки, краски и т. д.

В исследованиях было задействовано 580 волов, 530 морских свинок, 10240 мышей, 391 теленок, 1500 поросят.

Штаммы микроорганизмов получили из ВГНКИ с паспортами, в которых дана характеристика их биологических свойств.

Вирулентность сальмонелл определяли по величине 50%-ной летальной дозы для белых Мышей.

Антиген готовили реакторным способом. Волов гиперпммунн-зпровалп но различным схемам. В зависимости от задач исследований применяли иодкожИый, 1зйутрпвеннын, внутрпбрюшннный, внутримышечный способы инъекций, используя антиген различной концентрации. Антиген применяли в возрастающих дозах и вводили в различные места тела животного с интервалом от 4 до 12 суток.

В процессе гнпериммунИзацип у волов брали кровь, определяли количество гемоглобина, лейкоцитов, эритроцитов и изучали ее агглютинирующую и превентивную активность.

Агглютинирующую активность сыворотки определяли в РА.

Превентивную активность сыворотки изучали на морских свинках, голубях, белых мышах, телятах, поросятах

Величину 50%-пой пмкунизируюЩей дозы сыворотки для животных расчитывали по Керберу и Ашмарнну.

Количественное, определение иммуноглобулинов проводи;т но Манчини.

Содержание липндов в сыворотке определяли с помощью на-эра химических реактивов.

В работе использованы бактериологические, серологические и юхимические методы исследования, изложенные подробно в дис-фтацни в разделе «Собственные исследования».

III. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА КОНТРОЛЯ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ

I. Оценка применяемого метода контроля активности сыворотки

Активность сыворотки в отношении ¿'¿урЛг'уц**-

£ контролируют на морских свин-нх, а х — на голубях. Свинкам сыворотку

юдят подкожно в дозах: 0,25; 0,5 и 1,0 см3, используя па дозу двух ивотпых. Голубям препарат вводят внутримышечно в дозах 0,5 1,0 см3. На дозу берут трех голубей. Через 24 часа свинок и голу-;й заражают смертельной дозой сальмонелл соответствующего ■ровара. Одновременно заражают контрольных свинок и голубей 1е иммунизированных), по трое к каждому серовару сальмонелл, ыворотку признают активной, если из шести иммунизированных ¡инок и голубей выживают не менее четырех при гибели не менее зух контрольных. Данный метод, регламен т и р о в а н н ы й У 40-21-45-74, применяют для определения активности сыворотки 1ждой производственной серии. Чтобы судить об объективности вменяемого метода, мы провели определение активности 38 се-ш сыворотки с последующим анализом полученных данных. Ока-1лось что применяемый метод не позволяет объективно судить 5 уровне защиты лабораторных животных от сальмонелл. Связа-) это с тем, что при проверке активности препарата испытывают : более трех доз его и па дозу используют два-три подопытных (и но к и голубей. К тому же, голуби и морские свинки весьма ус-шчивы к сальмонеллам. Так, смертельная доза сальмонелл для мубей составляет 1,5-2 млрд., морских евннок — 4-5 млрд. мик-)бных тел. Кроме того, нами установлено, что нормальная сыво-)тка кровн волов обладает защитными свойствами и в дозе 1,0 см3 )едохраняет от гибели 3—4 свинок и голубей из 10, взятых в опыт, еобходимо отметить, что голуби и морские свинки могут быть :твественно устойчивыми к сальмонеллам..

Все это свидетельствует, что узаконенный метод контроля ак-[вностн сыворотки не позволяет объективно оценивать истинную дмуногенность препарата и дает только ориентировочное пред-авленпе о его качестве.

Поэтому мы решили разработать более объективный мете контроля активности сыворотки.

1.2. Предложенный ме.тод контроля иммуногенпости препарата

Для контроля активности нами были использованы белые М1 ши. Достоверность результатов контроля не ниже 95% (имеет мест' когда нммуногенпость проверяется не менее, чем на 10 жнвотпь при условии, что 8 из 10 иммунизированных выживают, а 8 из 1 контрольных гибнут.

С учетом этого, нами подобрана доза сыворотки, которая обе-печила выживание не менее 8 из 10 иммунизированных мыше при гибели 8—10 контрольных. Такой результат был получен пр иммунизации сывороткой в дозе 0,004 см3.

Затем мы исследовали иммуногепность сыворотки 11 произвол ственных серий. Было установлено, что сыворотка 10 серий обл; дает достаточно выраженной иммупогенной активностью п заии щает от гибели 80% иммунизированных при падеже 80 — 100% мь шей в контроле. Сыворотка одной серии (№ 214) оказалась не а! тивной, т. к. защищала от падежа пз 10 мышей только 4—6 ос( бей. При этом необходимо отметить, что сыворотка серии № 21 при исследовании узаконенным методом признана активной.

Нами в остром опыте была проконтролирована сыворотка с( рии №№ 214, 216 и 3-х проб препарата серии № 217. Сыворотку с< рин № 217 разводили стерильным физраствором, который добавл5 ли в количестве 20% (проба № 1), 30% (проба № 2), 40% (проб № 3) к объему препарата.

В результате установлено, что сыворотка серии № 216 запц щает от падежа 80—90% мышей, серии № 214 — 40—60%, а ра: веденная физраствором сыворотка серии № 217: проба №№ 1,240—60%, проба № 3 — 30—4.0% особей. '

Таким образом, метод контроля активности сыворотки на б< лых мышах с использованием одной дозы (0,004 см3), которая Я1 ляется своеобразной тест-пробой, позволяет достаточно эффектш но выявлять не иммунногенный препарат.

В «Инструкцию по изготовлению и контролю поливалентно антитоксической сыворотки против паратифа телят, поросят, ягня' овец п птиц» памп внесены дополнения, предусматривающие кон; роль активности сыворотки на белых мышах, утв. ГУВ РБ 19. 0 1993 г.

2. НЛШУННЫЯ ОТВЕТ ОРГАНИЗМА ВОЛОВ НА САЛ ЬМОНЕЛЛЕЗНЫЙ АНТИГЕН

2.1. Агглютинирующая и превентивная активность сыворотки крови волов в процессе гипернммуннзации

Сыворотку получали от 20 волов, гнперпммуипзированиых по рипятон схеме. Титр агглютининов определяли после 2, 4, 6, 8, 10, 2-ой инъекций антигена.

В результате установлено, что накопление антител для одно-менной стадии гипернммуннзации в отношении всех четырех се-оваров сальмонелл характеризуется одинаковой величиной титра глготшпшов. Это свидетельствует об отсутствии конкуренции межу агглютииогенным действием серологически различающихся зльмонелл, входящих в состав поливалентного формолантигена.

Агглютинирующая активность сыворотки крови подопытных элов нарастает до 8-й инъекции антигена. Последующие инъекции г вели к подъему агглютинирующей активности сыворотки крови элов.

Превентивная активность сыворотки крови волов в отношении :ех сероваров сальмонелл также существенно не различается, апример, после двух инъекций антигена ИДю сыворотки состави-а в отношении ЛегЛ&еЪ'-г:«*^^-^¿¿г 0,181 ± 0,02 см3,

с^г^&ст-ъ од62±о.ооз см3-

162 ± 0,01 см3, -У.- 0,169 ± 0,002 см3,

ледовательно, совместное введение различных по антигенной •руктуре сальмонелл в организм животного вызывает равную по гепеии интенсивности реакцию на каждый серовар.

