Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Особенности цереброваскулярных эффектов агонистов и антагонистов серотонина среди производных тропана

На правах рукописи

БЕЖАНЯН СОФИЯ ГРИШАЕВНА

ОСОБЕННОСТИ ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫХ ЭФФЕКТОВ АГОНИСТОВ И АНТАГОНИСТОВ СЕРОТОНИНА СРЕДИ ПРОИЗВОДНЫХ ТРОПАНА

14.00.25 -фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003058377

Работа выполнена в лаборатории фармакологии цереброваскулярных расстройств ГУ НИИ фармакологии имени В В Закусова РАМН

Научный руководитель доктор биологических наук

Ганыпина Тамара Сергеевна

Научный консультант доктор медицинских наук, профессор

Мирзоян Рубен Симонович

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Воронина Тагьяна Александровна доктор биологических наук, профессор Кошелев Владимир Борисович Ведущая организация ГОУ ВПО Московский государственный медико-

стоматологический университет Росздрава

Защита диссертации состоится « -Л / »_¿1 ¿Л 2007 года

в « 4Я » час на заседании диссертационного совета Д-001 024 01 при ГУ НИИ фармакологии имени В В Закусова РАМН по адресу 125315, г Москва, ул Балтийская, д 8

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ГУ НИИ фармакологии имени В В Закусова РАМН по адресу 125315, г Москва, ул Балтийская, д 8

Автореферат разослан «_ 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Е А Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Изыскание и изучение фармакологических средств для лечения больных мигренью является одной из приоритетных проблем современной медицины, так как мигрень относится к наиболее распространенным и социально значимым заболеваниям В развитых странах Европы и Америки мигренью страдает от 3 до 16% населения Мигренью страдают 18% женщин, 6% мужчин 4 % детей (Stewart W F et al, 1994, Rasmussen В К , 1994, Вейн AM и соавт , 1995, Silberstem S D et al, 1998, Яхно НН и соавт, 2001, Амелин А В и соавт, 2001, Черняк ЗВ и соавт, 2003) Показано, что лица трудоспособного возраста - 35-40 лет мигренью болеют чаще Исследования последних лет выявили тенденцию к увеличению числа больных мигренью (Амелин А В и соавт , 2001 Яхно Н Н и соавт , 2001, Яхно Н Н , Штульман Д Р , 2003)

Важная роль генетического фактора в возникновении мигрени получила подтверждение в многочисленных молекулярно-биологических и клинических исследованиях Поэтому мигрень считают заболеванием, обусловленным наследственно детерминированной дисфункцией вазомоторной регучяции, проявтяющейся пароксизмальными приступами головной боли пульсирующего характера чаще в одной половине головы (Алексеев ВВ, Яхно НН, 1997, Амелин А В и соавт, 2001) Многочисленные исследования посвящены изучению мигрени и имеется значительный прогресс в понимании патогенеза этого заболевания, однако, многие аспекты этого страдания остаются невыясненными (Pietrobon D, Stressing J 2003) Установлено, что в генезе этого заболевания существенную роль играет нейромедиатор - серотонин (Chugam DC et al, 1999) Серотонин, с одной стороны, оказывает выраженное влияние на мозговые сосуды, с другой - участвует в проведении болевых импульсов (Прусинский А, 1979,) В настоящее время обсуждаются следующие гипотезы формирования приступа мигрени Сосудистую гипотезу развития приступа

мигрени, которая не потеряла актуальность и в настоящее время, предложили Wolff HG и сотрудники (1963), согласно которой для приступа мигрени характерно первоначальное повышение тонуса мозговых сосудов с последующим его понижением Нейрогенную гипотезу, основанную на корреляции изменений мозгового кровообращения с распространяющейся кортикальной депрессией Leao, предложили Olesen J В и соавторы (1981) Наконец, согласно тригеминоваскулярной гипотезе, предложенной Moskowitz М А (1984), система тройничного нерва является ответственной за взаимодействие между центральной нервной системой и сосудами головного мозга во время приступа мигрени Следовательно, несмотря на различия в представлениях о формировании приступа мигрени, большинство исследователей указывают на существенную роль серотонина и сосудов мозга в патогенезе этого заболевания Вызывает сомнение лишь вопрос о первичном или вторичном значении сосудов мозга в реализации приступа мигрени

