Автореферат и диссертация по медицине (14.00.21) на тему:Разработка методов лабораторной диагностики и лечения кандида-ассоциированного пародонтита

Направахрукописи

УДК616314.17-085.014.47

НОСИК АНДРЕЙ СЕРГЕЕВИЧ

Разработка методов лабораторной диагностики и лечения кандида-ассоциированного пародонтита

14.00.21 - «Стоматология» 03.00.07- «Микробиология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва -2004

Работа выполнена в государственном образовательном убеждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет» и Российской медицинской академии последипломного образования Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Рафаэль Васильевич Ушаков

Доктор медицинских наук, профессор Виктор Николаевич Царёв Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Татьяна Григорьевна

Робустова

Доктор медицинских наук, профессор Алексей Юрьевич Сергеев Ведущая организация:

Институт повышения квалификации ФУ «Медбиоэкстрем» (Медико-биологических и экстремальных проблем) при Министерстве здравоохранения и социального развития РФ

Защита состоится 2004 г. в 11.00. на

заседании диссертационного Совета К.208.041.02 при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» МЗСР РФ

по адресу: 109201, г. Москва, ул. Делегатская д.20/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» МЗСР РФ по адресу: г. Москва, ул. Вучетича, д. 10а.

Автореферат разослан: 2004 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

О.П. Дашкова

Актуальность работы. Среди важнейших проблем современной стоматологии воспалительные заболевания пародонта занимают одно из ведущих мест. Как известно, пародоптит является главной причиной потери зубов у людей средней и старшей возрастных групп населения, что требует повышенного внимания исследователей к проблеме этиологии, патогенеза, диагностики и терапии данного заболевания (Иванов B.C., 1986; Барер Г.М., 1995; Максимовский Ю.М., 1997; Грудянов А.И., 2001).

Вместе с тем, отечественные и зарубежные исследователи отмечают высокую частоту так называемых торпидных или устойчивых к терапии форм парод онтита (Л .А. Дмитриева, СВ.Чернышова, 2000).

В стоматологии серьезную проблему представляют различные осложнения инфекционно-воспалительного характера, в том числе, ассоциированные с дрожжеподобными грибами рода Candida

(Копейкин В.Н., 1994; Абакаров СИ., 2000; Ушаков Р.В., Царёв В.Н.,

В последние годы в зарубежной литературе всё чаще используется специальный термин - кандида-ассоциированные пародонтиты, которые отличаются от кандидоза слизистой оболочки полости рта избирательной инвазией грибов не только в десневой эпителий, но и область пародонтальной связки (С^а1кег, J.Gordon, 1993; J.VinkelhofГ, 1996). Развитие специфической грибковой патологии пародонта может быть связано как с необоснованным выбором антибактериальных препаратов, так и с развитием дисбиоза. Кроме того, многие препараты, эффективные в отношении пародонтопатогенных бактерий, оказывают негативное влияние на иммунные процессы в организме больного и, таким образом, также могут способствовать развитию грибковой инвазии (Бажанов Н.Н., Г.П.Тер-Асатуров, 2000).

Однако, углублённого анализа основных причин возникновения и возможных механизмов развития кандида-ассоциированных пародонтитов на современном уровне в отечественной литературе не проводилось. Дальнейшей разработки требуют методы клинической и лабораторной диагностики и лечения этого тяжёлого заболевания.

Разрешению этой проблемы может способствовать создание и внедрение в практику новых фунпщидных препаратов -производных триазола. Вместе с тем, не

2001).

з

рос. национальна«

библиотека

их сравнительной эффективности при кандида-ассоциированном пародонтите и кандидозе полости рта. В доступной литературе мы также не нашли работ, посвященных экспериментальному обоснованию (микробиологическому и иммунологическому) выбора фунгицидных препаратов для включения в схемы лечения заболеваний полости рта, ассоциированных с дрожжеподобными грибами рода Candida.

Цель исследования: разработка современных методов диагностики и лечения пародонтита, ассоциированного с дрожжеподобными грибами рода Candida, на основании данных клинического, микробиологического, молекулярно-генетического и иммунологического исследования.

Задачи исследования.

1. Выявить особенности клинического течения парод онтита ассоциированного с грибами рода Candida.

2. Апробировать отечественные диагностические тест-системы для выявления дрожжеподобных грибов рода Candida (C.albicans, C.Krusei и др.) с помощью полимеразной цепной реакции (ПНР), а также сопоставить результаты исследования с данными классического культурального метода диагностики кандидоза.

3. Провести анализ чувствительности грибковой флоры in vitro к фунгицидным препаратам ряда фармакологических групп, используемым в настоящее время, и новым лекарственным средствам, ранее не применявшимся в комплексном лечении пародонтита.

4.Выявить особешюсти иммунного статуса (включая определение уровня антител к дрожжеподобным грибам рода Candida с помощью иммуноферментного анализа) у больных хроническим генерализованным пародонтитом и сопоставить их с данными молекулярно-генетического исследования.

5. Разработать принципиальную схему лечения пародонтита ассоциированного с грибами рода Candida с применением фунгицидных препаратов - производных триазола.

Научная новизна

Определены клинические и микробиологические особенности хронического генерализованного пародонтита, ассоциированного с грибами рода Candida. Получены сравнительные данные о

специфичности и чувствительности новой системы, для этиологической диагностики заболевания, основанной на полимеразной цепной реакции, с последующей обратной ДНК-гибридизацией.

Изучена чувствительность грибковой флоры, выделенной из пародонтального кармана больных пародонтитом, in vitro к фунгицидным препаратам ряда фармакологических групп, используемых в настоящее время, и новыми лекарственными средствам, ранее не применявшимся для лечения пародонтита. Разработаны показания для использования фунгицидных и иммуномодулирующих препаратов в комплексном лечении хронического генерализованного пародонтита, ассоциированного с грибами рода Candida.