Превентивная активность сыворотки крови для голубей и бе-лх мышей нарастает по мере увеличения количества инъекций и эзы антигена. Например, после 2-й инъекции ИДг.о сыворотки для ышей в отношении ^«¿►'^»и составляет 0,162±0,01 см3, й — 0,164±0,02 см3, 6-й — 0,017± 0,02 см3, 8-й — 0,003±0,03 см3, )-п — 0,005 ±0,001 см3, 12-й — 0,006 ±0,002 см3, т. е. подъем уров-1 активности сыворотки крови волов наблюдается до 8-й инъек-ш антигена.

Такая же закономерность установлена в отношении ^сАоёк-ьлС-п ./*. л оъ/ V .Опытные

шные позволяют заключить, что следующие за 8-й инъекции ан-1гена не ведут к повышению активности сыворотки крови волов неоправданно удлиняют срок гипериммунизации.

2.2. Гематологические показатели гипериммунизируемых волов

Содержание гемоглобина в крови волов, подвергнутых гипе-шмуппзалшг, колеблется незначительно и практически остается I том же уровне, что и до введения антигена (9,0±0,1 мг%).

В процессе гиперпммунпзацип волос, несмотря на увеличен! доз антигена и краткости его введения, количество эритроцитов I меняется.

Количество палочкоядерных лейкоцитов нарастает в процесс гипериммупнзацин и после седьмой инъекции достигает 15,1 ± млн/мкл, а затем после восьмой падает до 7,7±0,7 млп.'мкл. Ра: пица в количестве этих форм лейкоцитов между седьмой, девято и десятой инъекциями антигена недостоверна (Р>0,05). Поел! дующие инъекции (11-я и 12-я) вызывают увеличение палоикояде} пых лейкоцитов в крови волов (Р<0,05).

Содержание сегментоядерных лейкоцитов не меняется до пи стой инъекции включительно, а затем до конца гипериммуннзацн достоверно снижается (Р<0,05).

Количество эозннофнлов в процессе гипериммунизации увел! чивается и после шестой инъекции составляет 9,7+0,5% проти 4,7+0,4% с начала гипериммунизации.

Содержание базофплов в крови после первой инъекции антнп на увеличивается с 0,2 + 0,01%. затем наблюдается спплсение их кс личества до восьмой инъекции, а каждая следующая инъекция вс дет к уменьшению этих форм лейкоцитов па 0,1%.

Содержимое ,моноцитов в крови волов постепенно нарастае вплоть до шестой ппъекцин. Седьмая и восьмая инъекции вызывг ют снижение содержания их с 4,2 + 0,1% до 1,0 + 0,2% и 1,7+0,3» Затем, количество моноцитов остается до конца гнперпммунизацн па одном уровне.

Количество лимфоцитов достигает максимального значенн после восьмикратного введения антигена, а затем их содержани существенно не меняется до конца цикла гипериммунизации. Нам зафиксирован подъем уровня Т-клеток после 2-й, 7-й п 10-й пит екций антигена.

Количество В-лпмфоцитов в крови гнперпммунизнрованпы волов нарастает от инъекции к инъекции и достигает макспма.и ной величины (32%) после 7-кратного подкожного введения аитн гена животным.

Таким образом, морфологический состав крови у волов евнде тельствует о значительной реактивности организма волов па 7-краг мое парентеральное введение ннактивированных сальмонелл.

После седьмой инъекции гематологические показатели не ука зывают на возрастающую реактивность организма волов, что мс жет быть связано с многократностью введения антигена и угпете пнем органов кровотворения большими дозами его.

2.3. Белковый спектр сыворотки крови волов в процессе гипериммунизации

Установлено, что по мере увеличения числа инъекций антиге-а и его дозы, количество альбуминов в сыворотке крови волов снимется (с 38,6% до 18,8%), а содержание гамма-глобулинов увенчивается (с 5,9% до 14,1%). Снижение содержания альбуминов ггистрируется до 6-й инъекции антигена, а нарастание количества шма-глобулипов — до 8-й инъекции антигена.

Содержание альфа- и бета-глобулинов в сыворотке крови во-эв в процессе гипериммуннзации изменяется незначительно и ос-зется, примерно, на одном уровне (Р>0,05).

2.4. Содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови гипериммунизированных волов

В опыт было взято 12 здоровых волов массой 380—400 кг, ко-зрых гипериммунизировали по схеме, предусмотренной действующи инструкцией. Концентрацию иммуноглобулинов в сыворотке эови определяли после каждой инъекции антигена.

Максимальное накопление иммуноглобулинов ¿7/

ггистрируется после 2-й (13,9 + 0,2 мг/см3), 6-й (14,9 + 0,3 мг/см3) и 3-й (16,8+0,2 мг/см3) инъекций антигена, т. е. на 9-й, 20-й и 45-й ш от начала гпперпммунизации.

В отношении Ьа наблюдается несколько иной ха-

дктер изменений его концентрации в сыворотке крови гиперимму-изируемых животных. Так, содержание Я и в сыворотке

товн волов после 1,2, 3, 4 и 5-й инъекции не меняется и только я инъекция антигена в дозе 50 см3 вызывает увеличение концент-щни их до 14,0 мг/см3. Последующие инъекции антигена сущест-;нио пе влияют на содержание в сыворотке крови жи-

зтных.

Содержание иммуноглобулинов класса в сыворот-

з крови волов практически не меняется от инъекции к инъекции, сключением является увеличение концентрации в сы-

)ротке крови волов после 2-й инъекции. Видимо, повторное вве-вние антигена в дозе 17 см3 оказывает такое воздействие па орга-

иммунной системы, которое является наиболее адекватным в тане выработки иммуноглобулинов этого класса.

2.5. Влияние дозы и места введения антигена на активность получаемой от волов сыворотки

С целыо изучения влияния дозы антигена и места его введения з активность получаемой от волов сыворотки мы гипериммунизи-звали 7 групп животных по 10 в каждой. Волов первой группы дмуинзировали в соответствии с действующей инструкцией. Эта >уппа волов служила в качестве контроля. Волов второй группы шериммунизировали антигеном в дозах от 8 до 120 см3, третьей—

от 4 до 60 см3, четвертой — от 16 до 240 см3. Волам пятой групш антиген вводили в область шеи, шестой — в боковую грудную ой ласть, седьмой — в боковую грудную область и шею. Антиген шгь ецпровали не менее,-чем в три точки каждой из упомянутых об ластей, поочередно с двух сторон туловища и шеи. Инъекции ап тпгепа проводили подкожно и с интервалами, предусмотренным действующей инструкцией. Гииернммунпзацшо волов этих груп; проводили с целью изучения влияния различных зон введения ап тпгепа па активность получаемой сыворотки. Проведенная работ, позволила установить, что титр агглютининов сыворотки крови во лов контрольной группы составил 1:1600±217 ко всем сальмоиел лам. Такой же агглютинирующей активностью характеризуете: сыворотка крови волов 2, 3, 6 и 7 групп. И только сыворотка кров! волов 4 и 5 групп оказалась несколько активнее, т. е. титр агглюти иинов составил ко всем сальмонеллам 1:3200±180. В эксперимент! на голубях и белых мышах было установлено, что наиболее актив нон для упомянутых подопытных оказалась сыворотка крови от во лов 4 и 5 групп. ИД50 сыворотки от волов этих групп составила I среднем в отношении всех сальмонелл 0,01 ±0,001 см3, в то врем; как ИД50 сыворотки от волов остальных опытных групп составил; 0,018 + 0,002 см3. Таким образом, более интенсивный пммуппын от вет вызывал сальмонеллезный антиген в дозах от 16 до 240 см3, ; наиболее реактогенной зоной введения его оказалась шея живот ного.

