Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Разработка методологии поиска новых противомигреневых средств

На правах рукописи

Ганьшина Тамара Сергеевна

РАЗРАБОТКА МЕТОДОЛОГИИ ПОИСКА НОВЫХ ПРОТИВОМИГРЕНЕВЫХ СРЕДСТВ. СОЗДАНИЕ ОРИГИНАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА - ТРОПОКСИН

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва -2004

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологам им. В.В.Закусова РАМН

Научный консультант: доктор медицинских наук,

профессор Р.С.Мирзоян

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Т.А. Воронина доктор медицинских наук, профессор Р.Д. Сейфулла доктор биологических наук, профессор В.Б. Кошелев

Ведущее учреждение: Московский государственный

медико-стоматологический университет

Защита состоится

в «_» на заседании диссертационного совета Д.001.024.01 в ГУ НИИ

фармакологии им. В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в Ученой части ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д. 8.

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

ААВальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Мигрень является одним из наиболее распространенных и социально значимых заболеваний среди населения. Согласно данным, представленным на 7-м Международном конгрессе по головным болям в развитых странах Европы и Америки мигренью страдает от 3 до 16% населения, а по некоторым данным и до 30%. Среди женщин мигренью болеют 18% , среди мужчин - 6% и среди детей - 4 % (Silberstein S.D. et al., 1998; Яхно Н.Н. и соавт., 2001; Черняк З.В. и соавт, 2003). У женщин приступы мигренью возникают в 2 -3 раза чаще, чем у мужчин (Вейн А.М. и соавт., 1995; Rasmussen B.K., 1991; Stewart W.F. et al., 1994; Амелин А.В. и соавт., 2001). Наиболее часто мигренью болеют лица трудоспособного возраста - 35-40 лет. Эпидемиологические исследования последних лет выявили тенденцию к увеличению числа больных мигренью (Stewart W.F. et al., 1992; Амелин А.В. и соавт., 2001; Яхно Н.Н. и соавт., 2001; Яхно Н.Н., Штульман Д.Р., 2003).

Многочисленные клинические и молекулярно-биологические исследования свидетельствуют о важной роли генетического фактора в возникновении мигрени (Вейн А.М. и соавт., 1995; Амелин А.В. и соавт., 2001). Мигрень считают заболеванием, обусловленным, наследственно детерминированной дисфункцией вазомоторной регуляции, проявляющейся пароксизмальными приступами головной боли пульсирующего характера, чаще в одной половине головы (Алексеев В.В., Яхно Н.Н., 1997). Несмотря на значительный прогресс в изучении патогенеза приступа мигрени, многие аспекты этой проблемы остаются невыясненными (Pietrobon D., Striessing J., 2003). В настоящее время очевидно, что одну из существенных ролей в генезе этого заболевания играет нейромедиатор - серотонин. Важно отметить, что серотонин, с одной стороны, оказывает выраженное влияние на мозговые сосуды, с другой - участвует в проведении болевых импульсов.

В литературе широко обсуждаются гипотезы формирования приступа мигрени. Так, в середине прошлого столетия Wolff H.G. и сотрудники (1963) предложили сосудистую гипотезу развития приступа мигрени, которая не потеряла актуальность и в настоящее время. Согласно этой гипотезе приступ мигрени сопровождается повышением тонуса мозговых сосудов с последующим их расслаблением. Далее Olesen J. В. и соавт. (1981) выдвинули нейрогенную гипотезу, основанную на обнаруженной ими корреляции изменений мозгового кровообращения с распространяющейся кортикальной депрессией Leao. В последние годы широко обсуждается значение тройничного нерва в механизмах формирования головной боли при мигрени. Moskowitz M.A. (1984) была предложена гипотеза, получившая название тригеминоваскулярной, согласно которой система тройничного нерва является ответственной за взаимодействие между центральной нервной системой и сосудами головного мозга во время приступа мигрени. Следует подчеркнуть, что, несмотря на различия в представлениях о формировании приступа мигрени, сторонники различных гипотез признают, что серотонин и цереброваскулярный компонент являются существенными факторами в этом процессе. Открытым остается вопрос о первичности или вторичности реакции сосудов мозга, наблюдаемой во время приступа мигрени.

Для лечения больных мигренью используются лекарственные препараты, относящиеся к различным группам фармакологических веществ: адреноблокаторы, антидепрессанты, блокаторы кальциевых каналов, противосудорожные, ненаркотические анальгетики и другие. Среди них особое место занимают препараты, воздействующие на серотониновые рецепторы - агонисты и антагонисты - рецепторов.

Имеющиеся в наличии у клиницистов лекарственные средства для лечения мигрени не всегда отличаются достаточной эффективностью и обладают выраженными нежелательными побочными свойствами, поэтому поиск новых препаратов для профилактики и лечения приступа мигрени является

одной из наиболее актуальных задач современной фармакологии и неврологии.

В соответствии с современными представлениями о патогенезе приступа мигрени необходимо совершенствовать методологию поиска новых средств для лечения этого заболевания: При этом следует учитывать как факторы, определяющие генез приступа мигрени, так и сведения о механизме действия известных препаратов, применяемых для лечения этого заболевания.

В соответствии с важной ролью цереброваскулярного компонента и серотонина в генезе приступа мигрени при поиске новых противомигреневых препаратов необходимо, чтобы вещество проявляло антисеротониновую активность по отношению к церебральным сосудам.

Вышеизложенное явилось основанием для поиска противомигреневых препаратов, который проводился среди производных тропана. Выбор этого ряда соединений обусловлен тем, что среди производных тропана выявлены препараты, обладающие антисеротониновой активностью а-адреноблокатор - тропафен (Машковский М.Д., Шварц ГЛ., 1979) и антагонист 5НТз типа рецепторов- трописетрон (Richardson B.R. etal., 1985).

Цель_исследования: разработка методологии поиска

противомигреневых препаратов с учетом основных патогенетических факторов развития приступа мигрени, изыскание нового препарата с антисеротониновой цереброваскулярной активностью среди производных тропана, изучение механизма его действия и проведение расширенных доклинических испытаний.

Задачи исследования: 1. провести систематическое изучение влияния серотонина на тонус сосудов различных артериальных систем мозга, состояние микроциркуляции в коре головного мозга и разработать модель серотонинового спазма церебральных сосудов;

2. изучить роль серотонина в реализации цереброваскулярных эффектов известных противомигреневых препаратов: метисергида, дигидроэрготамина, ницерголина, пропранолола, толфенамовой кислоты;

3. провести скрининг среди производных тропана (в опытах in vitro, in vivo) с целью выявления соединения, с наиболее выраженной антисеротониновой цереброваскулярной активностью и наименьшей токсичностью и сопоставить его эффекты с эталонными препаратами;

4. провести анализ антисеротонинового эффекта нового соединения для определения типа серотониновых рецепторов-мишеней с использованием метода радиолигандного связывания;

5. провести нейромедиаторный анализ механизма действия наиболее активного соединения;

6. изучить влияние наиболее активного соединения на центральные и периферические механизмы регуляции сосудистого тонуса;

7. изучить нейропсихотропные свойства наиболее активного соединения с использованием комплекса общепринятых методик;

8. изучить анальгетическую активность нового соединения;

9. изучить фармакокинетику и хроническую токсичность нового противомигреневого препарата.

Научная новизна работы. Разработана методология поиска новых противомигреневых препаратов на основе современных представлений о существенной роли серотонина и цереброваскулярного компонента в патогенезе приступа мигрени.

Установлена существенная роль серотонина в реализации констрикторных реакций сосудов каротидной артериальной системы мозга по сравнению с вертебробазилярной системой. Показано, что в условиях ишемического поражения мозга реакция микрососудов мозга на серотонин возрастает.

Систематическое изучение механизма действия противомигреневых препаратов позволило установить антисеротониновую цереброваскулярную активность у ницерголина, пропранолола и толфенамовой кислоты.

Скрининг среди производных оксима тропинона выявил новое оригинальное соединение, получившее название тропоксин, обладающее выраженной антисеротониновой цереброваскулярной активностью и низкой токсичностью.

Тропоксин блокирует реакции сосудов мозга на серотонин как у интактных животных, так и в условиях локальной перманентной ишемии мозга. По силе антисеротониновой активности тропоксин превосходит метисергид, ницерголин, пропранолол, толфенамовую кислоту и не уступает дигидроэрготамину.

С использованием методики радиолигандного связывания выявлена способность тропоксина блокировать 5НТ2 - рецепторы коры головного мозга. Тропоксин не влияет на адрено-, холино- и гистаминовые рецепторы.

Тропоксин обладает умеренно выраженным стимулирующим действием и не проявляет анальгетическую активность.

Установлено, что тропоксин преодолевает гемато-энцефалический барьер и в течение полутора часов уровень концентрации препарата в ткани мозга выше, чем в крови.

Тропоксин по данным изучения шестимесячной «хронической» токсичности не оказывает отрицательного влияния на строение внутренних органов, не вызывает изменений электрокардиограммы, поведенческих реакций, гематологических и клинико-биохимических параметров крови и мочи. Он не обладает местноанестезирующим, иммунотоксическим, тератогенным и мутагенным действием.

Научно-практическое значение работы. Предложенная методология скрининга противомигреневых препаратов, проведенный анализ роли серотонина в регуляции тонуса мозговых сосудов и в механизме действия

известных средств для лечения мигрени, создают основу для направленного поиска потенциальных препаратов для лечения больных мигренью.

Научные положения, разработанные в настоящем исследовании, явились основой для составления изданных Фармакологическим государственным комитетом РФ «Методических указаний по экспериментальному изучению препаратов для лечения нарушений мозгового кровообращения и мигрени», которые вошли в «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» 2000 года.

Выявленное впервые среди производных оксима тропинона новое соединение с выраженной цереброваскулярной антисеротониновой активностью (патент РФ № 1832683, 1994) позволяет считать целесообразным поиск потенциальных противомигреневых препаратов в указанном ряду химических соединений.

Полученные в результате настоящего исследования данные составили основу представленных в Фармакологический государственный комитет МЗ РФ материалов доклинического изучения препарата тропоксин, на которые получено разрешение на проведение клинических испытаний препарата в качестве средства для лечения мигрени.

Результаты проведенного экспериментального изучения препарата тропоксин получили клиническое подтверждение на кафедре неврологии и нейрохирургии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. И.П.Павлова, где выявлена высокая эффективность тропоксина при межприступном лечении частых тяжелых приступов мигрени.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на VII национальной конференции по фармакологии и клинике бълкарски лекарства (София, 1987), У! Всесоюзном съезде фармакологов «Фармакология и научно-технический прогресс» (Ташкент, 1988), на советско-финском симпозиуме по нейрофармакологии и биологическому исследованию

алкоголя (Куопио, 1989), Всесоюзной конференции «Оценка фармакологической активности химических соединений, принципы и подходы» (Москва, 1989), III конгрессе болгарских фармакологов (София, 1990), XY конференции по клинической фармакологии с международным участием «Актуальные вопросы клинической фармакологии» (Волгоград, 1990), Международном конгрессе патофизиологов (Москва, 1991), Международном конгрессе «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропных средствам» (Москва, 1993), Рабочем совещании по междисциплинарной научной программе «Мозговое кровообращение» (Санкт-Петербург, 1995), I Съезде Российского научного общества фармакологов «Фундаментальные исследования как основа создания лекарственных средств» (Волгоград, 1995), Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1997, 1998, 1999), XIII Международном конгрессе фармакологов (Мюнхен, 1998), конференции «Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов», посвященной 15-летию НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (Томск, 1999), Всесоюзной конференции «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Москва, 1999), II Европейском конгрессе фармакологов (Будапешт, 1999), Пленуме правления российского научного общества фармакологов (Санкт-Петербург, 1999), Симпозиуме «Регуляция мозгового кровообращения в норме и патологии» (Ростов-на-Дону, 1999), Международном симпозиуме по мигрени на 5-ом Европейском колледже по нейропсихофармакологии (Санкт-Петербург, 2000), XIV Международном конгрессе фармакологов (Сан-Франциско, 2002), II съезде Российского Научного Общества фармакологов (Москва, 2003), Международной конференции «Роль биологически активных веществ в интегративной деятельности организма в норме и в процессе формирования общеадаптационного синдрома» (Ереван, 2003), межлабораторной конференции ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН (декабрь, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 научных работ, из них 15 статей в отечественных и зарубежных журналах и сборниках, а также имеется патент РФ № 1832683.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 7 глав; собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы;

Диссертация изложена на страницах компьютерного текста,

содержит 43 таблицы, и 34 рисунка, указатель литературы содержит 28 отечественных и 307 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на 326 наркотизированных (уретан 500 мг/кг, хлоралоза 50 мг/кг внутривенно) кошках массой 2.8—4.0, в условиях искусственной вентиляции легких при напряжении углекислого газа, равного 35-40 мм рт. ст.; на 126 кроликах, породы Шиншилла, массой 2.0 - 3.0 кг, на 297 наркотизированных (нембутал 40 мг/кг или хлоралгидрат 400 мг/кг в/б) крысах-самцах и 9 бодрствующих крысах-самцах (250-320 г), и на 576 беспородных мышах-самцах массой 18-28г.

В работе использован комплекс современных количественных методов исследования кровоснабжения мозга, регуляции кровообращения, нейропсихотропной активности, фармакокинетики, лекарственной токсикологии, а также изучения нейромедиаторных и нейрохимических механизмов действия препаратов.

