Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка методов серологической диагностики инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека

0 9 3'

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР

МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМЕНИ Г. Н. ГАБРИЧЕВСКОГО

На правах рукописи

СУВОРОВА Зоя Константиновна

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

ИНФЕКЦИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ ВИРУСОМ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА

14.00.36 — Аллергология и иммупологня

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

\

Москва 1991

Работа выполнена в Центральном научно-исследовательском институте эпидемиологии Минздрава СССР.

Научный руководитель доктор медицинских наук Покровский В. В.

Официальные, оппоненты:

доктор медицинских наук Воеводин.А. Ф.,

доктор медицинских наук Воробьева М. С.

Ведущее учреждение — Научно-исследовательский институт вирусных препаратов АМН СССР.

в « 10. » часов на заседании специализированного совета К 084.18.02 при Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского МЗ РСФСР по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « » . 1991 г.

Защита состоится « ¿У. »

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

О. В. Котельникова

л

«ЦиД

Актуальность темы.

В условиях развития пандемии инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека (БИЧ;, важное значение для организаций эпиднадзора и проведения противоэпидемичес^: мероприятии, а также для постановки индивидуального диагноза приобрету/' г своевременная диагностика случаев заболевания. В ниетонкр.м.- >.-ре'мл ВИЧ-чшфекция распространяется на территориях, ранее считается свободными от данной инфекции (страны Восточной ¡?1риш:, Азия). Характер распространении мохет приобретать ||>орми и;гш-шек, госпитальной инфекции с формированием целой с-ити вторичных очагов, как это было установлено Б СССР (Элиста, Ростов, Волгоград) и Румынии. , ' '

Помимо инфекции, вызываемой ВИЧ 1, в последнее время все более широкое распространение получает вирус иммунодефицита человека второго типа (БИЧ 2). Несмотря на то, что в СССР выявлено только несколько случаев инфекции ШЧ 2, большой поток иностранных студентов из регионов эндемичных по ВОТ 2, может привести к широкому распространению этого вируса в нашей стране. 3 связи с этим разработка диагностики инфекции, вызываемой® ВИЧ 2 является актуальной.

Большинство методов диагностики ВИЧ -инфекции основано на определении антител к белкам ВИЧ в крови или других биологи ческих жидкостях. С этой целью' чаще всего используются различные методики, основанные' на принципах мммуноферментного анали- з за ПИЛ).

Эффективность диагностики зависит от качества и специфичности антигенов, используемых в тест -системе, ее оптимизации и стандартизации.

В первых диагностических '¿^стснстемах иииодь^ьадесь

тигены ВИЧ, .полученные из культуры.клеток, зараженных ВИЧ. Недостатками таких тест систем являются: 1) недостаточно высокая специфичность; 2)' низкая стабильность антигенов в процессе хранения; 3) недостаточная стандартность и ' воспроизводимость результатов 4) необходимость соблюдения особых мер безопасности н процессе производства и-использования тест -систем. Кроме того в СССР отсутствуют клетЬшше линии - продуценты ВИЧ.

Одним из путей совершенствования диагностических тест -систем является использование пептидных аналогов основных им-мунодоминанткых эпитопов БИЧ,' полученных методом химического' синтеза (синтетические пептиды) и,генной инженерии (рекомби-нантные белки). Достоинствами таких тест -систем являются: 1) высокая специфичность; 2) возможность проведения дифференциации между двумя типами ВИЧ; 3) более высокая стандартность и .воспроизводимость теста; 4) невысокая стоимость; 5) отсутствие необходимости в особых мерах б&эопасности. , <

Однако.при разработке и оценке.качества диагностикумов на основе пептидных аналогов эпитопов БМЧ^ необходимо использо-рать достаточное количество образцов сывороток крови, получении х из различных географических вон, в связи с возможными вариациями антигенов вируса, а соответственно и специфичности антител. Кроме того в состав панели необходимо включать сыворотки крови от лиц, инфицированных ВИЧ,, находящихся на разных стадиях заболевания, а именно, период ранней сероконверсии, рнавернутую клиническую и терминальную стадии, а также образцы

сы&Ьроток от детей, инфицированных ВИЧ

«5 ' ' х

- Недостаточная чувствительность тест --систем снижает эф-

фектившэсть обследования населения, а большое количество лож-нопо лоште ль ных. реакций приводит .к значительной затрате средств на проводимое обследование. Применение тест -систем,-обладающих высокой чувствительностью и специфичностью позволило бы избавиться от перечисленных недостатков. Таким образом * разработка и внедрение диагностических тест-систем, обладающие такими качествами и позволяющих . выявлять антитела к БИЧ 1 и ВИЧ 2, является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы является совершенствование серологической диагностики инфекции, вызываемой ВИЧ, путем разработки диагностической тест -системы, обладающей высокой чувствительностью и специфичностью, для выявления антител к ВИЧ 1 и ВИЧ 2.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Охарактеризовать антительный ответ к отдельным антигенным структурам' ВИЧ и сформировать панель сывороток крови, • содержащих антитела к ВИЧ.

2. Изучить антигенные свойства синтетических пептидов с помсщью созданной панели сывороток.

3. Подобрать оптимальный состав смеси антигенов на основе синтетических антигенных детерминант для йммуноферментной тест-системы, выявляющей антитела к ВИЧ 1 и ВИЧ 2.

4. Оценить чувствительность и специфичность разработанной тест -системы и сравнить ее с другими диагностикумами.

Научная новизна полученных данных.

Научная новизна представляемой работы заключается в том,

что дается ■ характеристика синтетических антигенных детерминант, аналогов различных участков белков ВИЧ, по их способности взаимодействовать с антителами к ВКЧ, что позволило оценить роль различных участков белковых молекул в развитии иммунного ответа и выбрать иммунодоминактные зпитопы ВИЧ.

Учет'штаммоспецифйческих-различий в сиквенсе эпйтопов по-' верхностных гликопротеинов позволил разработать оптимальный сорбент для ИФ тест-системы.

Предложи метод сорбции биотинилировашшх синтетических антигенных детерминант на твердую фазу с использованием стреп-тавидина в качестве носителя, что.лривело к повышению чувстви-.тельности реакции и сокращении количества антигена при сорбции.

Практическая ценность работы.

Практическая значимость работы заключается в том, • что на . основании полученных материалов была разработана тест -система "Пептест", предназначенная,.для' выявления антител к ВОТ 1 и ВИЧ ?.. В настоящее время разработанная тест-система внедряется в НПО "Вектор" г. Новосибирск под названием "ВИЧ-тест 1+2".

Используя данные, полученных при создании.панели сывороток крови, •' содержащих антитела к |ЗИЧ, разработан критерий оценки результатов тестирования сывороток крови методом иммунного блоттинга, а такие схема проведения серологической диагностики. Данные материалы учитывались, .при разработке'методических рекомендаций "Серологическая диагностика инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека, иммуноферментными матодами". •

- б -

Апробация работы.

Основные материалы диссертации доложены на Всесоюзном съезде эпидемиологов в Алма-Ате (1989), на советско-австралийс> ком симпозиуме по проблеме СПИД в ЦНШЭ (1990), на 1 Всесоюзной научно-практической конференции "Профилактика и борьба со ' СПИДом в СССР" в г.Ленинграде (1990), на Всесоюзном симпозиуме по химии пептидов в г.Риге (1990) и на Международной конференции по молекулярно-биологическим аспектам диагностики и лечения СПИДа г. Новосибирск 1991 г.

Диссертация апробирована на заседании комиссии по апробации кандидатских диссертаций в Центральном научно-исследовательском институте эпидемиологии Минздрава СССР 7.05.1991 г.,

Основные положения диссертации изложены в 14 опубликованных работах и защищены 5 авторскими свидетельствами.

Обьем и структура диссертации.

Диссертация состоит из следующих глав : введения, обзора литературы, материалы и методы, результаты исследований, об- . суждение результатов и выводы. Список литературы состоит из 115 источников. . ,

Материалы диссертации изложены на -НО страницах текста,' содержащих И таблиц, 14 рисунков и список источников литературы.. . •

Список сокращений. ВИЧ 1 (ВИЧ 2) вирус иммунодефицита человека первого (второго) типа-, ИФА*- иммуноферментн'ый анализ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Все сыворотки, используемые в работе, были протестированы

в следующих иммунофермецтных тест-системах.- "Viroriostica anti-HTLV-III. Organon teknika" Голландия; "Genétic_ sistems" США; "Wellcome Diagnostica" Англия; "Enzygnost-Anti HIV 1+2. Behringwerke AG"; "Enzygnost. Behringwerke AG" Марбург ФРГ; "Virgo" США; "Biochrom" ФРГ;'Т)и Pont" США и в тест-слсте-ме, основанной на .принципе . агглютинации. -"Ser'odia-HIV.

Fujirebio inc." Япония. Наличиё антител к отдельным белкам ВИЧ *

-1 определяли методом иммунного блбтинга в тест-системе • "Du Pont HIV 1 " Western Blot (IgQ)" США и "LAV-BLOT. 1" и "NEW LAV-BLOT Г' производства фирмы "Diagnostics Pasteur" Франция.

Сыворотки, содержащие антитела к ВИЧ-2 .тестировались в иммуноферментной тест-системе "ELAVIA Ab НIV 2. Diagnostics Pasteur" Франция. Антитела к отдельным белкам БИЧ-2 определяли с помощью тест-системы "LAV-BLOT 2. Diagnostic Pasteur" Франция. . Сыворотки, предоставленнные фирмой "Diagnostics Pasteur",. были протестированы фирмой в иммуноферментных тест-системах '"ELAVIA -1", "ELAVIA-2" и "Rapíd ELAVIA ЦШ", а Такле "NEWLAV-BLOT 1" и "NEWLAV-BLOT 2" фирмы '"Diagnostic Pasteur" Франция..

Характеристика сывороток. • В работе использовали панель сывороток в' состав которой входили следуюте образцы:

516 образцов сывороток, содержащих антитела к БИЧ-1, от лиц, находящихся на различных -этапах инфекционного процесса (бессимптомное носительство, лимфоаденопатия, СПИД-ассоциированный комплекс и СПИД). ' В состав панели входили сыворотки от иностранцев (176), граддан СССР (214) и-детей (126). Из сывороток детей 9 были взяты у детей в возрасте до 1 года, 55 - от 1 года до 2-х лет, 12 - от Z до 4 лет и 49 сывороток от детей

старше 4 дет. Иностранцы, сыворотки которых вошли в панель, были в основном из Африки: 13,7% -Уганда, 12,2% -Эфиопия, 7,9% Танзания, 8% -Конго, 8,?Л-Замбия, 7,5Х -Бурунди и 5,2Х Руанда и др. От лиц, проживающих в других региондх, в панель вошли следующие сыворотки: из Европы -4 сыворотки, из Индии -1, из ' Японии -1, из Перу -1, из США -2, из Вьетнама -2. В терминальной- стадии инфекции находилось 6 взрослых и 12 детей.

По антительному спектру сыворотки распределились следующим образом: 3 сыворотки содержали антитела только к gpl60; 4 сыворотки содержали антитела к gpl50 и g-plEO; 10 сывороток содержали антитела к gplGO, Ь'р120 и р24. Остальные сыворотки содержали антитела не менее,чем к трем трупам антигенов, кодируемых генами env, gag- и pol.

22 образца сывороток, содержали антитела к ВИЧ-2, из них 13 любезно предоставлены фирмой "Diagnostics Pasteur", 2 сыворотки от гралдан СССР и 7 от африканцев.

Кроме, того в панель были включены 5? образцов сывороток, содержащих антитела перекреетнореагирующие с антигенами ВИЧ и 50 образцов сывороток от здоровых б®ременных женщин.

В работе использовались две панели сывороток, взятых от лиц с сероконверсией, любезно предоставленные фирмой "Immunetics". ' •

Также в работе применялись сыворотки не содержащие антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2, полученные от здоровых доноров (всего 2316 сывороток).

Синтетические пептиды. Синтез синтетических антигенныу детерминант проводился в Институте биоорганической химии им. М.

- в -

M. Шемякина группой в составе: Кошч А. Т., Иванов В» С., Чикин;

Из ободочечного белка исследовал}« 12 пейтидов длиною от

* » *

lg до 27 остатков. Из основных структурных Щелков сердцевины вириона, кодируемых геном gag, были выбраны Б пептидов, в основном из белка р24. Из последовательностей белков, кодируемых геном pol '- .7 пептидов и 4 пептида из белка, кодируемого генам nef. Были синтезированы 7 пептйдов, шалогов белковых последовательностей из обратной транскриптагы.

Из последовательности белка оболочки вируса иммунодефицита человека 2 типа бьши синтезированы 8 пептидов.

Проведение твердофазного иммуноферментного анализа осуществлялось по общепринятым методикам. Максимальной способностью сорбировать синтетические антигенные детерминанты обладали планшеты фирмы "Nunc( Maxi sorb)" и "Costar". Вся. работа проводилась на планшетах этих фирм. Для определения специфического связывания антител с антигенами использовали коньюгат

протеина А с пероксидазой хрена ( Atnershant).

i' *

Математическая обработка результатов. Расчет средних величин, оценку критериев достоверности, допустимых интервалов и коэффициентбв корреляции проводили по общепринятым методикам (Малета и Тарасов, 1S87).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. •

В.качестве основного метода дю>. исследования антигенных свойств синтетических детерминант и разработки тест-системы использовался непрямой иммуноферментный анализ с антигеном иммобилизованным на твердую фазу. ' ' .