В соответствии с вышеизложенным патогенетически обоснованным лечением больных мигренью является применение лекарственных препаратов, воздействующих на серотониновые рецепторы - агонистов 5HTib/id- и антагонистов 5НТ2-рецепторов Однако указанные средства не всегда отличаются достаточной эффективностью и обладают выраженными нежелательными побочными свойствами Поэтому поиск новых препаратов для профилактики и лечения приступа мигрени является важнейшей задачей современной фармакологии и медицины Учитывая важную роль мозгового кровообращения и серотонина в патогенезе приступа мигрени, при поиске новых противомигреневых препаратов необходимо выявлять вещества, обладающие способностью воздействовать на серотониновые рецепторы сосудов мозга

Ранее в ГУ НИИ фармакологии им В В Закусова РАМН был создан оригинальный антагонист серотониновых рецепторов с противомигреневой активностью - тропоксин, который, блокируя 5НТ2 - рецепторы,

предупреждает развитие констрикторных реакций мозговых сосудов, вызванных серотонином Поэтому мы считали целесообразным проводить дальнейшее изыскание новых противомигреневых препаратов среди производных тропана, к которым относится и тропоксин Все производные тропана были синтезированы в отделе химии ГУ НИИ фармакологии им В В Закусова РАМН ведущим научным сотрудником, канд хим наук Л М Косточкой В целях понимания патогенеза мигрени представляет интерес более подробно знать механизм действия применяемых препаратов в лечении мигрени Поэтому представлялось важным провести дальнейшее изучение механизмов противомигреневой активности препарата - тропоксин, а также изучить цереброваскулярную серотонинергическую активность известного противомигреневого препарата-суматриптан

Цель исследования. Изыскание новых противомигреневых препаратов среди производных тропана и изучение механизма действия тропоксина и суматриптана Задачи исследования.

1 Проведение скрининга среди вновь синтезированных производных тропана и сравнительное изучение антисеротониновой цереброваскулярной активности соединения ЛК-728 и тропоксина

2 Сравнительное изучение серотонинергической цереброваскулярной активности нового производного тропана (ЛК-769) в сравнении с суматриптаном

3 Микроионофоретическое изучение механизма нейронального действия тропоксина и выяснение роли фрагментов молекулы препарата в реализации его антисеротониновой активности

4 Изучение и сопоставление антиагрегационных свойств тропоксина и известного препарата дитгаридамола

Научная новизна работы. Исследование связи между структурой и антисеротониновой цереброваскулярной активностью среди новых производных тропана позволило выявить как антагониста, так и агониста серотонина Выявлены антисеротониновые цереброваскулярные свойства у соединения под шифром ЛК-728, которое более продолжительно по сравнению с тропоксином ослабляет констрикторные реакции сосудов мозга и изменения артериального давления, вызванные серотонином

Агонистические свойства выявлены у другого производного тропана -шифр JIK-769, которое, напротив, усиливает реакции сосудов мозга в ответ на введение серотонина Эффект этого соединения сопоставим с известным агонистом серотониновых рецепторов суматриптаном Выявлена способность суматриптана и соединения JIK-769 оказывать двухфазное влияние на мозговое кровообращение интактных животных - первоначально снижать уровень кровоснабжения мозга, а затем его увеличивать Эта особенность суматриптана, по-видимому, также играет роль в механизме противомигреневого эффекта препарата

С использованием техники микроионофореза установлено, что тропоксин является блокатором 5НТ-рецепторов возбуждающего (деполяризующего) типа, локализованных на нейронах сенсомоторной коры головного мозга Исследование нейротропной активности отдельных фрагментов молекулы тропоксина показало, что для максимального проявления антисеротониновой и противомигреневой активности препарата необходимо сохранение конформации всей молекулы

В опытах in vitro и ex vivo обнаружена антиагрегационная активность противомигреневого препарата - тропоксин, сопоставимая с эталонным антиагрегантом - дипиридамолом

Научно-практическая значимость работы. Обнаруженная в работе способность соединений ЛК-728 и ЛК-769 оказывать выраженное влияние на серотонинергическую систему регуляции мозгового кровообращение указывает на целесообразность проведения их расширенного доклинического