Методы исследования кровоснабжения мозга и регуляции кровообращения

Регионарный мозговой кровоток регистрировали в системе сонных артерий с помощью электромагнитных измерителей кровотока фирмы Nichon Koden (Япония), РКЭ-2-БИ (Россия) и ультразвукового флоуметра фирмы «Transonic Systems Inc» (США).

Для регистрации тонуса мозговых сосудов использовали методику раздельной двухсторонней перфузии каротидных и вертебробазилярных

артерий с помощью многоканального перфузионного насоса с постоянным объемом крови (Мирзоян Р.С.,1973, Хаютин В.М. и соавт., 1958).

Локальный мозговой кровоток определяли полярографическим методом с помощью водородного клиренса при его ингаляции (Aukland К., 1964). Количественное определение микроциркуляции в коре головного мозга проводилось с помощью лазерного допплеровского флоуметра ALF-21 фирмы «Transonic Systems Inc» (США).

Прижизненное изучение- микроциркуляции в бассейне средней мозговой артерии проводили с помощью установки, собранной на базе осветителей ОСЛ-1, ОИ-30 и микрофотонасадки МНФ-10. Использование контактного объектива ЛК-10 позволяло проводить наблюдения через интактную твердую мозговую оболочку. При группировании сосудов учитывали как начальный диаметр артериол, так и порядок ее ветвления (Александров П.Н. и соавт., 1989).

Для измерения сократительной способности сосудов регистрировали изометрическое напряжение кольцевых сегментов базилярной артерии с помощью преобразователя UC-2 на димографе R-711 (Бекман, США).

Учитывая существенную роль рСО2 в регуляции мозгового кровотока определяли напряжение углекислоты с помощью установки АВС-1 фирмы « Radiometen» (Дания) (Тодоров Й., 1961; Агапов Ю.Я., 1968).

Во всех опытах регистрировали артериальное давление в бедренной артерии с помощью электроманометра. О частоте сердечных сокращений судили по изменениям электрокардиограммы во II стандартном отведении.

Влияние фармакологических веществ на нервную регуляцию мозгового кровообращения оценивали с помощью комплекса методических приемов, включающих в себя регистрацию констрикторных рефлекторных реакций сосудов каротидного и вертебробазилярного бассейнов. Полученные данные сопоставляли с изменениями спонтанной и рефлекторной биоэлектрической активности в симпатических нервах почечного сплетения и вазомоторным рефлексом.

Метод радиолигандного связывания

Изучение нейрохимического спектра действия тропоксина проводили на крысах. Инкубационная смесь состояла из 240 мкл суспензии грубой фракции синаптических мембран, 30 мкл раствора радиоактивного лиганда соответственной концентрации и 30 мкл соответствующей концентрации исследуемых веществ. Был использован 3Н- спиперон (88 Ci/mmol) в концентрации 2пМ. Подсчет радиоактивности проводили при помощи сцинтилляционного счетчика "Intertechnique SL-3000". Концентрацию белка в пробах определяли по методу Петерсона. Определение 1С 50 и константы ингибирования осуществляли по специальной программе "1С 50.

Изучение нейропсихотропной активности

Спонтанную двигательную активность мышей изучали в аппарате "Optovarimex" при одновременной посадке в камеру группы из 10 животных. Изучалось ориентировочно-исследовательское поведение у мышей в «открытом поле», поведение мышей в условиях модифицированного плавательного теста по Porsolt, поведение крыс в условиях методики выработки и сохранения условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ), поведение крыс в условиях конфликтной ситуации с питьевой депривацией, а также изучалась выживаемость животных в условиях гипоксии на модели нормобарической гипоксии в гермообъеме и в условиях полной ишемии посредством декапитации мышей.

Анальгетическую активность изучали на мышах по двум тестам: - тест 1-tail flick- отдергивание хвоста с использованием установки "Analgesia test" фирмы "Hugo Sacks Е1ейшшк"(Германия) и - теста 2 - hot plate - горячая пластинка. Изучалась также болевая реакция крыс при электрической стимуляции хвоста животного через игольчатые электроды с помощью стимулятора ЭСЛ-2.

Исследуемые соединения вводили в бедренную вену, внутрибрюшинно или в боковой желудочек мозга с помощью специальной канюли (Бендиков Э.А., 1964).

Полученные результаты обрабатывали статистически с вычислением доверительных границ, значимость различий определяли с помощью t-критерия Стьюдента (Беленький М.Л., 1963). Значения ED50 рассчитывали, используя программу "Quantal Dose—Response: Probits (Tallarida R.J., Murray R.B., 1981).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Моделирование спазмов сосудов мозга с помощью серотоннна

Опыты на наркотизированных кошках показали, что серотонин в дозе 20 мкг/кг при внутривенном введении в подавляющем большинстве экспериментов вызывает выраженное уменьшение объемной скорости мозгового кровотока, которое в среднем составляет 44,0±1,5%. Цереброваскулярный эффект серотонина наблюдается сразу же после введения и сохраняется в течение 5-10 минут после инъекции серотонина. Уменьшение притока крови в мозг в большинстве экспериментов сопровождается понижением уровня артериального давления, которое в среднем составляет 26,0± 1,3% (рис.1). В ряде экспериментов наблюдалось небольшое повышение уровня артериального давления под влиянием серотонина, которое затем сменялось его уменьшением. Следует отметить, что на фоне повышения уровня артериального давления также наблюдалось уменьшение объемной скорости мозгового кровотока под влиянием моноамина, что свидетельствует о констрикторной реакции сосудов мозга на серотонин. Полученные нами данные о констрикторных цереброваскулярных реакциях серотонина согласуются с результатами исследований Ланского В. II. (1968), Lowe R.F., Gilboe D.D. (1973), Edvinsson L. и соавт. (1984) и других исследователей, также продемонстрировавших способность серотонина понижать уровень кровоснабжения мозга и повышать тонус церебральных сосудов.

В опытах на крысах было показано, что серотонин также уменьшает приток крови в мозг в системе сонных артерий в среднем на 54,0 ± 14,0%, что согласуется с данными, полученными на кошках.

При изучении влияния серотонина на микроциркуляцию коры головного мозга крыс с помощью лазерного допплеровского флоуметра оказалось, что серотонин вызывает снижение локального мозгового кровотока в среднем на 27,0 ± 3,3%. Полученные данные получили подтверждение в экспериментах на бодрствующих крысах при исследовании локального мозгового кровотока в коре головного мозга с помощью метода водородного клиренса. Было показано, что серотонин в дозе 50 мкг/кг при внутрибрюшинном введении вызывает уменьшение кровотока в среднем на 17,0 ± 3,9% в течение 10 минут после введения серотонина, а затем происходит постепенное восстановление исходного уровня кровотока.

Контроль 30 мин 60 мнн

Рис. 2. Влияние серотонина (20 мкг/кг, в/в) при многократном введении на локальный (ЛМК), регионарный мозговой кровоток (МК) и артериальное давление (АД) у кошек (А) и крыс (Б). По оси ординат -изменения показателей в % к исходному уровню.

Учитывая необходимость повторного введения серотонина при моделировании констрикторных реакций сосудов мозга была проведена серия опытов с его многократным введением. Опыты показали, что при повторных введениях с интервалом в 30 минут серотонин вызывает аналогичные изменения мозгового кровотока. Изменения уровня артериального давления, при этом, также не претерпевают существенных изменений (рис. 2).

Полученные данные указывают на то, что реакции сосудов мозга и артериального давления на серотонин отличаются стабильностью на протяжении всего эксперимента и позволяют исследовать влияние фармакологических веществ на цереброваскулярные реакции серотонина при многократном введении последнего.

В отдельной серии опытов исследовали влияние серотонина на тонус сосудов в системах каротидных и вертебробазилярных артерий.

Эксперименты с использованием методики раздельной двухсторонней перфузии каротидных и вертебробазилярных артерий позволили выявить неодинаковую чувствительность артериальных систем мозга в опытах in vivo.

Оказалось, что серотонин в дозе 20 мкг/кг при внутривенном введении в значительно большей степени повышает тонус в каротидной артериальной системе (37,0± 10,0%), тогда как в вертебробазилярной системе увеличение сопротивления сосудов менее выражено (10,0±3,1%, р<0,05) (рис.3).

Следует отметить, что более высокая чувствительность каротидной артериальной системы выявлена также к норадреналину. Норадреналин повышает тонус сосудов в бассейне каротидных артерий на 35,0±5,2%, тогда как повышение перфузионного давления в вертебробазилярной системе составляет 20,0±3,2% (р<0,05) (Мирзоян Р. С, 1976).

Следовательно, оба нейромедиатора - серотонин и норадреналин оказывают более выраженное влияние на сосуды каротидного бассейна. Эти

данные следует учитывать как при обсуждении патогенеза мигрени, так и при поиске противомигреневых и цереброваскулярных средств.

Согласно литературным данным серотонинергическая система играет существенную роль в развитии ишемических поражений мозга. Некоторые антагонисты серотонина проявляют нейропротекторный эффект в условиях глобальной ишемии мозга (Fujikura К et al., 1994). Heyck К (1954) высказал мнение о том, что головная боль при мигрени связана не с пульсацией сосудов, а ишемической гипоксией мозговой ткани, которая возникает в результате открытия артериовенозных шунтов и нарушения кровообращения в микроциркуляторном русле. Поэтому представляло интерес изучить влияние серотонина на кровоснабжение мозга до и после локальной ишемии мозга, вызванной перевязкой средней мозговой артерии. Локальную ишемию мозга вызывали перевязкой средней мозговой артерии по Tamura А. и соавторов (1981) в модификации Топчяна А.В. (1996).

В результате проведенных опытов было показано, что в условиях перевязки средней мозговой артерии, когда в зоне ишемии имеет место значительное понижение мозгового кровотока, введение серотонина приводит к дальнейшему уменьшению кровотока и артериального давления. Через 30 минут после окклюзии средней мозговой артерии серотонин приводит к понижению локального кровотока на 42,0%, а артериального давления на 29% (рис.4).

Таким образом, полученные данные по влиянию сертонина на кровоснабжение мозга у интактных животных и в условиях перевязки средней мозговой артерии позволяют заключить, что серотонин понижает уровень мозгового кровотока в большей степени у крыс с локальной ишемией, чем у интактных животных. Полученные данные подтверждают существенную роль серотонина в патогенезе ишемических расстройств мозгового кровообращения.

При изучении влияния серотонина на диаметр пиальных артериол было показано, что серотонин, в основном, вызывает дозозависимый сосудосуживающий эффект (рис.5).

Рис. 5. Влияние серотонина (60 мкг/кг, в/в) на диаметр пиальных артериол. Стрелкой показана пиальная артериола.

При аппликации серотонина на поверхность мозга артериолы диаметром от 40 мкм и выше отвечали констрикгорной реакцией, а пиальные артериолы меньшего калибра, напротив, существенно увеличивали свой просвет.

Следовательно, микрососуды мозга также проявляют неодинаковую чувствительность к серотонину. Можно предположить, что вазоконстрикторный эффект серотонина связан с его взаимодействием с 5HT1- или 5НТ2-типом рецепторов, а вазодилататорный, по-видимому, с 5НТг типом рецепторов, которые, согласно литературным данным, располагаются в сосудах мозга и ответственны за вазодилатацию (Watts S.W., Cohen MX., 1999).

Таким образом, серотонин вызывает ухудшение мозгового кровообращения, обусловленное, в основном сужением как магистральных, так и микрососудов мозга. Реакции сосудов мозга, вызванные серотонином, имеют сходный характер у разных видов животных (кошки, крысы) и при различном состоянии (наркоз или бодрствование), сохраняются при многократном введении моноамина и усиливаются в условиях ишемического поражения мозга.

Вышеизложенное свидетельствует об участии серотонина в реализации констрикторных реакций сосудов мозга и указывает на целесообразность использования этой реакции для моделирования ишемических состояний мозга, характерных для приступа мигрени.

Изучение цереброваскулярных антисеротониновых свойств противомигреневых препаратов

Учитывая важную роль серотонина и цереброваскулярного компонента в патогенезе мигрени были изучены серотониновые сосудистые механизмы действия противомигреневых препаратов, которые широко применяются в неврологической практике как для профилактического лечения, так и для купирования приступа мигрени. Были выбраны следующие препараты: метисергид - антагонист серотониновых рецепторов, дигидроэрготамин и

ницерголин - а-адреноблокаторы, пропранолол - Р-адреноблокатор и толфенамовая кислота -ингибитор синтеза простагландинов.

Проведенные опыты на кошках позволили установить, что метисергид существенно ослабляет констрикторную реакцию сосудов мозга на серотонин (25,0±4,5%, контроль: 47,0+3,5%, р<0,01). Полученные нами данные согласуются с наблюдениями Karlsberg P. и соавт. (1963),Welch К.М.А. и соавт. (1974), Mylecharane EJ. и соавт. (1978), свидетельствующими о способности метисергида как предупреждать развитие серотониновых спазмов мозговых сосудов, так и восстанавливать исходный уровень кровоснабжения мозга, нарушенный серотонином. Изменения уровня артериального давления при этом не отличались однородностью. В ряде опытов (5 из 9) серотонин на фоне действия метисергида вызывал понижение уровня артериального давления в среднем на 22,0±4,4%, в остальных четырех экспериментах серотонин повышал уровень артериального давления в среднем на 16,0±4,6%. Следует отметить, что в контроле серотонин вызывал понижение уровня артериального давления в среднем на 21,0+3,2%.