Для выбора оптимальных условий сорбции антигена на планшет проводилось исследование зависимости сорбции антигена от рН буфера и концентрации сорбируемого антигена. Для большинства пептидов, оптимальная концентрация находится в пределах 0,5-1мкг/мл, а оптимальное значение рН буфера 9,0-10,0.

Применение коныогации очищенных антигенов позволяет предста-

>

вить чх в виде близком к их нативному состоянию. С этой целью применялись биотинилированные пептиды и стрептавидин в качестве носителя.

При выборе оптимальных условий сенсибилизации планшетов комплексом сТрептавидин-биотинилированный пептид было проведено несколько различных вариантов иммобилизации этого комплекса.

В качестве оптимального варианта был выбран следующий: планшет иммобилизировали стрептавидином в течение 2 часов при 37 °С или 16-18 часов при +4°С, а затем после отмени вносили модифицированный1пептид в концентрации 0,1 мкг/мл. Инкубировали 2часа при 37"С или 16-18 часов при +4"С. После этого реакция проводилась по стандартной схеуе.

Использование биотинилированных пептидов со стрептавидином позволило повысить чувствительность ИФА более, чем в 2 раза. Причем при последовательном нанесении стрептавидин?- и биотинилированных пептидов чувствительность была выше, чем при нанесении комплекса стрептавидин-биотинилированный пептид. ;

Тот факт, что при сорбции биотинилированного пептида на

. стрептавидин его концентрация ниже в 10 раз по сравнению с

1

сорбцией пептида на пластик, свидетельствует о том, что от-

еууствие стерических помех дает возможность происходить взаимодействию антигена е антителом в оптимальных условиях.

Кроме того была предпринята попытка еще. больше ослабить влияние пластика на синтетические антигенные детерминанты и приблизить структуру эпнгопа к нативной. С этой целью к б:юти-нилироваин'ому пептиду с конца, взаимодействующего с носителем

пришивалась "ножа" ив трех йшшскислэт. »

Происходило повышение чувствительности ИФА при введении "ножи" по сравнению с использованием биотинилированного пептида без ножки в 2 раза, что свидетельствовало о том, что такой подход или позволяет приблизить структуру синтетического зпитопа к нативной, или условия проведения реакции приближаются к гомогенной фазе, которая более Есего соответствует условиям, существующим в организме, а, возможно, и то и другое .вместе, взятое. . '

В разработанном нами варианте сорбции, наиболее эффективным оказался вариант при котором вначале сорбировался стрепта-

ьидин, а затем биотинилировашшй пептидч При этом, вероятно,

- \

структура синтетического пептида приближается к нативной структуре белка в вирусе т. к. ослабевает влияние пластику, а условия взаимодействия антиген-антитело к условиям взаимодейс-. твия в гомогенной фазе. <1нкт увеличения чувствительности за счет введения "ножки" между носителем и пептидом также подт;-серждает данное предположение. Кроме того, предложенная процедура сорбции, позволяет избежать денатурации иммобилизироваи-ного пептида, которая имеет место при сорбции пептида -на пластик 'непосредственно. Нельзя, конечно, Исключить слияния на

информацию молекулы пептида самого процесса модификации.

Изучение антигенности синтетических детерминант. Среди пептидов, последовательности которых выбраны из ВИЧ. ., наибольшей способностью взаимодействовать с антителами к ¡ему обладали пептиды СП 15(автор.свидет.) - 94^7% позитивных сыЕороток, СП 7 (600- 618) - 93,3% и Z 3 - 94,7. 1 из последовательности оболочечного белка gp41. Попытки изме-шть структуру эпитопа приводили .к потери способности связы-_ зать антитела в сыворотках крови. Так замена цистеинов в СП 7 ia серины привела к потере способности связывать ^антитела до 50,7%. ! '' .

Пептиды из. gpl20 были выбраны из одной области и макси-

« ' '

«альной способностью взаимодействовать с антителами обладай СП 26(492-517)- 68,82 ВИЧ-позитивных сывороток.

Значения оптической плотности для пептидов из pol, пеГ и sag были невысоки, и не было необходимости включать их в разрабатываемую тест-систему. Иммунореактнвность этих пептидов пока не дает оснований сделать вывод о том, что найдены имму-нодоминантные области" в этих белках и работу в этом направлении следует продолжать.^4 \

Пептиды Z 3, СП 29 и СП 5 взяты из одной области белка gp41 (598-609), но их последовательности встречаются у разных штаммов вируса. Если СП 5 имеет последовательность аналогичную СП 7, но короче и выявляет только 80,32 сывороток, содержащих антитела к ВИЧ 1, то СП 29 отличается от него тем, что аминокислота лейцин в нем заменена на гистидин, что привело к тому, что этот пептид вступает во взаимодействие с антителами ь та-

ких сыворотках, которые не взаимодействуют с СП 7, хотя общий процент выявленных сывороток упал до 30,9%. Последовательность ' СП 29 вэята из штамма LAV -ELI. И хотя последовательности Z -3 и СП Б также взяты из разных штаммов, эти пептиды перекрестно-реагируш с антителами в сыворотках. 1

Распространение ВИЧ 2 в СССР и во всем мире привело к необходимости включения в тест-систему пептидов, позволяющих выявлять антитела к ВИЧ 2. По данным многих авторов наблюдается перекрестная реактивность антител и антигенов ВИЧ 1 и ВИЧ 2. Чаща всего эта перекрестная реактивность наблюдается для продуктов генов gag и pol. И хотя антитела к ВИЧ 2 также связываются споверхностными белками ВИЧ 1, но в меньшей степени. » t

Поэтому наиболее перспективной областью для выбора ' диагностических антигенов являлась область поверхностных антигенов. Наиболее активными оказались три" пептида из трансмеморанного белка', Причем эти пептиды имели перекрывающиеся последова-: тельности, что позволило сделать вывод о том, что в данной об-• ласти белка находится по крайней мере два зпитопа.'

Необходимо также отметить, что применение стрептавидина в качестве носителя для сорбции биотинилированных пептидов позволило повысить чувствительность метода в большинстве случаев. Так для СП 15 процент выявляемых сывороток повысился с 94,71 до 99,IX, а для СП 29 с 30,9% до 77%.

При анализе пептидов на панелях сывороток от лиц с серо-конверсией способностью выявлять' антитела в более ранние сроки обладал"биотинилированный пептид СП 27 (аналог СП 15). Кроме того значение оптической плотности для данного пептида при

• - 13 -

проведении ИФА выше, чем для других пептидов. Эти данные свидетельствуют о том,' что антитела к gp41 появляются не позже, чем антитела к ,р24 и другим белкам. То, что в иммуноблотте в. начале сероконверсии определяются антитела к р24 скорее свидетельствует о том, что этот белок при приготовлении антигенов ♦ *

цля иммуноблотта сохраняет свою антигенность и присутствует■ в. достаточных количествах. В то же время gp41 в процессе приготовления иммунного блотта или изменяется или наиболее иммуно-^ генный сайт 598-616 экранируется при переносе на нитроцеллюло- ' зу и не участвует в реакции с антителами. г

Выбор оптимального состава! антигенной смеси. ' ' .

Так, согласно нашим данным', антитела к gp41, при использц,-

i '* . \ вании метода иммуноблоттинга, ¡где в качестве антигена использовался вирусный лизат (фирма'"Du Pont"), выявлялись в 90,5% •. случаев, а использование синтетической антигенной детерминанты, длиною в 16 аминокислот, где возможно наличие только нескольких эпитопов, приводит к повышению выявляемости до 94,7%. ^пользование носителя в нашей работе, то есть повышение чувствительности иммуноферментнрго метода за счет использования юсителя, а не введение ^Дополнительных эпитояов, позволило по-зысить выявляемость сывороток от лиц, инфицированных ВИЧ, до 39,IX. И то, что оставшиеся 0,9% сывороток взаимодействовали с синтетической антигенной детерминантой (СП 29), последователь-юсть которой взята из другого штамма вируса ( LAV - ELI ), но и той те области gp41, свидетельствует о том, что антитела к »питопам этого региона присутствуют во всех сыворотках и имеют только итаммослецифическое отличие.

- 14 -

Проверка работы тест-систему, где в качестве гштигенно: сорбента использовалась смесь двух пептидов - СП 27 и ОН Н( на панели сывороток, содержащих антитела к ВИ'1 1, иокаапл что данная тест -система обладает 1007. чувствительностью и н-необходимости введения дополнительных антигенных детерминант антигенную ек»есь.

Однако, необходимостью обследования населения на налич антител к ВИЧ 2, в связи с начинающимся распространением это вируса, было вызвано включение в состав антигенной смеси по гида из ВИЧ 2. Для этих целей использовали пептид СП 34.

Все три пептида были проверены на специфичность и не дн положительных результатов с сыворотками не содержащими антит к ВИЧ 1 и ВИЧ 2. •

Определение чувствительности и специфичности т«с-т-систе Разработанной тест-системе было дано рабочее назван "Пеп'те.е?".» Чувствительность • и специфичность тест-системы щ: ' в.еррлись на панели сывороток. Из 397 сывороток, содержащих г титела к ВИЧ' 1, и 22 сывороток, содержащих антитела к. ВИЧ бцли выявлены все 100%.

. -Испытания тест-системы на специфичность дали •сдаэдуки результаты. Из 1000 сывороток от клинически гдерошлс лиц а < ли положительную реакцию т. е. специфичность о&итаьила й9,$ При исследовании в тест-системе "Пептест" 57 сыкоротск, дай ложноположительные результаты в тест-системах на ооноье вир; ного лиаата и дающих неспецифические полосы в блоте, знчче! оптической плотности не превышали порогового значения.

Все. это позволяет сделать вывод о достаточной чувот

• - 15 -

льности и специфичности тест-системы, что подтверждается ре-льтатами испытаний, проведенными в ГИСКе им. Л. Д. Гарасеви-, полученными .при консультативном испытании тест-системы. Сравнительные испытания тест-системы "Шптест" с. другими тест-системами. Проводились сравнительные испытания тест-системы "Пеп- . ст" с тест-системой "ELAVIA MIX" Diagnostic Pasteur Франция тест-системой "Enzygnost HIV 1+2". Behringwerke ФРГ. Панель вороток, которой пользовались при сравнении этих тест-сис-м, состояла из 63 положительных сывороток и 18 ; сывороток,

ющих неспецифические полосы в:'б лоте. Были получены следующие

*

(

эультаты: из положительных ензороток не выявила 2 сыворогкз^

V V

ст-система "Enzygnost HIV I+8", а из лототюлотттелъных были явлены как положительные тес^-системой "Пептест" 2 сыворот- •■. , тест-системой "ELAVIA MIX" - 3 сыворотки, a "Enzygnost HIV 2" - 11 сывороток, .

Кроме того были проведены сравнительные испытания ст-системы "Шптест" а другими тест-системам отечественного оизводства и производства, фирм других стран. Испытания лро-дились на базе лаборатории инфакщюнной иммунологии Главного енного госпиталя им, Е Н. Бурденко, При проведении этих испы-ний были использованы 22 образца анти-ВИЧ-1 позитивных сыво-гок, наличие антител к ШЧ 0 которых было подтверждено мето-м иммуноблоттинга, 24 сыворотки, ложнопозитивные в различных тест-системах и дадщях неспецифические полосы в блотте, и сыворотки здоровых доноров крови. "Шптест" выявил все ложительные и не выявил ни одной из отрицательных или "сом-

• нитедьных" сывороток. ■

, Таким образом, в результате проведенной работы была ра работала диагностическая тест-система, предназначенная для в 'явления антител к ВИЧ 1 и ВИЧ 2 в сыворотке и плазме крови, качестве антигенов в данной тест-системе используются три>с^ тетические антигенные детерминанты: одна из gp41 ВИЧ 1 ( > рактерна для большинства штаммов, циркулирующих в мире вторая из gp41 ВИЧ 1 штамм LAV-ELI и третья из gp36 ВИЧ Предложенный оригинальный метод посадки синтетических антиге них детерминант на пластик позволил повысить чувствительное тест-системы до 100%, при специфичности 99,5%. Сравнение рг работаннойтест-сиетемы с иммуноферментными тест-система! применяемыми в других странах для выявления антител к ВИЧ . ВИЧ 2, подтвердило данные о высокой чувствительности и enei 'фичности разработанной тест-сйстемы и позволило сделать выв< ' что 'по _данным параметрам она не уступает, а в ряде случ,

• превосходит аналогичные тест-системы.

ВЫВОДЫ

Л. Собрана панель сывороток от лиц инфицированных В состоящая из 515 образцов сывороток крови с антител к ВЙЧ ' 1 и 22 сывороток с антителами к ВИЧ 2, кото является хорошим инструментом для решения научных . практических задач. 2. Исходя из данных о взаимодействии 36 тестирован синтетических пептидов с антителами в сыворотках ь ви, подобрана смесь ' антигенов, используемых

тест-системе "Пептест" для сенсибилизации планшетов, которая состояла из трех синтетических антигенных детерминант, последовательности которых взяты из gp4l штаммов LAV-BRU и LAV -ELI ВИЧ 1 И из gp36 ВИЧ 2.

3. Применение авидина в качестве носителя для биотинили-» рованных пептидов позволило повысить чувствительность-ИФА более, чем в два раза и снизить количество синтетических пептидов при сенсибилизации планшета в 10 раз.

4. Разработана новая иммуноферментная тест -система "Пептест" для определения антител к ВИЧ 1 и ВИЧ 2.т Чувс-

I

. твителыюсть и специфичность ее при анализе 397 позитивных и 1000 негативны}; по анти -ВИЧ антитела*; образцов сывороток крови, составили соответственно ' 100% и 99,5%. !