Обосновано применение иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления кандидоза слизистой оболочки полости рта.и кандида-ассоциированного пародонтита

Проведена клиническая и микробиологическая оценка эффективности антифунгальной химиотерапии в комплексном лечении кандида-ассоциированного пародонтита.

Практическая значимость

Определены характерные местные, общие и анамнестические признаки хронического генерализованного пародонтита,

ассоциированного с грибами рода Candida.

Разработана принципиальная схема лечения. кандида-ассоциированного пародонтита, установлены сроки- проведения каждого компонента комплексного лечения. На основании данных, полученных в исследованиях штаммов Candida in vitro, выделенных у больных кандида-ассоциированным пародонтитом, разработаны показания для. антимикробной химиотерапии пародонтита, включающей использование фунгицидных препаратов - производных триазола.

Проведена оценка новых диагностических систем; основанных на полимеразной цепной реакции, обратной гибридизации ДНК и иммуно-ферментном определении антител сыворотки крови для-диагностики кандида-ассоциированного пародонтита.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Кандида-ассоциированный пародонтит представляет собой вариант пародонтита, обусловленный поверхностным прединвазивным или инвазивным кандидозом тканей десны и пародонталыюго кармана.

2. Представители дрожжеподобных грибов рода Candida являются компонентом ассоциаций, формируемых с участием пародонтопатогенной микрофлоры полости рта.

3. Диагностика кандидозного поражения тканей пародонта должна быть комплексной и основываться на данных иммуноферментного определения антител к грибам рода Candida (ориентировочный экспресс-метод) и обнаружения грибов микробиологическим или молекулярно-генетическим методом (окончательный диагноз).

4. Клинико-лабораториая и анамнестическая характеристика кандида-ассоциированного пародонтита отличается от пародонтита бактериальной этиологии.

5. Фунгицидные препараты группы триазола являются эффективным средством в комплексном лечении кандида-ассоциированного пародонтита.

Реализация результатов работы

Внедрение

Результаты работы внедрены в программу преподавания на кафедрах микробиологии МГМСУ и кафедры стоматологии РМАПО по курсу «Заболевания пародонта», практику работы пародонтологических отделений клинико-диагностических центров МГМСУ и ЛПУ г. Москвы. Изданы методические рекомендации и учебные пособия по совершенствованию лабораторной диагностики заболеваний пародонта.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 2 учебных пособия УМО МЗ РФ и методические рекомендации МЗ РФ.

Объём и структура диссертации

Диссертация состоит из обзора литературы, главы «Материалы и методы», двух глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и практических

б

рекомендаций. Список литературы включает 192 источников, в том числе - 85 отечественных и 107 - зарубежных изданий.

Текст диссертации включает 136 страниц машинописного текста, иллюстрирован 17 таблицами, 15 рисунками и фотографиями.

Апробация работы

Результаты исследований доложены на городской межинститутской конференции (Москва, 2001), Всероссийском конгрессе с международным участием «Форум второго тысячелетия» (М., 2002), научно-практической конференции памяти профессора Х.А. Каламкарова «Пути совершен-ствования постдипломного образования специалистов стоматологического профиля» (М., 2002), X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (М., 2003), межкафедральной конференции кафедр микробиологии, иммунологии и вирусологии МГМСУ, фармакологии МГМСУ и стоматологии РМАПО (18 декабря 2003).

Содержание работы

Материалы и методы исследования. Проведено обследование 129 больных хроническим генерализованным пародонтитом в стадии обострения, в том числе, 61 мужчина и 68 женщин в возрасте от 33 до 69 лет. По результатам комплексного клинико-лабораторного и иммуно-микробиологического исследования у 30 пациентов (23,3%) выявлен пародонтит ассоциированный с грибами рода Candida.

Для подтверждения клинического диагноза использовали следующие методы лабораторного исследования -цитоморфологический, культуральный, иммуноферментный и молекулярно-генетический.

Для культурального (микологического) и молекулярно-генетического методов исследования использовали содержимое пародонтального кармана, которое забирали сорбирующими файлами №30. Выделение изолированных колоний грибов проводили на селективной среде Сабуро с антибиотиками (амшщиллин/стрептомицин), а затем, по числу полученных изолированных колоний, определяли количественную обсеменённость содержимого (экссудата) пародонтального кармана, которую выражали через десятичный логарифм величины выросших колоний (lg КОЕ).

Молекулярно-генетическое исследование включало постановку полимеразной цепной реакции и обратной гибридизации ДНК с применением отечественных диагностических систем (НПФ «Ниар-Медик+, РФ) и импортных (МикроДент, Германия) на отечественной аппаратуре «Терцик».

Для оценки результатов твёрдо-фазного иммуноферментного анализа (ИФА) использовали спектрофотометр «Мультискан» (Швеция). ИФА в твёрдой фазе использовали для определения антител сыворотки крови (2 мл венозной крови пациентов) к грибам Candida albicans для последующего сопоставления данных культурального и молекулярно-генетического обнаружения грибов с уровнем антител к ним.

Результаты исследования обработаны статистически с вычислением средней величины М, ошибки средней величины m и вероятности различий Р. Для обработки результатов ИФА вычисляли также среднее квадратичное отклонение. При обработке результатов использовали компьютерную программу Biostat для Microsoft.

Результаты и их обсуждение.

Полученные данные комплексного клинико-лабораторного обследования пациентов позволили разделить всех пациентов на группы в зависимости от отсутствия или наличия грибов в исследуемом материале, а также степени обсеменённости (рисунок 1).

Рисунок 1. Распределение пациентов с заболеваниями пародонта по степени обсеменённости пародонтального

кармана грибами Candida

12 10 8

% 6 4 2 0

□ Высокая обсемененность

ИУмеренная обсемененность

0 Низкая обсемененность

Так, у 14-и пациентов с генерализованным пародонтитом выявлены грибы рода Candida в значительном количестве - lg КОЕ составил 6,5+0,5 (10,0% от общего числа больных хроническим генерализованным пародонтитом в стадии обострения).

