Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Инфекция, вызванная вирусом Эпштейна - Барр: эпидемиологические проявления и лабораторная диагностика

ава: ^>ук

С

Бошьян Роман Евгеньевич

ИНФЕКЦИЯ, ВЫЗВАННАЯ ВИРУСОМ ЭПШТЕЙНА-БАРР: ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА.

14.00.30-«э пи демиоло гия»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 о ДЕК 2009

Москва - 2009

003488686

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН

Научный руководитель доктор биологических наук

Наталия Владимировна Каражас

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Евгения Петровна Селькова доктор медицинских наук, профессор Станислав Николаевич Кузин

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Защита диссертации состоится «25» декабря 2009 в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 001.007.02. в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (г.Москва, 123098, ул. Гамалеи, д. 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан « 24 » ноября 2009

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Е.В. Русакова

Актуальность проблемы.

В последние годы в России, как и во всем мире, отмечен значительный рост числа лиц с иммунодефицитными состояниями различной этиологии. Так, численность ВИЧ-инфицированных увеличилась с 6918 в 1997 г. до 403100 в 2007 г. (Г.Г.Онищенко, 2009). На фоне ухудшающейся экологической ситуации зарегистрировано увеличение числа пациентов с соматическими и онкологическими заболеваниями, сопровождающихся развитием иммунодефицита (А.А.Воробьев, 1991, 1994). Имеющиеся для значительной части населения России социальные условия приводят к развитию стрессов, широко распространены наркомания и алкоголизм, особенно среди молодежи, что в значительной степени детерминирует формирование иммунодефицитных состояний.

Приобретенные иммунодефицита, в том числе и СПИД, у подавляющего большинства людей сопровождаются различными осложнениями, в том числе оппортунистическими инфекциями, которые могут проявляться в виде различных заболеваний (Р.Р.Редфилд, Д.С.Берке, 1988; C.A.Glaser, 1994). Этиологическими агентами оппортунистических инфекций являются бактерии, грибы, простейшие, а также вирусы, среди которых важное место занимают герпесвирусы (С.В.Прозоровский, 1998). Номенклатура СПИД-ассоциированных инфекций, согласно классификации ВОЗ от 1987 года, действующей в настоящее время, включает 23 инфекции. Исследователями установлено, что оппортунистические инфекции часто встречаются в виде ассоциаций (М.ВЛавдовская, Лысенко А.Я., 1990; Т.Н.Долгих, 2000; Н.В.Каражас, 2005). О возрастающей роли оппортунистических инфекций в последние годы свидетельствуют данные серологического мониторинга цитомегаловирусной инфекции (ЦМВ) в Омской области (Т.И.Долгих и Н.С.Запарий, 2008). В течение 15 лет удельный вес взрослого населения с наличием специфических антител к ЦМВ класса IgM и IgG вырос на 33,1% - с 56,7% (1992 год) до 88,8% (2006 год).

Одним из ведущих этиологических агентов оппортунистических инфекций является вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ), так же, как и ЦМВ, относящийся к герпесвирусам. Вирус Эпштейна-Барр вызывает такие заболевания, как инфекционный мононуклеоз (единственная официально регистрируемая нозоформа), лимфому Беркитта, назофарингеальную карциному. Инфекция, вызываемая ВЭБ (ВЭБИ), не всегда сопровождается специфической клинической картиной и часто протекает в виде скрытых, латентных форм. Необходимо отметить, что ВЭБИ, как правило, сопровождает онкологические, гематологические, бронхо-легочные заболевания, значительно осложняя их течение и ухудшая прогноз. Инфекция, вызываемая вирусом Эпштейна-Барр, номинирована как СПИД-ассоциированное заболевание (Лысенко А.Я. 1995).

Системы эпидемиологического надзора за ВЭБИ, так же как и за другими герпесвирусными инфекциями, в полном объеме нет, что в значительной мере связано с трудностями выявления и учета этой патологии.

Инфекционный мононуклеоз, представляет лишь незначительную часть от всех возможных вариантов ВЭБИ, поэтому только на основе официальных данных регистрации этого заболевания невозможно организовать эффективную систему эпиднадзора за ВЭБИ с полноценными информационно-аналитической, диагностической и управленческой подсистемами.

На возросшее значение оппортунистических инфекций в современном мире указывал академик РАМН A.A. Воробьев. Он одним из первых предложил использовать термин «популяционные иммунодефициты». Именно академик РАМН А.А.Воробьев предложил изучить вирус Эпштейна-Барр, как возбудителя оппортунистической инфекции, что послужило основанием для выполнения данной работы.

В этой связи особую актуальность приобретает, с одной стороны, оптимизация лабораторной диагностики ВЭБИ, включая определение антигенов вируса, с другой стороны - расширение контингентов, подлежащих обследованию на наличие маркеров этой инфекции, для активного выявления явных и скрытых форм ВЭБИ. Подобные подходы уже реализуются в системе эпиднадзора за социально-значимыми инфекциями, такими как гепатиты В и С, при этом лица с активно выявленными HBsAg и анти-ВГС регистрируются как носители вирусов-возбудителей этих заболеваний, что позволяет более точно оценивать масштабы распространения этих инфекций.

Изложенное выше послужило основанием для разработки диагностикума, позволяющего определять признаки текущей инфекции (антигены ВЭБ), оценки распространения ВЭБИ среди населения различных возрастных групп лиц на отдельных территориях России, выявления групп риска, а также для разработки алгоритма серологического обследования с целью диагностики различных форм ВЭБИ.

Цель исследования.

Характеристика клинико-эпидемиологических проявлений различных форм ВЭБИ с применением комплекса методов современной лабораторной диагностики.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать динамику и тенденции заболеваемости инфекционным мононуклеозом в России и на отдельных территориях в период с 2000 по 2008 годы.

2. Разработать диагностикум для выявления антигенов ВЭБ методом непрямой реакции иммунофлуоресценции и определить его диагностическую значимость.

3. Изучить закономерности возрастного распространения ВЭБИ на основании иммуноструктуры населения Москвы к вирусу Эпштейна-Барр.

4. Определить частоту выявления маркеров ВЭБИ при патологических процессах, сопровождающихся иммунодефицитами, у различных групп больных (детей и взрослых).

5. Разработать алгоритм серологического обследования различных групп пациентов для диагностики различных форм ВЭБИ.

Научная новизна.

Сопоставление данных официальной регистрации и серологических данных, полученных в исследовании, позволили установить, что официально регистрируется примерно 0,5% случаев острой ВЭБИ у взрослых и детей. Выявлено несоответствие между показателями заболеваемости ИМ ( 20,9 на 100000 населения) и результатами оценки иммуноструктуры населения к ВЭБ (нарастание сероположительных с возрастом достигающее 90% у взрослых), что свидетельствует о более широкой циркуляции ВЭБ среди населения, чем это отражено в данных официальной статистики.

Получены новые данные о широте распространения ВЭБИ, выявлено более 90% доноров, сероположительных по отношению к ВЭБ, при этом антитела, характерные для острой фазы заболевания, были обнаружены у 4-6% обследованных.

Показано что инфекция, вызванная ВЭБ, часто протекает с клиническими симптомами ОРЗ, при лабораторном обследовании таких больных было выявлено 17.7% детей с маркерами острой формой ВЭБИ; Впервые определена частота выявления маркеров ВЭБИ у разных категорий больных с иммунодефицитными состояниями: максимально часто они были выявлены у больных гемобластозами с пневмонией (26,8%), реже у ВИЧ-инфицированных больных туберкулезом (25,6%), меньше всего у больных гемобластозами с поражением ЦНС (20,5%)

Практическая значимость

Результаты работы были использованы при составлении методических указаний «Герпесвирусная инфекция», утвержденных департаментом здравоохранения г. Москвы в 2007г., материалы которых используются при чтении лекций на кафедрах Детских инфекционных заболеваний ГОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития и Инфектологии ММА им. И.М. Сеченова.

Впервые разработана экспериментальная тест-система НРИФ для диагностики антигена ВЭБ в исследуемых материалах, а так же разработан алгоритм диагностики ВЭБИ, что позволяет усовершенствовать лабораторную диагностику ВЭБ- инфекции в системе эпидемиологического надзора. Опубликованные материалы

По теме диссертации опубликовано 15 работ из них 2 в журналах рекомендованных ВАК РФ.

Положения выносимые на защиту

В настоящее время официальная статистика учитывает только незначительную часть инфекции вызванной вирусом Эпштейна- Барр, поэтому

для более полного выявления случаев инфекции необходимо применять комплекс современных лабораторных методов исследования при обследовании различных групп больных и здоровых лиц.

- Разработана экспериментальная тест-система НРИФ для выявления маркеров «свежего» инфицирования - антигенов ВЭБ в различных биологических материалах. Данная тест-система позволяет выявлять антигены ВЭБ у лиц с иммунодефицитами, которые не в состоянии ответить на внедрение возбудителя выработкой специфических антител.

Определены современные эпидемиологические характеристики ВЭБИ -наличие большого числа инфицированных на различных территориях РФ, значительное количество лиц с маркерами острого заболевания среди доноров, большое количество лиц с маркерами острой ВЭБИ не охваченных официальной регистрацией, среди различных групп больных с иммунодефицитными состояниями

Апробация диссертации

Материалы диссертации доложены 27 июня 2008 г на конференции кафедры Микробиологии, вирусологии и иммунологии ММА им.И.М. Сеченова, на конференции «Дни иммунологии в Сибири» Омск 20-23 сентября 2007 г., научно-практическом симпозиуме «Национальные дни лабораторной медицины России» Москва октябрь 2005г.