Учитывая литературные данные о том, что дигидроэрготамин применяется при лечении мигрени и обладает как альфа-адреноблокирующими, так и антисеротониновыми свойствами, представляло интерес провести сравнительное изучение антисеротониновой и антиадренергической активности препарата. Результаты экспериментов показали, что препарат снимает напряжение мозговых сосудов, вызванное норадреналином: ЕД50 дигидроэрготамина на фоне норадреналина равно 2,7+0,5х10-8М, а также снижает тонус сосудов мозга, повышенный серотонином: ЕД50 дигидроэрготамина на фоне серотонина равно 8,9±0,66х1(Г7М.

Препарат не только ослабляет констрикторные реакции сосудов мозга, вызванные как норадреналином, так и серотонином, но может их и предупреждать. Оказалось, что на фоне действия дигидроэрготамина дозо-

зависимые (10-9М-10-4М) констрикторные реакции мозговых сосудов, вызванные норадреналином, не развиваются. Эксперименты показали, что дигидроэрготамин (10-8М) полностью блокирует дозо-зависимые реакции изолированных сегментов базилярной артерии кролика, вызванные серотонином. Таким образом, проведенное исследование показало, что дигидроэрготамин способен устранять и предупреждать констрикторные реакции церебральных сосудов, вызванные норадреналином, и в меньшей степени серотонином.

Опыты, проведенные in vivo, также показали, что дигидроэрготамин в дозе 1 мг/кг при внутривенном введении предупреждает или в значительной степени ослабляет уменьшение мозгового кровотока, наблюдаемое под влиянием серотонина. Полученные данные согласуются с данными Машковского М.Д. и Ланского В.П. (1968), которые в опытах на кошках обнаружили способность дигидроэрготамина предупреждать или ослаблять повышение тонуса сонной артерии, вызванное серотонином.

Ницерголин, производное эрголина - 10-метокси-1,6-диметил-эрголин 8- альфа-метанол-5-бромо-З-пиридин карбоксилат (сермион) обладает альфа-адреноблокирующей активностью (Heitz Ch. et al., 1986, Huchet A.M. et al., 1981; Caillard C.G. et al., 1981; Huguet F. et al., 1980). Данных об антисеротониновых цереброваскулярных эффектах ницерголина мы не обнаружили. Поэтому было проведено сравнительное изучение влияния ницерголина на констрикторные реакции изолированных сегментов базилярной артерии, вызванные норадреналином и серотонином.

На изолированных сегментах базилярной артерии кролика было показано, что препарат снимает напряжение мозговых сосудов, вызванное норадреналином. Опыты показали, что препарат снижает напряжение сосудов, вызванное предварительным введением серотонина (10-6 М), ЕД50 =2,2±0,5х10-бМ. При предварительном введении ницерголина (10-6M) дозозависимая реакция сегментов базилярной артерии на серотонин уменьшалась по сравнению с контролем: ЕД50 серотонина = 5,5±0,6х10-8М, а

ЕД50 серотонина на фоне ницерголина = 7,5±0,4х10-7М. Следует отметить, что ницерголин в большей степени уменьшает дозозависимые реакции сегментов базилярной артерии, вызванные норадреналином, чем серотонином.

Антисеротониновые свойства ницерголина были подтверждены также на наркотизированных кошках- с регистрацией мозгового кровотока. Было показано, что в условиях предварительного введения ницерголина серотонин уменьшает мозговой кровоток в среднем, на 30,0+5,2%, а в контроле на 47,0±2,9% (р<0,02). Следовательно, ницерголин обладает как антиадренергическими, так и антисеротониновыми свойствами по отношению к сосудам мозга.

Бета-адреноблокатор - пропранолол широко применяется в качестве профилактического средства для лечения больных мигренью. Представляло интерес выяснить, обладает ли он антисеротониновыми - свойствами • по отношению к сосудам мозга.

В опытах на изолированных кольцевых сегментах базилярной артерии кролика было показано, что пропранолол в достаточно высокой концентрации 3х10-5М начинает расслаблять тонус базилярной артерии кролика, предварительно повышенный серотонином. А при концентрации пропранолола 10-4М наблюдается» практически полное расслабление сегментов.

Опыты, проведенные на наркотизированных кошках, показали, что серотонин в дозе 20 мкг/кг при внутривенном введении вызывает уменьшение объемной скорости мозгового кровотока в среднем на 57,0±5,5%. При исследовании эффектов серотонина на- фоне действия пропранолола (1 мг/кг, внутривенно) оказалось, что в 50% экспериментов наблюдается существенное ослабление констрикторного действия серотонина под влиянием пропранолола. Так в контроле серотонин уменьшал мозговой кровоток на 58,0±2,6%, а на фоне действия пропранолола мозговой кровоток уменьшался в среднем на 34,0±7,7% (р<0,05). В других опытах

серотонин уменьшал приток крови в мозг у интактных животных в среднем на 56,0+11,6%, а на фоне пропранолола 61,0+7,6% . Серотонин понижал уровень артериального давления в среднем на 31,0+4,0%, а на фоне действия пропранолола гипотензия под влиянием серотонина составляла 27,0+5,3%.

Следовательно, пропранолол обладает антисеротониновой цереброваскулярной активностью, которая на изолированных сегментах базилярной артерии проявляется в очень высоких концентрациях препарата, а в опытах in vivo проявляется лишь у 50% животных, что свидетельствует об индивидуальной чувствительности животных к пропранололу.

Для купирования приступа мигрени используется толфенамовая кислота, которая обладает противовоспалительным и анальгетическим свойствами, угнетая синтез простагландинов. Изучение антисеротониновых эффектов толфенамовой кислоты показало, что препарат в дозе 5 мг/кг при внутривенном введении в большинстве экспериментов на кошках (5 из 9) значимо ослаблял уменьшения мозгового кровотока, вызванные серотонином. В контроле серотонин вызывал уменьшение кровотока в среднем на 50,0+5,7%, а после введения толфенамовой кислоты уменьшение мозгового кровотока после серотонина составило 25,0+2,9% (р< 0,01). Следует отметить, что в 4-х опытах из 9-ти толфенамовая кислота не оказывала статистически значимого влияния на изменения мозгового кровотока в ответ на введение серотонина.

В 5 опытах из 9-ти в условиях предварительного введения толфенамовой кислоты гипотензивный эффект серотонина был выражен в значительно меньшей степени, чем в контроле. Снижение уровня артериального давления под влиянием серотониа в контроле составляло в среднем 42,0+7,0%, на фоне действия препарата серотонин понижал артериальное давление только на 19,0+6,8% (р < 0,05). В 3 из 5-ти экспериментах этой серии серотонин на фоне действия толфенамовой кислоты вызывал первоначально увеличение уровня артериального давления, которое сменялось его уменьшением.

Таким образом, как и в экспериментах с изучением пропранолола индивидуальная чувствительность животных проявляется и к толфенамовой кислоте. По-видимому, выявленная индивидуальная чувствительность к антисеротониновому цереброваскулярному эффекту пропранолола и толфенамовой кислоты играет определенную роль в противомигреневой активности указанных препаратов.

Таким образом, проведенные опыты позволили установить, что все исследованные противомигреневые препараты в большей или меньшей степени обладают антисеротониновой цереброваскулярной активностью. Полученные данные еще раз подтверждают значение серотонинового и сосудистого факторов в патогенезе мигрени.

Изучение антисеротониновых цереброваскулярных эффектов производных оксима тропинона. Сравнительное изучение тропоксина с противомигреневыми препаратами

Поиск противомигреневых препаратов проводился в ряду производных тропана, которые были синтезированы канд. хим. наук Косточкой Л.М. Вновь синтезированные соединения являются сложными эфирами оксима тропинона и различных ароматических кислот (рис. 6).

Первоначально было проведено изучение способности исследуемых соединений уменьшать напряжение кольцевого сегмента базилярной артерии кролика, вызванное серотонином (10-6М). Все изученные соединения в той или иной степени обладали антисеротониновыми свойствами. Однако наиболее выраженной антисеротониновой активностью обладало соединение ЛК-86, являющееся производным оксима тропинона и 3,4,5-триметоксибензойной кислоты (табл.1).

Эксперименты на наркотизированных кошках показали, что все соединения в разной степени проявляли антисеротониновую активность.

Наиболее активным соединением в этих экспериментах оказалось также соединение ЛК-86, которое обладало и наименьшей токсичностью (табл.2).

Таблица 2. Влияние ароматических и гетероароматических эфиров оксима тропинона на изменения мозгового кровотока (МК), вызванные серотонином (20мкг/кг, в/в) и острую токсичность (ЛД50)

Шифр Изменения МКь ■ Изменения МКг, Индекс ЛД50В

соедине- вызванные вызванные серото- антисеро- мг/кг

ния« серотонином в нином после тониновой

% к исходному Введения активности

уровню соединений« в % к исходному уровню МК2:МК,

ЛКМ-25 -46 -39! 0,84. 500

ЛК-86 - -58 -33 0,57 920

ЛК-97 -47 -31 0,62 100

ЛК-99 -69 -51 0,74 850

лк-юо. -59 -45 0,76 750

ЛК-101 -67 -61 0,91 600

Ж-103 -58 -81 1,31 200

Таким образом, проведенное исследование позволило выявить соединение (ЛК-86) с наибольшей антисеротониновой цереброваскулярной активностью и наименьшей токсичностью, которое в дальнейшем получило название тропоксин.

Детальное изучение антисеротониновой активности тропоксина показало, что серотонин на фоне действия тропоксина не только в меньшей степени вызывал уменьшение мозгового кровотока (27,0±1,9%, в контроле: 40,0+2,0%, р<0,001), но в ряде опытов увеличивал мозговой кровоток в среднем на 21,0±4,8%, которое в трех экспериментах наблюдалось после первоначального уменьшения притока крови в мозг.

Наряду с цереброваскулярной антисеротониновой активностью тропоксин оказывает значительное воздействие на реакции артериального давления, вызванные серотонином. В контрольных опытах серотонин вызывает снижение уровня артериального давления в среднем на 23,0±4,3%,

после введения тропоксина в большинстве опытов (5 из 9) артериальное давление, напротив, повышается на 23,0+4,9%, а в других опытах снижается всего на 16,0+2,5%.

Учитывая необходимость перорального применения

противомигреневого препарата, было исследовано влияние тропоксина при введении внутрь на изменения мозгового кровотока, вызванные серотонином. Опыты показали, что тропоксин в дозе 30 мг/кг после введения per os существенно ослабляет нарушения церебральной гемодинамики, вызванные серотонином. Уменьшения кровотока, вызванные серотонином, на фоне тропоксина начинают ослабляться уже на 20 минуте после введения препарата, на 60 минуте снижение кровотока составляет 34,0+5,76% (контроль 51,0+3,8%, р<0,05), а к 90 минуте это снижение составило 28,0+4,6% (р<0,01) (рис.7). Таким образом, тропоксин при введении внутрь значительно ослабляет констрикторное влияние серотонина на мозговое кровообращение в течение полутора часов.

контроль 20 мяа 60 мин 90 мин

Рис.7. Влияние тропоксина ( 30 мг/кг, per os) на изменения регионарного мозгового кровотока у кошек в % к исходному уровню (*- р< 0,05, * * - р<0,01).

В следующей серии экспериментов было изучено влияние тропоксина на микроциркуляцию у крыс, нарушенную серотонином. Опыты показали, что тропоксин вызывает ослабление констрикторных реакций микрососудов на серотонин. Так, под влиянием серотонина наблюдается снижение локального мозгового кровотока у крыс в среднем на 27,0±3,3%, а на фоне действия тропоксина снижение кровотока после серотонина постепенно уменьшается и к 60 минуте почти полностью устраняется.

Представляло значительный интерес изучить влияние тропоксина на констрикторные реакции мозговых сосудов серотонинергической природы в условиях ишемического поражения мозга, столь характерного для приступа мигрени. Как было показано выше, сосудосуживающий эффект серотонина в условиях перевязки средней мозговой артерии у крыс появляется в большей степени, чем у интактных животных. При введении серотонина через 10 минут после тропоксина оказалось, что в течение двух часов констрикторный цереброваскулярный эффект моноамина в отношении микроциркуляции головного мозга не проявлялся.

н 1- К - -

80 Ь-У1 Ф ' 1 "

—4—

— —1—1

- 13» ~А кД -

,0» г т ** яа ■'!■■ 1

30- А

+ — Л & п г:

№ 60- -1 Ьь _ . ___ "А _

—1р( -I- »ПО! к си 1Н . "Серотонин

- ь Ь—] —_ - *

<0- ^ишсмия^ С«| »отонин - —Н

Рис. 8. Влияние тропоксина на изменения локального мозгового кровотока (ЛМК) в мл/мин/100г и артериального давления (АД) в мм рт.ст., вызванные серотонином, в условиях локальной перманентной ишемии.

Необходимо отметить, что наряду с блокадой реакции микрососудов мозга, тропоксин угнетает также изменения артериального давления, вызванные серотонином. Аналогичным действием обладает и дигидроэрготамин.

Таким образом, тропоксин проявляет антисеротониновую цереброваскулярную активность и в условиях локального ишемического поражения мозга, полностью подавляя сосудосуживающую реакцию микрососудов на серотонин (рис.8).

При сопоставлении данных с изучением антисеротониновой активности тропоксина и известных противомигреневых препаратов было показано, что препарат значительно превосходит по силе своего эффекта такие противомигреневые препараты как метисергид, ницерголин, толфенамовую кислоту, пропранолол. Тропоксин не только уменьшает кровоснабжение мозга, вызванное серотонином, но и извращает эту реакцию, вызывая увеличение мозгового кровотока (рис.9).