У 5-и пациентов налёт был не выражен, но определялись микротрещины слизистой языка и щёк на фоне изменения цвета слизистой оболочки и сглаженности сосочков языка, а также трещины в уголках рта. Данная клиническая картина соответствовала хроническому атрофическому кандидозу слизистой оболочки полости рта.

У 11-и пациентов степень обсеменённости была ниже 6,0 и составляла в среднем 4,5+1,1. Это составило 8,5% от общего числа обследованных больных с хроническим генерализованным пародонтитом в стадии обострения. Признаки атрофического кандидоза выявлены у 3-х пациентов. У 4-х пациентов обсеменённость составляла 2,0±0,8. Элементов псевдомицелия не выявлено.

Таким образом, выделение грибов отмечено нами только у 30 пациентов из 129 обследованных больных хроническим генерализованным пародонтитом в стадии обострения, что составило 23,3%.

Диагноз кандидоза у всех пациентов подтверждён цитоморфологически. При микроскопическом исследовании (окраска по Граму) у обследованных пациентов обнаружен псевдомицелий гриба в материале пародонтального кармана, взятого при завершении процедуры открытого кюретажа пародонтальных карманов. Лишь у единичных пациентов аналогичная картина отмечена нами при исследовании мазка-соскоба со слизистой оболочки полости рта.

Следующий вопрос, который мы поставили при анализе результатов культурального исследования - видовой состав дрожжеподобных грибов, выделенных из пародонтального кармана пациентов. При идентификации выделенных чистых культур грибов установлено, что у 24-х больных из 30-и выделялся вид Candida albicans (у 80% больных), причём у 4-х пациентов в ассоциации с другими видами: C.Krusei - у 2-х, C.guilliermondii - у одного и C.glabrata - у одного (рис. 2).

Рисунок 2. Видовой состав штаммов Candida, выделенных у больных пародонтитом

Таким образом, вид C.albicans доминировал по частоте выделения у больных хроническим генерализованным пародонтитом в стадии обострения.

На втором месте оказался вид C.Krusei, который выявлен у 4-х пациентов (13,3% больных). К единичным находкам можно отнести виды C.stellatoidea и C. tropicalis, а также C.gnilliermondii и C.glabrata, выявленные только в ассоциациях с C.albicans.

Тем не менее, как свидетельствуют представленные данные, видовой пейзаж дрожжеподобных грибов рода Candida в содержимом пародонтального кармана у больных хроническим генерализованным пародонтитом в стадии обострения отличается значительным разнообразием и включает, как минимум 6 видов грибов данного рода. На долю вида C.albicans приходится 70,6%, C.Krusei - 11,8%, прочих видов - 17,6% всех выделенных штаммов.

Рисунок 3. Соотношение положительных и отрицательных результатов обнаружения грибов разными методами (ПЦР)

Выявление дрожжеподобных грибов Candida albicans при заболеваниях пародонта в нашей работе впервые проводили одновременно культуральным и молекулярно-генетическим методом, используя отечественную систему Gene Pak™ PCR для выделения образцов ДНК из материала и постановки полимеразной. цепной реакции (рис. 3).

У 72 больных хроническим генерализованным пародонтитом в стадии обострения, которым проводили молекулярно-генетическое исследование с помощью ПЦР у 18 подтверждено наличие ДНК дрожжеподобных грибов Candida albicans в содержимом пародонтального кармана в диагностической концентрации, что составило 25% от общего числа пациентов.

Таким образом, число положительных проб оказалась несколько выше, чем при культуральном исследовании.

Учитывая, что дрожжеподобные грибы рода Candida выявлены нами непосредственно в содержимом пародонтального кармана, а у значительной части больных (10,9%) в виде псевдомицелия, прорастающего десневой эпителий у больных хроническим генерализованным пародонтитом в стадии обострения, представлялось весьма важным выявить насколько часто наблюдалось сочетание грибов с представителями основных пародонтопатогенных анаэробных видов из группы пигментообразующих бактероидов - Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsithus, а также другими, менее значимыми с точки зрения развития пародонтита.

Оказалось, что среди больных с кандида-ассоциированным пародонтитом представители пигментообразующих бактероидов выявлены всего у 5 пациентов из 30 (16,7%) в то время как при отсутствии выделения грибов -у 33 из 99 (33,3%).

Сочетание дрожжеподобных грибов с актиномицетами (A. Israelii, A.naeslundii) и анаэробными стрептококками (P.micros, S.intermedius) выявлено у 16 из 30 больных кандида-ассоциированным пародонтитом (53,3%), в то время как при отсутствии выделения грибов - у 95 из 99 больных (96%).

Таким образом, частота выявления основных пародонтопатогенных видов бактерий, а также актиномицетов и анаэробных стрептококков была примерно в 2 раза ниже у больных с кандида-ассоциированным пародонтитом по сравнению с типичным хроническим генерализованным пародонтитом в стадии обострения.

В тоже время, у 9 пациентов из 30 с подозрением на кандида-ассоциированный пародонтит дрожжеподобные грибы рода Candida выделены в чистой культуре (30% больных). Учитывая выше приведённые факты можно предполагать, что дрожжеподобные грибы являются основным причинным фактором заболевания пародонта у данных пациентов. Однако, для окончательного ответа на этот вопрос нам представлялось необходимым проанализировать данные иммунного ответа, полученные с помощью иммуноферментного анализа сыворотки крови пациентов (с целью определения антител к грибам и их уровня).

Из 82 больных хроническим генерализованным пародонтитом в стадии обострения, которым проводили ИФА, наличие антител к дрожжеподобным грибам Candida albicans в диагностической концентрации (более 1:200) выявлено у 45, что составило 54,5% от общего числа пациентов, обследованных данным методом.