Апробация диссертации состоялась 3 июля 2008 г. на научной конференции отделов Эпидемиологии, Природноочаговых инфекций и Медицинской микробиологии НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 126 странице машинописного текста, иллюстрирована 12 рисунками и 20 таблицами. Работа включает обзор литературы описание материалов и методов, 4 главы собственных исследований, заключение выводы и приложение. Список литературы содержит 147 работ из них 32 отечественных и 115 иностранных авторов.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена в лаборатории эпидемиологии оппортунистических исследований, НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Объем исследований представлен в таблице №1. Методы исследования Эпидемиологические методы

В работе применялся ретроспективный эпидемиологический анализ - анализ уровня структуры и динамики заболевания. (Покровский В.И. 2004)

Таблица №1

Общий объем проведенных исследований

Контингент!.! Город/ Количество обследованных Исследуемый материал Определяемые маркеры

Доноры Москва 118, Омск 93, Чебоксары 100 Сыворотка крови Антитела кл. ^М, ДОЕЛ, ГдОХЛ.

Беременные Москва 92, Челябинск 45 Чебоксары 100 Сыворотка крови Антитела кл. 1§М, ДОЕЛ,

Беременные с ВИЧ Челябинск 45, Москва 100 Сыворотка крови Антитела кл. ^М, ДОЕЛ, ^С1ЧЛ, антиген

Больные туберкулезом с ВИЧ-инфекцией Москва 77 Сыворотка крови, мокрота, клетки крови Антитела кл. ^М, ДОЕА, ДООД антиген

Больные гемобластозами Москва 168 Сыворотка крови, мокрота, клетки Антитела кл. ^М, ^ЕА, ДОХА, антиген

Дети с ОРВИ Москва 78 Сыворотка крови, мокрота, лимфоциты крови Антитела кл. ^М, ДОЕЛ, ДОХА, антиген

Дети больные инфекционным мононуклеозом Москва 30 Сыворотка крови, мокрота, лимфоциты крови Антитела кл. ^М, ^вЕА, ДОХА, антиген

Больные ОРВН Москва 1997 Сыворотка крови Антитела клЛцМ, ДОЕА, ДОХА

Итого 3047

Серологические методы

Определение специфических антител IgM, IgGEA, IgGNA к ВЭБ, а также определение антител IgM, IgG к вирусу простого герпеса 1 и 2 типа, цитомегаловирусу и антител класса IgG к вирусу герпеса человека 6 и 8 типа проводилось с помощью метода иммуноферментного анализа (ИФА). Тест -системы были изготовлены ЗАО «Вектор - Бест» г. Новосибирск. Нами, совместно с лабораториями НИИЭИ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, для расшифровки этиологии пневмоний и ОРЗ были использованы серологические методы, направленные на выявление маркеров свежего и ранее перенесенного инфицирования в отношении M.pneumoniae, M.hominis, CI. Pneumoniae.

Молекулярно - генетические методы.

Наличие специфической последовательности нуклеотидов ВЭБ определялось с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Исследования проводились с помощью набора реагентов «Авиценна - EBV-ПЦР», производства АО «Авиценна» г. Москва.

Метод основан на использовании процесса амплификации ДНК. В данной реакции используются 2 немодифицированных праймера, синтезированных на основе известной последовательности нуклеотидов ВЭБ.

Микробиологические методы - были использованы для расшифровки этиологии ОРЗ и пневмоний. В клинических лабораториях проводились исследования по выделению от больных культур: S. aureus, S. epidermidis, Н. influenza, Klebsiella spp, P. aeruginosa., St. Viridans, S. aureus, Enterococcus, Acinetobacter.

Статистические методы.

Для определения достоверности полученных результатов вычисляли среднюю ошибку процентного отклонения - т. Достоверность различий показателей определяли при помощи t-критерия достоверности Стьюдента (Ашмарин И.П., Воробьев A.A. 1962).

Результаты исследований.

Анализ заболеваемости инфекционным мононуклеозом на отдельных территориях Российской Федерации в период с 2000 по 2008 годы.

Динамика заболеваемости инфекционным мононуклеозом в указанные годы представлена на рисунке 1.

1 25

2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 _годы

—•— РФ .....«— Москва —*— Чувашия Челябинская область —ж— Омская область

Рисунок 1. Динамика заболеваемости инфекционным мононуклеозом в отдельных регионах Российской Федерации в период с 2000 по 2008 годы.

В течение анализируемого периода заболеваемость ИМ в России стабильно росла с 6,8 в 2000 до 12,1 на 100 тысяч населения в 2008 году, что соответствует выраженной тенденции к росту (Т=+8,05%). Анализ динамики заболеваемости ИМ в отдельных регионах России показал, что и уровень заболеваемости ИМ и ее тенденции различны. Максимальная заболеваемость ИМ зарегистрирована в Москве - в анализируемый период она составляла от 16,4 в 2000 до 20,8 на 100 тысяч населения в 2008 году (умеренный рост -Т=+3,08%). В Омской и Челябинской областях заболеваемость ИМ в течение

анализируемого периода была существенно ниже. Так, в Омской области в 2000 и 2008 годы показатели составили 9.1 и 13,6 на 100 тысяч населения соответственно, причем максимум зарегистрирован в 2005 году - 14,3 на 100 тысяч населения. Динамика заболеваемости в Омской области имела выраженную тенденцию к росту(Т=+5,70%). В Челябинской области уровень заболеваемости ИМ при стабильном росте с 6,4 в 2000 до 13,1 на 100 тысяч населения в 2008 году был несколько ниже, чем в Омской. Самая низкая заболеваемость ИМ среди анализируемых территорий в 2000-2008 годах зарегистрирована в Чувашии (гшп/тах - 1,4-4,1 на 100 тысяч населения) при тенденции к умеренному росту - Т=+2,5%. По нашему мнению такой разброс показателей свидетельствует, главным образом, не об особенностях эпидемического процесса ВЭБИ на данных территориях и не об отсутствии случаев ИМ, а о проблемах с диагностикой и, соответственно, регистрацией заболевания. Подтверждением этому могут служить официальные данные об отсутствии случаев ИМ на протяжении пяти лет и более в ряде субъектов РФ (Кабардино-Балкария, Республика Алтай, Чеченская республика, Ненецкий автономный округ, Усть-Ордынский Бурятский автономный округ, Чукотский автономный округ).

Инфекционный мононуклеоз является «детской» инфекцией, что обусловлено преимущественным воздушно-капельным путем передачи ВЭБ. На рисунке 2 представлена заболеваемость ИМ детей до 17 лет на отдельных территориях России в 2006-2008 годы.

2 120

% 100

и я

о 80

2 60

«

х

40 20 0

104,5

54,1 53,5 ■

9,4 Ю,4

59,8 543 --52,6 51,5

1111

Чувашия

Челябинская Омская область область

О 2006 И 2007 □ 2008

Рисунок 2. Заболеваемсоть инфекционным мононуклеозом детей до 17 лет в отдельных регионах России в 2006-2008 годы.

Обращает на себя внимание значительно более высокий уровень заболеваемости ИМ детей и подростков до 17 лет на анализируемых территориях, а также значительный разброс показателей. Уровень заболеваемости ИМ детей в РФ превосходит совокупную заболеваемость в 4,5-5,5 раза. Максимальная заболеваемость ИМ зарегистрирована в 20062008 годы в Москве - 95,7-104,5 на 100 тысяч населения. Минимальная заболеваемость - в Чувашии 9,4-13,3 на 100 тысяч населения. Различия

составляют 7,2-11,1 раза. Можно заключить, что основное распространение ВЭБ получает среди молодежи и благодаря своим свойствам закрепляется в популяции. В последующем ВЭБ выступает в качестве возбудителя оппортунистической инфекции.

Важной характеристикой, позволяющей оценить распространение ВЭБИ, может служить частота обнаружения ее маркеров в индикаторных группах здорового населения. В рамках данной работы обследованы доноры крови, как мужчины, так и женщины, нескольких регионов. Исследования выполняли с помощью коммерческих иммуноферментных тест-систем производства ЗАО «ВекторБест» (г.Новосибирск). Результаты обследования представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Частота обнаружения маркеров ВЭБИ у доноров некоторых регионов России.

Регион/ маркеры ВЭБИ Москва Чувашия Челябинская область Омская область

Маркеры ВЭБИ 97% 94% 96% 95%

Антитела к ВЭБ и ДОЕЛ 4% 4% 6% 5%

Полученные данные позволяют констатировать тот факт, что маркеры ВЭБИ выявлены у подавляющего большинства обследованных доноров (94%-97%). Это соответствует уже известным данным, полученным различными группами авторов, как в России, так и за рубежом. Важно отметить, что у 4%-6% доноров выявлены маркеры острой фазы (антитела класса 1§М и ^йБА), что характеризует их, с одной стороны, как резервуар возбудителя инфекции, с другой - как активный источник инфекции, учитывая их принадлежность к донорам крови и реализацию артифициального механизма передачи. Следует отметить, что у 56% от общего числа обследованных доноров с наличием маркеров острой инфекции выявлена поздняя реактивация ВЭБИ, о чем свидетельствуют антитела ^ОЫА в титре более 1:2000. Антитела 1§ОЕА были определены у 22% из них, что свидетельствует о ранней реактивации. С таким же удельным весом обнаружены антитела класса 1£М, свидетельствующие о первичной ранней инфекции. Важно отметить, что все лица с маркерами острой ВЭБИ среди доноров были старше 30 лет. Необходимо подчеркнуть, что значительная часть пациентов, нуждающихся в систематическом переливании крови и ее препаратов, являются пациентами с гематологическими и онкологическими заболеваниями, чаще всего, в тяжелых формах. Эти заболевания, как правило, сопровождаются значительным поражением иммунной системы пациентов, причем не только из-за основного заболевания, но и проводимой терапии. На таком фоне попадание в организм вируса Эпшетйна-Барр может

привести к развитию ВЭБИ как оппортунистической, что является тяжелым осложнением и ухудшает прогноз основного заболевания.