Рис. 9. Влияние противомигреневых препаратов и тропоксина на изменения мозгового кровотока, вызванные серотонином в % к исходному уровню (* - р< 0,05; ♦* - р< 0,01).

Изучение сердечно-сосудистых эффектов и нейромедиаторных механизмов действия тропоксина

Исследование цереброваскулярных эффектов тропоксина на кошках показало, что тропоксин в дозе 10 мг/кг при внутривенном введении вызывает неоднородные изменения мозгового кровотока. При введении препарата наблюдается кратковременное (5-7 минут) снижение объемной скорости мозгового кровотока в среднем на 51,0±7,0%, затем в большинстве опытов (8 из 12) после снижения мозгового кровотока следует его восстановление или усиление в среднем на 26,0±6,0%. При изучении влияния тропоксина на уровень артериального давления было показано, что препарат вызывал первоначальное кратковременное (5-7 минут) снижение уровня артериального давления в среднем на 41,0 ± 6,2%. Затем в большинстве опытов отмечалось частичное или полное восстановление уровня артериального давления.

Было также изучено влияние тропоксина на нервную регуляцию кровообращения. Показано, что тропоксин вызывает угнетение прессорного вазомоторного рефлекса в среднем на 28,0±5,7%. Этот эффект был максимальным на 3-10 минутах эксперимента, а затем отмечалось восстановление рефлекса до исходного уровня. Препарат вызывал угнетение биоэлектрической активности в симпатическом нерве почки. Депримирующий эффект тропоксина на нервную регуляцию кровообращения имеет сходство с эффектом серотонина при его введении в боковой желудочек мозга.

Далее- изучалось влияние тропоксина на частоту сердечных сокращений и дыхание. О частоте сердечных сокращений судили по количеству сокращений сердца в минуту на ЭКГ. Опыты показали, что тропоксин вызывает у животных небольшую брадикардию. Частота сердечных сокращений под влиянием тропоксина уменьшалась в среднем на 17,6±4,8% (р<0,02).

Дыхание у наркотизированных кошек оценивали по количеству вдохов в минуту. Оказалось, что тропоксин не оказывает влияния на дыхание животных. Так в контроле у животных наблюдается в среднем 9,5±0,4% вдохов в минуту. После введения тропоксина показатели дыхания не менялись на протяжении 60-90 минут и составили также 9,5±0,4% вдохов в минуту.

В соответствии с полученными данными об антисеротониновой цереброваскулярной активностью- тропоксина представляло интерес выяснить, какой тип серотониновых рецепторов принимает участие в реализации антисеротониновой активности препарата. Было проведено изучение цереброваскулярной антисеротониновой активности антагониста 5НТ2-рецепторов - кетансерина и химического аналога тропоксина и антагониста 5НТз-рецепторов —трописетрона. Эксперименты проводились в условиях разработанной модели и полученные данные сравнивались с эффектами тропоксина. Кроме того, было исследовано влияние тропоксина на другие нейромедиаторные системы.

Кетансерин. является антагонистом 5НТ2-типа серотониновых рецепторов, которые, согласно классификации серотониновых рецепторов, расположены как в сосудах мозга, так и в нервной ткани. Было изучено влияние кетансерина на констрикторные реакции сосудов мозга, вызванные серотонином.

Проведенные опыты показали, что серотонин, введенный на фоне действия кетансерина (1 мг/кг, внутривенно) в меньшей степени вызывал снижение мозгового кровотока, которое составило в среднем 42,0±4,6% (в контроле 63,0±7,3%, р< 0,05). Кетансерин ослаблял также эффект серотонина на артериальное давление. Так, в контроле серотонин вызывал снижение артериального давления в среднем на 33,0±3,8%, а после кетансерина под влиянием серотонина наблюдалось как снижение (19%), так и повышение (12%) уровня артериального давления. Антисеротониновый эффект препарата проявлялся в течение 30 минут. Следует отметить, что

кетансерин оказывает благоприятное влияние на церебральную гемодинамику, вызывая увеличение мозгового кровотока в среднем на 35,0±10,9%, понижая при этом уровень артериального давления в среднем на 33,0±2,2%. В некоторых опытах после усиления кровоснабжения мозга кетансерин вызывал небольшое снижение мозгового кровотока.

% 25155-5-15 -25-35-45-55-■65-75-

Тропоксин Кетансерин Трописетрон 10 мг/кг 1 иг/кг 2мг/кг

Рис.10. Сравнительное изучение цереброваскулярных эффектов антагонистов серотонина.

По оси ординат: изменения мозгового кровотока в % к исходному уровню (* - р<0,05).

Проведенные исследования на наркотизированн^гх кошках позволили установить, что антагонист 5НТз-рецепторов - трописетрон не ослабляет констрикторные реакции сосудов мозга на серотонин. Не было обнаружено статистически значимых различий между изменениями мозгового кровотока, вызванного серотонином на фоне действия трописетрона по сравнению с контролем. Реакция артериального давления на серотонин также не претерпевала существенных изменений под влиянием трописетрона. Таким образом по своим антисеротониновым цереброваскулярным свойствам тропоксин имеет сходство с кетансерином и отличается от трописетрона (рис.10).

Далее совместно с канд. мед. наук Русаковым Д.Ю. был проведен

нейрохимический анализ антисеротонинового действия тропоксина. Анализ проводился с помощью радиолигандного метода с использованием антагониста 5НТ2 - типа рецепторов спиперона. Полученные результаты показали, что концентрация или Втах серотониновых рецепторов, используемых животных, а также константа диссоциации или И соответствуют, как литературным, так и ранее полученным нами данным. Тропоксин обнаруживает выраженную аффинность к 5НТ2 рецепторам (1С5о= 8,986x10"7М и Ю=1,172х10*7М). Об этом свидетельствует способность тропоксина конкурировать с меченым спипероном за места его специфического связывания. Следовательно, 5НТ2 - рецептор является первичной мишенью для тропоксина.

Полученные нами данные о способности тропоксина блокировать серотониновые рецепторы 5НТ2-типа получили подтверждение в исследованиях Амелина А.В. и соавторов (2001), которые установили, что тропоксин уменьшает вызванное стимуляцией тройничного нерва или мета-хлорфенилпиперазином пропотевание альбумина плазмы в твердую мозговую оболочку. Согласно литературным данным «вазогенное» асептическое воспаление в твердой мозговой оболочке, которое вызывает мета-хлорфенилпиперазин, обусловлено активацией 5НТ2в/2с - типов рецепторов ( Fozard J.R., Kalkman H.O., 1994).

Вместе с тем, Амелин А.В. и соавторы (2001) установили, что тропоксин угнетает активность сенсорных нейронов тройничного комплекса, вызванные электрической стимуляцией верхнего сагиттального синуса. Эти данные свидетельствуют о способности тропоксина угнетать асептическое «нейрогенное» воспаление, которое является следствием выделения из пресинаптических окончаний тройничного нерва вазоактивных и алгогенных нейропептидов (пептиды, связанные с геном кальцитонина, субстанции Р) и регулируется тормозными пресинаптическими гетерорецепторами 5НТ 1В/Штипа. Аналогичным эффектом обладают агонисты 5НТ|В|ю

рецепторов суматриптан и

высказать

БИБЛИОТЕКА ГГ СПетер^т {

оэ ко »гг 1 -- ----

предположение о способности тропоксина взаимодействовать с 5НТ1В/Ш-типами рецепторов. Эти данные согласуются с результатами наших исследований, свидетельствующих о некотором сходстве в эффектах тропоксина и серотонина.

Для изучения периферических адреноблокирующих свойств препарата были проведены исследования'на кошках, которым вводили норадреналин в дозе 0,01 мг/кг внутривенно. Под влиянием норадреналина у животных наблюдалось повышение уровня артериального давления в среднем на 44%, а на фоне действия тропоксина это повышение составило 50%.

При изучении влияния тропоксина на изменения уровня артериального давления, вызванные внутривенным введением ацетилхолина в дозе 3 мкг/кг, было показано, что тропоксин не оказывает влияния на эти изменения артериального давления. Так в контроле ацетилхолин понижал уровень артериального давления на 65,0±1,6% (60-5-70), а после введения тропоксина снижение уровня артериального давления составило 61,0±3,2% (51-71).

Об антигистаминных свойствах судили по изменению уровня артериального давления на введение гистамина. Гистамин вводили кошкам в дозе 0,1 мг/кг внутривенно. Опыты показали, что гистамин значительно понижает уровень артериального давления в контроле в среднем на 67,0±6,5%. При введении гистамина на фоне действия тропоксина уровень артериального давления также снижается, но в меньшей степени и составляет 57,0±2,8% (разница статистически не значима).

Таким образом, можно сделать вывод, что тропоксин блокирует 5НТ2-рецепторы и не обладает адреноблокирующими, холиноблокирующими и антигистаминными свойствами.

Изучение нейропсихотропных свойств тропоксина

Исследование психотропных свойств тропоксина показало, что он обладает способностью достоверно уменьшать продолжительность сна, вызванного гексеналом, увеличивать горизонтальную активность в открытом

поле и сокращать (в 1,5 раза) время иммобилизации («поведенческой беспомощности») в условиях плавательного теста Порсолта. Под влиянием препарата отмечается улучшение выработки/сохранности условного рефлекса пассивного избегания у плохообучаемых животных. Тропоксин уменьшает спонтанную двигательную активность, регистрируемую в актометре. Кроме того, препарат ослабляет судорожное действие тиосемикарбазида и 5-окситриптофана, а в высоких дозах усиливает действие коразола. Тропоксин не обладает анксиолитическим эффектом в условиях конфликтной ситуации и не оказывает противогипоксического и антиамнестического действия.

Представлялось важным изучить анальгетическую активность тропоксина, так как известно, что некоторые агонисты серотонина с противомигреневой активностью, в частности, суматриптан, обладают обезболивающим действием. Кроме того, ненаркотические анальгетики используются для купирования приступа мигрени. Ноцицептивные реакции оценивали по стандартным тестам: tail flick- отдергивание хвоста, hot plate -горячая пластинка и электрическая стимуляция хвоста у крыс. Эксперименты показали, что тропоксин не оказывает влияния на болевые пороги у исследуемых животных и, следовательно, не обладает анальгетической активностью.

Таким образом, тропоксин обладает умеренно выраженным психостимулирующим действием. По спектру психостимулирующих эффектов тропоксин отличается от действия типичных психостимуляторов типа амфетамина. Способность тропоксина усиливать действие антагониста ГАМК-бензодиазепинового комплекса коразола и ослаблять судороги, вызываемые 5-окситриптофаном, позволяет предположить вовлечение ГАМК- и серотонинегрической нейромедиаторных систем в реализацию психотропных эффектов препарата.

Результаты нашего исследования получили подтверждение в работе С.Н.Кожечкина и соавт.(2001), которые установили, что тропоксин у

высокоэмоциональных крыс MR, в отличие от крыс с низкой

эмоциональностью MNRA, снижает мощность спектра в дельта-диапазоне и увеличивает в тега-, бета1 и бета^диапазонах ЭЭГ. Это свидетельствует о центральном стимулирующем эффекте тропоксина. Вместе с тем, тропоксин подобно анксиолитикам - диазепаму и афобазолу уменьшает количество измененных под влиянием стрессового воздействия физиологического раствора (0,9% №0, в/б) параметров ЭЭГ.

Изучение фармакокинетики и хронической токсичности тропоксина

Фармакокинетические исследования были выполнены совместно с канд. хим. наук Родионовьш АЛ. Опыты проводились на двух видах животных: на беспородных крысах-самцах массой тела 240-250г и кошках весом 4-4,5 кг в течение 4-х часов после однократного введения препарата животным в дозе 10 мг/кг внутривенно или внутрибрюшинно и при введении внутрь в дозе 20 мг/кг.

После введения препарата кровь отбирали из хвостовой вены крысы или из яремной вены у кошек через дискретные интервалы времени (15 мин; 30 мин; 45мин; 1час; 1,5 часа и 2 часа). Пробы крови центрифугировали в течение Юмин при g = 3500 об/мин и отбирали по 0,5 мл плазмы. До анализа пробы хранили при температуре минус 18°С.

Для изучения процессов распределения препарата по органам и тканям в опытах на мелких животных была разработана методика количественного определения тропоксина с использованием твердофазного иммуноферментного анализа. Специально полученные антитела позволяют с высокой степенью селективности распознавать в биопробах химические соединения, имеющие в своей молекуле а-аминотропановую часть тропоксина.

В таблице 3 представлены данные, свидетельствующие о распределении тропоксина по тканям и органам.

Таблица 3. Значения коэффициентов распределения тропоксина между тканями органов / кровь после внутрибрюшинного введения препарата крысам в дозе 10 мг/кг

Время (мин) 15 30 60 90 120 240 360

Почки 9,9 20,2 10,3 11,6 7,6 8,8 8,6

Селезенка 11,9 11,7 5,3 4,6 6,2 5,88 0,8

Печень 13,3 12,9 13,5 15,8 18,8 29,2 16,3

Легкое 3,6. 6,3 4,4 5,3 6,8 3,3 1,4

Мозг 1,0 1,5 1,3 1,2 0,6 0,3 0

Кровь 1 1 1 1 1 1 1

Рассчитанные коэффициенты распределения для всех органов показывают, что наибольшей абсорбционной способностью обладают ткани, метаболизирующих и выводящих органов - печени и почек, где уровень концентрации тропоксина в 15-25 раз больше, чем в крови. Тропоксин преодолевает гематоэнцефалический барьер и в течение полутора часов уровень концентрации его в мозге выше, чем в крови. Процесс выведения препарата из большинства органов идет со скоростью, равной или близкой скорости выведения его из крови.