изучения Установленная в результате исследований взаимосвязь между структурой и цереброваскулярной серотонинергической активностью среди производных тропана свидетельствует о целесообразности проведения дальнейших исследовании в этом ряду соединений с целью создания новых препаратов с противомигреневой активностью

Выявленная в работе зависимость антисеротониновой активности гропоксина от всей конформации молекулы препарата и способность тропоксина оказывать выраженное антиагрегационное действие расширяют наши представления о свойствах противомигреневого эффекта препарата Обнаруженные в результате исследования особенности цереброваскулярного эффекта агониста серотониновых рецепторов -суматриптана, позволяют по-новому рассматривать механизм эффективности агониста 5НТ1В/Тгрецепторов при лечении приступа мигрени

Основные сведения об апробации работы

Материалы диссертации доложены на II съезде Российского Научного Общества фармакологов, Москва (апрель, 2003 г), на международной конференции, посвященной 100-летнему юбилею присуждения Нобелевской премии академику И П Павлову «Проблемы интеграции функции в физиологии и медицине», Минск (июнь, 2004г ), 8-ой Европейский колледж по нейропсихофармакологии, Москва (апрель, 2005г), межлабораторной конференции ГУНИИ фармакологии им В В Закусова РАМЩапрель, 2007г)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 2 статьи в центральных журналах, 2 статьи в сборнике работ и 3 тезисов Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 114 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, 4 главы результатов собственных исследований и их обсуждений, заключение, выводы, список литературы, включающий 26 отечественных и 171 зарубежных источника Работа иллюстрирована 18 таблицами и 11 рисунками

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на 135 наркотизированных (хлоралгидрат 350-400 мг/кг, внутрибрюшинно) беспородных крысах-самцах массой 250400г, на 15 наркотизированных галотаном и обездвиженных диплацином беспородных крысах-самцах массой 180-240г и 4-х кроликах-самцах массой 3-4кг, 4-х бодрствующих кроликах-самцах массой 3-4кг, была использована венозная кровь 20 здоровых доноров

Состояние мозгового кровообращения у животных оценивали с помощью комплекса современных количественных методов исследования Для оценки микроциркуляции в коре головного мозга крыс применяли метод лазерной допплеровской флоуметрии Региональный мозговой кровоток у крыс регистрировали методом ультразвуковой флоуметрии Одновременно регистрировали изменения артериального давления

Методика лазерной допплеровской флоуметрии, которая позволяет оценивать состояние кровотока на капиллярном уровне, была использована для регистрации локального мозгового кровотока в теменной области коры головного мозга крыс с использованием лазерного допплеровского флоуметра ALF-21 фирмы "Transonic System Inc " (США) Для этой цели игольчатый датчик флоуметра диаметром 0,8 мм устанавливали на теменной области коры большого мозга крысы с помощью микроманипулятора и коромысла

Для регистрации притока крови в мозг применяли метод ультразвуковой флоуметрии (Е Н Рябцева, 1998) Приток крови в мозг регистрировали во внутренней сонной артерии ультразвуковым флоуметром Т106 фирмы "Transonic System Inc", датчик которого диаметром 1 мм устанавливали на общей сонной артерии после перевязки наружной сонной артерии Для регистрации артериального давления полиэтиленовый катетер вставляли в бедренную артерию и соединяли с электроманометром BPR-01

Expenmetria Для внутривенного введения исследуемых веществ в бедренную вену экспериментальных животных вставляли полиэтиленовый катетер

С помощью метода микроионофореза, который проводили совместно с ведущим научным сотрудником С Н Кожечкиным, исследовали влияние противомигреневого препарата тропоксина и основных компонентов его молекулы тропана и 3,4,5 - триметоксибензоата (ТМБ) на чувствительность к серотонину постсинаптической мембраны нейронов сенсомоторной коры большого мозга крыс