Важной характеристикой интенсивности эпидемического процесса любой инфекции является иммуноструктура населения к возбудителю. В рамках данной работы в Москве проведены обследования 1997 человек в возрасте от 0 до 74 лет, в том числе 1193 (59,7%) мужчины и 804 (40,3%) женщины, на наличие маркеров ВЭБИ. На рисунке 3 представлена частота обнаружения маркеров ВЭБИ в различных возрастных группах детей.

до 1 года 1-3 года 4-7 лет 8-14 лет 15-18 лет

□ антитела к ВЭБ

I маркеры острой ВЭБИ

Рисунок 3. Частота обнаружения маркеров ВЭБИ у детей различных возрастных групп г.Москвы.

У детей в возрасте до 1 года отсутствуют маркеры острой ВЭБИ, а антитела к ВЭБ выявлены лишь в 10,0% случаев. По нашему мнению наличие маркеров ВЭБИ у этих детей обусловлено трансплацентарной передачей материнских антител и не свидетельствуют о перенесенной или имеющейся инфекции. У детей более старших возрастных групп отчетливо выражено нарастание удельного веса серопозитивных лиц - с 28,5% в группе детей 1-3 года до 65,4% - 15-18 лет. Важно отметить, что частота выявления маркеров острой ВЭБИ с увеличением возраста детей также возрастает и в возрастной группе у 15-18 лет достигает максимума - 11,3%. С нашей точки зрения, есть основания считать, что именно в этой возрастной группе интенсивность эпидемического процесса максимальна. Следует отметить достоверность различий в частоте определения маркеров острой ВЭБИ между возрастной группой 15-18 лет и другими сравниваемыми возрастными группами - 1-3, 47 и 8-14 лет (t=2,0769, t=2,9800 t=2,7059 соответственно).

У лиц более старших возрастных групп выявлены другие закономерности в распространении маркеров ВЭБИ (рисунок 4).

Маркеры ВЭБИ, характеризующие общую инфицированность у лиц в возрасте старше 30 лет обнаружены с максимальной и одинаковой частотой -91,0%-91,8%. В то же время частота обнаружения маркеров острой ВЭБИ с

увеличением возраста обследованных лиц уменьшается - с 6,8% в группе 1930 лет до 1,0% - в группе 51-60 лет.

',0 90,0 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0

82,3

91,4

91,0

91,8

-90,5-

1)6,8

4,6

¡3,4

1,0

¡0,0

19-30 лет 31-40 лет 41-50 лет 51-60 старше 60

И антитела к ВЭБ__И маркеры острой ВЭБИ__

Рисунок 4. Частота обнаружения маркеров ВЭБИ у взрослых "здоровых" людей различных возрастных групп г.Москвы

У людей старше 60 лет в рамках данного исследования эти маркеры не обнаружены, что свидетельствует о минимальной активности эпидемического процесса. Таким образом, иммуноструктура к ВЭБ населения г.Москвы свидетельствует о том, что интенсивность эпидемического процесса ВЭБИ наиболее велика у детей и нарастает до 1518 лет (максимальная частота обнаружения маркеров острой ВЭБИ - 11,3%). Среди взрослого населения эпидемический процесс значительно снижает свою активность, но тем не менее остается достаточно интенсивным, о чем свидетельствует довольно высокая частота выявления маркеров острой ВЭБИ у лиц 41-50 лет - 3,4%. Необходимо отметить, что выявленные закономерности возрастного распределения маркеров ВЭБИ среди населения г.Москвы отличаются от характерных для инфекций, передающихся посредством воздушно-капельного пути. Обычно для этих инфекций максимальная интенсивность эпидемического процесса приходится на дошкольные годы детей и минимизируется к 15-20 годам. Полученные данные о превалентности маркеров острой ВЭБИ у детей до 17 лет и взрослого населения г. Москвы в сопоставлении с данными регистрируемой заболеваемости ИМ позволяют оценить удельный вес манифестных случаев инфекции к общему количеству острой ВЭБИ. У детей это соотношение составило 1 к 202, у взрослых - 1 к 220.

Разработка экспериментальной тест-системы для выявления антигенов ВЭБ.

Определение антител к ВЭБ различных классов может быть недостаточным для диагностики ВЭБИ, особенно, если у пациента имеет место иммунодефицит. Важным дополнением к существующим методам выявления антител к ВЭБ может служить детекция специфических вирусных антигенов.

В рамках данной работы разработана экспериментальная иммунофлюоресцентная тест- система, позволяющая выявлять антигены ВЭБ .

Для выявления антигена вируса Эпштейна - Барр в биологических жидкостях и биоптатах тканей была разработана экспериментальная тест-система. Для указанной тест-системы отобрали с помощью ИФА из сыворотки крови пациентов гипериммунную сыворотку содержащую специфические иммуноглобулины к ВЭБ в высоких титрах.

Сыворотки, отобранные для пулирования, должны были содержать антитела классов ^М, ЕА, при отсутствии данных маркеров проводился отбор сывороток, содержащих антитела ЫА в титрах не ниже 1: 10000. Для обеспечения высокой специфичности реакции сыворотки тестировали на отсутствие антител классов 1§М и к другим герпес вирусам.

После этого сыворотки объединяли в пул, который проходил повторное тестирование на антитела всех классов антител к ВЭБ, причем титр ЫА должен был составлять не менее 1:5000.

Высокую чувствительность реакция приобретала при соблюдении оптимальных условий ее проведения. Для разведения гипериммунной сыворотки физиологическим раствором было выбрано соотношение 1:20. При инкубации препарата в течение 15 минут наблюдалось 50% свечение клеток, инкубации в течение 30, 45 и 60 минут наблюдалось 100% свечения клеток. Время инкубации со стандартно разведенной люминесцентной сывороткой (1:32) было определено аналогичным способом. Инкубация в течение 15 минут дала 50% свечение клеток, инкубация 30, 45, 60 минут дала 100% свечения клеток.

Для исследования на наличие антигена в биологических материалах образец указанной жидкости помещают в пробирку с физиологическим раствором хлорида натрия, после чего интенсивно пипетируют. Материал центрифугируют при 1000 об/ мин. 5 минут. Надосадочную жидкость удаляется, проводят повторное центрифугирование, после чего осадок помещают в лунку 18 луночного предметного стекла, высушивают при комнатной температуре и наносят гипериммунную сыворотку.

Образец помещают во влажную камеру на 30 мин. при I = 37С. После инкубации препарат отмывают в проточной воде 30 мин и снова сушат. Далее на образец наносят раствор флюоресцентной сыворотки и радомина и повторно инкубируют во влажной камере. После очередной инкубации препарат отмывают и сушат. Препарат микроскопируют в УФ свете, при X-400-кратном увеличении. Использовали микроскоп Ломо ЕС Люмам РПО 11.

Для определения специфичности указанной реакции при выявлении антигена были отобраны три группы лиц. В каждой из групп была выявлена одна какая-либо инфекция, вызванная возбудителями, относящимися к семейству герпесвирусов.

В первую группу вошли 70 пациентов с диагнозом цитомегаловирусная инфекция, у которых кроме специфических антител был выявлен антиген в лейкоцитах крови. Все эти лица были обследованы на отсутствие специфических антител к ВЭБ классов 1§М, ЕА, ^С ЫА для исключения

наличия ВЭБИ. Затем было проведено исследование для определения отсутствия антигена ВЭБ в указанных образцах. Положительными оказались 2 анализа. Специфичность диагностикума составила 97,2%.

Во вторую группу вошли 32 пациента с диагнозом, инфекция вызванная вирусом простого герпеса, которая была подтверждена лабораторно выявлением наряду со специфическими антителами антигена в клетках крови. Далее проводилось исследование с целью исключить наличие антигена ВЭБ у данных больных. Положительным результат был у одного пациента, специфичность метода в этом случае составила 96,9%.

Третья, группа была представлена 32 больными у которых была выявлена инфекция, вызванная вирусом герпеса человека 6 типа. В данной группе специфичность составила 96,2%.

Чувствительность метода определялась сопоставлением результатов, полученных при помощи ПЦР в материалах у лиц с клинически подтвержденным диагнозом «инфекционный мононуклеоз». Было отобрано 32 человека, у которых была положительная реакция ПЦР. У 29 человек был при этом выявлен антиген ВЭБ. Расчет чувствительности проводили по формуле:

Чувствительность = ——— * 100%;

П + ЛО

где П - число положительных проб, правильно распознанных тест-системой; ЛО - число ложно отрицательных проб, не распознанных тест системой. В результате получаем: Чувс„елы,ост. = ^-'\оо% = <ю,б%

29 + 3

Следует подчеркнуть, что в настоящее время на рынке отсутствуют коммерческие тест-системы РИФ для выявления антигенов вируса Эпштейна-Барр, что не дало возможности провести сравнительные исследования с разработанной НРИФ.

Выявление маркеров ВЭБИ у лиц с инфекционной и неинфекционной

патологией

Выявление маркеров ВЭБИ у лиц с гематологическими и онкологическими заболеваниями

Больные гематобластозами были отобраны для исследования, потому что, являясь иммунокомпрометированными, представляют собой «группу риска», подверженную развитию различных оппортунистических инфекций. Диагностика клинических форм оппортунистических инфекций у онкологических больных затруднена, так как их основные проявления: лихорадка, лимфоаденопатия, гепатоспленомегалия часто расцениваются, как признаки основного заболевания или последствия проводимой терапии. В группу исследуемых вошли пациенты Гематологического научного центра РАМН, и пациенты отделения гематологии Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН.

Материалами для исследования служили: сыворотка крови, лейкоциты крови, бронхоальвеолярный лаваж. Все пациенты имели диагноз пневмония или картина неясного поражения легких. Всего было обследовано 168 человек, в возрасте от 17 до 78 лет. Пациентов до 30 лет было 34 человека, в возрасте от

30 до 40 лет - 33, от 40 до 50 лет - 36 человек, больных в возрастной группе 50 - 60 лет было 40 человек, старше 60 лет - 25 человек.