2.6. Выбор интервалов между инъекциями антигена при получении гипериммунной сыворотки

Одним из факторов, обеспечивающим получение активной сы воротки, являются оптимальные интервалы между введениями ап тпгепа. В этой связи, мы провели гппериммупизацию двух груш волов по 10 голов в каждой. Животных обеих групп гиперпммунн знровалн по существующей схеме с той лишь разницей, что вола?> второй группы антиген вводили с интервалом 10—12 сугок. Сыво ротка, полученная от волов опытных групп, оказалась равнознач ной но аглютинирующей активности (титр 1:1600 + 180). При нзу чении превентивной активности сыворотки по величине ИД5о длз белых мышей и голубей было выявлено, что сыворотка от воло! второй опытной группы активнее сыворотки, полученной от живот ных первой группы. ИДг,о сыворотки от волов первой группы соста вила в отношении -Л 0,015±0,002 см3

¡¿.¿урАгьюс*.еаЛгг-*»-» 0,018±0,003 СМ3| -Г.¿г¿^Л' 0,021 ±0,003 см3, а второй группы соответственно 0,01 ±0,001 см3 0,011 ±0,002 см3, 0,009±0,001 см3, 0,012±0,001 см3. Следовательно гипернммунизацня волов с интервалом между инъекциями антиге на в 11 —12 суток позволяет получить от них более активную сыво ротку, чем с интервалом в 4—5 суток.

2.7. Активность сыворотки от продуцентов разного возраста и сроков эксплуатации

Нами изучена агглютинирующая и превентивная активность сыворотки от II групп продуцентов разного возраста н срока эксплуатации. Было установлено, что титр антител ко Ьсем четырем сероварам сальмонелл нарастает с увеличением сроков эксплуатации продуцентов и достигает максимальной величины в сыворотке, полученной от волов, эксплуатировавшихся в течение 5 лет (1:3200+172). Дальнейшая эксплуатация волов постепенно ведет к снижению титра агглютининов в сыворотке их крови. Примерно, такая же закономерность наблюдается в отношении превентивной активности сыворотки крови эксплуатируемых продуцентов, т. е. наиболее активную сыворотку продуцируют животные в течение пяти лет эксплуатации (ИДоо сыворотки в среднем составляет для лабораторных животных 0,010+0,001 см3). Активную сыворотку можно получать в течение 9 лет. Однако, по истечении пятилетнего срока эксплуатации регистрируется значительный отход и выбраковка животных. Поэтому разработка и внедрение в сывороточное производство более щадящего режима эксплуатации — важная задача.

3. РАЦИОНАЛИЗАЦИЯ ПРОИЗВОДСТВА ГИПЕРИММУННОЙ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ

3.1. Отбор волов-продуцентов для производства сыворотки

Отбор волов для производства сыворотки ведут с учетом их развития, массы, возраста, породы, состояния здоровья и т. д. Недостатком такого отбора является отсутствие оценки реактогенно-:тн животных к сальмонеллам. Мы провели работу, направленную на поиск способа прогностической оценки вола как будущего продуцента гарантированно активной сыворотки. В опыт было взято 33 вола, не подвергавшихся инъекции- сальмонеллезиым антигеном. Сыворотку крови каждого животного исследовали па наличие антител в РА. Из 93 волов у 65 титр антител составил 1:160—1:320, а у 28 — 1:20—1:80. Затем всех животных гипериммунпзировали. По окончании гипериммупизацпи исследовали агглютипнзирующую I превентивную активность сыворотки крови волов. Оказалось, ¡то животные с титром протпвосальмонеллезных агглютининов до чтерпмиуннзации 1:160—1:320 являются продуцентами более активной сыворотки, чем животные с титром 1:20—1:80. Так, 50%-ная шмупнзпрующая доза сыворотки, полученной от продуцентов с титром агглютининов до гппериммунизацнн 1:160—1:320 составила з отношении для голубей 0,012 + 0,001 см3,

г .к, для белых мышей 0,013±0,002 см3,

У, •¿^Ъъуъыъгъс-™*- 0,008 + 0,001 см3,

0,010±0,003 см3, в то время как активность сыворотки, полученной от продуцентов с титром агглютининов до гнпериммунизацпп 1:20— 1:80, равнялась 0,025±0,011 см3, 0,022±0,002 см3, 0,025±0,003 см3 и 0,026±0,004 см3, соответственно. Следовательно, отбор волов для производства сыворотки нужно вести не только по общему состоянию здоровья, но н по высоте титра антител в сыворотке крови их к сальмонеллам. На способ отбора волов-продуцентов протнвосаль-мопеллезпой сыворотки Госкомизобретеиий выдал нам авторское свидетельство № 1655979 от 15 февраля 1991 г. Этот способ прост и приемлем для бпопредприятий СНГ.

3.2. Разработка рационального способа гипериммунизации волов

Работа начата с изучения влияния различных способов введения антигена на активность получаемой от волов сыворотки. Наиболее быстрое и интенсивное нарастание титра агглютининов и уровня превентивной активности вызывал антиген при внутривенном введении. Менее интенсивный иммунный ответ наблюдали при внутрибрюшинном введении антигена. При внутривенных инъекциях волы реагировали на антиген полной потерей аппетита, угнетением, повышением температуры тела. После 2-3-кратпого введения антиген вызывал шок у 30% животных. При впутрнбрюшннном введении антигена у животных наблюдали незначительное угнетение, повышение температуры тела па 0,1—0,2°С, шоковых явлений не зарегистрировано. Затем были подобраны дозы антигена н интервалы между инъекциями его, которые обеспечили при впутрнбрюшннном способе гпперпммунпзации максимальное накопление антител в сыворотке крови волов при минимальном отрицательном воздействии инъекций на общее состояние животных. Исходя пз экспериментальных данных, мы предложили для внедрения в практику способ гнпериммупизации волов, представленный в табл. 1.

На данный способ получения гипериммунной сыворотки против сальмонеллеза нам выдано авторское свидетельство за № 1754114 от 15 апреля 1992 г. Этот способ внедрен в практику сывороточного производства, т. е. в «Инструкцию по изготовлению п контролю антитоксической поливалентной сыворотки против сальмонеллеза телят, поросят, ягнят, овец н птиц» внесены изменения, касающиеся гнперпммупнзации волов, утверждении ГУВ Минсельхозпрода Республики Беларусь от 19. 01. 93 г.

Таблица К

Способ гнпериммунизации полов

Инъекции Дни инъекций антигена Доза антигена Концентрация антигена |способ введения

1 1 2 10 млрд/см3 внутрибрюшинный

2 4 3 —»— —»—

3 9 4 —»— —»—

4 14 5 —»— —»—

5 18 6 —»— —»—

6 22 1 —»— —»—

7 26 10 _,,_ —»—

_ На 34-е сутки рабочее крововзятие

В процессе экспериментов при поиске рационального способа ппернммунизацнн волов было'замечено, что сальмонеллезный ан-'иген при внутрнбрюшннном введении вызывает эозинофилню у )0°/о гппернммунизпруемых животных. Затем мы установили, что :ыворотка крови от волов с высоким содержанием эозинофилов в раз активнее сыворотки, полученной от волов с физиологически юрмальиым содержанием в крови этих форм лейкоцитов. Так, -1Д50 сыворотки, полученной от волов с высоким содержанием эози-юфплов в крови (16—23%) составила в среднем в отношении всех :альмоиелл для лабораторных животных 0,003±0,001 см3, содер-каннем эозинофилов (6—7%) — 0,023 + 0,001 см3.

На основании проведенной опытной работы можно заключить, [то эозннофнлня у волов-продуцентов сыворотки является показателем уровня пммунореагировання организма на сальмонеллезный штиген.