Эксперименты по изучению влияния тропоксина на агрегационную активность тромбоцитов т vitro были выполнены совместно с сотрудниками лаборатории патологии и фармакологии гемостаза Гематологического научного центра РАМН (зав - профессор В А Макаров) ст научн сотр Т М Васильевой и вед научн сотр Г Н Петрухиной на венозной крови здоровых доноров (п=20), которую получали путем пункции кубитальной вены и стабилизировали 3,8%-ым раствором цитрата натрия в соотношении 9 1 Для приготовления богатой тромбоцитами плазмы кровь центрифугировали в течение 10 минут при 1000 об/мин, после чего верхний слой плазмы переносили в другую пробирку, а остаток повторно центрифугировали в течение 20 минут при 3000 об/мин для получения плазмы, бедной тромбоцитами

В экспериментах по изучению влияния тропоксина на агрегацию тромбоцитов ex vivo использовали кроликов, которым внутривенно вводили данный препарат в дозе 10 мг/кг Агрегацию тромбоцитов исследовали на агрегометре фирмы "Biola" (Россия) по методу Bom G (1962)

Результаты исследования обрабатывали методом вариационной статистики с помощью t-критерия Стьюдента с использованием программы «Biostat»

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование было начато со скрининга вновь синтезированных производных тронана на модели констрикторных реакций сосудов мозга, вызванных сер ото ни ном. С целью повышения устойчивости к био трансформации тропотссина и увеличения длительности его эффекта было синтезировано соединение под шифром ЛК-728, у которого в отличие от тропоксина тропинон и 3-метоксибензойная кислота соединены через амидную, а не сложно-эфирную связь, как а трошжсине.

Проведенные опыты позволили установить, что соединение ЛК-728 в дозах 5 и 10 мг/кг, также как и троггоксин (10 мг/кг), при внутривенном введении обладает выраженной антисеротопиновой цсреброваскудярной активностью.

5НТ ЛК-728 5НТ 5НТ

20мин 4Ймин

Рис.1, Влияние ЛК-728 (5 мг/кг,в/в) на изменения локального мозгового кровотока в усл.ел. (в верхней части рисунка) и артериального давления в мм рт.ст (в нижней части), вызванные ссротонином (5НТ, 20 мкг/кг, в/в)

Оказалось, что через 20 минут после введения соединение ЛК- 728 в дозах 5 и 10 ,чг/кг при внутривенном введении существенно ослабляет

серотониновые спазмы сосудов мозга, а также реакции артериального давления на серотонин (табл 1, рис 1)

Таблица 1

Влияние ЛК- 728 (10 мг/кг, в/в) на изменения локального мозгового кровотока (ЛМК в уел ед и в % к исходному уровню), вызванные серотонином (5НТ, 20 мкг/кг, в/в) у наркотизированных крыс

Контроль После соединения ЛК-728

№ опыта ЛМК (фон) ЛМК после 5НТ % изм контроль Эффект 5НТчерез 20 мин (в%) Эффект 5НТ через 35 мин (%) Эффект 5НТ через 60 мин и более (%)

1 20 15 -25 -22 +28

2 28 22 -21 0 0 0

3 40 24 -40 -9 0 0

4 53 42 -30 -5 +12 +18

5 52 42 -19 -19 -8 -6

6 32 24 -25 -19 -8 -7

7 25 17 -16 -10 -16 0

8 22 17 -23 -15 0 0

9 24 21 -12 -12 -12 -6

М±т 33,0 ±4,2 25,0+3,4 -23±2,7 -12±1,9* (п=7) -11,0±1,95* (п=4) -6,3* (п=3)

* Р<0,05 по сравнению с контролем

При изучении влияния соединения ЛК-728 и тропоксина на локальный мозговой кровоток у интактных животных было показано, что оба вещества сразу же после введения вызывают снижение мозгового кровотока, т е вызывают повышение тонуса сосудов мозга, что характерно для серотонина Это позволяет предположить, что наряду с антисеротониновой активностью, указанные соединения первоначально, по-видимому, стимулируют серотониновые рецепторы

Далее было изучено другое производное тропана под шифром ЛК-769, где в качестве заместителя в третьем положении кольца была использована 1- (4-хлорбензоил) -5-метокси- 2-метил- 1Н- индол -3- уксусная кислота