Таблица №4

Структура больных гемобластозами:_

Диагноз Количество %

Острый лейкоз 68 41,5

Хронический лейкоз 19 11,6

Лимфома 50 30,5

Анемии 10 6,0

Миеломы 17 10,4

Всего 164 100,0

Все больные в клиниках уже проходили обследование на наличие различных этиологических агентов пневмонии в рамках приказа МЗ СССР № 535 от 22.04. 85, согласно которому в исследование включали St. Viridans, S. aureus, Enterococcus, P. Aeruqinosa, Acinnetobacter. Наличие этих возбудителей не нашло подтверждения. Данный приказ не предусматривал проведения исследований для изучения вирусов в качестве возбудителей пневмоний. В настоявшее время известно, что вирусы гриппа, парагриппа, аденовирусы, коронавирусы, RS-вирус являются частыми возбудителями пневмоний. Наше исследование было посвящено выявлению маркеров вируса Эпштейна-Барр, сведения о котором, как об этиологическом агенте пневмоний, ограничены.

Таблица №5.

Выявление острой ВЭБИ, комплексом лабораторных методов, у больных гемобластозами с поражением легких._

Заболевание Кол-во больных Выявление острой ВЭБИ

Абс. %

Лимфома 50 12 24,0

Острый лейкоз 68 19 30,9

Хронический лейкоз 19 5 26,3

Миелома 17 6 35,3

Анемия 10 2 20,0

Всего 164 44 26,8

Маркеры острой инфекции были обнаружены у 44 пациентов (26,8%). (Рис 4) Возрастной состав лиц в этой группе распределился следующим образом: лица до 30 лет 9 человек, 30 - 40 лет 5, 40 - 50 лет 8 человек, 50 - 60 12 человек, в группе старше 60 лет 10 человек, при этом наиболее часто маркеры острой инфекции были выявлены у больных миеломой (35,3%).

Маркеры ВЭБИ у Маркеры ВЭБИ у Маркеры остройт Маркеры острой доноров Москвы гематологических ВЭБИ у доноров ВЭБИ у

больных Москвы гематологических

Рисунок 4. Маркеры ВЭБИ у больных гемобластозами

На основании представленных данных можно сделать вывод о том, что при заболеваниях гемобластозами ВЭБ является распространенным инфекционным агентом, так как более 1/3 обследованных больных имели маркеры острой стадии ВЭБИ. Возрастные группы лиц, наиболее подверженные развитию острой ВЭБИ, от 50 до 60 и старше 60 лет, что вероятно можно объяснить снижением иммунной защиты с возрастом. Следует отметить, что на две данные группы приходится 27,2% и 22,7% случаев, то есть в совокупности практически половина всех выявленных острых форм инфекции вызванной вирусом Эпштейна - Барр (49,9%). В этой связи нельзя не отметить, что среди практически здоровых лиц, вошедших в исследование иммуноструктуры Москвы, группы пожилых были напротив, наименее подвержены развитию острых форм ВЭБИ, в обеих группах не было найдено людей с маркерами острой инфекции.

Помимо больных с поражением легких было проведено исследование группы больных гемобластозами у которых наблюдалось поражение ЦНС.

Таблица № 6

Больные гемобластозами с поражением ЦНС

Диагноз Количество больных

Лимфома 16 (47,0%)

Острый лейкоз 9 (26,4%)

Хронический лейкоз 7 (20,5%)

Миелома 1 (2,9%)

Анемия 1 (2,9%)

Итого 34 (100%)

Лицам, у которых был обнаружен антиген ВЭБ в ликворе, в 7 случаях был поставлен диагноз лимфома и в двух случаях хронический лейкоз. Всего антиген выявлен у 9(20,5%) человек. Все больные с наличием антигена имели антитела. Антитела класса ^М без других маркеров отсутствовали.

Иммуноглобулины класса ^О ЕА и ^О ИА были выявлены у двух человек, по одному с диагнозом лимфома и хронический лейкоз. У одного пациента с диагнозом лимфома были обнаружены все маркеры 1§М, ^О ЕА , ЫА и антиген. Все остальные положительные на антиген имели антитела класса ^О ЫА . Всего с маркерами ВЭБ было выявлено 31(91,1%), острая инфекция была выявлена у 20,5%.

Антитела не выявлены у трех человек с диагнозом: лимфома, острый лейкоз и миелома. Маркеры ВЭБ у данных больных полностью отсутствовали.

Это обстоятельство дает возможность рекомендовать обследование данных больных для назначения исследования на наличие ВЭБ при симптомах поражения ЦНС и будет способствовать назначению адекватной терапии.

Выявление маркеров ВЭБИ у ВИЧ-инфицированных больных туберкулезом.

Одним из основных факторов, влияющих на заболевание туберкулезом ВИЧ- инфицированных, является то обстоятельство, что на фоне широкого инфицирования микобактериями туберкулеза взрослого населения, присоединение ВИЧ-инфекции вызывает переход от состояния инфицированное™ к клинически выраженной болезни. Тяжелое поражение иммунной системы при ВИЧ-инфекции ведет к быстрому прогрессированию туберкулеза. В исследование была включена группа пациентов Туберкулезной клинической больницы №3. В нее вошли 78 пациентов в возрасте от 22 до 58 лет. От больных были получены: сыворотки крови, клетки периферической крови и мокрота. Все больные имели диагноз: ВИЧ - инфекция, стадия ЗБ, и различные формы туберкулеза, что свидетельствует о развитии у этих больных тяжелого иммунодефицитного состояния. Диагноз диссеминированный туберкулез был поставлен 41(52,6%) больному, генерализованный - 17(21,7%) больным. Ограниченные формы туберкулеза были выявлены у 20(25,6%) человек. В группу ограниченных форм туберкулеза вошли больные, которым были поставлены следующие диагнозы: туберкулез ВГЛУ - пять человек, милиарный, инфильтративный, туберкулезный менингоэнцефалит - трем, туберкулезный менингит, очаговый туберкулез, активный и последствия перенесенного туберкулеза - одному больному, так же по одному -туберкулез периферических лимфоузлов, туберкулезный эксудативный плеврит.

Всего маркеры ВЭБИ были выявлены у 73 (93,6%), маркеры острой инфекции у 20 (25,6%) человек. Антитела класса ^М без других маркеров не встречались у одного больного с диагнозом «диссеминированный туберкулез».

В качестве группы сравнения в исследование нами была включена группа больных туберкулезом, не инфицированных ВИЧ. В группу вошли 95 человек, среди них мужчины составляли 80 человек, женщины 15. У них были диагностированы следующие формы туберкулеза: диссеминированный

туберкулез - у 45(47,4%) человек, инфильтративный - у 35(36,8%) и генерализованный - у 15(15,8%) человек.

Всего маркеры ВЭБИ у больных туберкулезом были выявлены у 90 (94,7%) больных. Острая форма инфекции была обнаружена у 16(16,8%) человек, При этом обращает на себя внимание тот факт, что среди больных диссеминированным туберкулезом острая ВЭБИ отсутствовала, а у больных инфильтративным туберкулезом данная форма инфекции встречалась значительно чаще, чем у больных генерализованным туберкулезом в 11(11,%) и 5(5,3%) случаев соответственно.

Высокая частота маркеров острой ВЭБ инфекции у больных ВИЧ-инфекцией и туберкулезом дает основания предполагать, что вирус Эпштейна - Барр проявляет свойства оппортунистической инфекции. Реактивация этого возбудителя происходит у больных с иммунодефицитом вследствие ВИЧ - инфекции и уже развившегося на данном фоне туберкулеза, который является одной из основных оппортунистических инфекций у данной категории больных.

Выявление маркеров ВЭБИ у ВИЧ - инфицированных беременных.

Известно, что герпесвирусы могут активно поражать беременных и преодолевать плацентарный барьер, инфицируя при этом плод. Особенно уязвимыми в этом отношении являются ВИЧ-инфицированные беременные. Нами были проведены сравнительные исследования обнаружения маркеров ВЭБ среди различных групп населения г.Челябинска: здоровых женщин фертильного возраста, здоровых беременных, ВИЧ-инфицированных беременных и детей, рожденных от них. На момент наблюдения ни у одного из обследованных не отмечалось клинических проявлений ВЭБИ.

При анализе частоты внутриутробного инфицирования ВЭБ установлено, что маркеры внутриутробного инфицирования (в виде ^М) в 2 раза чаще встречались у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, чем от здоровых.

Полученные результаты свидетельствуют о необходимости проведения профилактических мероприятий, направленных на предупреждение вертикальной передачи ВЭБ.

Анализируя частоту обнаружения антител к ВЭБ в зависимости от стадии ВИЧ-инфекции установлено, что маркеры острой ВЭБИ (в виде ^ М) определялись только у четырех женщин, находившихся в латентной стадии ВИЧ-инфекции с генерализованной лимфоаденопатией, что, возможно, свидетельствует о том, что увеличение лимфоузлов было связано не с прогрессированием ВИЧ-инфекции, а с острой ВЭБИ, которая не была диагностирована. Маркеры реинфекции ВЭБ (в виде 1§ в ЕА и ^ О ЫА в высоких титрах) в 3,5 раза чаще обнаруживались у ВИЧ-инфицированных беременных в острой фазе ВИЧ-инфекции (II), чем в латентной стадии течения ВИЧ-инфекции, что свидетельствует о том, что различные неспецифические клинические проявления на ранних стадиях ВИЧ-инфекции могли быть вызваны ВЭБ, но также не были своевременно диагностированы.