Характер распределения тропоксина по органам и тканям, а также полное отсутствие неизмененного препарата в моче, указывают на то, что препарат подвергается интенсивному метаболизму. С помощью тонкослойной хроматографии было показано, что основным путем метаболизма является гидролиз молекулы тропоксина по эфирной связи с образованием оксима тропинона и 3,4,5 - триметоксибензойной кислоты.

При сравнении площадей под концентрационными кривыми у кошек при внутривенном и пероральном путях введения была определена абсолютная биодоступность препарата, которая составляет 36,8 (рис.11).

нг/мл

50 100 150 200 250 300 350 400

Рис.11. Изменение концентрации эквивалента тропоксина в крови кошек после внутривенного и перорального введения препарата. По оси ординат - концентрация в нг/мл. По оси абсцисс - время в минутах.

Таким, образом, тропоксин, попадая в кровеносное русло, быстро абсорбируется практически всеми органами и тканями, преодолевает гемато-энцефалический барьер и в течение полутора часов уровень концентрации его в мозге выше, чем в крови. Установлено, что препарат быстро выводится из организма с мочой (за сутки из организма выводится 34,6% от введенной дозы).

Изучение общетоксического действия тропоксина изучалось на двух видах животных обоего пола: 48 беспородных белых крысах и 14 кроликах породы «шиншилла». Крысам таблетки препарата тропоксин в виде суспензии на дистиллированной воде вводили per os (через зонд в желудок) 1 раз в сутки, на протяжении шести месяцев в следующих дозах (по действующему веществу): 20 мг/кг (терапевтическая доза) и 400 мг/кг - доза, двадцатикратно превышающая терапевтическую. Кроликам препарат тропоксин вводили 1 раз в сутки через зонд внутрижелудочно в течение шести месяцев в фармакологически эффективной дозе - 20 мг/кг. Животным

контрольной группы (крысы, кролики) в аналогичных условиях опыта вводили эквиобъемное количество дистиллированной воды.

В результате экспериментального изучения общетоксического действия таблетированной лекарственной формы препарата тропоксин было установлено, что препарат, не вызывает патологических изменений в жизненно важных органах и системах организма животных, даже при использовании в дозе, в 20 раз превышающей терапевтическую. Тропоксин в изучаемых дозах не влиял на поведенческие реакции и не изменял гематологических и биохимических показателей у всех подопытных животных. Тропоксин не вызывал патологических изменений внутренних органов, а также не обладал местнораздражающим действием.

Тропоксин в дозе 400 мг/кг при введении внутрижелудочно крысам во время беременности не оказывал влияния на динамику массы, состояние и поведение беременных самок, при антенатальном воздействии не повышал показателей спонтанной эмбриональной гибели плода и не влиял на его массу и размер. Тропоксин не оказывал влияние на постнатальное развитие потомства. Отмечена повышенная способность к обучению и памяти у самок потомства, подвергнутого антенатальному воздействию тропоксина. Тропоксин в дозе 400 мг/кг внутрижелудочно не влияет на генеративную функцию самцов и самок крыс.

Таким образом, тропоксин даже в дозе 400 мг/кг при внутрижелудочном введении во время беременности крысам не вызывает эмбриотоксического и тератогенного действия, не оказывает отрицательного влияния на постнатальное развитие потомства и генеративную функцию животных.

При изучении аллергизирующих свойств препарата тропоксин было установлено, что в изученном промежутке доз (20 и 200 мг/кг) препарат не оказывал влияния на активацию факторов высвобождения медиаторов воспаления. Тропоксин не усиливал анафилактических реакций у морских свинок, сенсибилизированных чужеродным белком (белок куриного яйца)

животных. У 20 % иммунизированных препаратом тропоксин животных было обнаружено наличие кожносенсибилизирующих антител, что говорит об индивидуальной чувствительности животных к препарату. Это учитывалось при написании инструкции по применению препарата у больных с тяжелыми аллергическими заболеваниями.

Пероральное применение препарата тропоксин в дозах 20 и 400 мг/кг у мышей линии СВА, отвечающим высокой агрегацией на эритроциты барана, не вызывал подавления гуморального и клеточного иммунного ответа. При введении тропоксина мышам линии С57БЬ/6, отвечающим низкой агрегацией на эритроциты барана, была обнаружена зависимая от дозы препарата стимуляция иммунного ответа. Таким образом, иммунотоксических свойств у препарата тропоксин не выявлено.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методология поиска противомигреневых препаратов, основанная на использовании взаимодействия серотонина и сосудов мозга, играющих существенную роль в патогенезе приступа мигрени. Установлено, что у различных видов животных серотонин повышает тонус мозговых сосудов преимущественно каротидного бассейна, который усиливается в условиях ишемии и сохраняется при его многократном введении.

2. Сравнительное изучение роли серотонинового компонента в механизме действия известных противомигреневых препаратов позволило установить, что антисеротониновой цереброваскулярной активностью, наряду с метисергидом и дигидроэрготамином, обладают ницерголин и в меньшей степени пропранолол и толфенамовая кислота.

3. Среди производных сложных эфиров оксима тропинона выявлено новое соединение-гидрохлорид 3-(3,4,5-триметоксибензоил-оксиимино)-8-метил-8-азабицикло [3,2,1] октана, обладающее наиболее

выраженной антисеротониновой активностью и наименьшей острой токсичностью, которое в дальнейшем получило название тропоксин.

4. Тропоксин блокирует реакции сосудов мозга на серотонин как у интактных животных, так и в условиях локальной перманентной ишемии головного мозга у крыс. По силе антисеротониновой цереброваскулярной активности тропоксин превосходит метисергид, ницерголин, пропранолол, толфенамовую кислоту.

5. Методом радиолигандного связывания установлено, что тропоксин блокирует серотониновые рецепторы 5НТ2-типа. Препарат не обладает адрено-, холиноблокирующей и антигистаминной активностью.

6. Тропоксин обладает умеренно выраженной психостимулирующей активностью и не проявляет анальгетических и противогипоксических эффектов.

7. Тропоксин хорошо всасывается из желудочно-кишечного тракта, быстро распределяется в организме, преодолевает гемато-энцефалический барьер и в течение полутора часов уровень концентрации тропоксина и/или его метаболитов в ткани мозга превышает их содержание в крови.

8. Тропоксин при изучении «хронической токсичности» на двух видах животных не вызывает существенных функциональных и структурных нарушений в органах и системах организма.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Mirzoyan R.S, Ganshina T.S., Parantainen J.// Possible sites of interaction between the noradrenergic systems. GABA and prostaglandins in some cerebrovascular events relevant to migraine. Pharmacology and Toxicology (ХХХШ Nordic Meeting of Pharmacology, (Kuopio,Finland), 1987, v.60, Suppl.lll,p.57.

2. Мирзоян Р.С., Ганыпина Т.С., Волобуева Т.И., Дикова М, Николова М., Николов Р. Предупреждение спазмов церебральных сосудов ницерголином. // Тез.докл. YII-ма национальна конференция по фармакология и клиника на бълкарски лекарства. София, 1988, с.47.

3. Мирзоян Р.С., Ганыпина Т.С., Волобуева Т.И., Пухальская Т.Г. Мигрень и нейромедиаторные механизмы регуляции мозгового кровообращения. // Тез. YI Всесоюзн. Съезда фармакологов «Фармакология и научно-технический прогресс», Ташкент, 1988, c.251-252.

4. Mirzoyan R.S., Ganshina T.S., Puchalskaya T.G., Romanycheva N.A..Parantainen J. Neuromediator mechanisms involved in the cerebrovascular effects of clotam and picamilon.// in Absracts of Finish-Soviet Symposium on Neuropharmacology and biological alcohol research.Kuopio. September 14-16,1989, p.37.

5. Мирзоян P.C., Романычева НА, Волобуева Т.И., Ганыпина. Т.С. Пути поиска противомигреневых средств. // Тез. Докл. Всесоюз. Научн. Конф. «Оценка фармакологической активности химических соединений, принципы и подходы» Москва, 1989, стр.208.

6. Mirzoyan, R.S., Ganshina T.S., Pukhalskaya T.G. Volobueva T.I., Vedernikov J. P., Dicova M., Nicolova M., Nicolov R. Effects of Nicergoline in Experimental Models Related to Pathogenesis of Migraine. // Meth. And Find Exp.Clin.Pharmacol., 1989,11(1 l),p.671-676.

7. Mirzoyan R.S., Ganshina T.S., Pukchalskaya T.G., Romanicheva N.A., Neverovich M.B. Neurotransmitters as modulator of cerebral circulation. // In Absracts of Third congress of the Bulgarian Pharmacological society. Sofia, Bulgaria, 1990, p.175.

8. Мирзоян P.C., Пухальская Т.Г., Ганыпина T.C., Романычева Н.А., Волобуева Т.И. Влияние противомигреневых средств на транспорт серотонина и регуляцию мозгового кровообращения. // Тез. Докл. XY конф. По клин, фармакологии с международ.участием «Актуальные вопросы клинической фармакологии», Волгоград, 1990, с.86-87.

9. Mirzoyan R.S., Ganshina T.S., Pukhalskaya T.G.,m Ronanicheva N.A., Volobuyeva T.I., Neverovich MB. Pharmacological correction of constriction of cerebral vesselsV/ in Abstracts of Constituent Congress International society for pathophisiology, Moscow, 1991, p. 106.

10. Мирзоян Р.С., Ганыпина Т.С., Волобоуева Т.И., Романычева Н.А. Нейромедиаторы в механизме действия цереброваскулярных средств.

В сб.: Итоги науки и техники. Серия Фармакология. Химиотерапевтические средства. Фармакология мозгового кровообращения. 1. Экспериментальные исследования. Москва, ВИНИТИ, 1991, т.26, стр.5-19.

11. Mirzoyan R.S., Ganshina T.S., Romanicheva N.A. Individual differences of antiserotonin cerebrovascular effects of propranolol and toifenamic acid. // In: «Biological Basis of Individual sensitivity to psychotropic drags». Moskow, 1993, p.121.

12. Мирзоян Р.С., Романычева Н.А., Ганьшина T.C., Александрии В.В., Волобуева Т.И., Александров П.Н. Неодинаковая чувствительность сосудов мозга к серотонину .// Экспер. и клин, фармакол., 1993, т.56, №3, с.22-25.

13. Мирзоян Р.С., Косточка Л.М., Ганьшина Т.С. и др. Соли ароматических и гетероароматических эфиров оксима тропинона, обладающие антисеротониновыми свойствами и противомигреневым действием. //

Патент РФ № 1832683 от 24 января 1994 г. Бюлл. «Изобретения» №17, 1996. Приоритет 13 июля 1989.

14. Mirzoyan R.S., Ganshina T.S., Romanicheva N.A. Individual differences of antiserotonin cerebrovascular effects of propranolol and tolfenamic acid. // In: «Biological Basis of Individual sensitivity to psychotropic drugs». Eds.: S.B.Seredenin, VXongo, G.Gavaraghi. 1994, Graffliam Press Ltd. Edinburgh, p. 121-125.

15. Романычева Н.А., Ганьшина T.C., Мирзоян Р.С. Индивидуальная чувствительность к цереброваскулярному антисеротониновому действию пропранолола и толфенамовой кислоты.// Экспер. и клин, фармакол., 1995, т.58, №2, с.25-26.

16. Мирзоян Р.С, Ганьшина Т.С., Семкина Г.А. Мациевский ДД. Анализ цереброваскулярных эффектов нимодипина, нифедипина и тропоксина Мат.раб.совещания по междисциплинарной научной программе «Мозговое кровообращение». Санкт-Петербург, 1995, стр.25-26.

17. Мирзоян Р.С, Ганьшина Т.С., Романычева. Н.А., Семкина Г.А., Мациевский Д. Д., Косточка Л.М. Фармакологическая регуляция серотонинергических нарушений мозгового кровообращения. // Тез.докл. I Съезда Российского научного общества фармакологов «Фундаментальные исследования как основа создания лекарственных средств». Волгоград, Москва, 1995, с.282.

18. Мирзоян Р.С, Ганьшина Т.С., Романычева Н.А., Косточка Л.М., Кожечкин С.Н., Топчян А.В. Новый антагонист серотонина с цереброваскулярной активностью - тропоксин. // Тез. докл. 1У Российского Нац. конгресса «Человек и лекарство», Москва, 1997, с. 275.

19. Мирозян Р.С, Ганьшина Т.С Использование ультразвукового флоуметра в цереброваскулярной фармакологии. // В сб. «Методология Флоуметрии». Москва, 1997, с.125-128.

20. Мирзоян Р.С, Середенин СБ., Ганьшина Т.С, Косточка Л.М., Романычева НА, Русаков Д.Ю. Тропоксин - новый антагонист

серотонина и потенциальное противомигреневое средство. // Экспер. и клин, фармакол., 1998, т.61, №2, стр.28-31.

21. Мирзоян Р.С., Ганышша Т.С., Косточка Л.М., Кожечкин С.Н.,.Топчян А.В., Русаков Д.Ю. Противомигреневые препараты и серотониновые рецепторы. // Тез.докл. У Российского нац. конгресса «Человек и лекарство». Москва, 1998, с.589.