(индометацин) Индометацин, угнетая активность циклооксигеназы и снижая синтез простагландинов, обладает противовоспалительным и анальгетическим действием По-видимому, эти свойства индометацина лежат в основе его применения у больных мигренью, так как в литературе мы не обнаружили сведений о его влиянии на серотонинергическую систему Важно также отметить, что в индольном фрагменте индометацина, в отличие от серотонина, оксигруппа в 5 положении бензольного кольца заменена на метокси группу Можно было допустить, что использование в качестве заместителя в третьем положении тропанового кольца 1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1Н-индол-3-уксусной кислоты, где метокси группа находится в 5 положении индольного фрагмента, будет способствовать проявлению агонистических свойств по отношению к серотониновым рецепторам Здесь следует отметить, что в структуре известного противомигреневого препарата-суматриптана, который является агонистом серотониновых 5НТшо -рецепторов, имеется наличие метансульфонамидной группы в 5 положении индольного кольца

Изучение влияния соединения ЛК-769 на констрикторные реакции сосудов мозга, вызванные серотонином, показало, что это производное тропана, в отличие от известных тропановых производных, которые обладают антисеротониновой активностью, напротив, усиливает констрикторные реакции сосудов мозга, вызванные серотонином Так, через 20 минут после введения соединения ЛК-769 серотонин вызывает уменьшение локального мозгового кровотока на 32,0±2,9% (контроль 18,0±2,5%, р<0,01, рис 2) Следует отметить, что соединение ЛК-769, наряду с усилением реакции сосудов мозга на серотонин, в большинстве опытов вызывало угнетение реакции артериального давления на серотонин Далее представляло интерес изучить цереброваскулярную серотонинергическую активность у известного агониста серотониновых рецепторов противомигреневого препарата суматриптана и сравнить его эффекты с действием соединения ЛК-769

5НТ ЛК-769 5НТ10 мин 5НТ 5НТ

20 мнн 30 мин

Рис.2. Влияние ЛК-769 (I Омг/кг, в/в) на изменения локального мозгового кровотока в усл.ед. (в верхней части рисунка) и артериального давления в мм рт.ст. (в нижней части), вызванные серотонином (5НТ, 20 мкг/кг, в/в)

Проведенные опыты позволили установить, что суматриптан в большинстве экспериментов усиливает снижение мозгового кровотока, вызванное серотонином. В данной серии экспериментов серотоние в контроле вызывал уменьшение локального мозгового кровотока у крыс в среднем на 17,0±2,9%, а после введения суматриптана снижение кровотока под влиянием серотонина составляло в среднем 34,0±4,9% (р<0,02). Суматриптан не оказывал влияния на реакции артериального давления, вызванные серотонином (рис.3).

Обнаружена способность суматриптана и соединения ЛК-769 оказывать двухфазное влияние на кровоснабжение коры головного мозга интактных животных - первоначальное кратковременное снижение уровня кровоснабжения мозга с последующим его существенным увеличением, что, по-видимому, может также играть важную роль в механизме противом игреневого действия суматриптана (рис,4).

30 мин 40 мин

Рис.З. Влияние суматриптана (1 мг/кг, в/в) на изменения локального мозгового кровотока в уел,ел {в верхней части рисунка) и артериального давления в мм рт.ст. (в нижней части), вызванные серотонином (5НТ, 20 мкг/кг,в/в)

Суматрииган 40 мин 60 мин

Рис. 4. Влияние суматриптана (1 мг/кг, в/в) на локальный мозговой кровоток в усл.ед {в верхней части рисунка) и артериального давления в мм рт.ст.) (в нижней части)

Таким образом, среди производных тропана выявлены новые соединения, которые способны как ослаблять, так и потенциировать констрикторные реакции сосудов мозга, вызываемые серотонином, и могут являться или агонистами, или антагонистами по отношению к серотониновым рецепторам сосудов мозга Необходимо продолжить исследовательские работы по выявлению особенностей действия этих производных и их отличий от известных препаратов, для того, чтобы решить вопрос о целесообразности разработки на их основе новых лекарственных препаратов