Таким образом, общая цифра обнаружения AT сыворотки крови к грибам оказалась существенно выше (более, чем в 2 раза), чем обнаружение грибов при культуральном исследовании.

Совпадение положительных результатов, детектируемых обоими методами, наблюдалось лишь в 82,0% случаев. При этом у 37 пациентов с положительными результатами культурального исследования, ИФА была положительной в 27 случаях (69,9%), т.е. совпадение положительных результатов обоих методов было меньшим, чем при сопоставлении с ПЦР (совпадение положительных результатов культурального исследования и ПЦР наблюдалось в 82,0% случаев). Напротив, у 45 пациентов дрожжеподобные грибы рода Candida не выявляли при культивировании на среде Сабуро, а ИФА среди них была отрицательной только у 24 пациентов (53,3%). В тоже время ПЦР в аналогичной ситуации была отрицательной лишь у 5-и пациентов ПЦР (6,9 %).

Выявленные расхождения, на первый взгляд, резко снижают диагностическую значимость ИФА при диагностике кандидоза, поэтому требуют соответствующей интерпретации с учетом чувствительности используемой тест-системы для ИФА, с одной стороны, и возможными ошибками при регистрации результатов культурального исследования, с другой. Поэтому, мы провели сопоставление результатов ИФА и культурального исследования с учётом количественной обсемененности материала пародонталыюго кармана грибами (рис. 4).

Рисунок 4. Совпадение положительных результатов, полученных разными методами (культуральным и ИФА) с учётом обсеменённости

-/I -—

Низкая

Умеренная

Высокая

О 2 4 б 8 10 12 14

Больные, %

□ Культуральный метод В Положительный результат ИФА

Как было показано при цитоморфологическом исследовании, прорастание псевдомицелия грибов в ткани пародонта наблюдается лишь при высокой и средней степени обсеменённости экссудата пародонтального кармана или, иначе, - обильное содержание грибов в пародонталыюм кармане сопровождалось их инвазией в ткани пародонта.

Из данных, представленных на диаграммах очевидно, что при высокой и умеренной обсеменённости пародонтального кармана грибами ИФА была всегда положительна и процент совпадения результатов составлял 100%. При низкой обсеменённости АТ, напротив, не выявлены ни в одном случае.

Практически у всех пациентов кандида-ассоциированным пародонтитом выявлены существенные изменения иммунного статуса. Иммунологический вариант развития процесса у данного контингента характеризовался распределением основных иммунологических параметров Т и В систем на уровне нижней

границы нормы. Только CD 16 субпопуляция (нормальные киллеры) была существенно увеличена по сравнению со здоровыми лицами. Несколько ниже уровня нижней границы нормы находились показатели, характеризующие хемилюминесценцию гранулоцитов. Однако, основные изменения иммунного статуса касались экспрессии рецепторов CD 25, 71 и 95 на лимфоцитах и фагоцитирующих клетках. Таким образом, описанный иммунологический вариант развития пародонтита характеризовался показателями Т-системы на уровне нижней границе нормы, пониженной активностью фагоцитирующих клеток, некоторым увеличением вероятности апоптоза лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов, т.е. программируемой гибели данных клеток.

Большое разнообразие клинической симптоматики и анамнестических данных позволило нам сгруппировать клинические признаки кандида-ассоциированного пародонтита в три группы. Первая группа клинических признаков - местные клинические проявления; вторая - общие клинические проявления; третья -данные анамнеза заболевания. Установлено, что традиционно используемые в пародонтологии индексы (пародонтальный индекс, папиллярно-маргинально-альвеолярный индекс) при кандида-ассоциированном пародонтите достоверно не различались от аналогичных индексов при пародонтите не ассоциированном с грибами рода кандида (например при средней степени тяжести пародонтита соответственно ПИ был 3,4+0.5 и 3,5+0,2, а ПМА -46,5+5,2 и 44,6+3,6). Другой известный парод онтологический индекс - индекс кровоточивости у больных кандида-ассоциированным пародонтитом был несколько выше.

Более выраженными были отличия по некоторым клиническим и анамнестическим показателям, которые пародонтальные индексы не учитывают. Так, для кандида-ассоциированного пародонтита было не характерно гноетечение из пародонтального кармана и формирование пародонтальных абсцессов (хотя некоторые пациенты отмечали абсцедирование в анамнезе). Экссудация из пародонтальных карманов была слабо выражена, при ревизии карманов в ряде случаев выявлялась белесоватая крошкообразная масса, которая плотно прилегала к стенкам кармана. Вероятно, что активность такого компонента пародонтита как гноетечение, связано с характером микрофлоры пародонтального кармана и активностью

воспалительной реакции. У пациентов кандида-ассоциированным пародонтитом были отмечены застойные явления в области десны и инфильтрация отдельных участков десневого края в виде плотного на ощупь валика. Как известно такая инфильтрация слизистых оболочек характерна для кандидоза других систем организма, например кишечника.

К весьма характерным клиническим признакам кандидоза можно отнести беловатый налет, который может не наблюдаться в области десны, но обнаруживается в других областях полости рта (на слизистой оболочке щек, языка, мягкого неба).

Детальный анализ рентгенограмм больных кандида-ассоциированным пародонтитом показал, что резорбция костной ткани происходит крайне неравномерно, во всех случаях отмечались как горизонтальный, так и вертикальный тип резорбции, причем потеря костной ткани на разных участках челюстей была различной.

Полученные данные позволили нам сформулировать клинико-лабораторные и анамнестические признаки, которые позволяют с высокой степенью вероятности предполагать у больного хроническим генерализованным пародонтитом кандида-ассоциированную патологию.