22. Mirzoyan R.S. Topchyan A.V., Ganshina T.S., Kostochka L.M., Balassanyan M.G. Serotonin and tropoxin in local brain ischemia. // In Abstracts ofXlll-th International congress of Pharmacology 26-31 July 1998. Munchen, Germany. Arch.of Pharmacol.Suppl. 1, v.358, N1, p. R106.

23. Мирзоян Р.С., Топчян А.В., Тимкина М.И., Ганьшина Т.С. Особенности регуляции мозгового кровообращения при локальной ишемии мозга. // Тез. Докладов YI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва,, 1999, с.51.

24. Мирзоян-Р.С., Топчян А.В., Ганьшина Т.С, Баласанян М.Г. Блокада тропоксином усиленных локальной ишемией мозга цереброваскулярных эффектов серотонина. Мат. Конф. «Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов», посвященной 15-летию НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, 1999,т.10,с.58-62.

25. Мирзоян Р.С., Топчян А.В., Ганьшина Т.С, Баласанян MX., Косточка Л.М. Моноаминергическая регуляция мозгового кровообращения и локальная ишемия мозга. // Мат. Всероссийской конф. «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» под ред. чл.-корр. РАМН НС.Сапронова, 1999, с. 139.

26.Mirzoyan . R.S., Ganshina T.S., Kostochka L.M., Kozhechkin S.N., Topchyan A.V. Tropoxin- novel 5НТ2 receptor antagonist as a promising drug for migraine treatment. Abstracts 2nd European congress of Pharmacology, Budapest, Hungary, 1999, v.13, Suppl.l, p.279s, Elsevier.

27. Мирзоян P.C., Аджиенко Л.М., Ганьшина Т.С, Топчян А.В.

- Фармакологическая регуляция ишемических расстройств мозгового

кровообращения. // Тез. докл. «Фармакология и современная медицина». Пленум правления российского научного общества фармакологов. Санкт-Петербург, 1999, с. 80-81.

28. Мирзоян Р.С., Топчян А.В., Ганыпина Т.С., Косточка Л.М. Цереброваскулярные эффекты серотонина и тропоксина. // В сб. «Методология флоуметрии»; выпуск 3,1999 с. 153-160/

29. Мирзоян Р.С., Топчян А.В., Тимкина М.И., Ганыпина Т.С. Различие в моноаминергической регуляции кровоснабжения интактного и ишемизированного мозга. Мат. симпозиума "Регуляция мозгового кровообращения в норме и патологии. Ростов-на-Дону, 1999, с.55-57.

30. Мирзоян Р.С., Саратиков А.С., Плотников М.Б., Топчян А.В., Ганьшина Т.С. Методические указания по экспериментальному изучению препаратов для лечения нарушений мозгового кровообращения и мигрени. // В кн.: «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» под ред. В.П.Фисенко и др. Москва, 2000, с. 159-161.

31. Мирзоян Р.С., Топчян А.В., Ганьшина Т.С, Косточка Л.М. Тропоксин и цереброваскулярные эффекты серотонина. // Экспер. и клин, фармакол., 2000,т.63,№3,с.21-23.

32. Косточка Л.М., Романычева НА, Мирзоян Р.С., Ганьшина Т.С. Синтез и цереброваскулярная активность сложных эфиров N-циннамилтропинона. // Хим.-фарм.журнал, 2000, т.34, №8, с.18-19.

33. Ганьшина Т.С. Нейромедиаторные механизмы противомигреневого действия тропоксина. // Психофармакология и биологическая наркология, 2002, т.2, №3-4, с.378.

34.Kostochka M.L., Kostochka L.M., Ganshina T.S., Mirzoyan R.S. Design and synthesis new antimigraine drug, Tropoxin. // The Pharmacologist, 2002,v.44, N 2 (Suppl. l),p.A45.

35. Ганьшина Т.С, Бежанян С.Г., Александрии В.В. Изменения регионарного и локального мозгового кровотока у крыс под влиянием серотонина и

тропоксина «Фундаментальные проблемы фармакологии». Сб. тезисов 2-го Съезда Росс. Научного Общества фармакологов. Москва, 2003, часть 1, с.118.

36. Косточка Л.М., Ганьшина Т.С., Волобуева Т.И., Мирзоян Р.С. и соавт. Соли 3-ацилоксиимино-8-метил-8-азабицикло 3,2,1 октана, обладающие антисеротониновой и противомигреневой активностью. // Патент РФ №1832683 - 1994. Приоритет от 13 июля 1989 года.

37. Косточка Л.М., Мирзоян Р.С., Ганьшина Т.С. Дизайн и синтез нового противомигреневого средства тропоксин. «Фундаментальные проблемы фариакологии». Сб.тезисов 2-го Съезда Росс. Научного Общества фармакологов. Москва, 2003, часть 1, с.266.

38. Ганьшина Т.С, Бежанян С.Г., Александрии В.В., Косточка Л.М. Изменения регионарного и локального мозгового кровотока у крыс под влиянием серотонина и тропоксина. // Тез. 2-го съезда РНОФ «Фундаментальные проблемы фармакологии», 2003, ч. I, с.118.

39. Ганьшина Т.С. Нейромедиаторный механизм действия тропоксина в сравнении с противомигреневыми препаратами. // Экспер. и клин, фармакол., 2003, т.66, № 3, с. 17-20.

40. Ганьшина Т.С. Тропоксин - новое средство для лечения мигрени. // Тез. Межд.конферениции "Роль биологически активных веществ в интегративной деятельности организма в норме и в процессе формирования общеадаптационного синдрома". Ереван, 2003, с. 65-66.

к--.3949

Отпечатано с оригинала заказчика в ЗАО «ОПЕРАТИВНОЕ ТИРАЖИРОВАНИЕ»

ИНН-7710243829

г. Москва, ул. Большая Новодмитровская, д 23 тел.: 257-89-04

т. 100 экз., заказ № 102/16-1, от 16.02.2004

Актуальность темы. Мигрень является одним из наиболее распространенных и социально значимых заболеваний среди населения. Согласно данным, представленным на 7-м Международном конгрессе по головным болям, в развитых странах Европы и Америки мигренью страдает от 3 до 16% населения, а по некоторым данным и до 30%. Среди женщин мигренью болеют 18% , среди мужчин - 6% и среди детей - 4 % (Silberstein S.D. et al., 1998; Яхно Н.Н. и соавт., 2001; Черняк З.В. и соавт, 2003). У женщин приступы мигренью возникают в 2 -3 раза чаще, чем у мужчин (Вейн А.М.и соавт., 1995; Rasmussen В.К., 1994; Stewart W.F. et al., 1994; Амелин А.В. и соавт., 2001). Наиболее часто мигренью болеют лица трудоспособного возраста - 35-40 лет. Эпидемиологические исследования последних лет выявили тенденцию д к увеличению числа больных мигренью (Stewart W.F. et al., 1994;

Амелин А.В. и соавт., 2001 Яхно Н.Н. и соавт., 2001; Яхно Н.Н., Штульман Д.Р., 2003).

Многочисленные клинические и молекулярно-биологические исследования свидетельствуют о важной роли генетического фактора в возникновении мигрени (Вейн A.M. и соавт., 1995; Амелин А.В. и соавт., 2001). Мигрень считают заболеванием, обусловленным наследственно детерминированной дисфункцией вазомоторной регуляции, проявляющейся пароксизмальными приступами головной боли пульсирующего характера чаще в одной половине головы (Алексеев В.В., Яхно Н.Н., 1997). Несмотря на значительный прогресс в изучении патогенеза приступа мигрени, многие аспекты этой проблемы остаются невыясненными (Pietrobon D., Stressing J. 2003). В настоящее ^ время очевидно, что одну из существенных ролей в генезе этого заболевания играет нейромедиатор - серотонин. Важно отметить, что серотонин, с одной стороны, оказывает выраженное влияние на мозговые сосуды, с другой - участвует в проведении болевых импульсов (Прусинский А., 1979). В литературе широко обсуждаются гипотезы формирования приступа мигрени. Так, в середине прошлого столетия Wolff H.G. и сотрудники (1963) предложили сосудистую гипотезу развития приступа мигрени, которая не потеряла актуальность и в настоящее время. Согласно этой гипотезе приступ мигрени сопровождается повышением тонуса мозговых сосудов с последующим их расслаблением. Далее Olesen J. В. и соавторы (1981) предложили нейрогенную гипотезу, основанную на обнаруженной ими корреляции изменений мозгового кровообращения с распространяющейся кортикальной депрессией Leao. В последние годы широко обсуждается значение тройничного нерва в механизмах формирования головной боли при мигрени. Эта гипотеза, получившая название тригеминоваскулярной, предложена Moskowitz М.А. (1984), согласно которой система тройничного нерва является ответственной за взаимодействие между центральной нервной системой и сосудами головного мозга во время приступа мигрени. Следует подчеркнуть, что, несмотря на различия в представлениях формирования приступа мигрени, представители всех гипотез признают, что серотонин и цереброваскулярный компонент являются существенными факторами в этом процессе. Открытым остается вопрос о первичности или вторичности реакции сосудов мозга, наблюдаемой во время приступа мигрени.

Для лечения больных мигренью используются лекарственные препараты, относящиеся к различным группам фармакологических веществ: адреноблокаторы, антидепрессанты, блокаторы кальциевых каналов, противосудорожные, ненаркотические анальгетики и другие. Среди них особое место занимают препараты, воздействующие на серотониновые рецепторы - агонисты 5HTib/id~ и антагонисты 5НТ2-рецепторов. Имеющиеся в наличии у клиницистов лекарственные средства для лечения мигрени не всегда отличаются достаточной эффективностью и обладают выраженными нежелательными побочными свойствами. Поэтому поиск новых препаратов для профилактики и лечения приступа мигрени является одной из наиболее актуальных задач современной фармакологии и медицины.

В соответствии с современными представлениями о патогенезе приступа мигрени необходимо совершенствовать методологию поиска новых средств для лечения этого заболевания. При этом следует учитывать как факторы, определяющие генез приступа мигрени, так и располагать сведениями о механизме действия известных препаратов, применяемых для лечения этого заболевания.

В соответствии с важной ролью цереброваскулярного компонента и серотонина в генезе приступа мигрени при поиске новых противомигреневых препаратов необходимо, чтобы вещество проявляло антисеротониновую активность по отношению к церебральным сосудам.

При выборе химического ряда наше внимание привлекли производные тропана, к которым относятся обладающий антисеротониновой активностью а - адреноблокатор - тропафен (Машковский М.Д., Шварц Г.Я., 1979) и антагонист 5НТ3 типа рецепторов - трописетрон (Richardson В.Р. et al., 1985).

Цель исследования: разработка методологии поиска противомигреневых препаратов с учетом основных патогенетических факторов развития приступа мигрени, изыскание нового препарата с антисеротониновой цереброваскулярной активностью среди производных тропана, изучение механизма его действия и проведение расширенных доклинических испытаний.

Задачи исследования:

1. провести систематическое изучение влияния серотонина на тонус сосудов различных артериальных систем мозга, состояние микроциркуляции в коре головного мозга и разработать модель серотонинового спазма церебральных сосудов;

2. изучить роль серотонина в реализации цереброваскулярных эффектов известных противомигреневых препаратов: метисергида, дигидроэрготамина, ницерголина, пропранолола, толфенамовой кислоты;

3. провести скрининг среди производных тропана (в опытах in vitro, in vivo) с целью выявления соединения с наиболее выраженной антисеротониновой цереброваскулярной активностью и наименьшей токсичностью и сопоставить его эффекты с эталонными препаратами;

4. провести анализ антисеротонинового эффекта нового соединения для определения типа серотониновых рецепторов-мишеней с использованием метода радиолигандного связывания;

5. провести нейромедиаторный анализ механизма действия наиболее активного соединения;

6. изучить влияние наиболее активного соединения на центральные и периферические механизмы регуляции сосудистого тонуса;

7. изучить нейротропные свойства наиболее активного соединения с использованием комплекса общепризнанных методик;

8. определить анальгетическую активность нового соединения;

9. изучить фармакокинетику и хроническую токсичность нового противомигреневого препарата.

Научная новизна работы. Разработана методология поиска новых противомигреневых препаратов на основе современных представлений о существенной роли серотонина и цереброваскулярного компонента в патогенезе приступа мигрени.

Установлена существенная роль серотонина в реализации констрикторных реакций сосудов каротидной артериальной системы мозга по сравнению с вертебробазилярной системой. Показано, что в условиях ишемического поражения мозга реакция микрососудов мозга на серотонин возрастает.

Систематическое изучение механизма действия противомигреневых препаратов позволило установить антисеротониновую цереброваскулярную активность у ницерголина, пропранолола и толфенамовой кислоты.

Скрининг среди производных оксима тропинона выявил новое оригинальное соединение, получившее название тропоксин, обладающее выраженной антисеротониновой цереброваскулярной активностью и низкой токсичностью.

Тропоксин блокирует реакции сосудов мозга на серотонин как у интактных животных, так и в условиях локальной перманентной ишемии мозга. По силе антисеротониновой активности тропоксин превосходит метисергид, ницерголин, пропранолол, толфенамовую кислоту и не уступает дигидроэрготамину.

С использованием методики радиолигандного связывания выявлена способность тропоксина блокировать 5НТ2 - рецепторы коры головного мозга. Тропоксин не влияет на адрено- холино- и гистаминергические рецепторы.

Тропоксин обладает умеренно выраженным стимулирующим действием и не проявляет анальгетическую активность.