Таким образом, нами установлено, что большинство ВИЧ-инфицированных беременных (90,2%) имели маркеры ВЭБИ без клинических проявлений. Все женщины, имеющие острую ВЭБИ были в молодом возрасте, находились в латентной стадии (III) течения ВИЧ-инфекции и имели артифициальный путь инфицирования ВИЧ.

Также нами была проанализирована группа ВИЧ-инфицированных беременных в количестве 100 человек проживающих в Москве. Все они были инфицированы парентерально и являлись инъекционными наркоманками.

Серологические маркеры ВЭБИ были выявлены у всех обследованных. Маркеры острой ВЭБИ были выявлены у 37 % обследованных, причем у 12 % встречалась первичная острая инфекция, а у 25 реактивация инфекции. Все женщины с маркерами первичной инфекции были в возрасте до 20 лет.

Частота обнаружения маркеров ВЭБИ у детей с острым респираторным заболеванием.

Бактериальная флора (S. aureus, S. epidermidis, Н. influenza, Klebsiella spp, Pseudomonas aeruginosa.) вызывала заболевания у 28 человек, микоплазменная этиология (M.pneumoniae M.hominis) установлена у 9 человек, хламидиийная этиология (CI. Pneumoniae) у 5 человек- и пневмоцистная инфекция (P. carinii) у 10 человек. Смешанное инфицирование наблюдалось у 70 человек. У 78 человек этиологию,. ОРЗ установить не удалось (Таблица7).

Таблица 7

Выявление различных возбудителей у детей больных ОРЗ

Количество обследованных Возбудители ОРЗ неясной этиологии

Бак. флора M.pneumoniae M.hominis С1. pneumoniae Р. carinii Микстинфекция

200 Абс % Абс % Абс % Аб с % Абс % Абс %

28 14 9 4,5 5 2,5 10 5 70 35 78 39

Эта группа из 78 детей в возрасте от 1,5 месяцев до 14,5 лет была нами обследована на наличие маркеров ВЭБ - инфекции. Роль вирусов (гриппа, парагриппа, аденовируса, коронавируса, Р8-вируса) в этиологии ОРЗ и пневмонии достаточно хорошо известна, тогда как роль ВЭБ изучена пока недостаточно. Детей до года было 12 человек (15,2%), от 1до 3 лет 17 (21,5%), 3 -7 лет 14 (17,7%), 7 - 10 лет 5 (6,3%), от 10 до 14 лет 31 (39,2%). При поступлении в стационар исследовался и преморбидный фон было установлено, что среди обследованных - 46% были отнесены к практически здоровым, а 54% являлись длительно и часто болеющими детьми.

Различные маркеры ВЭБИ были найдены почти у половины обследованных детей у 37 человек (46,8%). У детей с ОРВИ антитела класса ^М к ВЭБ были выявлены у 7 человек. Антиген был обнаружен в мокроте у 11 детей, у 6 человек он встречался без обнаружения антител.

Пять детей имели антиген в сочетании с антителами. Из них у трех он сочетался только с антителами у одного 1£М с 1§ОЕА и одного только с антителами 1§ОЕА. Три ребенка имели только антитела 1§М.

Проведенные исследования показали, что признаки острой ВЭБИ можно выявить у детей с различными острыми респираторными заболеваниями. Данное обстоятельство диктует необходимость проведения комплексного лабораторного обследования детей для выявления маскированных случаев ВЭБИ.

Маркеры ВЭБИ и ЦМВИ у детей с диагнозом «инфекционный мононуклеоз».

Постановка диагноза «инфекционный мононуклеоз» требует лабораторного подтверждения, так как собственно мононуклеоз и мононуклеозоподобный синдром клинически схожи, но могут вызываются разными инфекционными агентами.

Для выявления специфической ДНК ВЭБ, а также определения иммуноглобулинов классов ^М, ^СЕА, ГсОЫА и выявления антигена, была отобрана группа из 30 детей в возрасте от 1 года 2 месяцев до 14 лет, мальчиков - 14, девочек - 16 человек. Эти дети были пациентами Детской городской клинической больницы Святого Владимира. У всех был поставлен клинический диагноз «инфекционный мононуклеоз».

Поскольку сходную с инфекционным мононуклеозом картину может давать и мононуклеозоподобный синдром, вызываемый циотомегаловирусом, дети были обследованы и на наличие маркеров цитомегаловирусной инфекции, а именно антител классов ^М, 1§0 и антигена цитомегаловируса. В целях изучения динамики появления маркеров заболевания, забор материала и его исследование проводились два раза с интервалом в 2 недели.

Применение различных методов исследования: ИФА, НРИФ и ПЦР дали возможность, сравнивая их результаты определить диагностическую ценность каждого из этих методов. Исследование выявило, что у всех детей, вошедших в группу, имелись маркеры ВЭБИ, были выявлены антитела тех или иных классов. Антиген был обнаружен у 6 (20,0%) человек, у 2 (6,6%) человек его определяли в первом исследовании, но он отсутствовал при повторном, в этих случаях - в сочетании с антителами всех классов - ^М, ^вЕА. В 2 случаях антиген выявлялся в повторном исследовании, при этом в одном случае он сочетался с антителами ^вИА, в другом с ^ОЕА, [§СЫА. Среди 2 детей, у которых антиген был найден, как в первом, так и во втором исследовании в одном случае присутствовали все классы антител - 1§М, ^вЕА, в другом случае в первом исследовании были выявлены антитела ^М, ^СЕА, а во второй постановке обнаружены только антитела класса ^ОЫА.

Следует подчеркнуть, что ВЭБ-инфекция сочеталась у обследованных детей с цитомегаловирусной в 20% и как моноинфекция была выявлена у 80%, в тоже время моноинфекция, вызванная цитомегаловирусом, не встречалась.

Таким образом, результаты исследований показали необходимость комплексной лабораторной диагностики инфекционного мононуклеоза. Кроме того необходимо исследовать материалы от больных детей, как минимум на

наличие двух инфекционных агентов - ВЭБ и ЦМВ для дифференциации собственно инфекционного мононуклеоза от мононуклеозоподобного синдрома.

Алгоритм диагностики ВЭБИ

В настоящее время для диагностики инфекционного мононуклеоза и других заболеваний, вызываемых ВЭБ, все шире применяют определение антител в сыворотках крови. Одним из первых, получивших широкое распространение методов серологической диагностики заболеваний, связанных с ВЭБ, является непрямой иммунофлюоресцентный (НРИФ) анализ вирусспецифических АТ. В качестве антигена в нем используется вирус, культивированный на лимфобластоидных клетках. Данный метод до настоящего времени считается одним из важных в серодиагностике ВЭБ, хотя его трудно стандартизировать, так как оценка результатов производится визуально. Более перспективными простым в постановке методом серодиагностики ВЭБ инфекций является иммуноферментный анализ (ИФА). Для ИФА используются отдельные высокоочищенные и стандартизированные белки-антигены ВЭБ, полученные методами генной инженерии. Важным методом диагностики в последние годы стало определение авидности антител классов ^О. Низкоавидные антитела говорят о ранней стадии инфекции. По мере развития инфекции антитела все больше адаптируются к антигену и авидность антител возрастает. До того времени, пока в сыворотке крови не обнаружены высокоавидные антитела можно говорить о том что

инфекция все еще находится на ранней стадии. В последнее время для диагностики ВЭБИ использовались методы: ИФА, НРИФ, ПЦР. Эти реакции включают в себя объективные методы контроля и учета результатов.

Нами предложен алгоритм диагностики ВЭБИ, который разработан с учетом опыта проведенных исследований. От практически здоровых людей, которые привлекаются для скринингового обследования, достаточно исследовать сыворотку крови методом ИФА на наличие антител к ВЭБ. Присутствие антител классов 1§М и ^ОЕА дает право говорить о развитии острой ВЭБИ инфекции. Выявление антител к ядерному антигену IgGNA говорит о наличии анамнестических антител.

Другая тактика должна применяться при обследовании больных с иммунодефицитом, а также больных мононуклеозом. Расширяется спектр исследуемых материалов. Помимо сыворотки необходимо исследовать методом НРИФ на наличие антигена следующие материалы: лимфоциты периферической крови, мокроту, мочу, ликвор на наличие антигенов ВЭБ. Данное исследование способствует выявлению острой ВЭБИ у лиц с иммунодефицитами, так как они не всегда могут адекватно ответить антителами и по этому поиск только серологических маркеров острой ВЭБИ у этой группы людей может быть не эффективным. Выявление антител класса 1§М и ^ОЕА говорит о развитии острой ВЭБИ, выявление антигена вируса и специфических его ДНК в биологических материалах тоже подтверждает развитие острой формы инфекции. Применение данного алгоритма позволит

более полно выявлять лиц с ВЭБ-инфекцией, что дает возможность эпидемиологам более полно проводить регистрацию инфекции и создать адекватную информационно-аналитическую подсистему эпидемиологического надзора.

Рисунок 5. Алгоритм диагностики ВЭБИ

Выводы

1. Определены современные эпидемиологические характеристики ВЭБИ: установлено, что в целом по России и на отдельных территориях имеется выраженная тенденция к росту регистрируемой заболеваемости инфекционным мононуклеозом. Показано, что наивысший уровень заболеваемости выявлен в Москве-20,8 на 100000 населения.

2. Изучение иммуноструктуры населения в г. Москве показало, что среди обследованных здоровых лиц более 90% имели антитела, тогда как 5,5% имели 1£М антитела, указывающие на острую стадию инфекции. Установлено, что наибольшее число лиц (11,3%) с острой формой ВЭБИ приходится на возрастную группу 14-18 лет. Установлено, что с возрастом количество инфицированных ВЭБ возрастает и достигает максимума к 30 годам.

3. Впервые разработана и апробирована экспериментальная тест- система НРИФ, для выявления антигена ВЭБ в биологических материалах. Данная тест-система позволяет выявлять антиген ВЭБ у иммунодефицитных лиц, которые не в состоянии ответить выработкой специфических антител на внедрение возбудителя.