3.3. Оптимизация режима эксплуатации волов-продуцентов сыворотки

В опыт взяли две группы продуцентов. Волов первой группы жсплуатнровали как предусмотрено действующей инструкцией, '. е. после каждого очередного крововзятня спустя двое-трое суток шъекцнровали антиген в половинной дозе, а спустя еще 4—6 суток ¡водили полную дозу антигена и на 7—8 сутки снова брали кровь I т. д. Такая жесткая эксплуатация отрицательно сказывается на )бщем состоянии здоровья продуцентов.

Волам второй группы половинную дозу антигена не вводили, а :пустя 4—5 суток инъецировали антиген в полной дозе. От проду-[ептов опытных групп брали кровь, получали сыворотку и иссле-ювали ее активность. В результате установили, что можно полу-

чать активную сыворотку, ннъекдируя антиген продуцентам в пол ной дозе, исключив инъекции антигена в половинной дозе. Так, например, титр антител сыворотки, полученной от волов II группы г отношении -6',

составил через б месяцев после начала эксперимента 1:800±!50 год — 1:1600±217, 1,5 года,— 1:1600±380, 2 года — 1:1600 = 217. а сыворотки от волов 1 группы 1:1600±380, 1:1600±250, 1:1600*350 1:1600±380, соответственно. Величина 50%-ной иммунизирующей дозы сыворотки, полученной от волов II группы, составила ь ¿2Лгл' спустя 6 месяцев с начала опыта

0,013±0,02 см3, ГОД — 0,010±0,001 см3, 1,5 года — 0,012±0,003 см3, 2 года — 0,010*0,001 см3, а сыворотки от продуцентов I группы — 0,011 ±0,001 см3, 0,012±0,001 см3, 0,013±0,002 см3, 0,013*0,003 см3 соответственно. Примерно, такими же данными, характеризуется агглютинирующая и превентивная активность сыворотки, полученной от волов I и II групп, по отношению к другим сальмонеллам.

Исключение инъекций антигена в половинной дозе уменьшает его расход, облегчает производство препарата и способствует сохранности поголовья.

Предложенные нами изменения, касающиеся режима эксплуатации волов-продуцентов, были утверждены ГУВ МСХ СССР 13 февраля 1990 г. и внедрены в практику изготовления препарата на всех биопредприятиях бывшего СССР. Режим эксплуатации продуцентов предусматривает не только их иммунизацию, но и взятие крови не менее, чем два раза в месяц из расчета 16 см3 па 1 кг живой массы, т. е. количество забираемой крови не превышает 1,6% общей массы тела животного. Эта норма взятия крови не исчерпывает физиологические возможности организма. Достаточно отметить, что содержание крови у крупного рогатого скота составляет 8% массы животного. К тому же, предложенный нами режим иммунизации до некоторой степени избавляет организм от напряженных функциональных нагрузок, что позволяет, на наш взгляд, увеличить предусмотренную инструкцией норму взятия крови. Для подтверждения этого мы провели опыт, в котором использовали две группы волов. Первую группу продуцентов эксплуатировали как предусмотрено инструкцией, вторую в соответствии с разработанным нами режимом иммунизации. У продуцентов первой группы кровь бралн из расчета 16 см3, второй — 17 см3 па кг массы животного. Продуцентов обеих групп эксплуатировали в течение 5 лет. В процессе эксплуатации оценивали общее состояние здоровья волов, проводили диагностические и лечебные мероприятия. Результаты опытной работы позволили нам предложить следующий режим эксплуатации. Рабочее крововзятпе от волов проводить из

расчета 17 см3 на 1 кг массы продуцента. После взятия крови на 3-4 сутки волам внутрпбрюшнпно вводить антиген в дозе 10 см3 па голову п па 7-8 сутки брать кровь. Затем, спустя 3-4 суток снова вводить антиген и па 7-8 сутки проводить крововзятие и т. д. Данный режим эксплуатации введен в новую «Инструкцию'по изготовлению п контролю сыворотки против сальмонеллеза животных», утв. ГУВ Минсельхозпрода РБ 29 августа 1996 г.

3.4. Повышение выхода сыворотки из крови продуцентов

Сыворотку против сальмонеллеза животных готовят из крови полов-продуцентов. Кровь сепарируют, дефнбрннпруют и получают плазму. Выход плазмы из крови составляет 72—74%. Количество вырабатываемого полуфабриката сыворотки находится в прямой зависимости от объема получаемой плазмы. Поэтому для увеличения процента выхода плазмы из крови продуцентов мы решили использовать содо-солевой раствор. Солевой раствор готовили 6,6%-иой, а содовый — 10%-ной концентрации на дистиллированной воде. Оба раствора смешивали в соотношении 1:1 и смесь стерилизовали в автоклаве при 1,5 ат.м в течение 30 минут. Из одинакового количества крови приготовили четыре серии сыворотки (№№ 173, 174, 175, 176). Все серии были приготовлены в соответствии с требованиями действующей инструкции, с той лишь разницей, что на 1 литр сыворотки, предназначенной для изготовления серий №№ 175, 176, добавляли 15 см3 содо-солевого раствора. В результате применения содо-солевого раствора нам уда.'¡ось повысить выход плазмы крови на 4,5%- Выход плазмы из крови, к которой не добавляли раствор (серии №№ 173, 174) составил 72,5%. а пз крови, в которую добавили раствор—77% (серии №№ 175, 176). Манипуляции по приготовлению и применению раствора просты и доступны в условиях промышленного производства сыворотки. Применение содо-солевого раствора в серийном производстве препарата позволит увеличить объем выпускаемой продукции без увеличения поголовья продуцентов.

3.5. Консервация сыворотки

Для консервации биопрепаратов используют различные вещества:' формалин, хинозол, борную кислоту, мертнолят и т. д.

Сыворотку против сальмонеллеза животных, как и большинство гипернммунных сывороток, консервируют чаще всего фенолом в форме раствора 5%-ной концентрации, который добавляют пз расчета 10 см3 па 90 см3 сыворотки. Этот способ консервации имеет существенные недостатки: раствор фенола разбавляет сыворотку на 10% и тем самым уменьшает концентрацию протпвосальмопел-лезных антител в препарате, к тому же фенол обладает раздражающим действием. Поэтому мы решили заменить фенол другим консервантом.

Наиболее подходящим для консервации сыворотки, по результатам наших опытов, оказался водный раствор димерэтнлеипмипа (ДЭИ).

В биологической промышленности ДЭИ применяют для инактивации вирусного генома при получении ннактивировошшх вакцин (против ящура, болезни Ныокасла и т. д.).

Для выбора минимальной консервирующей дозы ДЭИ, его добавляли к сыворотке из расчета 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4%. Раствор ДЭИ надежно консервирует сыворотку в концентрации 0,1%, что обеспечивает ее стерильность, а также длительное сохранение ее первоначальных свойств. Такое малое количество консерванта практически не разбавляет сыворотку и не снижает в ней концентрации специфических иммуноглобулинов.

Для производственной проверки предлагаемого нами способа консервации к 2100-л сыворотки добавили 0,1% ДЭИ. Консервированная ДЭИ сыворотка была подвергнута комиссионному контролю и признана стернлыюи, безвредной, активной. По своим физико-химическим и биологическим показателям отвечала требованиям ТУ 46-21-45-74.

Комиссионной проверкой установлено, что предложенный способ консервации сыворотки является эффективным, простым и приемлемым для сывороточного производства.

Госкомпзобретений выдал нам авторское свидетельство от 1. 08. 1992 г. за № 1777886 на изобретение: «Способ консервации сыворотки против сальмонеллеза животных».