Установлено, что тропоксин преодолевает гемато-энцефалический барьер и в течение полутора часов уровень концентрации препарата в ткани мозга выше, чем в крови.

Тропоксин по данным изучения шестимесячной «хронической» токсичности не оказывает отрицательного влияния на строение внутренних органов, не вызывает изменений электрокардиограммы, поведенческих реакций, гематологических и клинико-биохимических параметров крови и мочи. Он не обладает местноанестезирующим, иммунотоксическим, тератогенным, мутагенным действием.

Научно-практическое значение работы. Предложенная методология скрининга противомигреневых препаратов, проведенный анализ роли серотонина в регуляции тонуса мозговых сосудов и в механизме действия известных средств для лечения мигрени, создают 4 основу для направленного поиска потенциальных препаратов для лечения больных мигренью.

Научные положения, разработанные в настоящем исследовании, явились основой для составления изданных Фармакологическим государственным комитетом РФ «Методических указаний по экспериментальному изучению препаратов для лечения нарушений мозгового кровообращения и мигрени», которые вошли в «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» 2000 года.

Выявленное впервые среди производных тропана новое соединение с выраженной цереброваскулярной антсеротониновой активностью (патент РФ №1832683, 1994) позволяет считать целесообразным поиск потенциальных противомигреневых препаратов в i* указанном ряду химических соединений.

Полученные в результате настоящего исследования данные составили основу представленных в Фармакологический государственный комитет МЗ РФ материалов доклинического изучения препарата тропоксин, на который получено разрешение на проведение клинических испытаний препарата в качестве средства для лечения мигрени.

Результаты проведенного экспериментального изучения препарата тропоксин получили клиническое подтверждение на кафедре неврологии и нейрохирургии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. И.П.Павлова, где выявлена высокая эффективность тропоксина при межприступном лечении частых тяжелых приступов мигрени.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методология поиска противомигреневых препаратов, основанная на использовании взаимодействия серотонина и сосудов мозга, играющих существенную роль в патогенезе приступа мигрени. Установлено, что у различных видов животных серотонин повышает тонус мозговых сосудов преимущественно каротидного бассейна, который усиливается в условиях ишемии и сохраняется при его многократном введении.

2. Сравнительное изучение роли серотонинового компонента в механизме действия известных противомигреневых препаратов позволило установить, что антисеротониновой цереброваскулярной активностью, наряду с метисергидом и дигидроэрготамином, обладают ницерголин и в меньшей степени пропранолол и толфенамовая кислота.

3. Среди производных сложных эфиров оксима тропинона выявлено новое соединение-гидрохлорид 3-(3,4,5-триметоксибензоил-оксиимино)-8-метил-8-азабицикло [3,2,1] октана, обладающее наиболее выраженной антисеротониновой активностью и наименьшей острой токсичностью, которое в дальнейшем получило название тропоксин.

4. Тропоксин блокирует реакции сосудов мозга на серотонин как у интактных животных, так и в условиях локальной перманентной ишемии головного мозга у крыс. По силе антисеротониновой цереброваскулярной активности тропоксин превосходит метисергид, ницерголин, пропранолол, толфенамовую кислоту.

5. Методом радиолигандного связывания установлено, что тропоксин блокирует серотониновые рецепторы 5НТ2-типа. Препарат не обладает адрено-, холиноблокирующей и антигистаминной активностью.

6. Тропоксин обладает умеренно выраженной психостимулирующей активностью и не проявляет анальгетических и противогипоксических эффектов.

7. Тропоксин хорошо всасывается из желудочно-кишечного тракта, быстро распределяется в организме, преодолевает гемато-энцефалический барьер и в течение полутора часов уровень концентрации тропоксина и/или его метаболитов в ткани мозга превышает их содержание в крови.

8. Тропоксин при изучении «хронической токсичности» на двух видах животных не вызывает существенных функциональных и структурных нарушений в органах и системах организма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Фармакотерапия мигрени относится к числу важнейших проблем фармакологии и неврологии. Это определяется, с одной стороны, высоким процентом заболеваемости мигренью и, с другой, тем, что мигренью страдают лица трудоспособного возраста, что свидетельствует и о социальной значимости этой проблемы.

Несмотря на существенный прогресс в понимании патогенеза приступа мигрени, многие стороны этой проблемы продолжают оставаться невыясненными. В настоящее время предлагаются три гипотезы, объясняющие генез приступа мигрени. Это - сосудистая гипотеза, которая рассматривает цереброваскулярный компонент основным в формировании приступа мигрени. Нейрогенная гипотеза, согласно которой сосудистая реакция является вторичной, а приступ » мигрени обусловлен распространяющейся кортикальной депрессией

Leao. И последняя гипотеза получила название тригеминоваскулярной, где ведущая роль отводится системе тройничного нерва, которая ответственна и за проведение болевых импульсов, и за реакции сосудов мозга.

Вместе с тем, существует многочисленное количество данных, свидетельствующих о том, что в период приступа мигрени наблюдаются нарушения обмена эндогенного серотонина, которые коррелируют с динамикой приступа мигрени. Поэтому исследователи - сторонники различных гипотез о патогенезе мигрени, признают, что в реализации приступа мигрени принимает участие серотонин. Следует отметить, что препараты, используемые для профилактики и купирования приступа мигрени являются как антагонистами, так и агонистами серотониновых * рецепторов. Необходимо подчеркнуть, что многие препараты, используемые для лечения приступа мигрени не лишены существенных нежелательных побочных эффектов.

Вышеизложенное свидетельствует о необходимости изыскания новых противомигреневых лекарственных средств. Для этой цели прежде всего следовало разработать методологию поиска препаратов для лечения больных мигренью. При этом мы исходили из двух общепризнанных факторов патогенеза мигрени. Это — серотонин и цереброваскулярный компонент. Действительно, согласно трем гипотезам в реализации приступа мигрени неизменно участвуют серотонин и сосуды мозга. Поэтому при моделировании приступа мигрени нами была разработана модель, которая включает в себя реакции сосудов мозга на серотонин .

На первом этапе работы было проведено систематическое изучение влияния серотонина на мозговое кровообращение, а также на центральные и периферические механизмы регуляции кровообращения.

Было изучено влияние серотонина на изолированные сегменты базилярной артерии кроликов, а также на мозговое кровообращение у кошек и у крыс при различных условиях эксперимента. Проведенные опыты показали, что серотонин вызывает дозозависимое от концентрации (10'9 М до 10"4 М) сокращение сегментов базилярной артерии. Проведенные опыты на наркотизированных кошках показали, что серотонин в дозе 20 мкг/кг внутривенно вызывает снижение мозгового кровотока в системе сонных артерий в среднем на 44,0±1,5% в течение 7-10 минут. Уровень артериального давления в большинстве экспериментов в основном понижается и через 10 минут возвращается к исходному уровню. При многократном введении серотонина через 30 минут после каждого введения реакция сосудов мозга и артериального давления не изменялась. Поэтому эту реакцию можно использовать для изучения противомигреневых препаратов с антисеротониновой активностью. Серотонин вызывал аналогичные реакции сосудов мозга как у наркотизированных, так и у бодрствующих крыс.

Учитывая существенную роль ишемического компонента в формировании приступа мигрени, представляло интерес изучить влияние серотонина на мозговое кровообращение в условиях ишемического поражения мозга. Оказалось, что в условиях локальной перманентной ишемии мозга сосудосуживающий эффект серотонина возрастает. Полученные данные являются еще одним доказательством участия серотонина в патогенезе мигрени.

Далее исследовалось влияние серотонина на сосуды каротидной и вертебробазилярной артериальных систем мозга и на диаметр пиальных артериол. Опыты с использованием методики раздельной двухсторонней перфузии каротидных и вертебробазилярных артерий позволили выявить неодинаковую чувствительность различных сосудистых систем мозга к серотонину. Каротидная система оказалась более чувствительной, чем вертебробазилярная. Вазоконстрикторная реакция каротидных артерий на серотонин составила 37,0±10,0%, а реакция позвоночных артерий — 10,0±3,1% (р<0,05). Влияние серотонина на тонус мозговых сосудов наблюдается в течение 5-7 минут, а в дальнейшем происходит восстановление исходного уровня сосудов.

При изучении влияния серотонина на пиальные артериолы моноамин вводили в дозах 60 и 120 мкг/кг внутривенно или апплицировали на поверхность мозга в дозе 0,5 мл 0,012% раствора. Проведенные опыты показали, что серотонин, в основном, вызывает дозозависимый сосудосуживающий эффект. Однако, в опытах с аппликацией серотонина на поверхность мозга моноамин вызывает разнонаправленные изменения диаметра микрососудов мозга. Если артериолы диаметром более 40 мкм отвечали на аппликацию серотонина констрикторной реакцией, то пиальные артериолы меньшего калибра увеличивали свой просвет. Выявленные нами различия в эффектах серотонина можно объяснить наличием разных типов серотониновых рецепторов в микрососудах мозга. Известно, что сосудосуживающий эффект серотонина обусловлен стимуляцией 5HTi и 5НТ2 -рецепторов, тогда как расширение мозговых сосудов может реализовываться взаимодействием с 5НТ7-типом рецепторов (Martin G.R. et al., 1994; Watts S.W. and Cohen M.L., 1999).

С целью изучения влияния серотонина на центральные процессы регуляции кровообращения и артериального давления было изучено его влияние на сердечно-сосудистую систему при введении в боковой желудочек мозга. Такой способ введения серотонина был обусловлен его особенностью плохо проникать гемато-энцефалический барьер.

Опыты показали, что серотонин при таком способе введения оказывал депримирующее влияние на биоэлектрическую активность и рефлекторные ответы в симпатическом нерве почки, которое возрастало с увеличением дозы моноамина от 20 мкг/кг до 0,5-1,0 мг/кг. При этом наблюдалось угнетение и прессорного вазомоторного рефлекса, вызываемого электрической стимуляцией соматических нервов параметрами болевой модальности. Эти данные указывают на способность серотонина взаимодействовать с центральными норадренергическими структурами, принимающими участие в регуляции кровообращения.

Таким образом, разностороннее изучение сосудистых эффектов серотонина свидетельствует о его существенном влиянии на церебральную гемодинамику. Полученные результаты подтвердили правильность выбора серотонина для моделирования церебральных реакций, сходных с таковыми у больных мигренью.

Дальнейшее исследование было посвящено изучению серотонинового компонента в механизме действия применяемых для лечения мигрени лекарственных препаратов. Были подтверждены, полученные рядом исследователей данные, о способности метисергида и дигидроэрготамина устранять или ослаблять реакции сосудов мозга на серотонин. Вместе с тем, в литературе отстутсвуют сведения об участии серотонинового компонента в механизме действия других лекарственных средств, которые используются для лечения больных мигренью. К таким препаратам относятся ницерголин, пропранолол, толфенамовая кислота.

Проведенные опыты по изучению механизма действия ницерголина, позоволили установить, что препарат наряду с антиадренергической активностью обладает и антисеротониновыми цереброваскулярными свойствами, вызывая ослабление реакции мозговых сосудов на серотонин. Известно, что Р-адреноблокатор -пропранолол успешно применяется для межприступного лечения больных мигренью. При анализе полученных данных по изучению антисеротониновых свойств пропранолола было выявлено, что они не отличаются однородностью. Оказалось, что в половине опытов пропранолол достоверно угнетал реакции сосудов мозга на серотонин, тогда как в другой половине эффект отсутствовал. Выраженная способность ослаблять изменения мозгового кровотока, вызванная серотонином, была обнаружена и у толфенамовой кислоты, которая применяется для купирования приступа мигрени. Толфенамовая кислота также не во всех опытах (5 из 9) ослабляла констрикторные цереброваскулярные эффекты серотонина. Следовательно, выявлена неодинаковая чувствительность животных к антисеротониновой цереброваскулярной активности как пропранолола, так и толфенамовой кислоты.

Полученные нами данные о наличии антисеротонинового цереброваскулярного компонента в механизме противомигреневого эффекта исследованных препаратов также подтверждают адекватность нашего подхода в поиске новых препаратов для лечения приступа мигрени. Поэтому поиск новых противомигреневых препаратов мы проводили среди соединений, обладающих способностью ослаблять или устранять цереброваскулярные реакции на серотонин.

Изыскание нового противомигреневого препарата проводилось среди ароматических и гетероароматических эфиров оксима тропинона, так как к производным тропана относятся препараты тропафен и трописетрон, которые согласно литературным данным обладают антисеротониновой активностью (Машковский М.Д., Шварц Г.Я., 1979; Richardson В.Р. et al., 1985).

Первоначальный скрининг проводился на изолированных сегментах базилярной артерии кролика. Проведенные опыты позволили выявить антисеротониновую активность у большинства соединений. Полученные данные были подтверждены в опытах in vivo. Наибольшую антисеротониновую активность проявляло соединение ЛК-86, которое по сравнению с изученными соединениями обладало и наименьшей токсичностью. Таким образом, для дальнейшего подробного изучения было выбрано соединение под шифром ЛК-86, являющееся производным оксима тропинона и 3,4,5-триметоксибензойной кислоты, которое в дальнейшем было названо тропоксином.