Вторая часть настоящего исследования посвящена дальнейшему изучению механизма действия тропоксина, в частности, углубленному изучению его нейронального эффекта Согласно нейрональной гипотезе патогенеза мигрени серотонин, выделяющийся из пресинаптических терминалий в периваскулярные пространства коры головного мозга, может вызывать как спазм сосудов мозга, так и участвовать в реализации болевой реакции - одного из основных симптомов мигрени Известно, что кора головного мозга является последним пунктом ноцицептивных нервных путей, ответственных за субъективное ощущение боли Введение же химических агентов в ток крови может вызывать отраженные, непрямые эффекты на нервную систему сосудов мозга, опосредуемые внешними экстраваскулярными структурами, в том числе и центральной нервной системой Для того, чтобы судить о непосредственном воздействии препаратов на неокортекс в настоящем исследовании была использована техника микроионофореза Наряду с тропоксином на нейрональную спонтанную активность, а также на серотониновые ответы нейронов сенсомоторной коры головного мозга были изучены известные антагонисты 5НТ-рецепторов кетансерин, метисергид, ципрогептадин

Проведенные опыты позволили установить, что наиболее сильным угнетающим действием на спонтанную активность корковых нейронов обладает кетансерин, за ним следуют тропоксин и метисергид, а затем

ципрогептадин Тропоксин оказывал выраженное угнетающее влияние на возбуждающие (деполяризующие) 5НТ-ответы серотониновых рецепторов, локализованных на нейронах сенсомоторной коры головного мозга По своим эффектам тропоксин наиболее близок к метисергиду (рис 5) Известно, что метисергид эффективно блокирует реакции сосудов головного мозга на серотонин и является одним из противомигреневых препаратов (Ганьшина Т С , 2004)

Рис 5 Уменьшение возбуждающих ответов нейронов сенсомоторной коры головного мозга крыс на 5-НТ под влиянием тропоксина и других блокаторов 5-НТ-рецепторов Усредненные кривые для всех изученных нейронов

По оси абсцисс - микроионофоретический ток в нА (110"9А), по оси ординат - уменьшение нейрональных ответов на 5-НТ в % от величины первоначальных ответов до подведения тропоксина и блокаторов 5-НТ-рецепторов

- (толстая) - тропоксин,

- (тонкая) - метисергид,

кетансерин, ципрогептадин

Далее представлялось важным выяснить с каким участком молекулы тропоксина связан вышеуказанный эффект Были исследованы фрагменты молекулы тропоксина тропановый бицикл и ароматическая часть - 3-метоксибензойная кислота (натриевая соль) Оказалось, что как тропоксин,

так и основные структурные компоненты его молекулы тропан и 3-метоксибензойная кислота являются блокаторами рецепторов постсинаптической мембраны нейронов коры большого мозга, чувс 1ВИ1 едьных к серотонину Все три вещества уменьшают лишь возбуждающие ответы клеток на микроионофоретически подводимый серотонин, выражающиеся в увеличении частоты потенциалов действия нейронов Однако, наибольшей антисеротониновой активностью обладал тропоксин (рис 6)

Рис 6 Уменьшение ответов нейронов сенсомоторной коры головного мозга крысы на серотонин под влиянием тропоксина, тропана и триметоксибензоата при их микроионофоретическом подведении Усредненные данные для 13 нейронов, частота ПД которых увеличивалась при подведении серотонина

По оси абсцисс - сила микроионофоретического тока в нА (1 10'9 А) По оси ординат - величина угнетения серотониновых ответов в процентах Сплошная линия - тропоксин, прерывистая редкая - тропан, прерывистая частая - триметоксибензоат

Антагонизм с серотонином проявляют также тропан, и в меньшей степени 3-метоксибензойная кислота Можно полагать, что антисеротониновая активность тропоксина обусловлена преимущественно тропановой частью

его молекулы Однако, для максимального проявления антагонизма с серотонином необходимо сохранение конформации всей молекулы тропоксина и только в этом случае может быть обеспечена ее наибольшая комплементарность к серотониновым рецепторам