4. Выявление маркеров активной ВЭБИ у доноров в различных регионах России (в Москве - 4,2%, Чебоксарах - 4%, Челябинске - 6% и в Омске -5% ) свидетельствует об опасности переливания крови с такими маркерами реципиентам и о целесообразности ее предварительного тестирования для предотвращения инфицирования ВЭБ.

5. Впервые в России показано, что у 26,8% больных гемобластозами.ВЭБ являлся этиологическим агентом пневмоний, а у 20,5% он способен вызывать поражение ЦНС (менингиты, менингоэнцефалиты). У 25,6% ВИЧ-инфицированных, больных туберкулезом, выявлены маркеры острой ВЭБИ.

6. Установлено, что маркеры острой ВЭБИ М) в группе ВИЧ-инфицированных беременных встречались в 1,5-2 раза чаще, чем в группе здоровых беременных и здоровых женщин фертильного возраста. Маркеры реинфекции ВЭБИ ( ЕА или ^ в ЫА в высоких титрах) в 1,4-3,5 раза чаще выявлялись в группе ВИЧ-инфицированных беременных по сравнению со здоровыми женщинами фертильного возраста и здоровыми беременными.

7. Показано что маркеры острой ВЭБИ, часто (в 17,7%) встречаются у детей с симптомами острого респираторного заболевания.

9. На основании проведенных исследований разработан алгоритм диагностики ВЭБ — инфекции, который применим для выявления ВЭБИ, как в эпидемиологической, так и в клинической практике при обследовании различных групп больных и здоровых лиц.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Казакова С.П., Галкина Л.А., Бошъян P.E. Опыт применения «Кипферон, суппозиториев» в лечении инфекционного мононуклеоза у детей // «Международная конференция по проблема пробиотиков» МНИИ им Г.Н. Габричевского М. 2004 С. 64

2. Плаксина Г.В., Феклисова J1.B., Галкина H.A., Козакова С.П. Бошьян P.E. Каражас Н.В. Морфофунуциональные и кристаллооптические, критерии для обоснования комплексного лечения больных инфекционным лечения больных инфекционным мононуклеозом // Материалы конференции «Инфекционные болезни: проблемы и перспективы». СПб -2004. С. 32

3. Орлова O.A., Рыбалкина Т.Н., Бошьян P.E., Каражас Н.В. Клинико-эпидемиологические особенности ВИЧ-инфекции у беременных женщин // В кн.: «Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней». - М. 2005. - Выпуск 7. -с.195-198.

4. Русакова Е.В., Орлова O.A., Каражас Н.В., Бошьян P.E., Рыбалкина Т.Н. Характеристика ВИЧ-инфекции у беременных женщин // В кн.: «Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней». - М. 2005. - Выпуск 7. -С.179-183.

5. Бошьян P.E., Рыбалкина Т.Н., Каражас Н.В. Маркеры вируса Эпштейна - Барр у больных гемобластозами // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005 - №9. - С. 56.

6. Рыбалкина Т.Н., Бошьян P.E., Каражас Н.В. Маркеры вируса Эпштейна - Барр у детей с различными бронхолегочными заболеваниями // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. -№9-С. 61.

7. Рыбалкина Т.Н., Бошьян P.E., Каражас Н.В. Маркеры вируса Эпштейна - Барр у детей с различными бронхолегочными заболеваниями // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - №9 - С. 61.

8. Навольнев С.О., Рыбалкина Т.Н., Каражас Н.В., Бошьян P.E. Разработка и применеие программы для автоматического расчета титра сывороток дающих 50% насыщение сорбента //Клиническая лабораторная диагностика.-2005. - №10-С.27.

9. Бошьян P.E., Рыбалкина Т.Н., Каражас Н.В.Сывороточные антитела к возбудителям оппортунистических инфекций у больных гемобластозами, осложненными пневмонией // ЖМЭИ. - 2006. - №2. - С. 53-57.

10. Казарян С.М., Орлова O.A., Бошьян P.E. Частота обнаружения маркеров парентеральных вирусных гепатитов и оппортунистических инфекций у ВИЧ-инфицированных беременных и их новорожденных детей. // Эпидемиология инфекционные болезни. - 2006. - №6,- С. 16-20

10. Бошьян P.E., Орлова O.A. Маркеры вируса Эпштейна- Барр у здоровых лиц на различных территориях России. // Материалы IX Съезда Всероссийского Научно -практического эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М. - 2007.- ТЗ. - С.15.

12. Бошьян P.E., Каражас Н.В., Рыбалкина Т.Н. Маркеры ЦМВ и ВЭБ у ВИЧ-инфицированных больных туберкулезом // Материалы IX Съезда Всероссийского Научно - практического эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М. - 2007. - Т1. - С. 278.

13. Орлова O.A., Каражас Н.В, Бошьян P.E. Сопутствующие инфекции у ВИЧ-инфицированных беременных и новорожденных детей // Материалы IX Съезда Всероссийского Научно - практического эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М. - 2007,- Tl. - С. 302-303.

14. Бошян P.E., Каражас Н.В., Феклисова Л.В., Казакова С.П., Савицкая H.A. Инфекция, вызванная вирусом Эпштейна-Барр, у дтей с острым респераторно-вирусным заболеванием и инфекционным мононуклеозом // Омский Научный вестник. Приложение к выпуску шестьдесят первому. - 2007. - №3 (61). - С 74.

15. Каражас Н.В., Малышев H.A., Рыбалкина Т.Н., Калугина М.Ю., Бошьян P.E. Герпесвирусная инфекция (эпидемиология, клиника, диагностика и лечение) // Методические рекомендации М. - 2007.

16. Феклисова Л.В., Савицкая H.A., Каражас Н.В., Бошьян P.E. Клинико-лабораторная оценка обнаружения маркеров оппортунистических инфекций у детей, больных ОРЗ с обструкцией дыхательных путей//Детские инфекции.-2008. - Т7. - №4 С 13-17

Считаю большой честью и удачей в жизни, что мне пришлось работать с академиком A.A. Воробьевым - выдающимся ученым, педагогом, человеком, давшим путевку в научную жизнь многим достойным исследователям. Благодаря его идеям и энергии была начата и моя диссертация.

Благодарю д.б.н. Каражас Н.В. за многолетние труды в качестве научного руководителя моей работы.

Глубоко признателен ученому секретарю д.м.н., профессору Русаковой Е.В. за ценные замечания, советы и помощь в подготовке диссертации к защите. Благодарю ученого секретаря Кожевникову J1.K.

Выражаю искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории эпидемиологии оппортунистических инфекций: к.м.н. Рыбалкиной Т.Н., Ермаковой Т.М., Калугиной М.Ю., Корниенко М.Н., Никитиной М.Б. за помощь в работе, знания, и умения, которыми они щедро поделились со мной.

Сердечно благодарю сотрудников кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ММА им.И.М. Сеченова: академику РАМН, д.б.н., профессору Звереву

B.В., д.м.н профессору Быкову A.C., д.м.н профессору Пашкову Е.П., д.м.н профессору Бойченко М.Н., д.м.н профессору Несвижскому Ю.В., д.м.н профессору Миронову А.Ю., к.м.н. доценту Усатовой Г.Н., к.м.н. доценту Давыдовой Н.В., к.м.н. доценту Селезневу A.C., к.м.н. Корнееву M.J1. за ценный опыт, понимание и поддержку.

Благодарю врачей клиницистов: д.м.н. Османова Е.А., д.м.н., профессора Ларионову В.Б., д.м.н. Галстяна Г.М., д.м.н., профессора Феклисову Л.В., к.м.н. Саивцкую H.A., к.м.н. Казакову С.П., Юдицкого М.В. за методическую помощь и ценные рекомендации.

Благодарю за помощь и советы при выполнении работы: член-корр. РАМН, д.м.н., профессора Ананьину Ю.В., д.м.н., профессора Селькову Е.П., д.м.н., профессора Кузина

C.Н., к.м.н. Данилину Г.А., к.м.н. Гончарова Д.Н.

За предоставленные материалы и информацию благодарю к.м.н. Орлову O.A., и д.м.н., профессора Долгих Т.Н.

Подписано в печать:

23.11.2009

Заказ № 3138 Тираж -130 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat. ru

Актуальность темы

В последние годы в России, как и во всем мире, отмечен значительный рост числа лиц с иммунодефицитными состояниями различной этиологии. Так, численность ВИЧ-инфицированных увеличилась с 6918 в 1997 г. до 403100 в 2007 г. (Г.Г.Онищенко, 2009). На фоне ухудшающейся экологической ситуации зарегистрировано увеличение числа пациентов с соматическими и онкологическими заболеваниями, сопровождающимися развитием иммунодефицита (А.А.Воробьев, 1991, 1994). Имеющиеся для значительной части населения России социальные условия приводят к развитию стрессов, широко распространены наркомания и алкоголизм, особенно среди молодежи, что в значительной степени детерминирует формирование иммунодефицитных состояний.

Приобретенные иммунодефициты, в том числе и СПИД, у подавляющего большинства людей сопровождаются различными осложнениями, в том числе оппортунистическими инфекциями, которые могут проявляться в виде различных заболеваний (Р.Р.Редфилд, Д.С.Берке, 1988; C.A.Glaser, 1994). Этиологическими агентами оппортунистических инфекций являются бактерии, грибы, простейшие, а также вирусы, среди которых важное место занимают герпесвирусы (С.В.Прозоровский, 1998). Номенклатура СПИД-ассоциированных инфекций, согласно классификации ВОЗ от 1987 года, действующей в настоящее время, включает 23 инфекции. Исследователями установлено, что оппортунистические инфекции часто встречаются в виде ассоциаций (М.В.Лавдовская, Лысенко А .Я., 1990; Т.Н.Долгих, 2000; Н.В.Каражас, 2005). О возрастающей роли оппортунистических инфекций в последние годы свидетельствуют данные серологического мониторинга цитомегаловирусной инфекции (ЦМВ) в Омской области (Т.И.Долгих и Н.С.Запарий, 2008). В течение 15 лет удельный вес взрослого населения с наличием специфических антител к ЦМВ класса IgM и IgG вырос на 33,1% - с 56,7% (1992 год) до 88,8% (2006 год).