Сравнительные испытания тест -системы "Пептест" показали, что она не уступает лучшим образцам существующих тест -систем.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ.ДИССЕРТАЦИИ

1. Эткин А. Ф., Покровский RR,, Янкина( Суворова) 3. Л. Ана-специфичности серодиагностики синдрома приобретенного им-

ного дефицита. //Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. -6.- N9. - С. 73-76.

2. Первичный серологический скрининг инфекции, вызываемой усом LAV/HTLV -III/HIV в Москве. / Покровский В.В. , Янки-

• на( Суворова) 3. К. , Топоровский Л. Ы.. и др. //Журн. микробиол. э двыиол. и иммунобиол. - 1987.- N7.- С. 21-23.

3. Синдром приобретенного иммунодефицита и генерализов ная лимфоаденопатия у лиц, серопозитивных к вирусу H1V. / П ровский Е В, , Янкина 3. К. , Покровский В. И. и др. //Тер. aptt 1987.- N7. - С. 35-39.

4. Покровский В. К , ЯнкинаС Суворова) 3. К., Покровский В Эпидемиологическое расследование первого случая СПИД, выявд' ного у гражданина СССР. // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммуно! Ol.- 1987. - N 1.- С. 8-10.

5. Покровский В. В., Суворова 3. К. , Мангушев Т. Е Инф ция, вызванная вирусом иммунодефицита человека типа 2, в СС( // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. - 1988. -. NK С. 18-20. ' ,

6. Серологический скрининг инфекции вирусом иммунодефи! та в' 19§7 г. / Покровский В. Е , Виноград Д. JL , Деулина М. О. др. // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. - 1988.- N Ii 'С. 56-59. •

. 7, Возможности клинико-лабораторной диагностики лимфоа; нопатической стадии инфекции вирусом иммунодефицита -челове! / Ирова Т. И., Резников Ю.Е, Покровский ЕВ. и др. //Тер.; •■хив. - 1988. - N7'.- С. 14-16. ■

8. Использование иммуноферментных методов для диагност! инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека. /Суворс 3. К. .Буравцова Е. В. , Деулина Ы. 0. и др. //Материалы 18 еъе; микробиологов, эпидемиологов и парааигологов. г. Алма -Атг 1989,- С. 26-27.

9. Этнламид циклического доденапептида, обладающий спо-¡обностью специфически связываться с антителами к белку gp41 труса иммунодефицита человека первого типа HIV-1-2-3. /Вииог-*. )адов Е А., Покровский Б. В., Тищенко В. А. и др.//Авт.. свид. 11527876 от 8.08.1989.

I

10. Этиламид циклического ундекапептида, обладающий спо- . ¡обиостьга специфически связьшаться с антителами >к белку gp 41 зируса иммунодефицита человека второго типа HIV-2R0D. / Виног-_ )адов Е А. , Покровский В. В., Тищенко В. А. и др. // Авт. свид. N i529698. I

11. Этиламид циклического дрдекапептида, обладающий спо-

<

I

юбпосчъю специфически связываться, с антителами к белку gp- 41,

* *i

зируса иммунодефицита человека; первого типа HIV-I-LAV-EL1. /Ви1,

i

юградов В. А. , Покровский В. В,Тшцзнко В. А. и др. // Авт. свид. ■•. Ü542018 от 8.10.1988г.

12. Пептид, ■ обладающий способностью взаимодействовать с игаителами к вирусу иммунодефицита человека 1I типа / Иванов 3. С. , Чикин-ЛД., КокичА. Т., Суворова 3. К. //Авт. свид. N [545557.

.13. Efficient detection ОГ HIV 1 and HIV 2 antibodies ' iith sinthetic peptides -based ELISA./Kozhich A. T., ' Ivanov LS., Suvorova Z.K. , Tchikin L.D. //7 International conference зп AIDS. -1990.-V.3.- R. 248.

14. Способ твердофааного иммуноферментного определения штител к вирусу иммунодефицита человека и меченный биотипом синтетический пептид для его осуществления. / Иванов В. С. , Суворова З.К ,- Чикин ЛД,, Кохич А. Т. // Авт. свид. N 1612264.

- 20.15. Синтетические пептиды в диагностике инфекции, вызываемой ВИЧ. /Иванов В. С. , Чикин А. Д., Суворова 3. К. , Колич А. Т. /, •Материалы всесоюзного симпозиума'по химии пептидов, г. Рига. -1990.- С. 18-19.

16. Использование иммуноферментных методов для диагностики инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека. / Суворова 3. К , БураЕЦОва Е. В., Деулина М. О. и др. // Тезисы докладов 1-й Всесоюзной научно-практической конференции, г. Ленинград. -1990.- С. 90-91.

17. Synthetic peptides in HIV serodiagnosts./Ivanov V.S. Tchikin L. D. , Kozhich A. T. , Suvorova Z. K. //Internationa conference on molecular biology aspects of diagnostics an therapy of A}DS. Novosibirsk. - 1991.- P. 13.

18. Influence or" HIV antigens on functional activity о 'neutrophilic granulocytes in patients with HI ' irifsction. /Gabrilovich D. I., Kozhich A.T., Suvorova Z. К. e al. //Scand.J. Immunol.- 1991.-. V. 33. - P. 549-552.

. 19. Antibody response and age of children at the time о HIV transmission. /Buravtsova E. V. , Suvorova 2. K. Sergeyeva V M., Pokrovsky V. V. // VII Intern. Conference on AIDS.- 1991. V. 2. - Abstract V. A. 1348.

fficfjH. 0ruAQsrrU, ft.07.9/i, ^¿vc mctf /00 Tunvzpcupua HH> CCCp

Таблица 4

Связь раннего подавления реакции бласттраноформацшГ лим$о>дагов с индукцией супрессорщгс клеток z цротек-тивной активностью антигенов индукционных агентов

----1--i-1--f^T-

Антиген, использованный ; "йтогеп- (Подавленна¡Индукция ¡..ротох-для шд^низацшх ¡кая ая- ¡реакции ¡судресссрттгвнйя

¡тивкссть {оласттрачечкш: клетак; аш-j формации I ¡hoctl

Jordetalla pertussis колшзный токсин

brucella abortus ЛЕС 5ПА Ь'БПА

[lecionella pneumophila АЛЛ

Облученная кульгупа (I Ф) Цитолизин

'i.arthritidiB (НАС) Маши СМ {¿ли С57вь/б

Вирус гшппа тияг А [штамм wsir )

СБА Мыши R57BL/6

1одавленаэ блаоттранафорьацгг, отдуцгровацной ЕонА, оцонлзалг чэрсз 7 сут лосле введения антигена.ЫЗА - йслковоцолксахарщкнЁ йнзегэ:-:, tf ША - ЕЛА, облученный в дозе Т Мр. АЛЛ - антиген леггонзлл, со-церяащий преЕмуцестЕОКНо ШС.

4 Мятогенная активность БПА, яо-кидалщр, заблокирована дш'лзг-ггс.^м глюканом.

^Оценивалось токсическое действие микопласмн и скорость ез вьоеда-kh.fi ез организма.

титл ость специфических супроссороз после внугркутро^Еог-о згра- • нения.

++

-н-

-н- +

5KS

л.

+

+

+

+

вает накопление меток, реагирувдах на КонА, которое на 4 сутки, в отличие от 13 суток, сопровождаете ■ снижением хелперных свойств-. Указашшз и зш нения могут существенно влиять на иммунореактивноотъ орп шзыа. Один из способов, дозволявших избежать так:« сдвигов в жмуяяой системе, состоит в актльациа лимфоцитов KT in vitro . Спле-коцаты ши'^й СБА и свтеА , активированию КГ в течение 7 суток, через неделю после в/в введения сингенныл аивотнш в количестве 100-450 тц-сяч обеспечивали защиту- 60-£0 % мышей от ьнутряцоребрзльного заражения 2С00 микробных клеток В.pertussin 13323 •, вызывающих гибель

100 % Ш1ВОТНКХ.

Основным протектпвкым антигеном бруцелл, используемых в коле от б е хгл'лческой вакцины, является белколслолисахэридккй комплекс (БПА), подученный путем уксусномслотного гддролиза высушенных микробшк клеток. B.ujortus Э9 (Драновская Е,А., 1985). Этот препарат мгкет содержать в Hei >хьши количествах лападаый компо«ент, злособнкй вызывать иеспецяфическую бласттрансформаци». После облучения БЕА.(получения гГБПА.) 'лиладный компонент разрушаемся (Драновская Е.А.Кулаков В.И., 1986). При этом число тавотных с протективным иммунитетов возрастает с 52,3 до 71,4 %. Исследование неспецифической проли-©еративкой активности спленойитов. морских сейкок, ишуназгрованных БПА ила '¿БПА. показало, что БПА в оптимальной иммунизирующей дозе (0,6 мг/аивотное) уяе на 3 сутки пос 'з введения, ингиЗирует. ответ.на ФТА а КонА соответственно на 65 и 60 %. Напротив, у морских, евкнек, ишунязкрованкы" Ш1А, в этот же срок отмечена резкая стимуляция (в 3»8-5,0 раа) ответа на ФГА и на КонА (в 2,2-2,6 раз).

В более поэдниз сроки различая, в пролифератавней активности лимфоцитов .мевду группами. свинок, шмунизированних БПА п *БПА, становятся менее заметными.

Возможной причиной различий в пролийератшшой активности лим-фоидшк клеток после, шлунизацаа БПА н *БПЛ является разрушение лидгдяого компонента. Подтверждением этому слуаат данные об изменении пролиферации еллеяоцитов после ишунизацик морских свинок ЛПС бруцзлв:. Очицоннкй ДНО в.аЪогЬиа 93 после его ввздекпя ыорсыш. сванкам вызывает подавление ответа.на SEA на 7 сутки. Подавление сменяется стимуляцией ответа на Т-штсгеян на 14 сутки после введения ЛПС. Сам по себе бруделлезлы^ ЛПС оказывал кеслецифическое.митогеннсз действие на сплснопить нжттяых порсках свикок, а у «изотки, имэтнизл-роааияых <5руц?ллез:шм. ДОС, швогеая е действие этого препарата с; д-кекс на 66 Эти даккне согласуются о предлоложенагм о том. что вн-явлеглае р<\зшч*:я- в дМствкл ЗПЛ д *Б1>А связивы с присутствии« в

первом препарате остаточных количеств ЛПС, который, вероятно, вызывает индукции супрессоряых клеток, подавляющих продукцию специфических антител.

Таким образом, как а в случас В.pert ¡eis , т^енио животным прз: 1рата, обладающего шгогеншшп свойствами (ЛПО), оопрововдается супрессией. Отмена супрессорных свойств поело облучения ША. приводит к увеличении протективкых свойств препарата. Однако другие про-тективные антигены, теряющиеся в. процессе , получения БШ. или £ЕПА, по-видимому, также вносят свой вклад в создание проективного иммунитета. Так, после акгдвадил клеток пэриссеряческой крови морских свинок прогретыми бруцелласч вирулентного штамка Т.Ш и последующего введения таких меток аумлогячнкм животнш удалось получить протек-таикий иммунитет у 75 % свинок. Нукно отметить, что активация in vitro интактннх лимфоцитов возможна лишь при сохранении штогоькнх свойств бруцелл.

. Для изучения роли Щ леглокедл: в условиях in vi та исрокюс свинок згаауиазирозали подкожно антигенами легйонелл,. выделенных по методу yieslwr a.b. (1982) и состоянишпреимущбствеаяо аз ЛПС. . В различные срока после иммунизации.у аавотвызг забирагл.селезенку.и. исследовала пролиферативную активность сплепсцстов. .Реакция сплепо-цитсв именных свинок на ЛПС B.coli бияа.значительно сЕльлее реакции контрольных животных, что монет указывать на увеличение кодзгаз-ства.В-клеток .ч/или активности одной В-нлетки после иммунизации. Кривне, характеризующее ответ подопытных и контрольных яивотпых на i КокА., практически ке различались. Ответ клеток селезенка на антигены легйонелл .£АЛП) по абссштшм значениям был вше геакцил яа ЛПС . s.coli ; причем .тгл1.5$оцхти автактных а вшуцаых кшзотншев 3-суточных культурах стймулировалпсь в равней степени. Специфический ответ да. AJffi удалось вкявить только в. б-сугочных культурах па 28 сутки после зшмунизацид, причем усиление, ответа было связано преимущественно с Т-клзтвамк, тогда как у недшуешк животных пролифзраровзли г.^бнкш образом Б-клеткл. Поскольку исследований аярлген легйонелл состоит главный обраеом из ЛЕС. выявленные различия связаны, по-ъд-даисму, с действием, на иммунную систему непосредственно. Мф. .

В дальнеюс экспериментах в качестве яшуногзна были использованы тр.е аятягежиас препарата лег.аднела,. различающиеся по своим цитогг-няым свойствам; антиген, »оделенный методом pibsher a.b. (АЛП), илактояревакЕий прогреванием мугантный штамм легйонелл (АГмут) и обработакнг-а формалином вирулентная кульа-ура легйонелл (АГф) СРас. I).

Рис.1. Зависимость меаду матогеныой активностью антигенных препаратов b.pneumophila r их илишшем да продмфередиа Jua'^o-аднкх .шаток морских свинок in vivo.

А - сллекоцигы интактных юрских свивок стимулировали одним i¡¿ слздуюиих препаратов L.prieumopiiiia :.1) ДПС (незаштриховаь-кый стилбин); 2) формалинЕзированной культурой L.pneuiaophili PíiilsdelpMa I (АГф, косая штриховка); 3) |ормалинвзпрованной культурой мутантшго штамма . L.pneuaophila , полученного в лаборатории д.й.н. И.С.Тартаковского (АГМ, вер-шкальная штриховка).