Заключительный раздел диссертационного исследования посвящен изучению антиагрегационной активности тропоксина Хорошо известно, что серотонин является не только важным патогенетическим звеном приступа мигрени, но и сильным естественным проагрегантом Поэтому способность препаратов ингибировать агрегационную способность тромбоцитов является важной составляющей эффективности противомигреневых средств Серотонин, связываясь со специфическими 5-НТ2 - рецепторами, усиливает агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ, тромбином, коллагеном, адреналином, арахидоновой кислотой и другими агонистами Для лечения больных мигренью широко используются блокаторы 5ШУрецепторов -метисергид и пизотифен Из литературы известно, что эти препараты обладают антиагрегационными свойствами Инкубирование тромбоцитов с метисергидом приводит к ингибированию агрегации, индуцированной арахидоновой кислотой, и реакции высвобождения (Li BY et ai ,1998) Показано, что пизотифен также как и метисергид уменьшает АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека, стимулированную серотонином (Hladovec J, 1986) Эффективность пизотифена продемонстрирована не только в опытах in vitro, но и т vivo Снижение спонтанной агрегации тромбоцитов выявлено у пациентов, получавших пизотифен в течение двух месяцев (Mazal S , Rachmilewitz Е А ,1980)

Вышеизложенное явилось основанием для изучения влияния противомигреневого препарата и антагониста 5-ШУрецепторов -тропоксина - на агрегационную активность тромбоцитов Исследовалось влияние тропоксина как на параметры агрегации т vitro, так и агрегацию тромбоцитов ex vivo, где его действие сравнивали с антиагрегационным

эффектом дипиридамола - препарата, который часто применяется в клинической практике для ингибирования тромбоцитарного взаимодействия

Инкубирование богатой тромбоцитами плазмы вместе с тропоксином приводило к достоверному снижению АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов in vitro во всем диапазоне изученных концентраций Наиболее выраженный антиагрегационный эффект был выявлен у тропоксина (в концентрациях 2-7 мг/мл) при агрегации, индуцированной адреналином (табл 2,3) Как известно, под влиянием проагрегантов происходит активация тромбоцитов, в ходе которой развивается экзоцитоз множества соединений, стимулирующих агрегационный процесс, в том числе из плотных тромбоцитарных гранул высвобождается серотонин, который затем связывается с 5-ШУрецепторами и, таким образом, стимулирует активность тромбоцитов По-видимому, тропоксин, являясь антагонистом 5НТ2-рецепторов (Ганылина Т С , 2004), блокирует взаимодействие серотонина с одноименным рецептором и снижает способность тромбоцитов к агрегации Выявленная в наших экспериментах способность тропоксина уменьшать скорость агрегации тромбоцитов, индуцированной адреналином, при инкубировании богатой тромбоцитами плазмы с этим препаратом, указывает на наличие у него механизма, сопряженного с влиянием на реакцию высвобождения Необходимо подчеркнуть, что тропоксин достоверно ингибирует АДФ-индуцированную агрегацию во всем диапазоне исследованных концентраций, в то время как подавление адреналин-индуцированной агрегации наблюдается только при высоких дозах Этот эффект, по-видимому, обусловлен различной природой тромбоцитарной активации, которые инициируются АДФ и адреналином, в частности, участием пуринергических механизмов и агд-адренорецепторов (Casserly IР , Topol Е J , 2002)

Таблица 2

Влияние тропоксина ка агрегацию тромбоцитов человека in vitro (Amax, %)

Проагре- Концентрация тропоксина, мг/мл

гант 0 (контроль) 7 5 2 1 0,1 0,01

АДФ 58,6± 21,6+ 30,9± 41,3± 44,1± 45,2± 46,6±

lxlO'5 М 1,9 1,9* 1,9* 1,5* 1,4* 1,9* 1,7*

Адреналин 58,2± 1,6± 6,9+ 39,4± 52,3± 52,8+ 47,9+

2,5х10'бМ 3,5 0,5* 1,1* 6,4* 3,8 3,4 4,9

* - достоверно по отношению к контролю (р<0,05)

Таблица 3

Влияние тропоксина на скорость агрегации тромбоцитов человека, индуцированной адреналином (2,5х10"бМ) in vitro

Концентрация тропоксина, мг/мл

Скорость агрегации, % в мин 0 (контроль) 5 2 1 0,1 0,01

50,4+7,6 4,1 ±0,7* 21,7±3,9* 29,8±3,1* 32,3 ±3,1* 30,5±3,9

*- достоверно по отношению к контролю (р<0,05)

Изучение влияния тропоксина на агрегационную способность тромбоцитов ex vivo позволило установить, что тропоксин через 45 мин после инъекции приводит к снижению агрегации тромбоцитов Действие препарата