При изучении антисеротониновой активности тропоксина у интактных животных оказалось, что серотонин на фоне действия препарата в меньшей степени снижает мозговой кровоток, чем в контроле: 27,0 ± 1,9% (опыт) и 40,0 ± 2,0% (контроль), р<0,001. Следует отметить, что на фоне действия тропоксина серотонин не только уменьшал мозговой кровоток, но и вызывал его увеличение, которое составило 21,0 ±4,8%. Тропоксин ослаблял также и реакции артериального давления на серотонин. В контроле уровень артериального давления под влиянием серотонина снижался на 23,0±4,3%. На фоне действия тропоксина давление снижалось в меньшей степени, чем в контроле и составило лишь а 16,0±2,5%, а в некоторых опытах имело место даже повышение артериального давления на 23,0±4,9%.

Следует отметить, что тропоксин проявлял свою антисеротониновую активность и при введении внутрь. Препарат при введении per os в дозе 30 мг/кг через 60 минут после введения существенно ослаблял уменьшение церебрального кровотока, вызванное серотонином, которое составило после препарата 28,0 ± 4,6% (контроль в данной серии 51,0 ± 3,8%, р <0,01).

При изучении тропоксина в опытах на крысах в условиях ишемии, вызванной перевязкой средней мозговой артерии, было показано, что препарат полностью устранял или значительно ослаблял вазокострикторное влияние серотонина на микрососуды мозга.

При изучении цереброваскулярной активности тропоксина оказалось, что в большинстве экспериментов препарат вызывал уменьшение мозгового кровотока в среднем на 51,0 ± 7,0%. Но в некоторых опытах наблюдалось усиление мозгового кровотока в среднем на 26,0 ± 6,0% , а в ряде опытов отмечалось как уменьшение, так и увеличение притока крови в мозг. Изменение мозгового кровотока продолжалось 1-7 минут, а затем кровоснабжение восстанавливалось до исходного уровня. Уровень артериального давления под влиянием тропоксина также снижался в среднем на 41,0 ± 6,2% в течение 7-13 минут с дальнейшим его восстановлением. При изучении тропоксина на нервную регуляцию мозгового кровообращения и артериального давления было показано, что препарат вызывает угнетение прессорного вазомоторного рефлекса, а также тонической и рефлекторной активности в симпатическом нерве почки. Вместе с тем, было показано, что тропоксин угнетает вагусный рефлекс, что, по-видимому, также обусловлено центральным депримирующим влиянием тропоксина на нервную регуляцию кровообращения.

Таким образом, по влиянию на кровоснабжение мозга и артериальное давление тропоксин имеет некоторое сходство с серотонином, а по депримирующему влиянию на нервную регуляцию кровообращения препарат похож на эффекты серотонина при его введении в боковой желудочек мозга.

Анализируя антисеротониновые свойства тропоксина в сравнении с изученными на нашей модели противомигреневыми препаратами, оказалось, что тропоксин превосходит по этим свойствам метисергид, ницерголин, пропранолол, толфенамовую кислоту и не уступает дигидроэрготамину.

Далее представляло интерес выяснить механизм антисеротониновой активности тропоксина, в частности, определить какие типы серотониновых рецепторов участвуют в реализации этой активности. Для этой цели мы решили сопоставить антисеротониновые свойства тропоксина с его химическим аналогом трописетроном, который является блокатором 5НТз —типа рецепторов. Оказалось, что трописетрон не оказывает существенного влияния на констрикторные реакции сосудов мозга, вызванные серотонином. Следовательно, 5НТ3-тип рецепторов не принимает участие в констрикторной реакции сосудов мозга, вызванной серотонином. В аналогичных условиях мы изучили антисеротониновую активность блокатора 5НТ2-типа рецепторов - кетансерина и сопоставили полученные данные с эффектами тропоксина. Эксперименты показали, что кетансерин также как и тропоксин устраняет или ослабляет цереброваскулярные реакции, вызванные серотонином. Эти данные позволили предположить участие 5НТ2-тип рецепторов в реализации цереброваскулярного антисеротонинового эффекта тропоксина.

С целью подтверждения этого предположения были проведены опыты с использованием метода радиолигандного связывания, которые позволили установить, что тропоксин конкурирурет с меченым спипероном, известным антагонистом 5НТ2-типа, за места его специфического связывания и тем самым подтвердили высказанное ранее нами предположение о механизме антисеротонинового действия тропоксина. Следовательно 5НТ2 -рецепторы являются первичной мишенью антисеротониновой активности тропоксина.

Полученные нами данные о способности тропоксина блокировать серотониновые рецепторы 5НТ2-типа получили подтверждение в исследованиях Амелина А.В. и соавторов (2001), которые установили, что тропоксин уменьшает вызванные стимуляцией тройничного нерва или мета-хлорфенилпиперазином пропотевание альбумина плазмы в твердую мозговую оболочку. Согласно литературным данным «вазогенное» асептическое воспаление в твердой мозговой оболочке, которое вызывает мета-хлорфенилпиперазин, обусловлено активацией 5НТ2В/2с-типов рецепторов (Fozard J.R., Kalkman Н.О., 1994).

Вместе с тем Амелин А.В. и соавторы (2001) установили, что тропоксин угнетает активность сенсорных нейронов тройничного комплекса, вызванные электрической стимуляцией верхнего сагиттального синуса. Эти данные свидетельствуют о способности тропоксина угнетать асептическое «нейрогенное» воспаление, которое является следствием выделения из пресинаптических окончаний тройничного нерва вазоактивных и алгогенных нейропептидов (пептиды, связанные с геном кальцитонина, субстанции Р) и регулируется тормозными пресинаптическими гетерорецепторами

5НТш/юТипа. Аналогичным эффектом обладают агонисты 5HTjb/id рецепторов суматриптан и золмитриптан, что позволяет авторам высказать предположение о способности тропоксина взаимодействовать с 5HTib/id- типами рецепторов. Эти данные согласуются с результатами наших исследований, свидетельствующих о некотором сходстве в эффектах тропоксина и серотонина, что позволяет предположить наличие у тропоксина свойств агониста серотониновых рецепторов.

Дальнейшее исследование было посвящено изучению роли других нейромедиаторов в механизме действия тропоксина. Проведенные опыты показали, что тропоксин не обладает адрено-, холиноблокирующей и антигистаминной активностью.

В соответствии с требованиями к новым лекарственным препаратам необходимо было провести расширенное доклиническое изучение тропоксина.

С этой целью были изучены нейропсихотропные свойства препарата. Исследование тропоксина показало, что он обладает способностью достоверно уменьшать продолжительность сна, вызванного гексеналом, увеличивать горизонтальную активность в открытом поле и сокращать (в 1,5 раза) время иммобилизации («поведенческой беспомощности») в условиях плавательного теста Порсолта. Под влиянием препарата отмечается улучшение выработки/сохранности условного рефлекса пассивного избегания у плохообучаемых животных. Тропоксин уменьшает спонтанную двигательную активность, регистрируемую в актометре. Кроме того, препарат ослабляет судорожное действие тиосемикарбазида и 5-окситриптофана, а в высоких дозах усиливает действие коразола. Тропоксин не обладает анксиолитическим эффектом в условиях конфликтной ситуации и не оказывает противогипоксического, антиамнестического и анальгетического действия.

Таким образом, тропоксин обладает умеренно выраженным психостимулирующим действием. По спектру психостимулирующих эффектов тропоксин отличается от действия типичных психостимуляторов типа амфетамина. Полученные данные о способности тропоксина усиливать действие антагониста ГАМК-бензодиазепинового комплекса коразола и ослаблять судороги, вызываемые 5-окистриптофаном, позволяют предположить вовлечение ГАМК - и серотонинергической нейромедиаторных систем в реализации психотропных эффектов препарата.

Результаты нашего исследования получили подтверждение в работе С.Н. Кожечкина и соавт. (2001), которые установили, что тропоксин у высокоэмоциональных крыс MR, в отличие от крыс с низкой эмоциональностью MNRA, снижает мощность спектра в дельта-диапазоне и увеличивает в тета-, бета! и бета2-диапазонах ЭЭГ. Это свидетельствует о центральном стимулирующем эффекте тропоксина. Вместе с тем, тропоксин подобно анксиолитикам - диазепаму и афобазолу уменьшает количество измененных под влиянием стрессового воздействия физиологического раствора (0,9% NaCl, в/б) параметров ЭЭГ.

Представлялось важным изучить анальгетическую активность тропоксина. Известно, что некоторые агонисты серотонина, в частности, суматриптан, обладают анальгетической активностью. Кроме того, ненаркотические анальгетики используются для купирования приступа мигрени. Ноцицептивные реакции оценивали по стандартным тестам: tail flick- отдергивание хвоста, hot plate - горячая пластинка и электрическая стимуляция хвоста у крыс. Эксперименты показали, что тропоксин не оказывает влияние на болевые пороги у исследуемых животных и, следовательно, не обладает анальгетической активностью.

Далее были проведены фармакокинетические исследования тропоксина на двух видах животных: беспородных крысах-самцах и кошках. Для этой цели была разработана методика количественного определения тропоксина с использованием твердофазного иммуноферментного анализа с использованием кроличьих антител. В качестве твердофазного антигена был взят коньюгат сывороточного альбумина с а-аминотропаном. Специально полученные антитела позволяют с высокой степенью селективности распознать в биопробах химические соединения, имеющие в своей молекуле а-аминотропановую часть тропоксина.

Изучение фармакокинетики тропоксина показало, что в опытах на крысах при внутрибрюшинном введении препарат быстро всасывается в кровеносное русло, распределяется по всем органам и тканям и выводится параллельно скорости выведения препарата с кровью. Характер распределения тропоксина по органам и тканям, а также полное отсутствие неизмененного препарата в моче указывают, что препарат подвергается интенсивному метаболизму. Показано, что основным путем метаболизма является гидролиз молекулы тропоксина по эфирной связи с образованием оксима тропинона и 3,4,5-триметоксибензойной кислоты.

Тропоксин всасывается из желудочно-кишечного тракта и его содержание в крови составляет 36,8%. Изучение экскреции препарата с мочой показало, что за сутки из организма выводится 34,6 % от введенной дозы. Рассчитанные коэффициенты распределения для всех органов, показывают, что наибольшей абсорбционной способностью обладают ткани метаболизирующих и выводящих органов — печени и почек, где уровнь концентрации тропоксина в 15-25 раз больше, чем в крови. Тропоксин преодолевает гематоэнцефалический барьер и в течение полутора часов уровень концентрации тропоксина в мозге выше, чем в крови. Процесс выведения препарата из большинства органов идет со скоростью, равной или близкой скорости выведения его с кровью.

При доклиническом изучении безопасности препарата тропоксин на крысах и кроликах было установлено следующее. По данным изучения «хронической» токсичности при ежедневном введении препарата в течение шести месяцев в дозах 20 мг/кг внутрь (терапевтическая доза) и 400 мг/кг внутрь (двадцатикратно превышающая терапевтическую дозу) было установлено, что тропоксин не вызывает изменений ЭКГ, поведенческих реакций, гематологическим и клинико-биохимических параметров крови и мочи, а также по данным гистоморфологического изучения внутренних органов препарат не оказывает отрицательного влияния на жизненноважные органы и системы организма экспериментальных животных. Тропоксин не обладает местнораздражающим действием.

При изучении специфических видов токсичности было установлено, что тропоксин не обладает репродуктивной токсичностью, иммунотоксическим и мутагенным действием. При изучении аллергенных свойств препарата было установлено, что у 20% иммунизированных тропоксином животных имеются кожносенсибилизирующие антитела, что говорит о возможной индивидуальной чувствительности животных к препарату.

Таким образом, изучение «хронической токсичности» тропоксина на двух видах животных показало, что препарат не вызывает существенных функциональных и структурных нарушений в органах и системах организма и он может быть рекомендован для проведения клинического изучения без каких-либо ограничений и противопоказаний.

В соответствии с вышеизложенным подготовленные нами материалы по препарату тропоксин были представлены в Фармакологический Государственный комитет МЗ РФ и получено разрешение (протокол №6 от 02 июля 1991 года) на проведение клинических испытаний тропоксина в качестве средства для лечения мигрени.

Клиническое изучение тропоксина, проведенное на кафедре неврологии и нейрохирургии Санкт-Петербургского медицинского университета им.акад. И.П.Павлова, с использованием двойного слепого, плацебо контролируемого исследования позволило выявить высокую эффективность тропоксина при межприступном лечении больных мигренью. Было показано, что тропоксин снижает частоту приступов с 3-4 в контроле до 1,3 в месяц (р<0,001), что достоверно меньше, чем при приеме плацебо (2,0 приступа ежемесячно, р<001). Снижение частоты приступов мигрени более, чем на 50% от исходного уровня было выявлено у 73% больных. Продолжительность мигренозной головной боли на фоне приема тропоксина сократилась в среднем с 32 часов до 5 часов (р<001), а в группе больных, получавших плацебо с 28 часов до 17 часов. Интенсивность головной боли достоверно уменьшалась к концу курса лечения тропоксином, в среднем, с 2,7 до 0,8 баллов. По эффективности (урежение частоты приступов, уменьшение интенсивности и продолжительности головной боли) тропоксин имеет сходство с пропранололом, пизотифеном и амитриптилином, широко применяемыми для лечения больных мигренью в межприступный период (Амелин А.В., 2000; Амелин А.В., Игнатов Ю.Д., Скоромец А.А., 2001; Амелин А.В., Игнатов Ю. Д., 2003). Вместе с тем в отличие от пропранолола и аминтриптилина тропоксин не обладает характерными для них побочными эффектами. Тропоксин не оказывет влияние на адренорецепторы и не обладает выраженной нейропсихотропной активностью.

Таким образом, полученные нами в эксперименте данные, свидетельствующие о выраженной противомигреневой активности тропоксина, получили подтверждение в неврологической клинике.