По ося ординат - уровень включения %-тшндяна (дмпульсн в мшу ту х 10"^)..

Заштрихованная область - спонтанное включение %-тамгяя."а в культурах опленодитоз с5ез митогенов и антигенов,

Б - азменекке пролифзргаианой активно сти силешиктов череи ? суток поcjü Бяутрш5р;гшяной анмунизедаа морских сзанпк ЛИС, АГ(Т или АГЦ. I кавдой из трзх указанных групг- доследовав отхзт на ЛДС, АГф я АГМ (штриховка етодбмюв такая >:е, зек на pao.' I-A). Пролв$ерЧшк сялекоцитов шгаягпьгс аи от-¡шх ao,-i- дейсизизм £СС, АГф АГМ принята so 100 Тош-:ле яерхккалгнке линяя - стандартная ошибка.

Очащевный ЛПС оказывал самое сильное штэгешюс дейсгвае. е АВлут - сатее слабое. Б большей степени пролкфэрг; овадя кле'ли*., .срн-креплямдоесн к лейлояовой. рааа, а Ллфч воо£цо нз сталудярс^з.,: популяцию, обогаше.-шу» Т-клстхгыя.. Чзреа одну яеделз яосде данулгея'.лл «квотеых АЛи отмечено подавленна реахдга на КоцЛ и легаокеллаг.ще актлгеш. Полуденные данчыз указывают т суще. .'Волгине прядай корреляционной сзаиогаостя мевду уровнем супрессн?. сиосиагксской а/клн леслецгфической блзстграксфс^шдай в различных популяциях сдяеноцг-тов, с одю',1 отсрочь, и мятогенной активностью препарата, исасль-до-ванного для шэду кизации., с другой стороны. Супрессия чг т^ яазадается на фене довольно за^егьой актиьзцги в лозулнцлк, обегапогной Т-клеткаш. а вероятнее всего связана с кооперацией клеток, находящихся в фракции прикрепляющихся а нз лрш -еалявщгхся к нейлоновой .вате спленоцитов,. так как в отдельности. г этих популяциях яедазлз--ж бласттрансфоржцяи либо более атабое, лгбо отсутствует- В псг,лг— дуюауах..экссершеятэх было исследовано вдляние ггжа-облучеядя яа мунодепрессивназ свойства пкахмьяро ланкой культуры летчюлзши

. Облученный антжген стимуляровал. лродиэсератязкуз активность в точение более лродоллм-елъпого времени, чем необдучечный аг-тагпр., Ь'олес. того, обл^'чэкнкй аятетзя аяадвировал Т-ялетаи удэ ч?-реБ 7 суток .после введения, тогда как необлучешый антиген ~ только через месяц. Однако, несмотря на то» что после облучзгия з дезе 1 Мт даму-коде просодика свойства' легяонелл снижаются, те:.: на у-знее, чер&з 1..иссщ после иммунизации наблкдазтея подавдгкде яролифратьвкоС активности , то есть облучение е дозе I Ыр лдиь язлэздллег разя мунодецрессш. Другой ентигея легюнелл - ци-дэлизш:, оканыБавдй 'Енгабаруявдве дейстзне на блаеттракофориацлю, хтз&шфо I'окА, сталировал пролиферации, неприкреллявдихск сплзноцла'.-яз лод х;е£с?ззеь, антигенов логдокелл в течояяе всйго срока наблгдемк, ?. еоцу&ф;), обогащенную З-хлгтхаш - в период с 14 лс 30 сутки лис/б жиу*:яз-зди, что дает есгованке рассматривать зго в качестве перспективного кш-тектазяого антигена.

Пэдэьлзнде яеелецифичеокой прэлафератизлоа ажгяйиосла. золенное после гааунааациа павояшх цгтолнзаком, оЗусловлько кхеткада, пршфеплявдвшея к нейлоновой вате, Шало думать, чго цатогазаь через неделю после введения ашвоткш вызывает в популяций прикрепляющихся к нейлоновой вате едлеяоцзтоз нццухаяг. супрессоряих клеток, пщ'ябнруюаьх пролзфергцк» ¿-дшфдятоз*. %рез «¡ее&? после кчя/им^з.-пш».индуцируются клетки, сЗледаыдав хааяернка! сзойстзаак у. о'1"у.--руюдяа лросв&ехедип кятоктяух З-клзтск под дсйртг,ггм слгцил«секого

антагека.

Те.1 как лешон&лле? является, легочной инфекцией, представляло мгерес исследовать активность лшмфоидных клеток, находящихся не-пооредсгвекно з легких. Через недели после иммунизации кивоткых антигенами. легионелл, о<?лученннки в дозе I Мр, в легких отмече о увеличение активности клеток, огаечащюс на КонА и на актигеш легионелл. После добавления этих клеток и интактяым спленоцнтам, она ин-гибяруюа- стге? на легкодедлезный антиген на 31,9+4,0 %, .отлет на СПС - на, 67,3^4,2 % ц яе влияет на бласттрансфорьмция, вызванную КонА. Эти д&ннйо позволили преподавать, что в легких накапливаются ан^ЕГонсяедййпескиз судрзссорныо ьлетк?..

Известно, что подкогная или знутрлбрввшшая иммунизация легио-и&ялгт заа».иадет жшо?шк толхко от вкутрибршинного гараденгя и не оказньаот лротзктнвкого дзйствия ври го'ссотвеянсм, аэрозольном зара ейнйк ( ь:.гй1-с-1т1 т.х. ег. 198^). Одной из вегмогнш: причин этого могут бить яакаплзващаеез в легких доме иммунизации сулрассори. Поэтому и последующих экспериментах было проведено сравнение двух опссобсв иммуяииации г.юрскзх свинок: аорозольпох'о .или иодкогкиого. Екло уотаноьяено, что неспецифическая пролифера^ивная г.таивпос.ть Т-рлеюк,. вдуцированвая КонА. при подкожной иамуяиушуи! нарастает гораздо .раньше, чем при аэрозольной, но при аэрозольное введении антигена его сшадларукцее ¿ецс.тгке. сохраняется ъ течение более про долзктышюго времзки (до 21 суток).

Исследование реакции лимфондкьх «легок игл/укнкк и контрольных свидск на легиоагллзаные. антигены покачало. что иммунный ответ на ачрозольпо ЗБЗденныя .антигены легиокедд развивается более медленно по сраанз.-шй с нмыуняьы ответом па антигзк. вледенньй подчокно, Задержка и развитии максимальной дролифвратияной реакции составляет примерно I Неделю и сопроьовдддтея индукцией ант-игенспецийическихс супрессорнуу меток, ко¿орке ня обяаруаиззлясь з селезенке годкозшо ■зм^ипзированиых свикок. В сослсдуювдс экспериментах в качестве пер личного илыугогеаа б.чз: использован цадолазшх, через месяц после ям-ъ'унр.гыпв. ко'хорзл морских сванок а&розоныю зарезали виру лен г-юй культурой ь.рлеивюрЪИа . После зараньпал догионааламд жзотнии, а15дупизир<11лняах цитолизином, слегдаожческай пролаферативный ответ в оелззэ.чкз сохраняется аа фоне с.ки-енш ответа на другие анзда-енъ .югиекздл. и ви КсЕх'и Напротив, стзст ла'лфоцкгов легких на Есе иссле доважше аюжг&цы и на КонА стимулировался к 9 суткам инфекции и со .чрамяс? на высоком уровго в точение месяца. Еолучеяныэ данные ови-дегсльствуют, ло-г.ддшоку, о греямуцественжм х^акопленки в легких

у алслуказяро^&чкнх цитолазяшм кореках свинок Т-злеюк, отлочгяадх на Knbik.ii на.?нтигену легаокеяя, вскоре после заражена.?« "--^елкельяо сказалась п.^ол^ератявноя ашазкосл спленоцитов, вероятно, т ?<чет частичного аер^ресързделеяяя клеток (главны« обраесм Т-кло*:ч:к), спе-цафачных к .антигенам .язгло.ччкл, аз сслезеяха в лег^яе» На тг/^и ~>оз »лохность указывает а длительное сохранение почтенного стае га на КонА. в популяции нефракцкоккровгняш:. л пшкреплшдю-хя к неслоговой вате клеток селезенка без аг^ухцил суаресс-орках клеток. Интср?о.чо, что после добавления цитолизина к клетаам селезенка или легких ст интактных тшеотнкх он оетзцвгет слабое мктогекное дейс. .не ка обе популяции, а коматогенноз дейстзае - только т. культурах салгэкоцатов. Мэашо пре.г.полотать, что после иммувизапаи и последующего заргззпая животных и развитая пневмонии .члетуп, об« лечив&ю'дае коста^лшу/лэ, мигрируют а легкие.

. Фэршров-анае аротехтивзого иммунитета пра кяогах ан&зкци'эс обеспечивается вяелники ;.'.^м5ракнетл балмеди ьозбудьтчля ( 1)гд1о11 ь.м., еъ &1., 19*57) • Одним из оскознцх белков л неиней ыомбргны лсгвоксл;: (ЕШ) является белок с колекулдрной .'.ассой 20 лсД, которкй ттогс-янн-ма свойствами не обладал. Для лсучзьая илм^ологачесхр-х свсйстз ЕВ!.; ыореккх свинок 2 раза подкожно амг^яязлровзли белком с ыол21;улдр;:о.1. массой 29 кЦ с интервалом 2 надели. Через I месяц госло последней иммунизации каютных аэрогенно заругали гирутектяьс/я дагиодэлзгиа а в разлачЕыь сроки после, этого ¡тестировала спэца^чеокуа а яаспылфя-ческую прола^еративаую зктавчость. В рзнкаЯ период после взадвши; легаонелл .015ет на КонА. у яеимиунккх с: .кок подавлен, к 4 с?т:<-а\'. с;-г восстанавливается и позднее наблюдается некоторая его стккуля^ид. У предварительно ионизированных морских сгауоа в кулъ-гура^ салено-цатов п лейкоцитов легкого отсутствует пода рте ■12-; о?.- веха из. КонА а ранниз сроки крфвяциа, вместо которого наблюдается ;;.ос-'аточяо сильная стимуляция блаеттранейормац;«. с максимумом на 7 сутан,, с последующим снижением уровня пролиферация до 1:оятро.е>яих зрачегей к 2-3 недельному сроку и новым увеличением активности з селезенке к 3,5' месяцам.

Предварительная имкунлзацая озпкок Б2М создает через кесац достаточно ¿-¿содой уровень ответа на антигены яегкокаял, но достаточно о"лъ'лого а«ценил отчёта в о модели;: яирухеглегаонелг пчела мунаиации БВМ не происходит. Более того, в легких згрзЕоккз' п'-мук:-ных ехзияок оолео высокий стпе* та зарулеягкне легколелли огж^'гн да-ге ппздкез, чем в легких заргкенних яладукних санок., К;>о\'.е , легконога легких иммунных гаготны: до зйрлаеяая '.¿г?.:'- :;;

легионелл как антактные яивотные. Однако после заражения пролифзра-тдвнкй ответ лимфоцитов иммунных "вишк повышается гораздо бьсгрее, чем у нешщунных свинок,менее.сильный ответ наблюдался лишь через 4-', недель. 3 ранний период (с I по 4 сутки инфекции) ответ на БЗМ у 4 иммунизированных зарапешшх сванок был подавлен в селезенке яа 9-87 % пс сравнению с контролем з 4 опытах из 6. В этех опытах индекс стимуляции интактных спленоцитов под действием АГвир был равен •в среднем 3,0. В двух опытах в ранние срока после заражения наблюдалась стимуляция ответа на АГвяр в 1,35-2,0 раза по сравнению с контролем. При этом в опытах АГвир стимулировал интактные спленоцитн в меньшей степени (индекс стимуляции 1,65), то есть, подавление бласт-траноформации з ранние сро:си инфекции тем сильнее, чем сильнее ми-тогештя активность использованной культуры легионелл. Для изучения возшжных причин развития иммунодепрзссин бшш исследованы изменения в продукции 11.-1 и ИЕ-2 в легких и селезенке морских свинок, аэро-зольно зараггеншсс ь.рпешюрьиа • Подавление пролиферации лимфовд-кых клеток после заражения морских свинок ¿гагионеллаки сопровождалось увеличением продукция. ИИ-1. Продукция ИК-2, по-в единому, подчиняется более слоеным закономерностям, и роль Ш-2 в поддержании про-лифзративной активности вероятно. существенно зависит от субпопуля-ционного состава клеточной культуры. Подавление пролиферации при легко на ллезной инфекции частично спзано с интенсивным потребление« Ш-2 определенными типами клеток, внпошшадагди в данном случае суп-рессорную дню. Такие клетки в болзо' высокой концентрации присутствовали в легких зараяенянх еивотднх, чем в их селезенке.

Таким образом, после, шцунизациЕ морских свинок БВМ, не обла-давдим иятогенныш овойствемя, яз удается добиться формирования достаточно сильного иммунитета в отношения дпрулентких штаммов легионелл. Более того, такая ищуказация не способствует повышения специфической пролиферативной активности лимфовдных клеток непосредственно в легких.

В общей сложности, аналиа пролвфератввной активности .ламфовд-ных клеток морских свинок, кмцунизировашшх различными антигенными препаратами легионелл иди зараеешшх вирулентной культурой ь.рпеиио-рЬИз. , свидетельствует о ток, что чем выше митогешая активность введенного препарата, тем сильнее иммунодепрессия на ранних сроках. По крайней мере частично такая икиунодопресоия мояет быть связана с усиленным потреблением.Ш1-2. Ииму.г'.Езацяя препаратами,.на облад-щв-ми гштогекной актизностью, ае обеспечивает развитие стойкого иммунитета к вирулентным легиоаеллаи.