- Вялое течение, слабое гноетечение из пародонтальных карманов

- Застойные явления и инфильтрация слизистой оболочке десны

- Белый налет в области десны, щеки или неба

- Отсутствие клинического эффекта при проведении антибактериального лечения

- Нарушение функции ЖКТ

- Наличие кандидозного поражения других органов («молочница»)

- В анамнезе длительные инфекции, длительное лечени антибиотиками

- Короткие промежутки между обострениями

- Сочетание вертикального и горизонтального типа резорбции альвеолярной кости

- Наличие снижения реактивности (гипореактивный иммунологический вариант)

- Положительные результаты микробиологического исследования, ИФА или ПЦР

Следует подчеркнуть, что хотя бы 5-7 из 11 перечисленных признаков встречались у каждого пациента кандида-

ассоциированным лародонтитом и менее 5 признаков у больных с «бактериальной» формой поражения (как правило, 1-3 признака).

Сопоставляя полученные нами результаты с известными данными литературы можно представить следующим образом основные этапы патогенеза кандидозной инфекции пародонта.

При нормальном иммунном статусе имеет место синергизм микрофлоры десневой борозды, а также ротовой полости, выстланной слизистой оболочкой, с участием Candida, что можно расценивать как транзиторное кандидоносительство. В условиях не резко выраженных проявлений иммунодефицита, снижения

иммунорегуляторного индекса CD4/CD8 и респираторной активности гранулоцитов, может развиться, так называемый, «просветочный предынвазивный кандидоз» (по O.K. Хмельницкому), в том числе, в зоне десневой борозды. При более выраженном нарушении параметров: снижении экспрессии CD 16 (Fc-рецепторы для Ig) и CD25 (для цитокинов IL-2) на моноцитах, CD 4 (Т-хелперы/индукторы) и CD 16 на лимфоцитах неизбежно прогрессирование процесса с развитием инвазивного кандидоза как слизистой оболочки, так и тканей пародонта.

Поломка в системе многоуровнего антифунгального барьера, количественные и качественные нарушения со стороны нейтрофилов в просветах и на поверхности слизистых оболочек, а также изменения в Т-клеточной системе и экспрессии маркеров клеточной кооперации обусловливают возможность агрессии в виде адгезии, колонизации и инвазии резидентных условно-патогенных грибов.

При прижизненной дифференциальной диагностике кандидоносительства, просветочного прединвазивного и инвазивного кандидоза, основанной на комплексном подходе, должна быть предусмотрена возможность своевременного выявления отличающихся друг от друга форм взаимодействия Candida и макроорганизма, что определяет их более адекватное этиологическое и патогенетическое лечение.

Участие дрожжеподобных грибов рода Candida в развитии пародонтита обусловливает актуальность разработки адекватных методов консервативного лечения. За последние 10-15 лет в клиническую практику поступили новые противогрибковые препараты, применение которых при кандида-ассоциированном пародонтите до последнего времени не было обосновано. Учитывая

это обстоятельство, мы провели сравнительное изучение чувствительности штаммов грибов, выделенных при кандида-ассоциированном пародонтите, к нистатину и «новым» фунгицидным препаратам из группы кетоконазола с применением диффузионного способа дисков. Установлено, что максимальный диаметр зон подавления роста наблюдается при применении дисков с препаратами флюконазол («дифлюкан», Пфайзер, Франция) и итраконазол («орунгал», Янсен Силак, Бельгия).

По данным кассетного микрометода, минимальная подавляющая концентрация (МПК) данных препаратов составила 0,5 и 1-1,5 мкг/мл соответственно в отношении штаммов С. albicans. Для C.Krusei требовались большие концентрации: 30 мкг/мл дифлюкана и 50 мкг/мл орунгала.

Полученные данные позволили нам обосновать применение дифлюкана или орунгала в комплексном лечении кандида-ассоциированного пародонтита. Это предполагает использование алгоритма действий по диагностике данного заболевания с применением культурального, цитоморфологического, молекулярно-генетического методов исследования и иммунофермептного анализа, разработанного нами в виде методических рекомендаций для практического здравоохранения.

- Проведение ИФА с антигенами C.albicans (положительный результат ИФА рассматривался как сигнальный признак вероятности кандидозного процесса, требующий более детального исследования другими специальными методами)

- Проведение микробиологического и молекулярно-генетического исследования для подтверждения кандидоза

Полученные данные позволили нам в случае обнаружения у пациентов грибов рода кандида расширить традиционную схему комплексного лечения пародонтита, добавив следующие компоненты:

- Назначение противогрибковых препаратов группы кетоконазола (итраконазол или флюконазол)

- Местное использование антисептиков и иммунных средств (имудон, ликопид в таблетках или в составе пленки «Диплен-Дснта»)

- Хирургическое лечение проводили не ранее чем через 2-3 месяца после начала химиотерапии

ВЫВОДЫ

1. В развитии хронического генерализованного пародонтита у 23,3% пациентов активное участие принимают дрожжеподобные грибы рода Candida, что подтверждается с помощью комплекса методов, включающих микроскопическое, микологическое, молекулярно-генетическое и иммунологическое исследование.

2. На основании данных клинико-лабораторного исследования установлено, что кандида-ассоциированный пародонтит представляет собой вариант пародонтита, обусловленный поверхностным прединвазивным или инвазивным кандидозом тканей десны и пародонталыюго кармана.

3. Методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) и твердофазного иммуно-ферментного анализа (ИФА), основанные на применении отечественных систем, обладают достаточным уровнем специфичности и чувствительности, что позволяет использовать их в этиологической диагностики кандида-ассоциированного пародонтита.

4. Клинико- лабораторная и анамнестическая характеристика кандида-ассоциированного пародонтита отличается от пародонтитов бактериальной этиологии. Это позволяет получить дифференциально-диагностические клинические, клинико-рентгенологические и клинико-лабораторные критерии диагностики кандида-ассоциированного пародонтита.