Одним из ведущих этиологических агентов оппортунистических инфекций является вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ), так же, как и ЦМВ, относящийся к герпесвирусам. Вирус Эпштейна-Барр вызывает такие заболевания, как инфекционный мононуклеоз (единственная официально регистрируемая нозоформа), лимфому Беркитта, назофарингеальную карциному. Инфекция, вызываемая ВЭБ (ВЭБИ), не всегда сопровождается специфической клинической картиной и часто протекает в виде скрытых, латентных форм. Необходимо отметить, что ВЭБИ, как правило, сопровождает онкологические, гематологические, бронхо-легочные заболевания, значительно осложняя их течение и ухудшая прогноз. Инфекция, вызываемая вирусом Эпштейна-Барр, номинирована как СПИД-ассоциированное заболевание (Лысенко А.Я. 1995).

Системы эпидемиологического надзора за ВЭБИ, так же как и за другими герпесвирусными инфекциями, в полном объеме нет, что в значительной мере связано с трудностями выявления и учета этой патологии. Инфекционный мононуклеоз, представляет лишь незначительную часть от всех возможных вариантов ВЭБИ, поэтому только на основе официальных данных регистрации этого заболевания невозможно организовать эффективную систему эпиднадзора за ВЭБИ с полноценными информационно-аналитической, диагностической и управленческой подсистемами.

На возросшее значение оппортунистических инфекций в современном мире указывал академик РАМН А.А. Воробьев. Он одним из первых предложил использовать термин «популяционные иммунодефицит». Именно академик РАМН А.А.Воробьев предложил изучить вирус Эпштейна

Барр, как возбудителя оппортунистической инфекции, что послужило основанием для выполнения данной работы.

В этой связи особую актуальность приобретает, с одной стороны, оптимизация лабораторной диагностики ВЭБИ, включая определение антигенов вируса, с другой стороны - расширение контингентов, подлежащих обследованию на наличие маркеров этой инфекции, для активного выявления явных и скрытых форм ВЭБИ. Подобные подходы уже реализуются в системе эпиднадзора за социально-значимыми инфекциями, такими как гепатиты В и С, при этом лица с активно выявленными HBsAg и анти-ВГС регистрируются как носители вирусов-возбудителей этих заболеваний, что позволяет более точно оценивать масштабы распространения этих инфекций.

Изложенное выше послужило основанием для разработки диагностикума, позволяющего определять признаки текущей инфекции (антигены ВЭБ), оценки распространения ВЭБИ среди населения различных возрастных групп лиц на отдельных территориях России, выявления групп риска, а также для разработки алгоритма серологического обследования с целью диагностики различных форм ВЭБИ.

Цель исследования.

Характеристика клинико-эпидемиологических проявлений различных форм ВЭБИ с применением комплекса методов современной лабораторной диагностики.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать динамику и тенденции заболеваемости инфекционным мононуклеозом в России и на отдельных территориях в период с 2000 по 2008 годы.

2. Разработать диагностикум для выявления антигенов ВЭБ методом непрямой реакции иммунофлуоресценции и определить его диагностическую значимость.

3. Изучить закономерности возрастного распространения ВЭБИ на основании иммуноструктуры населения Москвы к вирусу Эпштейна-Барр.

4. Определить частоту выявления маркеров ВЭБИ при патологических процессах, сопровождающихся иммунодефицитами, у различных групп больных (детей и взрослых).

5. Разработать алгоритм серологического обследования различных групп пациентов для диагностики различных форм ВЭБИ.

Научная новизна.

Сопоставление данных официальной регистрации и серологических данных, полученных в исследовании, позволили установить, что официально регистрируется примерно 0,5% случаев острой ВЭБИ у взрослых и детей. Выявлено несоответствие между показателями заболеваемости ИМ ( 20,9 на 100000 населения) и результатами оценки иммуноструктуры населения к ВЭБ (нарастание сероположительных с возрастом, достигающее 90% у взрослых), что свидетельствует о более широкой циркуляции ВЭБ среди населения, чем это отражено в данных официальной статистики.

Получены новые данные о широте распространения ВЭБИ, выявлено более 90% доноров, сероположительных по отношению к ВЭБ, при этом антитела, характерные для острой фазы заболевания, были обнаружены у 4-6% обследованных.

Показано что инфекция, вызванная ВЭБ, часто протекает с клиническими симптомами ОРЗ, при лабораторном обследовании таких больных было выявлено 17.7% детей с маркерами острой формой ВЭБИ; Впервые определена частота выявления маркеров ВЭБИ у разных категорий больных с иммунодефицитными состояниями: максимально часто они были выявлены у больных гемобластозами с пневмонией (26,8%), реже у ВИЧ-инфицированных больных туберкулезом (25,6%), меньше всего у больных гемобластозами с поражением ЦНС (20,5%)

Практическая значимость

Результаты работы были использованы при составлении методических указаний «Герпесвирусная инфекция», утвержденных департаментом здравоохранения г. Москвы в 2007г., материалы которых используются при чтении лекций на кафедрах Детских инфекционных заболеваний ГОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития и Инфектологии ММА им. И.М. Сеченова.

Впервые разработана экспериментальная тест-система НРИФ для диагностики антигена ВЭБ в исследуемых материалах, а так же разработан алгоритм диагностики ВЭБИ, что позволяет усовершенствовать лабораторную диагностику ВЭБ- инфекции в системе эпидемиологического надзора.

Опубликованные материалы

По теме диссертации опубликовано 15 работ из них 2 в журналах рекомендованных ВАК РФ.

Положения выносимые на защиту В настоящее время официальная статистика учитывает только незначительную часть инфекции вызванной вирусом Эпштейна- Барр, поэтому для более полного выявления случаев инфекции необходимо применять комплекс современных лабораторных методов исследования при обследовании различных групп больных и здоровых лиц.

- Разработана экспериментальная тест-система НРИФ для выявления маркеров «свежего» инфицирования - антигенов ВЭБ в различных биологических материалах. Данная тест-система позволяет выявлять антигены ВЭБ у лиц с иммунодефицитами, которые не в состоянии ответить на внедрение возбудителя выработкой специфических антител.

Определены современные эпидемиологические характеристики ВЭБИ — наличие большого числа инфицированных на различных территориях РФ, значительное количество лиц с маркерами острого заболевания среди доноров, большое количество лиц с маркерами острой ВЭБИ не охваченных официальной регистрацией, среди различных групп больных с иммунодефицитными состояниями

Апробация диссертации

Материалы диссертации доложены 27 июня 2008 г на конференции кафедры Микробиологии, вирусологии и иммунологии ММА им.И.М. Сеченова, на конференции «Дни иммунологии в Сибири» Омск 20-23 сентября 2007 г., научно-практическом симпозиуме «Национальные дни лабораторной медицины России» Москва октябрь 2005г.

Апробация диссертации состоялась 3 июля 2008 г. на научной конференции отделов Эпидемиологии, Природноочаговых инфекций и Медицинской микробиологии НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста, иллюстрирована 12 рисунками и 20 таблицами. Работа включает обзор литературы описание материалов и методов, 4 главы собственных исследований, заключение выводы и приложение. Список литературы содержит 148 работ из них 32 отечественных и 115 иностранных авторов.

II. Обзор литературы Глава I. Современные представления о ВЭБИ. 1.1. Характеристика ВЭБ.

Вирус Эпштейна-Барр относится к семейству Herpesviridae подсемейству Gammaherpesvirinae роду Lymphocriptovirus, и является вирусом герпеса 4-го типа [5]. Значимость герпетических инфекций по сравнению с другими инфекционными заболеваниями в последние годы возрастает, что объясняется их широким распространенением, эпидемиологической ролью и сложностью диагностики. Особенно это проявляется в связи с увеличением числа лиц с вторичным иммунодефицитом, при котором герпетические инфекции являются оппортунистическими [2].

Среди взрослого населения 60-90% жителей городов нашей планеты в разные периоды жизни инфицируются хотя бы одним, а чаще, несколькими типами вирусов, относящимися к семейству герпесвирусов, при этом у 50% из них отмечаются рецидивы заболевания [6]. Эта инфекция, как правило, остается пожизненной. Для пациентов с иммунодефицитными состояниями (больных СПИДом, пациентов после трансплантации, новорожденных) герпесвирусные инфекции представляют опасность и могут приводить к тяжелой болезни и, в некоторых случаях, к летальному исходу [7]. С другой стороны, при заболевании герпевирусной инфекцией развиваются иммунодефицитные состояния, обусловленные недостаточностью различных звеньев иммунной системы и ее не способностью элиминировать вирус из организма. При этом вирусы герпеса сохраняются в организме в течение всей жизни, да и вируснейтрализующие антитела также присутствуют пожизненно, но не обладают протективным действием и не предупреждают возникновения рецидивов [6]. Количество иммунодефицитных лиц (ВИЧ — инфицированных, пациентов после трансплантации органов и костного мозга, онкологических и гематологических больных) постоянно возрастает, и исследование особенностей клинических проявлений, диагностики, профилактики и терапии герпесвирусных инфекций у таких людей имеет важное значение. К факторам риска возникновения герпесвирусных инфекций можно отнести охлаждение организма, солнечную инсоляцию, УФ - облучение, нахождение в условиях резких колебаний температуры воздуха и/или воды, эмоциональный стресс, психические расстройства, физическое перенапряжение, резкую смену климатических поясов, постоянное недосыпание, голодание, избыточное употребление алкогольных напитков [6].