Да чее была исследована продукция Ш-2 у интактннх, ишушшх животных или у карликов. Было установлено, что у ишушых кивотных активность Ш-2 в суперяатаято несколько выше, а у кашиков с повышенной чувствительностью тимоцитов к М-1 - ¡несколько кино контрольных значен"й. Шесте с тем, золотки .карликов этого типа после добавления к лимфоцитам селезенки иммунных или интакхньк нивотных не бли-яли на продукцию Ш-2. Напротив, спленоцитц карликов. с понз-енной чувствительность» тимоцитов к Ш1--1 лнгдбировали продукцию ИЯ-2. Наконец, у карликов I типа в отлично от карликов других типов снижена экспрессия рецепторов к Ш-2.

У мышей СБА, анфациро! ишнх ВГ, также розадались ¡шютике, отсталою в росте, у которых был значительно подавлен ответ спленоцитов на КснА, ЛЕС и антиген ВГ. Хроме того, иммунные мыши СВА характеризовались очень слабым специфическим ответом на антиген ВГ или полным его отсутствием. При исследовании супрессорной активности спленоцитов "карликов" СГЛ было выявлено две группы кавотнчх, соответствующих карликам 3 и 4 тиюв у мышей С573Ь/5 • При подсчете карликов того ала иного типа у иншей 057ВТ,/б и'СВА (основные свойства карликов разных типов суммированы л таблице 6) было установлено, что карлика 1,2,3 к 4 типов встречаются у мкзей С57Лъ/в з соотношении 33,3:10:36,7:20 , а у мыкей СВА - в соотношении 0:0:62,5:37,5. Следовательно, у напотных линии С57йг,/6 , которые реагирует на ЕГ как на мнтоген, часто развивается медленная гриппоэпая ля£екцпл с сильной иммунодепрэссией, выявляемой как по специфической, так и по \ несиецафкческой бласттрапсфэршции. Карлики со специфическими суп-рессооамл. встречаются только у мшей С57ВЬ/б . тогда как соотношение карликов 3 а 4 типов примерно одинаково у язвотннх обеих линяй-

Чувствительность супреосорпых клеток к облучении и к цпклофос-¿¡яну указывала на то, что иммуносупрессизные свойства спленсцитоз карликов, по крайней мере частично, связаны с Т-лшфоцитами. Для того, чтобы проверить это предпелояоние, были проведены опыты по обреем -хе спленоцитов карликов монодлоиалзыпага антителами против антигена Глу-1 п комплемзнтом.

Полученные данные свидетельствуют о том, что полного удаления суиресссрнхос клеток с помощью антител протав антигена Ч'^г-", не происходит. В большей степени чузстзктелькы к зтш антителам .специфические супреосорк, блокирующие пролиферацию под действием антигена ВГ. Спонтанная пролиферация иммунных спленоцитов (возможно, что такая пролиферация также -индуцировала антигеном НГ), по-видимому, контролируется супрессорки'д клетка!,ш, прасутствущима в селезенке нор-

ь'ильщк î.5kce.k СЯА и блокирующими после обработки их антителами против Thy- 1, а такке в селезенке карликов СБА.. У тар ликов C57BL." , наирэтив, часто присутствуют клетки, стиыулирукцие "спонтанную" пролиферацию норг/альннх и иммузных спленоцктэв, Зти клетки .такке иоче-BSCT после обработки суспензии антителами против антигена Tbv-1 . lia основании полутелнкх ранее данных о пониженной продукции M-I у карликов î.'chho б«ло думать, что ингибирущее действие саленоци-';оъ ха.рлчков связало о их А-клеткими, Поэтому в последующих экспе-pHVôEi-bx спланоцитн ка^шкоЕ I и 2 тага адсорбировали в .лунках кик-реплажетсв. Нйиракрепляэдкеся клетки удаляли, а в лунки добавляли слленоцг.гк Л'шунних ¡¿цветных с удаленными. путем адсо.^ции А-ддетка-wa (АГ-хготкц). Было установлено, что на подложка из А-клеток ?лр-.tiiicà I очна лщу.чкыс А*"-клзтки гораздо xyœ отвечают на КонА, а от-Гзст А"-клз?ок ча антиген БГ на изменяемся. Однако А-клетки

¿]щлз:й£ мш!ей ы. госсгакавлавади ответ на КскА л антиген БГ у кар-лвяоз. ...

Поскольку подавление (Зласттрансфоркоцки могло быть связано с !70еи>..с.чк&2 способностью А-клеток карликов продуцировать йЯ-I, в ча-ота опытов в культуру бет добавлен экзогенный KK--I. После добавления i'Ul-I к ¿\лзтд2м карлика I типа наблюдается лишь .кратковременный .углдир}ющий ьерхедг, Одним из мзхййкзмоз, посредством которых А-.ч jk¡íKf ко.ут кнг.ибировать ОА&сттрансформациэ, является продукция •:рсст<ггл&вдидоз. Чтобы иекдочить этот мзх&пизи жлунодепросспя, были. лревйдевы олни; по добг.елеяаз а культура издомстацина. Ичцомзта-цин ;:<? ьосст&яаьлнх-ал отчет на лонА у карликов.

HjBr.cïHo, что адсорбция на пластике не- обеспечивает полного удаления А-клетох. Гораздо более полного удаления мо^но добиться после обработ: а клеток каррагаяаком. токсически дейстзуивдм па $а-:Х'Ц>1'ск'. Спленоциты карлика I ти!>а, обработанные каррагинаяом, сти-уудирозеллсь КонА значительно сильнее, чем необработанные с-лленоцк-чн. Кромз того, клетки карлика, обраоотанние иигомицансм С, полно-C'XTùo блокировали бласттрохсфэр.\к.цию иммунных спленоцитов под действие:* КояА й антигена Зй\ Клетки карлика, o6r.atíovaHi?Hó дололкительнс к&рргггшлолг, ярайтлоеска че действовал на йдасттраасфоршця» iaj-;:уяпьи опленсцитов. нкдуцирогеняугз КокА или. аптигенг.м БГ (Рис. 2). V кермиои 2 типа удастся добиться полного восстановлена!:'а дахе стадулдцзч (5л&стгс?.ь-сйоруздаи под действием КонА. ели антигена ЕС' послй обработка епленоцатов ккррагиканогл и замг.ш А-члеюг. на А-;сле :кн n^-r/hnsy. jüiegthux 3).

Рас.2. Влрчнвз обработки саленоцатов карлика I мла карраг кланом на их про. лфзративяуэ активность и супрьс&орные свойства.

К - спленсцита карлица I ша л"наа С5?вь/С, • К^ - тз &е спленоци.тн,.обработанЕыз.кзрраг^даяоп, И - сплеяицаш сяягенннх швей, шмушгЕрозякяш: ВГ, И+К, И+К^ - пролиферация в смеси клеток И, К и К, (К л К^ дополнительно обработаны мтомицином С).

редставлекн данные, полученные при исследования,отзеа-а на ХочА (А) онтптени ВГ (Б). Заштрихованные области - сионтгштоо вялгкеляе' Н-тимадияа. По оси ордана? - уровень включения изотопа (кляульсц кику ту х Ю-3.. Тоеккз вертикальные линий, - ста ндартяая' овъйка«

50-!

со I ,

.л

Г-"

I

К

[0-1

| |Нг|

г&л--

К К+А А Кок А

К К+А А

В

Раг.З. Р^сотансвлеяае пролифвратавной.активности спленоцагов карлика 2 тала путем, их. обработка каррагананоа и до- ^ базлепил к обработаиньм меткам А-клеток селезенка от слоенных мышей, амму^зароаааннх заруссм гриппа. К - ссделоци?!: .кзрлауа. 2 чтаа у мазей леш с57бь/б, 1С,-- те ко сикеноцатк, обработанные каррагакаяом, А ~ А-клзчки селезенки сангешкх иммунных шгсей. Приведены данное, полученные пра асслодоьана?. ог-вета на КснА (/ V антагени ВГ (Е';. Заштрихованное облаем - сьовтияное вклтеш ^Б-трлыдана. По сс.ч ординат - уровень включения (импульсы в ми! ту х Ю~° . Тош:аз зертакальнне ланаа - стандартная саябгл.

М.С.Гордеевой высказано предположение, что одной аз прачки явления карликов .з результате гриппозной у ¿ереуенгах

вотянх является нарушение трапсплацентаркого зарьура для. лмг.фмга-з. гатерл. 3 результате цитотоксичесзде Т-лгч&вдтн, сп.-л^блчже антигенам ВГ, прояпкают в плод а вызывают разрушение 51н£лБг,ро1;-дн-х клеток. Л шлю иднке клетка карликов не лиз^оовадг макроса'!1. царовэянцх шюттх, ш.оказызел^цататохсичссдое дэйстзие на - . рмальнне сшгенкыв мпкро|а"И как ..о антигену.: БГ, так к без .к?го. и данные ведтверздалн продполояекае М.С.Гордзевой»_Волее таге, еле введения днтактннм йарсмеШ11м мышам в неонатальнс.. периоде еток лимфатических узлов.от зарахенлкх сингоннкх кшзотных у родив-гося потомства наблюдалось скижеаае. нролгйератдвной актиллоогг. яеноцигои н.культурах, сте.мул?.рова;шнх "оУЛ. иля атгигеном ВГ, лако, -сплзношпы -гаких мышей не о на е ни агл су про с сор лого де«стагя .бласттраксформанта клеток а,в,гунних язвотнкх под действгск Ком А лиуларовашг отлег' я& антиген ВГ, что. позволяет кх о трест л к леркам 3 типа. По-видимому, причиной деявленгя х&рллхоз I тюа, лла-их.зс'е основные признак медленной гриппозной'инфекцил, являатпя ..только.цитотокойчеслае лшфцяты патера, зроякка«ада! через гррлс-йцеитарк:;й барьер я лазкрукцде ян&щарованшю клеткл. плода. .. Таким образом,, во шогкх исследованных .з работе шдельяиг. сло-*12х введете акфвжцгояного' агента, обладападю сажшгке мптогбк-бш.свойст_азс1» сопройойдав-гся .т<уяоделресеге2 и ектизаадой. суп-ссораш: клеток 1см. таблицу 4). В чей причала прзгмуезстзесной тязацли код действием Ш суярессорнкх члзток? В настоящее Ерс-г/л ветать яа этот вопрос окоЕчатаоьно не представляется воглогши. аако ойравдает ва себя внимание, что и годосодздэшщ!годогез, г соко матогенкий стафилококковое эят.еротокслущ, л лзру;. грвгла . взивавтоя с антителами П класса, а. точнее с 1-Е ».'й-кгеиамн мша . эй. антигенами человека, кат-орио, как игшзоуко, служат злем&я-гъи» зтрикциа при акглзадяк С2$-+СВ45В+ "С-клетох хелпгров.1 таза,.дг-^яружшх Т-супргссоря. Крою того > о ацтлгекйиг. ггстосов'лгстжАО-з рзагпрукт и.Ьуог.ьлгЛз } виру о лйктатдегвдрогзяазы, так*а оЗла-. ощяе сальной катогеяиой акмаиэстх» (таблица ?). Гатогенная актая-зт1> 1Ш0 бкопируется аятитглама протка 1а антигенов. С аятигегзла. класса связывается ряд вкусов. Наконец, в аекоторкх случаях окружена ассоциация ийфекогсших агентов с друггам кродстазлтелнмьч ^уяоглобулулювогс; супорсэтайсгза: БИЧ - о гач , белка А --.г ■огмятгш кглчуноглсбу.таноз, коклшкого техсак« - с а^тагеаск с>';?„ ■.едявдк в комплекс Т-клеточ.чого рецептора.

Таблица 7

Ассоциация инфекционных агентов" в их штогенных факторов с ситагепами глазного' комплекса" гистооовместимозти и; другэми ь-одекуламн имуногясбуликового суперсемейства "

.Читогешыз йактсры и содзр- ¡Молекула главного!Другие м.лекул! г^а^ие их аяфеищшныз агэкты {комплекса'х*асто- jимму ноглобули-

совместимэсти Í класса|п класса

нового супер-

■-¡семейства.

1. Щ«рогеп lí.ar-ttoitiaiB . (Colé /:.С. ei; ai., 1962)

1

i2-. С'ГПбйЛОКОККОБ1/5! знтероток-j . сияы 'Уь .вьЬег 2. ot; al. ,1957)

¡3. Вирус гриппа (Sealzo i..', j ■ ¿ad-ífs B., -1935)

k. Xh70ri1.-t.al3 (Col« fc.C. üt al., 19Ь2).,

Я1П ОГакаЬыиа Г. ofc ai.,1?90).