3.6. Осветление сыворотки и сокращение продолжительности ее отстоя

Промышленная технология изготовления сыворотки предусматривает 2-месячный отстой ее, в течение которого выпадают в осадок нестойкие белки, что улучшает товарный вид препарата и его качество. Однако, длительный срок отстоя снижает эффективность использования производственного оборудования и повышает вероятность обсеменения сыворотки микроорганизмами, задерживает поставку препарата потребителям.

Поэтому мы поставили цель — найти приемлемый для производства способ осветления сыворотки.

Поставленная цель была достигнута следующим образом.

В сыворотку при включенной мешалке добавляли 0,2% порошкообразного дезмола. Мешалку оставляли работающе!! 10—15 мни. для растворения вещества в сыворотке. Затем сыворотку отстаивали 10—15 суток. Дезмол интенсифицирует естественный процесс выпадения осадка, что осветляет сыворотку. После удаления осадка сыворотку подвергали стерилизующей фильтрации.

С применением дезмола было приготовлено 25 промышленных серии сыворотки (№№ 193—217), изготовленных в июле-декабре 1988 г.

Все опытио-производственные серии сыворотки были подвергнуты государственному контролю на стерильность, безвредность, активность методами, предусмотренными ТУ 46-21-45-74. Установлено, что сыворотка всех 25 опытно-производственных серии, приготовленная с применением дезмола, отвечала требованиям НТД, была пригодна к практическому применению и реализована потребителям.

Следовательно, применение дезмола позволяет интенсифицировать естественный процесс выпадения осадка, осветлить сыворотку и сократит!) срок отстоя с 60 до 10—15 суток.

Госкомнзобретеннй выдал авторское свидетельство па изобретение «Способ осветления гипернммуннон сыворотки против саль-монеллеза» за № 1637088 от 2.2 ноября 1990 г. и патент № 1793929, зарег. в Гос. реестре пзобр. СССР 8 октября 1992 г.

3.7. Способ освобождения сыворотки от липидов

В состав сыворотки входит множество компонентов, к числу которых относятся и липпды. Содержание их в сыворотке достигает 3,8—4,0 г/л. Липпды пе отвечают за активность препарата и являются балластом. Поэтому удаление их из сыворотки — важная фактическая задача. В этой связи нами проведена следующая ра-Зота. К сыворотке (серия № 226) добавили и растворили в ней ),1% «Вид А» в порошкообразном состоянии. По истечении срока этетоя, из сыворотки удаляли верхний слой и осадок, подвергали ¡шльтяации, расфасовке, проверке на стерильность, активность, )езвредпость.

Препарат серии № 226 был признан по результатам контроля перильным, безвредным, активным.

До обработки сыворотки серии № 226 «Вид А» в ней содержа-юсь 2,33+0,04 г/л липидов. После обработки, отстоя и фильтрации :ывороткп в готовом препарате содержание липидов снизилось до ),33+0,1 г/л, в то время как в готовом препарате серии № 225 (конт->оль) их содержание составило 2,12 + 0,02 г/л.

«Вид А» относится к поверхностно-активным веществам и притеняется в молочной промышленности в качестве моющего сред-тва. Это порошок белого цвета, в состав которого входят сульфа-юл, триполифосфат натрия, сода кальцинированная, сульфат пат->ня.

Предложенный способ удаления липидов прост и доступен для ывороточного производства, кроме этого «Вид А» интенсифнцн-ует процесс выпадения осадка, что осветляет сыворотку и сокращает срок ее отстоя с 60 до 7—10 суток.

4. ПОЛУЧЕНИЕ АССОЦИИРОВАННОМ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ САЛЫУЮНЕЛЛЕЗА И ДРУГИХ БОЛЕЗНЕЙ

Сальмопеллсз, пастереллез, парагрнпп-З. инфекционный рп-нотрахеит в большинстве случаев у молодняка крупного рогатого скота развиваются одновременно. Поэтому нами совместно с сотрудниками ВИЭВ, ВНИ и ТИБП, ВГНКИ апробирована возможность получения ассоциированной сыворотки против упомянутых болезней.

Для гппериммупизацип волов использовали сальмоиеллезный антиген нз штаммов J'. г « «п 371,

-Г.о^с* 373, пастереллезный из штаммов

/э. тыz -f^v*- 656, 8683, Т-80, ассоннированную

внрусвакцппу против парагрпппа-3 и инфекционного рпнотрахепта крупного рогатого скота. С целыо создания грунднммупнтета волам вводили подкожно, раздельно пастереллезный антиген в дозе 5—6 млрд., сальмоиеллезный — 7—8 млрд. м. т. и ассоциированную внрусвакцппу в дозе 2—3 см3. Через 21 сутки повторяли введение названных антигенов в дозах: 10—12 млрд. м. т. и 3—4 см3, соответственно.

Гппериммунпзацию волов пастереллезный антигеном проводили внутримышечно, с интервалом 2—3 суток в дозах от 20 до 400 млрд. м. т. Сальмоиеллезный антиген инъецировали подкожно, с тем же интервалом, в нарастающих дозах от 20 до 600 млрд. м. т. Каждым антигеном провели 10 инъекции.

Ассоциированную внрусвакцппу против парагриппа-3 и инфекционного рпнотрахепта вводили подкожно в дозе 3,9—4,1 см3 с интервалом 5—6 суток. Всего провели 5 инъекций.

Через 8 суток, после последней инъекции антигенов, брали кровь и получали сыворотку, активность которой определяли в РА, РИГА, РТГА.

Титр сыворотки к ¿Э г серовара «А» со-

ставил 1:2048, серовара «В» — 1:1024, серовара «Д» —■ 1:1024, к вирусу парагрпппа-3 — 1:16, инфекционного рпнотрахепта — 1:8, К Ji ¿у^Ъг юч'ъ.ъ'с* 1:3200, -Г? — 1:3200.

Приведенные данные свидетельствуют, что можно получить достаточно активную ассоциированную сыворотку против сальмонел-леза и других болезней бактериальной и вирусной природы.

Госкомизобретений выдал авторское свидетельство за № 1795582 на «Способ получения гипериммунной сыворотки против распнра-торных заболеваний крупного рогатого скота», зарег. в Гос. реестре пзобр. СССР 8 октября 1992 г.

5. ПОЛУЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ ИММУНОГЛОБУЛИНА ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗЛ ЖИВОТНЫХ

5.1. Получение иммуноглобулина

К сыворотке добавляли в порошкообразном виде 7—9% полп-этпленглпколя 115 (ПЭГ-115). После полного растворения вещества в сыворотке ее подвергали отстою в течение 24 часов . Выход осадка составлял 3,2—4,1 кг со 100 литров сыворотки. К белковому осадку добавляли стернлышй физраствор 1:2 и тщательно перемешивали с осадком для получения белковой пасты. Затем к nací с добавляли физраствор с таким расчетом, чтобы количество белка в разбавленной пасте не превышало 10—12%, т. е. получали нро-тпвосальмопеллезный иммуноглобулин.

Иммуноглобулин консервировали 5%-пым раствором фенола, добавляя его до концентрации фенола в препарате 0,5%. После этого препарат фильтровали через фпльтрпластпны марки «Ф» и «СФ», расфасовывали в стерильные флаконы, закрывали стерильными пробками, обкатывали алюминиевыми колпачками, подвергали биологическому контролю.

В результате проведенной работы предложена схема получения протпвосальмонеллезпого иммуноглобулина, которая включает следующие стадии.

1. Фракционирование сыворотки.

2. Отстой сыворотки, получение осадка.

3. Декантация надосадочнон жидкости.