5. На основании данных исследований in vitro и учёта чувствительности штаммов Candida, выделенных у больных пародонтитом, разработаны показания для комбинированной химиотерапии кандида-ассоциированного пародонтита, с использованием итраконазола (орунгала) и флюконазола (дифлюкана).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для диагностики кандида-ассоциированного пародонтита пациентам группы риска (определяемой по данным анамнеза, клиническим и рентгенологическим признакам) предлагается проводить дополнительные микробиологические, иммунологические

и молекулярно-генетические лабораторные применением следующего алгоритма:

исследования

с

2. Для лечения кандада-ассоциированного пародонтита предлагается применение двух альтернативных схем лечения препаратами группы кетоконазола:

Схема №1. Орунгал (итраконазол). По 100 мг (капсулы) после еды 1 раз в сутки в течение 10-15 дней при контроле выделения грибов культуральным методом.

Схема №2. Дифлюкан (флюконазол). По 50-100 мг (капсулы) 1 раз в сутки в течение 7-14 дней при контроле выделения грибов культуральным методом.

Список работ, опубликованных но теме диссертации:

1. Носик А.С., Чувилкин В.И., Преснова А.Г.. Перспективы применения лечебных паст, обладающих сочетанным антибактериальным и иммуномодулирующим эффектами //Сб. тезисов XIX итоговой межвузовской научной конференции молодых учёных. - М., ММСИ.-1997. - С.62.

2. Самура Б.А., Кузнецов Е.А., Царёв В.Н., Чувилкин В.И., Носик А.С.. Изучение антибактериальной и противогрибковой активности новых производных триазола и акридина и перспектива их применения для профилактики осложнений дентальной имплантации воспалительного характсра//Лекарства-человеку: Международн. сб. научн. трудов Y1I научно-практич. конференции «Современные аспекты создания, исследования и апробации лекарственных средств». М., 1997. -Т.7. -С 351-355.

3. Скухторов В.В., Носик А.С., Левиев Д.О.. Перспективы применения излучения сверхмалых светодиодных источников для лечения воспалительных заболеваний полости рта инфекционной природы //Сб. тезисов XXI итоговой конфер. молодых учёных.. М., ММСИ.-1999.-С.69-70.

4. Арутюнов С.Д., Остроухова А. А., Носик А. С.. Оценка эффективности метода плазменной стерилизации с использованием аппарата ПС 200-2. //Материалы межвузовск. научно-теоретич. конфер. «Проблемы теоретической и практической медицины в начале XXI века» М., МГМСУ - 2001.-С.21-22.

5. Царёв В.Н., Носик А.С., Ушаков Р.В., Абакаров СИ., Григорова М.А.. Микробная флора полости рта человека. - Учебное пособие УМО МЗ РФ- М.-2002.-36с.

6. Царёв В.Н., Николаева Е.Н., Плахтий Л.Я., Зуева И.А., Фомичева Е.М., Носик А.С.. Диагностика хронического генерализованного пародонтита молекулярно-генетическими и иммунологическими методами. -Методические рекомендации для слушателей системы послевузовского образования. - УМО МЗ РФ. - Владикавказ. -2002.-20с.

7. Царев В.Н., Ушаков Р.В., Носик А.С., Гусев-Стренин М.С. Активность фунгицидных препаратов в отношении возбудителей «протезных» кандидозов и кандида-ассоциированного

пародонтита. Научно-практическая конференция памяти проф. Каламкарова Х.А. «Пути совершенствования постдипломного образования специалистов стоматологического профиля». Москва. 2002.-С.51-52

8. Носик А.С., Остроухова А.А., Царёв В.Н.. Клиническое течение пародонтиа ассоцированного с грибами Кандида.- Материалы Всероссийской конференции по профилактике, диагностике и лечению стоматологических заболеваний. - М.- 2003. - С. 16-19.

9. Царёв В.Н., Николаева Е.Н, Максимовский Ю.М., Носик А.С.. Применение полимеразно-цепной реакции для диагностики и контроля эффективности лечения генерализованного пародонтита. - Российский стоматологический журнал. -2002. -№3. - С.27-34.

10. Царев В.Н., Ушаков Р.В., Ушакова Т.В., Носик А.С., Николаева Л.Н.. Генерализованный пардонтит, ассоциированный с грибами рода Candida. Владикавказкий медико-стоматологический вестник Владикавказкий медико-стоматологический вестник. - 2002. - №2.

11. Царев В.Н.. Николаева Е.Н., Мегрелишвили Н.А., Николаева Л.Н., Носик А.С. ПЦР-диагностика пародонтита. 10-й Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». М. - 2003. - С 399.

12. Царев В.Н., Ушаков Р.В., Носик А.С. Курбакова Н.В., Григорова М.В Перспективы применения сангвиритрина в лечении кандида-ассоциированного пародонтита. 10-й Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». М. - 2003. - С.556.

13. Носик А.С. Роль грибов Candida в развитии хронического генерализованного пародонтита. Материалы Всероссийской конференции «Профилактика основных стоматологических заболеваний». Москва. - 2003. - С.94-95.

14. Носик А.С, Курбакова Н.В., Григорова М.В. Изучение активности сангвиритрина и фунгицидных препаратов в отношении референтных и клинических штаммов дрожжеподобных грибов рода Candida// Материалы всероссийской конференции «Профилактика основных стоматологических заболеваний». Москва. -2003.- С.96-97.

15. Царев В.Н., Остроухова А.А., Носик А.С.. Клиническое течение пародонтита, ассоциированного с грибами рода Candida//

Материалы всероссийской конференции «Профилактика основных стоматологических заболеваний». Москва. - 2003. -С. 141-143.

16. Царев В.Н., Дмитриева Л.А., Носик А.С., Мегрелишвили Н.А. К вопросу об актуальности дифференциации кандидоза слизистой оболочки полости рта и, так называемого, лептотрихоза // Материалы всероссийской конференции «Профилактика основных стоматологических заболеваний». Москва.-2003.-С.144-147.