Вирус лахтатдегдпрореназы

ЛцеПОЛИПуСУ CPaaoC G. «t al.,

Б'лт.-ус леса Согтки

с.А... 1936) лир., СУ илшуаодссЬацЕта ■ человека и обейсян (S.-..it;e>ifcaü al», 1933)

lü. Белок X стафилококка

(íüuegtíwa 2., Salto H.„19>56)

7.1,. КокяыаккЁ юксан

•••• íCílray li.S. e^ al.: 1999)

12. Тсхсин савдвока токсического ff.OKa-í (УсМуацо et al., ч£9£>)

+ (1-3) Т-клеточный pe цептор (TKP)

+ (1-й) T.K? + (i-£) tkp

+

+ (I-A) •f (1-Е)

íüay-1'

ío-фрагмент пммуяогло були-поо

TKF- (CD3)

+ (i-a)

Следует? отмотать. что срактачоски-все известные ь настоящее время растительные ю-.тетечы оказывают osoe миоганное действие пу тел1: суязызелей с Т-адехэчнш рецептором. Случайна лн эг<? они^? ¿'ззестло, что яра янеклеточ»ЛЕг гшйэкцкшх адфетацююшй агент ража кается зял кл«ткк.к прокипает в кое то.о.кс посредством фагоцитоза и только, ь iceт,га( лотеиппааьго обладдоадз способностью зкопоессв ревзть la aHi'iti'tííiu (главным образом ь макрофага). Основным заиу:?-.фактором в диплом случае являются антитела, продукция которых

до.4. Спс со Оы интернадазацаа молекул главного комплекса тис то-" совместимости и гдпотегаческке способы арсцессанга аята-генов внутри- и внеклеточных а.нфекцион:с&- агзнтов.

Молекулы главного комплекса гаотосоаместашста (.VHC) I класса ¡кспрессароваяы практически на всех клетках организма. Сантезаро-занные внутри клетка-хозяина антигены внутриклеточного аафекцкояно-х> агента частично разрушаются састеко2 протеаз цитозоля с растаем _ Захватана, а затем попадают в везикулы с днтерлалЕЗОвакншга аш заново саятезароваяннми молекулам;! МНС I класса, не содержала [а антигенов.

Молекулы МНС П класса экспрессированк только на часта клеток эргааазма (на макрофагах, дэндратаческях клетках, В-ламсфцагах), зпособпых в той или аяой степени ¿агоцатарэлагв внеклеточные цфу-;иокнне агенты. Эндосош (фагоссмн) с колок/лама МЯО П класса Cía антигенами) а внеклеточная инфекдаонгам згенгом, не ссдергздае молекул .ГКГ I класса, сливается с лазосомама. Часть алтдгенлого материала, задаренного от протеалаза' 1а ко леку лает., резкспрессару-ется на поверхности клетки.

контролиру тся Г-клетками хелпераыи« Активность Т-хелпероз ресгрик тарова: а именно по 1а антигенам. ' ' .

Внутриклеточные инфекционные агенты могут размножаться и вне, а внутри нлетки-хозяина, у них вырабатываются специальные приспособления, позволяющие проникать непосредственно в датозоль милуя сагодазосомн. Кроме антител пра внутриклеточных инфекциях защатную функцию выполняет КМ, а клеткой-хозяином йогут стать практически любье клеточные улекекты организма. Почти на всех клетках оргаяизьн зкспрессдрэванн антигены гистосовместимости I'класса,-которые слу-кат элеменгаг-ш рестрикции пра октивааии ЦТЕ. Таким образом, существует,. по-вздгмому, определенная взаимосвязь кеаду .пом инфекции и рестгшгцйонадя специфичностью Т--клеток» Но каким образом иммунная сас'сеш ио»ет отличатъ внутриклеточный инфзкционшй агент от внеклеточного?

. Известно, что аятерналазадая антигенов главного комплекса гас-тосошестшоств I-класса наблюдается, например, у Т-клеток а. резко усаливается под воздействием.матогенянх факторов. При этом актигз-нн 1лНС П класса. (1а ангагеш), • которые. также могут присутствовать на Т-лак£сацитах,' не пронакавг по неазвестшм причинам в везикула и актагеначд.1 класса. В цитоасле эндосойн, содержащие антигены МНС 1 класса, объединяются не о лизоссмаии,.а с везикулами зндопла: катгчеслого ретикулума, л котором, вероятно, происходит процессияг белков, синтезированных внутри, клетки, и объединение их с антигена' на I класса (Рас. 4).

Совсем иначе происходит автерпалазацая молекул МНС в Б-лклфз-цатах. В зток случ&с в эндосош проникают только антигены И класса а одновременно могут аопадать н .компонента, содержащиеся виз клетки, а также АГ. Прсцеоо инхерналазацаа резко усаливается под д'ейот ваечк Вчштогенов. Экдоссмы с 1а. антигенами не содераат антигенов I класса, а цатозоле : ча объединяются с-лазосомама, в результате чею попавшие сюда внеклеточные компоненты разрушаются, но часть аз шус объединяется с 1а. антигенам. Учатыз&я эти. данные, ыоано предположить, что актагекы гистссозместамоста исходно служила ре-цаптора?л£1 к наиболее шарокораспростраленнш детерминанта?/, анфещ^-ошъж агеотов, часть аз которых является в Мф. Фзкомек Ж-рестрак возник как отаот на необходимость распознавать внутрд- а внз-аМекцха и вклэтать только определенные гьенья иммунной с-.астад»!. О этой точка зренал Щ жкно рассматривать как козгаонеаты отзечпщао за ак га водна первой е^е шлоопецифичной линии зацаты от акейкцаа, которая не срабатывает только в том случае, когда лроас-

>дит быстрая активация специфичных. именно для данного микроба 'прессоров. Такая активация наблюдается, как правило, лрилрезмер-)й митогснкой активности инфекционного агента и, всзиохпо, яри прз-туааственном овязызааии МО и 1-Е антигенами.

вывода

I. Все исследованные з настоящей работе инфекционные агента геют факторы, оказывающие неспэцис^ическое стимулирующее действие i пролиферация ликфоидкык клеток, янтактного дон^вихте-ид йоктарн -D). Видимое отсутствие штогенкого зфректа связано, .как равило., наличием у микроорганизма компоаентов, ингибаругпдас пролиферации змфоцитоэ или с генетически детерминированной нечувствительностью ззяина к данному у'Ф.

2-Из культуры Цгсор1азва ar'jhrltiiis выделен и охаракторизо-1К новый А-аазиол:,«рй Т-клеточный мятоген (МАО) с модекуя&рной. ььс-■jü 23-25 кД, обладающий способность® стимулировать дродуздив ¿u--5рлейкин-1- и иятерлейкЕн-2--подобных факторов, активировать се one-адлческие хелперкые д специфичные для H.arthriii<ü3 с/аресоотще аетка у. миней СВА,. чувствительных к токсичзекому д-гййгыв МЕксплай» i. Стимуляция миковдазменнш ммоггном клеток. ан?згеяс.пеца$итеско'2 -хелаериой линии,.. полученной от шгзй G3A, ьрггодгг к дятяблда этих клеток на специфический антиген (гаи те тезированные шоресцепк-'.зотяоцианатом сингеьныз клетка).

. 3. У мышей л. ¿ид ё57ВЬ/б , быстро выводяэдх ía.artbxUiáin з уряакигма.и не чувствительных г. ее токсическому дэЗстакз, аты отвечают на Ш.С только в присутствии г-мер^ачтоэадяолг. При гом активируются исключительно хелперные клетки.

В макроднстах Sarsocystis gigantea , вз Вь'гыРалздщс re&epa-азозаняой инфекции и быстро выводящихся яз jprsK23.va чолоззка, Знаруг.ен Т-кле точный китоген - галактсзоспецифический лектия с элзкулярной массой GO кД, актлзнрузаций только Т-хлетки

не действующий ш спз+ Т-^шлфзцлты.

5. И>жукизацпя морских c.buzoz ангагекнымд препаратами. ыелс-

ella pneumophila или Brucella ¿bcrfcus , содергаСУл^«. Ь'Ф, лрх&о-

ат к яоданланпэ пролифератилвой актипност!* слленоцдтсв в :ечб2г& ервой недели, пасла иммунизации. степень которого -rev зыпе, чем безе сильное матогеяяое действие данякй препарат CKiSvsee-: в ус.:о~ зях 1л vibro. Подавлеяке сменяется стикудяцаг "1 дооле облучгзся атпгенных препаратов, вызывающего разруяенкз лмодо.тасахарвд' эпрововдае-ся увеличением протехтивкой аъ-тиваости амагеяоз брукы-,-.

6. После иммунизации морских свинок антигенными препаратами легионелл, а. такке после инфицирования юрских ^винок. b.pneunophii подавление, пролиферативной активности наблюдается на-дюне индукции в организме супрессорких клеток,

7. Сравнительный иммунологические анализ патологии, развившс--цейся у потомства мышей линий CSA и С5?ВЬ/б , зарааащшх во второй чсловине беременности- вирусом гриппа А (штамм wax ), показал, что у. мышей СВА, не реагирующих Еа вирус, гриппа как на - неспецифкческий мктоген, не образуются, под. воздействием вертикальной вирусной ияфея цен супрессоры, либо выявляются только не специфические супреосорннэ клетки. У мышей C57B.V6 ,. реагируювдх на вирус гриппа как на мато-ген, выявляются чувствительные к каррагинану з»русслецифичеокие и песпецкфьческие суарессэрн, подавляющие.продукции фактора с активностью и'—ерлейкина-I. Активность вирусспецифаческях.супрессоров

в. большей.степени зазисит от Т-клеток, активность неспецафических" супрессоров - от макрофагов.

8. Недатогенные компоненты Boztie^eiia pertussis , а также слабоматогеннке белковые антигены L.pneumophila не зачищают соот ветственно мыией от внутрицеребральнсго заражения бордетелламя■ к морских сзинох от аэрозольной инфекции, вызванной легионзляами. Напротив, лимфецглы, активированные в условиях, in vitro, бактериаль-.ныки антигенами, оказывающими «итоженное действие (коккшншл токсином, инактивироваянши прогреванием йруцедлами), после введения з организм донот>а клеток или сингеняого аивотного оказывает защитное действие. ...

9. Данные, полученное в настоящей работе, н данные литературы свидетельствуют о том, что связь мевду митогенной активностью .икфек ционного агента, его вирулентностью или патогеяность» отсутствует. Однако при. инфекциях, вызванных ii.artfcritidis, в.gigantea , а такке при врожденной гриппозной, инфекции активация под воздействием Mí сулресссрных клеток (в собенкости. специфических) увеличивает . тяжесть инфекционного процесса, в то зрэмя как неспецифическая акта вация хелперных клеток, напротив, .наблюдается при сравнительно легком ее протекании, чю указывает на определенную взаимосвязь между функциональной активностьи стимулированяш; М5 клеток и ролы. даляои № в нротивоинфекциояпм иммунитете.

10. В совокупности результаты исследований, проведенных, в настоящей работе, и данные литературы показывает, что Т-клеточну ул-тогены выявляются преимущественно у инфекционных агентов, в защите от которых оснсБЬ'ую роль играет кте^очннй иммунитет (факультативны?

и облагатные внутриклеточные инфекционные агенты). У внеклеточных микроорганизмов, занята от которга обеспечивается главным образом факторами гуморального иммунитета, встречаются, как правило, и Т-, и В-клеточпне. мнтогенн, часто секретаруемц. в среду.

II. Высказано предположение, что Мф филогенетически является одними из наиболее древних компонентов инфекционного ..агента, рецз п-торами к которым служат молекулн Г.ИЗ. Особенности лнтерналкпации антигенов МНС -I л П классов позволяют 1а молекулам ассоциировать преимущественно с внеклеточным ин^екционяшт агентами, прсииказ-чими з клетку только посредством фагоцитоза. Прл внутриклеточша янфзкцнях с проникновением чясЕпкционяого агента непосредственно в цитозоль создаются условия для ассоциации его антигенов л МО с го-лекуламп МКС I класса. Сеношн г.ЗС -р о с т р лкци я мог возникнуть как ответ на необходимость распознавать внутри- ъ внеклеточные инфйк-цнояяце агенты с целью зклкчския.только тех ззеаьеа иммунной систо--га, которые играют основную заздтную роль при данном типе инфекций.

Материал» диссертации дологэн^ на:

1. Кевдународной конференции молодых ученых социалистических стран по медицинской макробиологии я инфекционной лммуяолсхрл. л'осивз, 1581.

2. Всесоюзной конференции "Иммунологические аолек.ти инфекционной аатологиа'1. Таллии, 1981.

3. П и IX ¡легкие тлтутскзх научных конференциях "С&кторы есте- . отвзыного'пммунитета.пра различиях фйзлологйчэских л патологических состояниях". Челябинск, 1932, 1983.

4. Всесоюзном симпозиуме, посвященном 100-летял создания Кеч— лаксгкм Л.И. фагоцитарной теории гщунитета. Москва, 1933.

5. УШ :1 X межобластной мечниковской конференции молодых З'ченцх. Одесса, 1985, 1967.

5. Пленуме проблемной коыксснд Теоретическая к прикладная пяфзкцаоннал иммунология". Еальчих 4 1Э86.

7. Елзпумо проблемкой комиссии по латеьтнш я особсопаскыл; цнфакцЕЯМ "Химиотерапия а хаыаопроЗилактака варуспых инфекций, особоопаскпх и медленных вирусный инфекций". Мине*, 1986.

8. 10 рабочем сйзе'лакаа "Ква-ишк". Бориш, Г?С6.

5. Мекдународком симпозиуме по шялутастгмулятораи. Галле,1386.

10. 2 Всесоюзной конференции по инфекционной иммунологии. Саратов, 1987.

11. Уяжобластнсй кон$ерзвдьп по я.рограьмэ "Пероастзнцая". Мозкьа, 1987,

12. "'а хмадукародкой конференции "Свободные радикалы в мед дане" - .Вена. 1983, .

13. Республиканской конференции "Молекулярные и клеточные ; аектн клинической иммунологии". Москва, 1989.

14. ХУШ съезде Всесоюзного, общества эпидемиологов, укробш гс.а а паразитологов имена И.И.Мечникова. Алма-Ата, 1989.

15. Всесоюзном пленуме проблемкой комиссии по йедацааской : робиолсгии. Рата, 1939.