4. Растворение белкового осадка, получение белковой пасты.

5. Получение раствора иммуноглобулина, его консервация.

6. Получение стерильного препарата: префильтрация, стерилизующая фильтрация.

7. Расфасовка препарата и его этнкетнровапис.

8. Хнмпко-бпологическнп контроль иммуноглобулина.

Схема получения иммуноглобулина перспективна для внедрения в производство.

5. 2. Контроль протпвосальмонеллезпого иммуноглобулина

Нами была предусмотрена проверка стерильности, безвредности, активности и физико-химических свойств иммуноглобулина.

От опытных серий 1, 2) было отобрано по 4 флакона пре-

парата.

Иммуноглобулин высевали по 0,2—0,3 см3 из каждого флакона в пробирки с МПЛ, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом, со средой Сабуро и по 1—2 см3 во флаконы с МПБ и средой Кнтт-Тароц-цн.

Посевы культивировали при 37—38°С, а со средой Сабуро при 20—24°С в течение 10 суток. Препарат считали стерильным в случае отсутствия роста па всех питательных средах.

Для испытания на безвредность использовали общую пробу препарата из 4 флаконов. Иммуноглобулин вводили подкожно 5 белым мышам массой 16—18 г по 0,5 см3 и 3 морским свинкам массой 350—380 г по 10 см3. Препарат считали безвредным, если псе животные в течение 10 суток оставались здоровыми.

Концентрация водородных ионов в препарате — 7,0—7,2, массовая доля белка 10,1 —11,0+1,1%, массовая доля ПЭГ—2,9—3,0%■

Превентивную активность протпвосальмопеллезного иммуноглобулина определяли для голубей и белых мышей.

В предварительных опытах была найдена ЛД5о сальмонелл и количество 50%-ных летальных доз их для голубей и мышей.

Иммунизацию голубей и мышей проводили препаратом, начиная с дозы 0,1 см3 с 5-кратным шагом разведения. Только при таком шаге разведения дозы препарата были подобраны так, что в опытах наблюдали прямую зависимость между дозой и числом выживших голубей и мышей, что позволило обсчитать результаты опытов по методу Кербера в модификации Лшмарпна.

Иммуноглобулин вводили голубям в дозах: 0,1; 0,02; 0,004, 0,008 и 0,00016 см3 внутримышечно. В этих же дозах препарат вводили мышам, но только подкожно. Через 2—3 часа голубей и мышей заражали ЗЛДбо сальмонелл соответствующего серовара. В качестве контроля служили не иммунизированные голуби (5) и мыши (10) в отношении каждого серовара сальмонелл {s.cU^^^c^-j? еяёьс Л?, / г-v^ JY ¿t ¿V * sj.

Оценку активности иммуноглобулина Ii исходной сыворотки, взятой для его получения, проводили по величине ИД^о в параллельных опытах па голубях и белых мышах. Выло установлено, что по превентивной активности иммуноглобулин превосходит сыворотку, из которой получен, в 3 раза. Например, величина ИДзо препарата для голубей в отношении t^S

составила 0,006+0,001 см3, а сыворотки — 0,021 см3. То же самое можно отметить в отношении других сероваров сальмонелл.

6. ЛЕЧЕБНАЯ АКТИВНОСТЬ СЫВОРОТКИ ПРИ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САЛЬМОНЕЛЛЕЗЕ ТЕЛЯТ

Нами определена ИДзо сыворотки одной серии (№ 292) для телят, морских свинок и белых мышей.

В эксперименте использовано 32 теленка массой 35—40 кг в возрасте одного месяца.

По принципу аналогов сформировали восемь групп телят: в 1-й и 7-й по четыре, в 6-п — три теленка, 8-й пять. Каждому теленку первой группы ввели внутримышечно 100, второй — 80, третьей — 60, четвертой — 40, пятой — 20, шестой — 10 см3 сыворотки. Телятам седьмой группы препарат не вводили. Эта группа телят служила контрольной.

Спустя 3 часа после введения сыворотки всех телят 1, 2, 3, 4, 5, 6-й и 7-й групп заразили впутрпбрюшпнно смертельной дозой (80 млрд. м. т.)

Животным 8-и группы сыворотку вводили в дозах: 20, 40, 00, 80, 100 см3, используя по одному теленку па дозу. У телят этой группы брали кровь и исследовали агглютинирующую и превентивную активность сыворотки в отношении • •

У телят измеряли температуру тела, следили за приемом корма, воды, общим состоянием.

У павших п убитых по окончании эксперимента телят из сердца, легких, печени, почек, селезенки, желчного пузыря и брыжеечных лимфоузлов проводили выделение сальмонелл и их серологическую типизацию.

Было установлено, что препарат в дозе 100 см3 защищает от гибели всех телят, дозе 80 см3 — 3 нз 4-х животных, 40 см" — 1 из 4-х, 20 см3 — не предохраняет телят от падежа. В шестой группе телят, получивших по 10 см3 сыворотки, выжил один. В седьмой группе (контрольная) все телята пали. Следовательно, между выживаемостью животных п дозой введенной им сыворотки наблюдается прямая зависимость, что позволило рассчитать величину ИД™ для телят.

Затем, пятикратно, на морских свинках и белых, мышах мы определили ИД™ сыворотки серии № 292 для этих животных в отношении Л . Величина ИД:.» сыворотки составила для морских свинок 0,011+0,001 см3, белых мышей — 0,010+0,001 см3.

Зная величину 50%-ной иммунизирующей дозы сыворотки для телят и лабораторных животных, мы определили, что 2727 50%-пых доз препарата для морских свинок или 3000 50%-ных доз для белых мышей по иммуногенпой активности равнозначны 50%-поп дозе сыворотки для телят.

На обсеменепность органов телят оказала влияние доза сыворотки. -Л?не выделена из органов телят, получивших 100 см3 сыворотки, а получивших 80, 60, 40 см3 сальмонеллы упомянутого серовара выделены из органов, соответственно, одного, двух и трех телят. Обсемененными оказались органы всех телят, получивших 20 и 10 см3 сыворотки, а также контрольных животных.

Сыворотка крови телят паСснвпопммупизпрованних против сальмопеллеза (8 группа), получивших 100, 80, 60, 40 см3 препарата,' агглютинировала сальмонеллы в титре 1:100 па 1,2, 3, 4, 5, С-, 7 сутки с момента введения лечебной сыворотки.

Изучая превентивную активность сыворотки крови телят, пас-сивионммунизпрованных против сальмопеллеза, было установлено, что между дозой препарата, введенного телятам, н степенью зашиты от гибели мышей, иммунизированных сывороткой крови теля г, наблюдается прямая зависимость. Так, сыворотка крови телят, полученная от них па пятый день после введения препарата в дозе 100 см3, предохраняет от падежа 7—10 мышей из 20, взятых в опыт, в дозе 80 см3 — 7, в дозе 60 см3 — не более 5.

Экспериментальная работа, выполненная на телятах и лабораторных животных, открывает возможность дозирования сыворотки телятам в зависимости от ее активности для морских сг.ннок и мышей.

7. ПРОФИЛАКТИЧЕСКАЯ И ЛЕЧЕБНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ СЫВОРОТКИ И ИММУНОГЛОБУЛИНА ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ

Профилактическую и лечебную эффективность сыворотки и иммуноглобулина изучали на 356 телятах и 1500 поросятах.

Телятам (опытная группа — 128 голов) сыворотку вводили внутримышечно с профилактической целыо в дозе 10 см3. В этой группе заболело 16, в контрольной группе (не иммунизированные — 128 голов) — 32 животных. Больных телят опытной и контрольной групп лечили сывороткой. Препарат вводили внутримышечно в дозе 45—50 см3 с интервалом 8—12 часов. В опытной группе пал одни теленок, в контрольной — четыре. И все же результаты опыта свидетельствуют о высокой профилактической (87,5%) и лечебной (85,9%) эффективности сыворотки для телят.