17. Царёв В.Н., Дмитриева Л.А., НА. Мегрелишвили, Носик А.С., Романов А.Е., Давыдова М.М., Гусева О.А. Клинико-микробиологическая оценка эффективности применения «Элюдрила», «Пародиума», «Эльгидиума» в комплексном лечении пародонтита//Стоматология сегодня - 2003. - №2 (24). - С.28-30.

18. Царёв В.Н., Дмитриева Л.А., Мегрелишвили Н.А., Носик А.С. Клинико-микробиологическая оценка эффективности применения хлоргексидин-содержащих производных «Элюдрил», «Пародиум», «Эльгидиум» в комплексном лечении пародонтита// Пародонтология - 2003. - №3 (28).- - С.63-68.

19. Царёв В.Н., Дмитриева Л.А , Мегрилишвили Н.А., Носик А.С, Романов А.Е. Клинико-микробиологическая оценка эффективности применения «Элюдрила», «Пародиума» и «Эльгидиума при комплексном лечении пародонтита. //Кафедра -2003.-№1.-С54-58.

20. Царёв В.Н., Дмитриева Л.А , Мегрилишвили Н.А., Носик А.С, Романов А.Е. Давыдова М.М., Гусева О.А. Клиническая и микробиологическая оценка эффективности применения «Элюдрила», «Пародиума» и «Эльгидиума при комплексном лечении пародонтита. Учебное пособие УМО МЗ РФ. -М. - 2004. -24с.

-8 9 6 3

Формат А - 5 Отпечатано в Р ИО МГМСУ

Бумага офсетная N 1-80 г / м 2 И з д . лицензия ИД N° 04993 Усл. пет. л 0,1- Тираж /00 экз. от 04.06.01 года Заказ ЪЧ IV- Москва103473

Делегатская ул. 20/1

Среди важнейших проблем современной стоматологии воспалительные заболевания пародонта занимают одно из ведущих мест. Как известно, в средней и старшей возрастных группах населения пародонтит является главной причиной потери зубов, что требует повышенного внимания исследователей к пробле*ме этиологии, патогенеза, диагностики и терапии данного заболевания [3, 27,41,184].

Вместе с тем, отечественные и зарубежные исследователи отмечают высокую частоту так называемых торпидных или устойчивых к терапии форм пародонтита [24, 67, 122, 137, 173]. Эффективность ортопедических и хирургических методов лечения, включая дентальную имплантацию, существенно ограничивают осложнения инфекционно-воспалительного характера, в том числе, ассоциированные с дрожжеподобными грибами рода Candida [65,98, 136, 152, 170].

В последние годы в зарубежной литературе всё чаще используется специальный термин - кандида-ассоциированные пародонтиты, которые отличаются от кандидоза слизистой оболочки полости рта избирательной инвазией грибов не только в десневой эпителий, но и область пародонталыюй связки [158, 184]. Развитие специфической грибковой патологии пародонта может быть связано с необоснованным выбором антибактериальных препаратов и развитием дисбиоза [21, 62, 66, 142, 171]. Кроме того, многие препараты, эффективные в отношении пародонтопатогенных бактерий, оказывают негативное влияние па иммунные процессы в организме больного и, таким образом, также могут способствовать развитию грибковой инвазии [32,46, 125,174].

Однако, углублённого анализа основных причин возникновения и возможных механизмов развития кандида-ассоциированных пародонтитов на современном уровне в отечественной литературе не проводилось. Дальнейшей разработки требуют методы диагностики и лечения этого тяжёлого заболевания.

Введение в пародонтальный карман под лечебную повязку лекарственных форм, содержащих полиеновые фунгицидные средства (нистатин), к сожалению, оказывает кратковременное воздействия, что не позволяет достичь элиминации грибов в большинстве случаев [149, 176, 177].

Разрешению этой проблемы может способствовать создание и поступление в отечественную фармакопею новых фунгицидных препаратов -производных азола [30, 31, 53]. Вместе с тем, не проводилось исследований их сравнительной эффективности при кандида-ассоциированном пародон-тите и кандидозе полости рта [86, 127, 143, 188, 192J. В доступной литературе мы также не нашли работ, посвященных экспериментальному обоснованию (микробиологическому и иммунологическому) выбора фунгицидных препаратов для включения в схемы лечения заболеваний полости рта, ассоциированных с дрожжеподобными грибами рода Candida.

В связи с вышеизложенным, целью пашей работы являлась разработка современных методов диагностики и лечения пародонтита, ассоциированного с дрожжеподобными грибами рода Candida, на основании данных клинического, микробиологического, молекулярно-генетического и иммунологического исследования.

Задачи исследования.

1. Выявить особенности клинического течения пародонтита ассоциированного с грибами рода Candida.

2. Апробировать отечественную диагностическую тест-систему для выявления дрожжеподобных грибов рода Candida (С.albicans, C.Krusei и др.) с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также сопоставить результаты исследования с данными классического культурального метода диагностики кандидоза.

3. Провести анализ чувствительности грибковой флоры in vitro к фунги-цидным препаратам ряда фармакологических групп, используемым в настоящее время, и новым, ранее не применявшимся для лечения пародонтита.

4. Выявить особенности иммунного статуса (включая определение уровня AT к дрожжеподобным грибам рода Candida с помощью иммуно-ферментного анализа) у больных хроническим генерализованным пародонтитом и сопоставить их с данными молекулярно-генетического исследования.

5. Разработать принципиальную схему лечения пародонтита, ассоциированного с грибами рода Candida с применением фунгицидных препаратов -производных триазола.

Научная новизна

1. Определены клинические и микробиологические особенности хронического генерализованного пародонтита, ассоциированного с грибами рода Candida. Получены сравнительные данные о специфичности и чувствительности новой системы для этиологической диагностики заболевания, основанной на полимеразно-цепной реакции с последующей обратной Д Н К-гибр и д изацие й.