По данным Всемирной Организации Здравоохранения, частота инфицирования указанными вирусами и вследствие этого заболеваемость герпетическими инфекциями уступают только гриппу и другим острым респираторным вирусным инфекциям (ОРВИ); в структуре смертности эти инфекции также занимают лидирующее место [5]. В странах Западной Европы и США заболеваниям, вызываемым герпесвирусами, придается большое значение, делаются попытки их учета и регистрации для проведения эпидемиологического анализа [7].

В Российской Федерации учет герпетической инфекции, вызываемой вирусами простого герпеса 1-го и 2-го типов не ведется. Исключение составляет лишь генитальный герпес, данные о котором приводятся в форме №9 «Сведения о заболеваниях и чесотке» Федерального государственного статистического наблюдения, представляемые кожно-венерологическими диспансерами. Из других герпесвирусных болезней официально регистрируются только ветряная оспа, инфекционный мононуклеоз и цитомегаловирусная инфекция. Эти инфекции учитываются в форме №2 Федерального государственного статистического наблюдения «Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях» на основании отчетов санитарно-эпидемиологической службы.

К семейству Герпесвирусов человека в настоящее время относят 8 типов вирусов:

- вирус простого герпеса I типа;

- вирус простого герпеса II типа;

- вирус варицелла зостер III типа;

- вирус Эпштейна-Барр IV типа;

- цитомегаловирус V типа;

- вирус герпеса человека VI типа;

- вирус герпеса человека VII типа;

- вирус герпеса человека VIII типа. [5]

Впервые вирус герпеса IV типа был обнаружен Эпштейном и его коллегами в 1964 году при электронномикроскопическом исследовании клеток лимфомы Беркитта (ЛБ) [15]. Геном вируса представлен двойной спиралью ДНК, в ней закодировано 30 полепиптидов. Молекулярная масса 101xl06D, капсид имеет форму икосаэдра [18]. По своим свойствам вирус мало отличается от других представителей семейства вирусов герпеса, однако, его особенность заключается в том, что он способен вызывать не цитолиз, а размножение пораженных клеток В-лимфоцитов [26]. При этом вирус ЭБ вызывает латентную инфекцию, при которой в некоторых клетках макро- организма пожизненно персистирует геном вируса, тогда как инфекционный вирус образуется в редкие периоды реактивации [13].

Специфическое связывание вируса с мембраной клетки происходит по средством рецептора CD — 21. Данный гликопротеин является еще и рецептором к СЗс1-компоненту комплимента [72]. Репликация вируса происходит следующим образом. В начале вирус адсорбируется на поверхности клетки мишени. На следующем этапе происходит освобождение вириона от оболочки капсида. После чего происходит инфильтрация вирусной ДНК в ядро клетки. Далее активируется процесс формирования и созревания дочерних вирионов. Их оболочки, капсиды, и ДНК формируются из аминокислот, белков, липопротеинов, нуклеотидов, находящихся в клетке.

ДНК вируса представлена в клетках в основном в кольцевой форме и редко в интегрированной [18,124]. Линии клеток, продуцирующие вирус, содержат его ДНК в виде кольцевых молекул, репродукция вируса начинается с амплификации этих молекул при помощи ВЭБ-специфической ДНК-полимеразы, после чего происходит синтез линейных молекул ДНК вирионов. В клетках, которые не продуцируют вирус, ДНК ВЭБ находится в структуре, подобной клеточному хроматину [18].

По отношению к В-лимфоцитам ВЭБ может вести себя двояко. В одном случае после заражения клетки трансформируются в бласты. В другом случае ВЭБ инфицирует В-лимфоциты без нарушения пролиферации с включением вирусной ДНК в виде плазмиды, передаваемой через ряд генераций этих клеток [18].

Вирус Эпштейна-Барр способен поражать не только В-лимфоциты. Он способен заражать и клетки эпителия рото- и носоглотки, низкодифференцированные клетки эпителия канальцев слюнных желез и тимуса [132].

Геном ВЭБ обнаруживается и в Т-лимфоцитах, эти клетки способны к экспрессии ранних и мембранных антигенов [18]. Установлено, что ВЭБ трансформирует как зрелые, так и незрелые В- клетки. В зараженных клетках вирус имеет четыре функции: индукция бласттрансформации, продолжительная пролиферация клеток, поддержание фонда вирусной ДНК в инфицированных клетках, регуляция экспрессии вирусных генов. Антигены вируса, синтезирующиеся в процессе его репродукции, формируются в разное время и имеют различное биологическое значение. Это мембранные антигены (МА) и ядерные антигены (ЭБНА). Указанные антигены определяются практически всегда в клетках, инфицированных ВЭБ. Они находятся всегда в ядре и в процессе митотического деления не отделяются от хромосом, так как прочно связаны с хроматином. Ядерные антигены (ЭБНА) обладают высоким сродством к ДНК и, вероятно, выполняют различные регуляторные функции. В настоящее время известно 6 ядерных антигенов. Причем ЭБНА-2 существует в двух видах- ЭБНА- 2А и ЭБНА-2В. Возможно комплекс антигенов ЭБНА-1, ЭБНА- 2А, ЭБНА-2В играет ведущую роль в иммортализации В- лимфоцитов. Группа пептидов создают комплекс ЭБНА-3, 28-62 кД -ЭБНА-4, от 22 до 70кД ЭБНА-5, ЭБНА-6. Функция этих антигенов неизвестна. ДНК ВЭБ имеет специфические участки связывания с ядерными антигенами. Предполагают, что ядерные антигены (ЭБНА), связываясь с геномом вируса, защищают большие эписомные копии генома вируса от деградации в клетке [18,68,79].

Комплекс ранних антигенов (РА). В начале продуктивного цикла инфекции, выявляется комплекс ранних антигенов, локализующихся в ядре и цитоплазме инфицированных клеток. Различают диффузный (Д) компонент, определяемый в ядре, и гранулярный (Р) компонент, который выявляется в цитоплазме клетки. Комплекс ранних антигенов выявляется еще до репликации ДНК. Функции комплекса не установлены, но показано, что появление комплекса означает переход к продуктивной фазе инфекции. Также известно, что у больных лимфомой Беркита преобладают антитела к Р- компоненту, а у больных раком носоглотки преобладают антитела к Д — компоненту [134].

Мембранные антигены (МА). Эти антигены определяются на поверхности вируспродуцирующих клеток и вирусных частиц. Известны ранние мембранные антигены, которые выявляются до синтеза ДНК. Поздние мембранные антигены обнаруживаются после начала синтеза ДНК вируса и на более поздних этапах синтеза вирусной частицы. Полагают, что ранние антигены входят в состав суперкапсидной оболочки вирионов, которая образуется за счет клеточных мембран [80].

Вирусный капсидный антиген (ВКА). Синтез вирусного капсидного антигена осуществляется после репликации вирусной ДНК и является продуктом поздней функции вирусного генома. ВКА является структурным компонентом вирусного капсида, локализуется и ядре, и цитоплазме продуцирующих клеток. Антитела к этому антигену в высоких титрах выявляются у 100% больных лимфомой Беркитта и раком носоглотки. Поскольку антитела в норме не выявляются, их наличие свидетельствует о развитии патологического процесса [18].

IV. Выводы.

1. Определены современные эпидемиологические характеристики ВЭБИ: установлено, что в целом по России и на отдельных территориях имеется выраженная тенденция к росту регистрируемой заболеваемости инфекционным мононуклеозом. Показано, что наивысший уровень заболеваемости выявлен в Москве — 20,8 на 100000 населения.

2. Изучение иммуноструктуры населения в г. Москве показало, что среди обследованных здоровых лиц более 90% имели IgG антитела, тогда как 5,5% имели IgM антитела, указывающие на острую стадию инфекции. Установлено, что наибольшее число лиц (11,3%) с острой формой ВЭБИ приходится на возрастную группу 14-18 лет. Установлено, что с возрастом количество инфицированных ВЭБ возрастает и достигает максимума к 30 годам.

3. Впервые разработана и апробирована экспериментальная тест- система НРИФ, для выявления антигена ВЭБ в биологических материалах. Данная тест-система позволяет выявлять антиген ВЭБ у иммунодефицитных лиц, которые не в состоянии ответить выработкой специфических антител на внедрение возбудителя.

4. Выявление маркеров активной ВЭБИ у доноров в различных регионах России (в Москве - 4,2%, Чебоксарах - 4%, Челябинске - 6% и в Омске -5%) свидетельствует об опасности переливания крови с такими маркерами реципиентам и о целесообразности ее предварительного тестирования для предотвращения инфицирования ВЭБ.

5. Впервые в России показано, что у 26,8% больных гемобластозами ВЭБ являлся этиологическим агентом пневмоний, а у 20,5% он способен вызывать поражение ЦНС (менингиты, менингоэнцефалиты). У 25,6% ВИЧ-инфицированных, больных туберкулезом, выявлены маркеры острой ВЭБИ.

6. Установлено, что маркеры острой ВЭБИ (Ig М) в группе ВИЧ-инфицированных беременных встречались в 1,5-2 раза чаще, чем в группе здоровых беременных и здоровых женщин фертильного возраста. Маркеры реинфекции ВЭБИ (IgGEA или IgGNA в высоких титрах) в 1,4-3,5 раза чаще выявлялись в группе ВИЧ-инфицированных беременных по сравнению со здоровыми женщинами фертильного возраста и здоровыми беременными. 7. Показано что маркеры острой ВЭБИ, часто (в 17,7%) встречаются у детей с симптомами острого респираторного заболевания.

9. На основании проведенных исследований разработан алгоритм диагностики ВЭБ - инфекции, который применим для выявления ВЭБИ, как в эпидемиологической, так и в клинической практике при обследовании различных групп больных и здоровых лиц.