Специфический иммуноглобулин телятам вводили с профилактической целыо в дозе 4 см3 внутримышечно. Препаратом было обработано 53 теленка. В этой группе заболел одни теленок. В контрольной (не иммунизированные) из 47 телят болезнь была зарегистрирована у трех голов. Больных телят лечили иммуноглобулином, который вводили внутримышечно в дозе 18—20 см3 через 8—12 часов. В результате лечения телята выздоровели. Профилактическая эффективность иммуноглобулина для телят составила 98,2%, а лечебная — 100%.

Поросятам сыворотку вводили с профилактической целью в дозе 20—25 см3, однократно, внутримышечно. Было иммунизировано 1500 голов, из числа которых болезнь зарегистрирована у 120 животных. Больным поросятам сыворотку инъецировали внутримышечно в дозе 30—45 см3, а тяжелобольным (30 голов) вводили

иммуноглобулин в дозе 10—15 см3. Препараты применяли с интервалом 8—12 часов.

Из 96 поросят, леченых сывороткой, 76 животных выздоровели, 14 — пали.

Иммуноглобулином вылечили 28 голов, 2 поросенка пали.

Результаты производственного опыта позволяют заключить, что для телят профилактическая эффективность сыворотки составляет 87,5%, а лечебная — 85,9%, для поросят — 92% и 84,5% соответственно.

Профилактическая эффективность иммуноглобулина для телят составляет 98,2%, лечебная — 100%.

Лечебная эффективность иммуноглобулина для поросят в нашем опыте составила 95,4%.

8. ВЫВОД Ы

1. Гнперпммунная сыворотка против сальмонеллсза животных в дозе 0,004 см3 профилактпрует гибель белых, мышей массой 18—20 г, зараженных 2—3 г^с

■¿".ег^а/-¿* 11 голубей, зараженных 4?, сЛ^^-!¿г&л*:*^

Для лечения телят массой 35—40 кг требуется 3000 мышиных доз такой сыворотки.

2. В процессе гппернммунпзацпи волов агглютинирующая активность сыворотки крови их нарастает до 7—8, а превентивная— до 10-й инъекций антигена. Последующие инъекции не повышают активность сыворотки.

3. Волы, ранее контактировавшие с сальмонеллами, потенциально являются более активными продуцентами пшернммупиои сыворотки, т. к. иммунологическая память организма животных интенсифицирует процесс образования антител, что проявляется повышением уровня их в крови.

4. Морфологический состав крови гипериммуиизпроваппых волов свидетельствует о значительной реактогенностн организма на 7-кратное парентеральное введение пнактивированных сальмонелл. Дальнейшие инъекции не вызывают изменений'гематологических показателей.

5. При подкожном способе введения антиген вызывает полный нмунный ответ в дозах от 16 до 240 см3 с интервалом между инъекциями в 11 —12 суток, а при внутрнбрюшпнном — в дозах от 2 до 10 см3 с интервалом 3—4 суток.

6. Предложен способ осветления сыворотки, заключающийся в добавлении к ней 0,1% порошкообразного препарата «Вид А», что снижает содержание липпдов в сыворотке с 2,46±0,02 до 0,56±0,01 г/л н позволяет сократить срок отстоя с 60 до 10—12 суток.

7. Консервация сыворотки водным раствором днмерэтнлеин-мииа (ДЭИ) обеспечивает ее стерильность и не снижает превентивной активности препарата.

8. Установлено, что сальмоиеллезный и пастереллезный антигены, парагрнппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота при одновременном введении в организм гппернммунн-знруемых волов вызывает иммунный ответ на каждый из них. обеспечивающий получение активной поливалентной гиперпммунной сыворотки.

9. Разработана промышленная технология получения сыворотки, включающая:

— отбор волов с учетом оценки реактогепности организма к сальмонеллам;

— антиген для гнпернммунизацпп готовят из 4 штаммов сальмонелл вместо 18;

— схема гнпериммунизацпп предусматривает 7 инъекций антигена вместо 22;

— антиген применяют в концентрации 10 млрд/см3 вместо 3 млрд/см3 микробных тел;

— способ введения антигена внутрнбрюшннный вместо подкожного;

— антиген вводят из расчета от 2 до 20 см3 па животное вместо 50—400 см3;

— отстой сыворотки сокращен с 60 до 10 суток.

10. Разработан метод контроля активности сыворотки на белых мышах и голубях, позволяющий выявлять препарат неактивных серий с достоверностью не ниже 95%.

. 11. Разработана технологическая схема производства протп-восальмопеллезного иммуноглобулина, включающая:

— фракционирование сыворотки, отстой ее и декантацию иад-осадочной жидкости;

— растворение белкового осадка и получение иммуноглобулина;

— консервацию препарата и его стерилизующую фильтрацию;

— расфасовку иммуноглобулина, его этикетировапне и биологический контроль.

12. Предложен способ контроля активности иммуноглобулина, редусматрнвающий:

— контроль препарата в отношении ^ Ж 1

¿¿г**, проводить на белых мышах, а в отно-

[ешш ¿'.с-Аое*'*** «г.*-«.^ V — на голубях;

— иммуноглобулин инъецировать мышам подкожно, голубям - внутримышечно в дозах: 0,1; 0,02; 0,004; 0,0008 и 0,00016 см3 нс-ользуя па дозу 5 особей;

— мышей и голубей заражать через 2—3 часа, после введения репарата 2—3 ЛД50 соответствующего серовара;

— препарат считать активным, если ИД50 для мышеи и голу-ей составит 0,004—0,0008 см3 при падеже не менее 8 из 10 особен в контроле.

9. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для контроля иммуногеНности сыворотки против сальмонел-еза животных в отношении Л?*»*, -?г г'л****^

в качестве лабораторной модели пс-ользовать белых мышей массой 18—20 г. При контроле активпо-ги препарата руководствоваться методикой, изложенной в допол-епип (утв. ГУВ РБ 19. 01. 1993 г.) к «Инструкции по нзготовле-шо н контролю антитоксической поливалентной сыворотки против аратифа телят, поросят, ягнят, овец и птиц» (утв. ГУВ МСХ СССР 1. 01. 1971 г.).

2. Отбор будущих волов-продуцентов для производства сыво-эткн проводить в хозяйствах не только с учетом физпологнческо-) состояния здоровья и результатов исследования животных па яфекцпонные и др. болезни, но и по величине титра противосаль-онеллезных агглютининов в сыворотке их крови (титр агглютн-пнов должен быть не ниже 1:160—1:320).

3. Гиперпммуннзнровать отобранных волов путем 7-кратного нутрибрюшннного введения сальмонеллезного формолаптпгеиа дозах от 2 до 10—20 см3 с интервалом 3—4 суток.

4. В процессе эксплуатации продуцентов антиген ипъецнро-зть впутрибрюшинно после каждого очередного взятия крови тустя 3—4 суток в дозе 10—20 сМ3 па животное.

5. В качестве адъюванта применять 10%-ный раствор хлорн--ого кальция, который'добавлять из расчета 0,2% к объему антична.

6. Для повышения выхода плазмы из крови добавлять на 1 ттр крови 15 см3 содо-солевого раствора.

7. Консервировать сыворотку водным раствором димерэтиль нимина, добавляя его в количестве 0,1% к объему препарата.