16. Объединенном заседании проблемной комиссии Научного со по ьшкробаологиа АМН СССР "Мгдиципская макробаологаа" а "Теорет веская а прикладная амлуаологая" совместно с секи,, эй микробаоло ШОМЭП гам. 'л.И.Ыечшасова. Москва, 1989.

17. Всесоюзном научном общества иммунологов. Москва, 1989.

1С. I Есёомозпотл иммунологическом съезде. Сочи, 1989.

19. Мезкд/аародай конференции по молекулярным аспекта:.-. ма; кого ответа я .аяЗекцпоышх: баболезаяай. Рам, 1233.

20. 5 международном совещании Европейской рабочей хруппы л лзгазнеллзззу. Москва, 1990.

Список г>бо?, опублкчоъачкак по материалам диссертации

I. Изменение популяций ламфоадных клеток селезенка крыс а сей П1 1 эксперилзаталхкой анфокяпк Мусор .иилг. /

Л.Р., Санак А.И., Хоробрых 3.3.. Пронин а.Б. // Труды Томского ЕН#!ВС. - 1581. - Т.30о - 0,267-273.

¿. Клуляя Д.Р., 'Пронин А.В., Хоро£ръ'1 Б.В. Антигенные мар:-а субпопуляцш! ламсооидных клеток крас // Иг/кукол. - Г?31. - & с С. -5-13.

П?"1систекция »1усор1азаа агьаг1ыа1ел некоторые показ?1! клйо'очного иммунитета пра экспериментальном артрите крыс / Вул} вам В.З., Залытга А.В., Броши; А.Б., Каган Г.Я. // Научн.докО школы. Биок. наука. - 198л. - .V 8. - С.23-25,

4. Пронин А.З. ¡\1акоплаклеанчя анфеацаг: как возмогшая арач! разги-гая аутоидзАунатека // Семакар молодых ученых по мздшцшиа макрос'аслогии а инфекционной иммунологии. - М., 1981. - С.55--5'

С. 1?рсктерасгаг.а нерт&чкого амлу иного ответа при макспла: вир/саой анфс-кцаа / Каулея Д.?., Сааан А.В-, .Хоробрых В.В., Пр; А.В..// Елв/укологическде аспекты анфекцаошой патосогва. - '¿ял: 1931. - С.46-47.

6, Яролан А.В., Каулен Д.Р., Хоробрых В.Б. Участие А--.члет; ояооредо^аяшд. :.!уецу1э.'даа агеьгчысИз аммуносупрессаи а шл?!

¡табуляции // Факгори естественного иммунитета при различных физпо-югическкх и патологических состояниях. - Челябинск, 1932, - Büh.S. • С. 97-93.

7. Механизмы активации лимфоцитов поликлональными митогенамл

' Хоробрых В.В.,Хирадзд A.Ö., Пронин A.B. и др. // ¡'мщеоЛ. - 1383. ■ И 2. - С.25-38.

8. Хоробрнх В.В., Пронин A.B., Адгезивные свойства клеток пери-юнеального экссудата крыс в условиях шксдлазыенной инфекции // Иммунология. - 1983. - № 2. - С.53-56.

9. Хоробрых Пронин A.B., Кирхин Методы : -схановки >еакции бласттрансформации в микрошдифакациа'// Иммунол. - 1983. ■КЗ. -С. 76-79.

'10. Клеточный иммунитет и маколлазмк /• Сакин A.B., Пронин A.B., [оробрнх В.В. и др. // Иммунология. - 1933. - В 4. - С.21-31.

11. Пронин A.B., Хоробрых В.В. Мкгогенноа действие KycopiEsna irthritidis на лшлфоидные клетки крыс // Баял. окспер. биол. кед. - 1983. - Т.95» J» 4. -.C.89-9I.

12. Пролиферация клеток селезенка в ответ на Bordetella рог-mssis / Хоробрых В.В.,.Бартенева Н.С., Снегирева Н.С., Пронин A.B., ¿зримская О.С. //Еюля. эксдср. биол. 'мед.и- 1953. - Т.95, £ 0.. -

H2-II4. .

13.логический анализ патологии, развивающейся у мыьей з результат вертикальной передачи заруса гриппа / Мирчиня S.U., Зуоз В.А., .Прения A.B. и др. // Вопр.ьирусол. - 1984. - 2. -

). 162-166.

14. Хоробрых В.В. ...Пронин A.B., Санин A.B. 0 злиякта ь^-сй?1аята irthiirldio на. ЛЕмфоядяые п кроветворные клетки лашзй и крыс // актуальные вопросы кикоплазшлогиь,.-- Ереван,. IS35. - €«,34-40..

7.5. Хоробрых В.В., Пронин A.B.; Снегирзаа А.Е. Роль 'А-клеток 1ря митогенной стимуляции лимюоцитоз микоплазмой // Е.мккробиол. -С985. -Ä7. - С.5У-63.

16. Хоробрых В.В.', Пронин А.В, Действие некоторых видов шко-глазм.на цролиферативяуа активность лимфоздкнх клеток мышей // Им-тунологая..- 1985. -.№ I. - С.37-39.

17. Горина Л.Г., Пронин A.B. Частичная счистка и некоторые )в0йства кктегешого. фактора b^ceplasaa archi-itidis // 2.г/икро-5иол. - 1985. — № 10- - С.53-66л

18. Специфические и не специфические реакции им,!уяитета у хтх-ХИКОВ, инфицированных Ureaplasma urealiticim / Проаин A.B.,

Тктц Ji.-Ю. Kë-_iep В,, Больман 3. // Миколлаэмц. - M., I9S5. -С.66 УС.

19. Прозоровский C.B., Пронин A.B., Саклн A.B. Иммунологические кеханазш персистенцаа мнкоплазм // Вестник АМН СССР. - 1986 - И 10. - С.43-51.

20. Пронин А.Б. Механизм развития аутояымунитэта при ияфевди онных заболеваниях // Молекулярная и клеточная регуляция инфекционного яммунлтета. - M., I9d5, --C.4Ü-47.

21. Саши A.B., Ярокпхг A.B.. Николаева Т.Н. Стимуляция и подавление образования кроветворных колоний в селезенке мншей под в действием сингсккых сплсноцитол, активированных ког"анэ.валиюк А Еклл. эксаер. биел. мед.,- 1986. - Ï.20I, П 5. -.0. 63?.

22. Проник A.B., Мэрикская Û.C., Кузина Т.Н. Синтея иятерлеЯ кила 2 и иэдущяя рецепторов к лятерлейкану 2 под действием мико-плазжееого мп^стен:его фактора // Теоретическая мкдеккологпя а ля$еюую/шя иммунология,- Нальчик, 1006« - С. 123-124.

23. Проягл A.B., !&рчикх Е.П.,Зуев Б.А. Иммунодепрессия при медленной гриппозной. инсенда у мшаой: возмоякая р^лъ супрессорш клеток. // Антивирусные вещества при экслерименталзкой терапии вирусных ивфекцйй. - Минск, IS86, - С.122-127.

24. Амелина И.А., Пронин A.B., Лалаева H.A. Митогеяяое рейс вис фазы Bordetella pertussis // Е.КККробаол., 1987. -•'S 7. - С. 6-10.

25. Китогспкое действие XesionelJa pneumophila : соотноие. 11ролг4«рарующцх Т- к ?-:слс.гск езкеняется после иммунизации / Про хин A.B., Кеоохина I.E., ТартакзвскиЛ К.С. и др. // Балл, экспер бкол. irjд. - 1988. - Т. 105. - # 5. - C.573-57G.

2Q. Si ;тракт.кз макроздет сзркэспорлдий - новый ?-клеточный .•¿итогел / Ги.тц Х.-й., л!олтаг Т., Пронин A.B., Кипе В..// Тзорети ческая и прш^едаая гч$скцяогл:ая лгьуяологхя. - Саратов, 1987. -С. 105-196.

27. Пронин A.B., Дргновская H.A., Калахоз Й.Е. Влпяиве гамг. облучения ка яхздунологические свойства бруцеллезного лротектп.аяс ¿'Л7г.1'сил // Радиобиология. - 1988. - Т.23, » 3, - 0.403-407.

2С. KitoRoniciT? of oxtracts froia HarooC7stts gigantза ou huaan зла aiiiicd lymphocytes / "iefci. К.-J., iTosacaï Th., Tronin i.V. et al. // ïofcai J. jfcpsr. Clin. Mai. --1966. - V.11, Suppl. o.

2Э. .Ирония A.B..Санин А.Б.,.1аясева ILA. Протектиппсз дейс?--е.димфоцлтов, активированных кохлюпиш токсансм в культуре // акторы гуморального и клеточ!даго_.лм^ппт5т& при. различите- ^иаксдо™ глэских и патологических. состояниях...-.Челябинск, 1983» - С.

30, Сания A.B., Пронин А.Б., Бартенева Я,С. Pojx r-cf ¿моток регуляции гемопоэза. // Стволовая крове творя.' ■ клетка в норме ц зи патологии. - Томск, IS88. - С.23-24.

.31. The action of alphc -tocoferol on prcd-jctiorj of .tL-1, Ur-2 у lmunmocoapeteat cells and pi ascitic а«аЬгам phospbori.lat 1 on / alinovbknya V.V., Gevorkiaa M.S., Prcmln Л.У. et al. / " j<Tee rile ale in Eödlclne. - Vienna, -. P. 5'*. ..

32.Толь супрассоряых iuiqtok при врожденной гриппозной еяФзйдгя мшей./..Мирчинк Е.П., Пронин А.В,, Зуе; S.A., Деевэ А.В, // Копр.

ирусол, -. 1988. -JS.6. - C.659-6SI. -

.. - 33. Зубешев U.K., Проачн A.B.'; Тартаковскш И. О,..Сравните дь-ый.акалаз специфической и леспевдскгее окей . прол;'.!рер--щ.я^ лпмдхьдннх таток' селезенки и легких, морских овипок после имунизацои a ¡^разная легиояелламп // йимукомодуляторы в инфекционной патологии.-

,19ö8. - С..'170-176. ... .....

"34....Сугроссоры иктерлейкияа I. не декствужаз. яг. продугшнл; ип-^рлейкияа 2. при гриппозной инфекция у .мшей / Яроняя А,В,„ Мгрчкшг . .11., Зуев В.А.,.Деева A.B. // Иммунология, -.IS8S, - 5 I, - С.25-32.

.. 35. Ca,fflH A.B., Пронин A.B., Бартенева К.С. Выявление аубтепу-щий.'Т-длвток, оказкваюдях ошюэдтаое действие на колоягеобр^Буи-№ функция стволовых кроветворных клеа.к.// Молокулярняз к клоточ-;з аспект клинической кшуяологш:. - М.,.1989. - 0.37-43.

36.. Буев В.А., Пронин A.B., Мирчинк ТЗ.П, Кинологические мл-шизмк медленной гриппозной.инфекции, у мдше^ //.'.С?з* докл. Х7Ш . >езда ХЮЗШ пм. Р.«.Мечникова. - Алма-Ата, 198Э. - С. 215-216.

37. Мкксплазмвнные артриты человека я иц.-соторке уехакизмы пх .тогенеза / Горина £.Г., Вульфоъкч Ю.В., .äu.v£ßH A.B., Рако-чсхе.?

B., Пронин.A.B., Жезоркеева И.В. // Вестник АШ СССР. - 1989, -6. - С. 84-87. ....... . ........

ЗВ. Пронин A.B. г Мирчинк E.H., ДееЕа A.B. ймцу&одз.чрессиз пря дленной гриппозной инспекции. у мшей: вогладкие ервчада развития // Всесоэзн, иммунол. съезд. Тез. докл. - Г, iL - 'iL, Г-Ж. - C.,:J59.

33, МзучлкЕв протектиптд: с-нсйстз разлачнчх яктггепоз легло- ■ лл прд зкспоришиталькай легяонеллезной иейзкцпр. / ^артаков'.-кий

C., Зубатев И.К., Кошжсв В.Ф., Не тросов В.В , Ерусланок Б.Ь.,

HaooziiEa I В., Радионов A.B., Дмитриев Б.А., Сучков Ю.Г., Проюш A.B., Прозоровский С.Е., Молокова В .В. //Ж. макробиол.а- 19:3. R 5. - С. 61-35. <:•-

40. кинологические свойства главного .белка внешнзй мембра легионелл / Зубашзв И.К., Проник.A.B., Тартакозскии И.С. и пр. /, S. лцкробиол. - 1990. - Ü 6. - С. 38-92.

АГавар, ЛГаир - антигена аваруаентных а аирулектанх легионелл

АГ^ - аатаген мутантяого штамма легаонелл

А!^ - форлзлиназзрованнал культура L.pneuaopMla Philadelphia

AJlîi - антиген L.pneumophila , полученный ПО мзтоду Fleeter .

БЕ*! - бе так внегшаЗ мембрана

ЪШ - бзласаоаоласахарэдаый антиген бруцелл

Ь'БПА - оолученака £ПА (доза I Мр),

ВГ - аирус.грапиа ..

.U0 1 - декотсачеулъбл?