2. Изучена чувствительность грибковой флоры in vitro к фунгицидным препаратам ряда фармакологических групп, используемым в настоящее время, и новым, ранее не применявшимся для лечения пародонтита. Разработаны показания для использования фунгицидных и иммуномодулирую-щих препаратов в комплексном лечении хронического генерализованного пародонтита в стадии обострения, ассоциированного с грибами рода Candida.

3. Обосновано применение иммуноферментного анализа для выявления кандидоза слизистой оболочки полости рта и кандида-ассоциированного пародонтита.

4. Проведена клиническая и микробиологическая оценка эффективности антифунгальной химиотерапии в комплексном лечении кандида-ассоциированного пародонтита.

Практическая значимость

1. Определены характерные местные, общие и анамнестические признаки хронического генерализованного пародонтита, ассоциированного с грибами рода Candida.

2. Разработана принципиальная схема лечения кандида-ассоциированного пародонтита, установлены сроки проведения каждого компонента комплексного лечения. На основании данных, полученных в исследованиях штаммов Candida in vitro, выделенных у больных кандида-ассоциированным пародонтитом, разработаны показания для антимикробной химиотерапии пародонтита, включающей использование фунгицидных препаратов — производных триазола.

3. Проведена оценка новых диагностических систем, основанных на по-лимеразной цепной реакции, обратной гибридизации ДНК и иммунофер-ментном определении антител сыворотки крови для диагностики кандида-ассоциированного пародонтита.

Положения, выносимые на защиту

1. Кандида-ассоциированный пародонтит представляет собой вариант пародонтита, обусловленный поверхностным предынвазивным или инва-зивным кандидозом слизистой оболочки десны.

2. Представители дрожжеподобных грибов рода Candida являются компонентом ассоциаций, формируемых пародонтопатогенной микрофлорой полости рта.

3. Диагностика кандидозного поражения тканей пародонта должна быть комплексной и основываться на данных иммуноферментного определения AT к кандида (ориентировочный экспресс-метод) и обнаружения грибов микробиологическим или молекулярно-генетическим методом (окончательный диагноз).

4. Клинико-лабораторная и анамнестическая характеристика кандида-ассоциированного пародонтита отличается от пародонтитов бактериальной этиологии.

5. Фунгицидные препараты группы триазола являются эффективным средством лечения кандида-ассоциированного пародонтита.

Объём и структура диссертации

Диссертация состоит из обзора литературы, главы «Материалы и методы», двух глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы включает 192 источника, в том числе - 85 отечественных и 107 - зарубежных изданий.

Текст диссертации включает 136 страниц машинописного текста, иллюстрирован 17 таблицами, 15 рисунками и фотографиями.

Апробация работы

Результаты исследований апробированы на городской межинститутской конференции (Москва, 2001), Всероссийском конгрессе с международным участием «Форум второго тысячелетия» (Москва, 2002), научно-практической конференции памяти профессора Х.А. Каламкарова «Пути совершенствования постдипломного образования специалистов стоматологического профиля» (Москва, 2002), X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003), межкафедральной конференции кафедры микробиологии МГМСУ и стоматологии РМАПО (18 декабря 2003 года).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 2 учебных пособия УМО МЗ РФ и методические рекомендации МЗ РФ.

Внедрение результатов исследования

Результаты работы внедрены в программу преподавания на кафедрах микробиологии МГМСУ и кафедры стоматологии РМАПО по курсу «Микробиология полости рта», практику работы пародонтологических отделений клинико-диагностических центров МГМСУ и ЛПУ г. Москвы. Изданы методические рекомендации и учебные пособия по совершенствованию лабораторной диагностики заболеваний пародонта.

ВЫВОДЫ

1. В развитии хронического генерализованного пародонтита у 23,3% пациентов активное участие принимают дрожжеподобные грибы рода Candida, что подтверждается с помощью комплекса методов, включающих микроскопическое, микологическое, молекулярно-генетическое и иммунологическое исследование.

2. На основании данных клинико-лабораторного исследования установлено, что кандида-ассоциированный пародонтит представляет собой вариант пародонтита, обусловленный поверхностным предын-вазивным или инвазивным кандидозом тканей десны и пародонталь-ного кармана.

3. Методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) и твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), основанные на применении отечественных систем, обладают достаточным уровнем специфичности и чувствительности, что позволяет использовать их в этиологической диагностики кандида-ассоциированного пародонтита.

4. Клинико-лабораторная и анамнестическая характеристика канди-да-ассоциированного пародонтита отличается от пародонтитов бактериальной этиологии. Это позволяет получить дифференциально-диагностические клинические, клинико-рентгенологические и клини-ко-лабораторные критерии диагностики кандида-ассоциированного пародонтита.

5. На основании данных исследований in vitro и учёта чувствительности штаммов Candida, выделенных у больных пародонтитом, разработаны показания для комбинированной химиотерапии кандида-ассоциированного пародонтита, с использованием итраконазола (орунгала) и флюконазола (дифлюкана).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для диагностики кандида-ассоциированного пародонтита пациентам группы риска (определяемой по данным анамнеза, клиническим и рентгенологическим признакам) предлагается проводить дополнительные лабораторные исследования но следующему алгоритму:

Для лечения кандида-ассоциированного пародонтита предлагается применение двух альтернативных схем лечения препаратами группы триазола: Схема №1. Орунгал (итраконазол). По 100 мг (капсулы) после еды 1 раз в сутки в течение 10—15 дней при контроле выделения грибов культураль-ным методом.

Схема №2. Дифлюкан (флюконазол). По 50-100 мг (капсулы) 1 раз в сутки в течение 7-14 дней при контроле выделения грибов культуральным методом.