8. Вносить в сыворотку 0,1% порошкообразного веществ «Вид А», что способствует отделению липидов, осветлению препг рата и сокращению срока отстоя с 60 до 7—10 суток.

9. Использовать волов в качестве продуцентов активной сь Еороткп против сальмонеллеза животных в течение 9 лет.

10. Обеспечить ветеринарную практику сывороткой проти сальмонеллеза животных по качеству соответствующей требоваш ям «Инструкции по изготовлению и контролю сыворотки иротн сальмонеллеза животных» (утв. ГУВ РБ 29. 08. 96 г.) и техниче ских условий (ТУ РБ 000483033, утв. ГУВ РБ 30. 04. 96 г.).

11. Наладить промышленное производство противосальмоне.; лезпого иммуноглобулина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Медведев А. П. О гипериммунизацин волов для получепн антитоксической поливалентной сыворотки против сальмонеллез // Тр. ВГКНИ, М„ 1978, т. 26, с. 159.

2. Медведев А. П. Совершенствование схемы гиперпммуннз; цни волов продуцентов антитоксической поливалентной сыворотк против паратифа телят, поросят, ягнят, овец, птиц // Тезисы док. Всесоюзн. науч. конф., М., 1981, с. 100.

3. Медведев А. П. Использование аттенуированных штамме сальмонелл для гипериммунизации волов продуцентов антитока ческой поливалентной сыворотки против паратифа телят, порося ягнят, овец п птиц // Сб. науч. тр. ВГНК.И, М., 1981, с. 67-71.

4. Медведев А. П. Получение и контроль антитоксической пол! валентной сыворотки против сальмонеллеза телят, поросят, ягня овец п птпц. // Автореф. канд. дис. — Витебск, 1983; с. 24.

5. Медведев А. П. Контроль сыворотки против сальмонеллез животных. // Сб. научи, тр. ВГНКИ, 1986, с. 74-78.

6. Медведев А. П., Лазуко А. М. Сравнительная оценка актн: ности сыворотки против сальмонеллеза животных, полученной ( волов и быков. // Передовой научн.-произв. опыт в биологич. про; Экспресс-информация, № 6, 1987, с. 10-12.

7. Медведев А. П. Активность сыворотки против сальмонелл за животных, полученной по укороченному циклу гипериммуниз цни. // Передовой научн.-произв. опыт в биолог, пром. Экспрес информация, № 7, 1987, с. 10-14.

8. Медведев А. П. Получение сыворотки против сальмопеллеза животных путем гнпернммуиизации волов антигеном из сокращенного числа сальмонелл. // Тезисы докл. III Всесоюзп. конфер., М„ 1987, с. 253.

9. Медведев А. П. Применение некоторых адъювантов при получении сыворотки против сальмопеллеза животных. // Научи, основы пром. произв. ветер, биолог, препаратов. Тезисы докл. III Всесоюзп. конф., М., 1987, с. 253.

10. Зайцев В. В., Медведев А. П. Исследования по усовершеш ствованнго метода получения полисахаридного антигена сальмонелл. // Научные основы пром. произв. ветер, биолог, препаратов. Тезисы докл. III Всесоюзн. конфер. М., 1987, с. 71-73.

11. ¿Медведев А. П., Мурашко И. П. Получение специфического иммуноглобулина из сыворотки против сальмопеллеза животных. // Передовой науч.-произв. опыт в биолог, пром. Экспресс-информация, № 9, 1987, с. 8-10.

12. Медведев А. П., Рачинская Л. П., Косплкнна Л. С. Содержание кальция и фосфора в крови волов продуцентов поливалентной сыворотки против сальмопеллеза животных. // Передовой науч.-произв. опыт в биолог, пром. Экспресс-информация, 1987, .NM 0, с. 8—10.

13. Медведев А. П. Гипериммунизация волов-продуцентов антитоксической поливалентной сыворотки против сальмопеллеза телят, поросят, ягнят, овец и птиц. // Сбор, научи, тр. ВГНКИ, М., 1987, с. 108-109.

14. Медведев А. П. Сокращение продолжительности периода отстоя сыворотки против сальмопеллеза животных. // Матер. Всесоюзн. конф., Львов, 1988, с. 294-295.

15. Кирпиченок В. А., Медведев А. П. Испытание пирогепала и левомизола при вакцинации кроликов против сальмопеллеза. // Матер. Всесоюзп. конф., Львов, 1988, с. 279-280.

16. Медведев А. П. Лечебная активность для телят гипериммунной сыворотки против сальмопеллеза животных. // Разработка методов контроля биологических препаратов и диагностических средств. Сб. научи, тр. ВГНКИ, М„ 1989, с. 66-70,

17. Медведев А. П. Активность для телят гипернммунной сыворотки против сальмопеллеза животных. // Сбор, научи, трудов ВГНКИ. М, 1989, с. 96-100.

18. Медведев А. П. Совершенствование режима эксплуатации волов-продуцентов сыворотки против сальмопеллеза животных. // Проф. н меры борьбы с болези. молод, сельхоз живот. — Витебск, 1990, с. 50-51.

19. Медведев Л. П. Активность сыворотки против сальмонелле-За животных, получаемой от волов-продуцентов разных сроков эксплуатации. // Ветеринарная наука — производству. Межвед. сб. вып. 28, Минск, «Ураджай», 1990, с. 68-71.

20. Медведев А. П. Способ осветления гпперпммунной сыворотки против сальмонеллеза. //Авторское свидетельство № 1637088, 22. 11. 1990 г.

21. Медведев А. П. Содержание белка в сыворотке крови волов при гипернммунизации сальмонеллезным антигеном. // Биопрепараты, методы их стандартизации и контроля. М., 1990, с. 41-45.

22. Медведев А. П. Применение содо-солевого раствора в производстве сыворотки против сальмонеллеза животных. // Научн. основы техн. пром. произв. ветер, биолог, препаратов. М., 1991, с. 163-165.

23. Кулешова И. П., Медведев А. П., Рачпнская Л. П. Содержание каротина в крови продуцентов антитоксической поливалентной сыворотки против сальмонеллеза. животных. // Научн. основы техн. пром. произв. ветер, биолог, препаратов. М., 1991, с. 166-167.

24. Медведев А. П. Способ контроля активности сыворотки против сальмонеллеза животных. // Совершенствование методов гос. контроля ветпрепаратов. М., 1991, с. 202-204.

25. Медведев А. П. Длительность интервалов между инъекциями антигена н активность сыворотки против сальмонеллеза животных, получаемой от волов-продуцентов. // Сб. научн. тр. ВГНК.И, М„ 1991, т. 53, с. 48-50.

26. Медведев А. П. Способ отбора волов-продуцентов противо-сальмонеллезной сыворотки. // Авторское свидетельство № 1655979, 15. 02. 1991 г.

27. Медведев А. П. Способ получения гпперпммунной сыворотки против сальмонеллеза животных. // Авторское свидетельство № 1754114, 15. 04. 1992 г.

28. Шагндевич Э. А., Юдин А. И., Федулов В. Б., Коломннна Г. Ф., Антонова Н. Н., Бушуева Н. Б., Рогожин С. П., Лукьянова Е. М., Душук Р. В., Шапошникова Е. К-, Шустер Б. 10., Юров К. П., Вечеркнн А. С., Эудилина 3. Ф., Малахов 10. А., Медведев А. П. Способ получения гпперпммунной сыворотки против распиратор-ных заболеваний крупного рогатого-скота. // Авторское свидетельство № 1795582, 08. 10. 1992 г.

29. Медведев А. П. Способ консервации сыворотки против сальмонеллеза животных. // Авторское свидетельство № 1777886, 1.08.1992 г.