SL. - актерлейка.ч

КоиА - ксаканазадан А

К? - кокяшянй токсак

ЛПС - лкпополпоахарид

МАО - жтогон из супернатанта M.arthxl'i;i£l&

РБТ - реакция блаеттранофор.чацаа

СГа - лекгил S.çigantoa

CI'ü - экстракт. S.gigdstea

CK' - среда-культаварозаная

CFA - смешанная, культура лимфоцитов

СИ - cpt-да. центрифугирования

ФТХ - фатогемлгглютанак

•ЫТЦ - флзисресдеваи: лтаодианат

A'FiC - та Jэг histoco^patiblMty roupies

Список сокращений

Ф . В условиях развития пандемии инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), важное значение для организации эпиднадзора и проведения противоэпидемических мероприятий, а также для постановки индивидуального диагноза приобретает своевременная диагностика случаев заболевания. В настоящее Бремя ВИЧ-инфекция распространяется на территориях, ранее считавшихся свободными от данной инфекции (страны Восточной Европы, Азия). Характер распространения может приобретать формы вспышек, госпитальной инфекции с формированием целой сети вторичных очагов, как это было установлено в СССР (Элиста, Ростов, Волгоград) и Румынии.

Помимо инфекции, вызываемой ВИЧ 1, в последнее время все более широкое распространение получает вирус иммунодефицита 4 человека второго типа (ВИЧ 2). Несмотря на то, что в СССР выявлено только несколько случаев инфекции ВИЧ 2, большой поток иностранных студентов из регионов эндемичных по ВИЧ 2, может привести к широкому распространению этого вируса в нашей стране. В связи с этим разработка диагностики инфекции, вызываемой ВИЧ 2 является актуальной.

Большинство методов диагностики ВИЧ -инфекции основано на определении антител к белкам ВИЧ в крови или других биологических жидкостях. С этой целью чаще всего используются различные методики, основанные на принципах иммуноферментного анализа (ИФА). С целью исключения возможных ложноположительных ре-р акций, полученных на первом этапе исследования сыворотки, проводится подтверждение этого результата с помощью иммунного блоттинга. Однако применение подтверждающих тестов значительно повышает стоимость обследования и интерпретация результатов иммунного блоттинга представляет определенную сложность и требует специальной подготовки. Избежать большого количества лож-ноположительных реакций можно повышая качество тест-систем, применяемых на первом этапе обследования.

Эффективность диагностики зависит от качества и специфичности антигенов, используемых в тест -системе, ее оптимизации и стандартизации.

В первых диагностических тест-системах использовались антигены ВИЧ, полученные из культуры клеток, зараженных ВИЧ. Недостатками таких тест систем являются: 1) недостаточно высокая специфичность; 2) низкая стабильность антигенов в процессе хранения; 3) недостаточная стандартность и . воспроизводимость результатов 4) необходимость соблюдения особых мер безопасности в процессе производства и использования тест -систем. Кроме того в СССР отсутствуют клеточные линии - продуценты ВИЧ.

Одним из путей совершенствования диагностических тест -систем является использование пептидных аналогов основных им-мунодоминантных эпитопов ВИЧ, полученных методом химического синтеза (синтетические пептиды) и генной инженерии (рекомби-нантные белки). Достоинствами таких тест -систем являются: 1) высокая специфичность; 2) возможность проведения дифференциации между двумя типами БИЧ; 3) более высокая стандартность и воспроизводимость теста; 4) невысокая стоимость; 5) отсутствие необходимости в особых мерах безопасности.

Однако при разработке и оценке качества диагностикумов на основе пептидных аналогов эпитопов ВИЧ, необходимо использовать достаточное количество образцов сывороток крови, полученных из различных географических зон, в связи с возможными вариациями антигенов вируса, а соответственно и специфичности антител. Кроме того в состав панели необходимо включать сыворотки крови от лиц, инфицированных ВИЧ, находящихся на разных стадиях заболевания, а именно, период ранней сероконверсии, развернутую клиническую и терминальную стадии, а также образцы сывороток от детей, инфицированных ВИЧ.

Несмотря на то, что качество используемых тест-систем постоянно повышается, избавиться от всех недостатков пока не удалось. Недостаточная чувствительность тест -систем снижает эффективность обследования населения, а большое количество ложноположительных реакций приводит к значительной затрате средств на проводимое обследование. Применение тест -систем, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью позволило бы избавиться от перечисленных недостатков. Таким образом разработка и внедрение диагностических тест-систем, обладающих такими качествами и позволяющих выявлять антитела к ВИЧ 1 и ВИЧ 2, является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы является совершенствование серологической диагностики инфекции, вызываемой ВИЧ, путем разработки диагностической тест -системы, обладающей высокой чувствительностью и специфичностью, для выявления антител к ВИЧ 1 и ВИЧ 2.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Охарактеризовать антительный ответ к отдельным анти-ф генным структурам ВИЧ и сформировать панель сывороток крови, содержащих антитела к ВИЧ.

2. Изучить антигенные свойства синтетических пептидов с помощью созданной панели сывороток.

3. Подобрать оптимальный состав смеси антигенов на основе синтетических антигенных детерминант для иммуноферментной тест-системы, выявляющей антитела к ВИЧ 1 и ВИЧ 2.

4. Оценить чувствительность и специфичность разработанной тест -системы и сравнить ее с другими диагностикумами.

Научная новизна полученных данных.

Научная новизна представляемой работы заключается е том, что дается характеристика синтетических антигенных детерминант, аналогов различных участков белков ВИЧ, по их способнос-* ти взаимодействовать с антителами к ВИЧ, что позволило оценить роль различных участков белковых молекул в развитии иммунного ответа и выбрать иммунодоминантные зпитопы ВИЧ.

Учет штаммоспецифических различий в сиквенсе эпитопов поверхностных гликопротеинов позволил разработать оптимальный сорбент для ИФ тест-системы.

Предложен метод сорбции биотинилированных синтетических антигенных детерминант на твердую фазу с использованием стреп-тавидина в качестве носителя, что привело к повышению чувствительности реакции и сокращению количества антигена при сорбции.

Практическая ценность работы. % Практическая значимость работы заключается в том, что на основании полученных материалов была разработана тест -система "Пептест", предназначенная для выявления антител к ВИЧ 1 и ВИЧ Ф 2. В настоящее время разработанная тест-система внедряется в НПО "Вектор" г. Новосибирск под названием "ВИЧ-тест 1+2".

Используя данные, полученных при создании панели сывороток крови, содержащих антитела к ВИЧ, разработан критерий оценки результатов тестирования сывороток крови методом иммунного блоттинга, а также схема проведения серологической диагностики. Данные материалы учитывались при разработке методических рекомендаций "Серологическая диагностика инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека, иммуноферментными методами".

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Антигенные структуры вируса иммунодефицита человека и гуморальный иммунитет.

Вирус иммунодефицита человека является этиологическим агентом, вызывающим у человека заболевание иммунной системы, приводящее к развитию синдрома приобретенного иммунного дефицита (СПИД). Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) - это ретровирус, который поражает преимущественно клетки, имеющие рецептор CD4.

На рисунке 1 схематически приведен геном вируса и его основные антигены. Ген gag кодирует р55 - полипротеин предшественник. При его расщеплении образуются меньшие структурные белки р17 и р24. Ген env кодирует высоко иммуногенный предшественник гликопро-теин - gpl60. При его расщеплении образуются гликопротеины gpl20 и gp41. Ген pol кодирует фермент обратную транскриптазу (р66/р51) и белок эндонуклеазу р31.

Исследования, проведенные с помощью методов иммунного блот-тинга и радиоиммунопреципитации, показали, что антитела против gpl60, gpl20, р24 и р17 при инфекции ВИЧ появляются первыми, через 2-4 недели выявляются антитела к gp41 и антигены молекул, Еесом от 50 до 65 кД (2-8). Антитела к р31 формируются в период от 3 до 6 недель, после появления самых ранних антител (2,5,8). Титр всех антител продолжает нарастать в течение нескольких месяцев и затем стабилизируется у бессимптомных носителей. У пациентов с прогрессирующим заболеванием по мере приближения к СПИД, продукция антител к р24 ослабевает и они исчезают у 2/3 пациентов (9,10), а антитела к поверхностным антигенам - gp41, gpl20 и gp 160 остаются щ геу Ж Ш т дод

УрГ ури р55

Р01 епу

Ий пе{ р47 р24 р15 др 460 р7 р9 р22 рбб/р5\ рЗ/ драо др44

Рисунок 1. Строение генома и основные антигены ВИЧ 1.

2,8,11-13). Антитела к р31 также исчезают при приближении к СПИД, но не в тот период, когда исчезают антитела к р24, а позже(13). Также важно наличие антител к р17, т. к. антитела к этому белку появляются одними из первых и пропадают при ухудшении состояния пациента раньше, чем антитела к р24, что позволяет назначить необходимое лечение своевременно. Кроме того, в ряде случаев антитела к р24 исчезают и появляется антиген р24, но этот процесс бывает не связан с ухудшением состояни пациента, а изучения уровня антител к р17 и р24 позволяет повысить надежность предсказания течения инфекции (14).

Во многих исследованиях, проведенных различными авторами, дату инфицирования установить не удалось, но сероконверсия с характерной картиной антительного ответа имела место во время или вскоре после развития острого симптомакомплекса, вызываемого ВИЧ. Эти случаи описаны для групп реципиентов крови, наркоманов, вводящих наркотик внутривенно и гомосексуалистов (4, 15-17). Сероконверсия наблюдается у большинства лиц в течение 2-3 месяцев после первичных проявлений ВИЧ инфекции. Однако, данные, полученные в последнее время свидетельствуют о том, что вирус может находиться в латентном состоянии, сроки которого точно не определены (18). И только пременение метода PCR(polymerase chain reaction - реакция цепной полимеризации ) позволит установить длительность этого периода. Кроме того, по данным некоторых авторов, у этих лиц присутствуют антитела к,регуляторному белку, кодируемому геном пеГ (19).

Из серологических методов при изучении сероконверсии лучше использовать те, которые обладают наибольшей чувствительностью при определении антител р24 или к поверхностным гликопротеинам с высоким молекулярным весом. Burke и др. (13) показали, что чувствительность комерческих наборов для определени антител к индивидуальным вирусным белкам значительно отличается, в частности, тест-система фирмы "Abbot" больше отражает уровень антител к gp41 и р31, тогда как другие тест-системы больше коррелируют с уровнем антител к р24, особенно наборы фирмы "Du Pont". Таким образом, данные о се-роконверсии будут различаться в зависимости от применяемой тест-системы (5).

Как и при других заболеваниях вирусной этиологии, невозможно определить антитела к ВИЧ на ранних стадиях. Кроме того описаны случаи, когда у пациентов выделяли вирус, но они при этом оставались серонегативными(2б,27). Такая ситуация встречается крайне редко, кроме периода в течение трех, а иногда больше месяцев, пока не образуются антитела к вирусу.

Данные, приведенные выше, относятся к ВИЧ 1, но в последнее время появилась информация о распространении ВИЧ 2 ео всем мире и в СССР (44-46). ВИЧ 1 и ВИЧ 2 различаются по молекулярному сиквен-су более чем на 55%, но они имеют много общих черт в морфологии, геномной организации, а также в биологии. Так же как ВИЧ 1, штаммы ВИЧ 2 обладают антигенной и биологической гетерогенностью (47). Антитела в сыворотках крови, полученных от лиц, инфицированных ВИЧ 2, могут перекрестно реагировать с антигенами ВИЧ 1 (48-50). Перекрестная реактивность наблюдается и при использовании метода им-муноблоттинга. Чаще всего такая перекрестная реактивность отмечается с белками, кодируемыми геном gag, хотя антитела к поверхностным белкам ВИЧ 2 также могут связываться, но в меньшей

- 14 степени, с поверхностными белками ВИЧ 1 (51-54).

Использование очищенных белков из ВИЧ 1 и ВИЧ 2 при проведении иммуноблоттинга, а также синтетических пептидов из иммунодоми-нантных областей трансмембранных белков ВИЧ 1 и ВИЧ 2 показало, что некоторые сыворотки крови взаимодействуют и с белками из ВИЧ 1 и из ВИЧ 2 (46-60). В ряде работ было высказано предположение, что такие лица инфицированы и ВИЧ 1 и ВИЧ 2. У нескольких пациентов было проведено выделение обеих вирусов и определена их провирусная ДНК с помощью PCR (61,62).

Сравнение продуктов регуляторных генов из ВИЧ 1 и БИЧ 2 показало, что белки из ВИЧ 1 ne Г, tat, rev и vpr имеют соответственно 34, 31, 36 и 35% идентичности по аминокислотам с ВИЧ 2, но ген vpu уникален для ВИЧ 1 (63,64), a vpx для ВИЧ 2 (65,66).

ВЫВОДЫ

1. Собрала панель сьшороток от лиц инфицированных ВИЧ, состоящая из 516 образцов сывороток крови с антителами к ВИЧ 1 и 22 сьшороток с антителами к ВИЧ 2, которая является хорошим инструментом для решения научных и практических задач .

2. Исходя из данных о взаимодействии 36 тестированных синтетических пептидов с антителами в сыворотках крови, подобрана смесь антигенов, используемых в тест-системе "Пептест" для сенсибилизации планшетов, которая состояла из трех синтетических антигенных детерминант, последовательности которых взяты из gp41 штаммов LAV-BRU и LAV -ELI ВИЧ 1 и из gp36 ВИЧ 2.

3. Применение авидина в качестве носителя для биотинили-рованных пептидов позволило повысить чувствительность ИФА более, чем в два раза и снизить количество синтетических пептидов при сенсибилизации планшета в 10 раз.

4. Разработана новая иммуноферментная тест -система "Пептест" для определения антител к ВИЧ 1 и БИЧ 2. Чувствительность и специфичность ее при анализе 397 позитивных и 1000 негативных по анти -ВИЧ антителам образцов сывороток крови, составили соответственно 100% и 99,5%.

Сравнительные испытания тест -системы "Пептест" показали, что она не уступает лучшим образцам сущест-вуюцдих тест -систем.