сохранялось в течение 30 мин и прекращалось спустя 90 мин после его введения Антиагрегационный эффект тропоксина сопоставляли с ингибирующим влиянием дипиридамола, механизм действия которого хорошо известен Антиагрегационный эффект дипиридамола обусловлен его способностью избирательно угнетать активность цГМФ-зависимой фосфодиэстеразы 5- типа и потенцировать действие N0 на тромбоциты (Aktas В, 2003) Опыты показали, что дипиридамол вызывает угнетение функциональной активности тромбоцитов в 1,2-1,7 раза, а под влиянием тропоксина наблюдается уменьшение агрегационной активности тромбоцитов в 1,2-1,4 раза по сравнению с контрольной величиной (табл 4,5)

Таблица 4.

Влияние тропоксина (10 мг/кг, внутривенно) на агрегацию тромбоцитов кролика ex vivo АДФ (1х10"5 М) (Amax, %)

До введения (контроль) После введения

15 мин 45 мин 75 мин 90 мин

34,1±1,7 27,0±3,2 28,2±1,9* 23,7±4,4* 33,7±1,7

* - достоверно по отношению к контролю (р<0,05)

Таблица 5

Влияние дипиридамола (25 мг/кг, per os) на агрегацию тромбоцитов кроликов ex vivo АДФ (lxlО'5 М) (Агаах, %)

До ведения После введения

30 мин 60 мин 90 мин 180 мин 240 мин

40,8±1,7 31,4+0,9* 31,9±1,0* 40,8±4,7 24,2±3,1* 42,2+1,1

*- достоверно по отношению к контролю (р<0,05)

Следовательно, противомигреневый препарат и антагонист 51ПУ рецепторов тропоксин наряду с выраженной цереброваскулярной

антисеротониновой активностью обладает антиагрегационными свойствами, сопоставимыми с ингибирующим влиянием дипиридамола

Таким образом, среди вновь синтезированных производных тропана выявлены как антагонист, так и агонист серотонина Антисеротониновые цереброваскулярные свойства, обнаруженные у соединения под шифром JIK-728, которое существенно ослабляет констрикторные реакции сосудов мозга и изменения артериального давления, вызванные серогонином, сравнимы с тропоксином Другое производное тропана - JIK-769, напротив, усиливает реакции сосудов мозга на серотонин, что свидетельствует о его агонистических свойствах по отношению к серотонину Действие этого соединения сопоставимо с известным агонистом серотониновых рецепторов суматриптаном Обнаружена способность суматриптана и соединения JIK-769 оказывать двухфазное влияние на кровоснабжение коры головного мозга интактных животных - первоначальное кратковременное снижение уровня кровоснабжения мозга с последующим его существенным увеличением, что, по-видимому, также играет важную роль в механизме противомигреневого эффекта суматриптана Использование микроионофоретической методики позволило установить, что тропоксин является блокатором 5НТ-рецепторов возбуждающего (деполяризующего) типа, которые локализованы на нейронах сенсомоторной коры головного мозга Максимальное проявление нейротропной антисеротониновой активности характерно для всей молекулы тропоксина, так как угнетающий эффект его фрагментов выражен в меньшей степени В опытах in vitro и ex vivo обнаружена выраженная антиагрегационная активность противомигреневого препарата - тропоксин, сопоставимая с эталонным антиагрегантом — дипиридамолом

ВЫВОДЫ

Изучение связи между структурой и серотонинергической цереброваскулярной активностью среди новых производных тропана позволило выявить соединения с антагонистической и агонистической активностью Соединение ЛК-728 обладает выраженной антисеротониновой цереброваскулярной активностью сопоставимой с тропоксином, тогда как J1K-769, напротив, усиливает реакции сосудов мозга на серотонин, что свидетельствует о его агонистических свойствах по отношению к серотонину, характерных для известного противомигреневого препарата -суматриптан

Суматриптан и соединение ЛК-769, в отличие от серотонина, оказывают двухфазное влияние на кровоснабжение коры головного мозга интактных животных - первоначальное снижение уровня кровоснабжения мозга сменяется последующим его увеличением, что играет важную роль в механизме противомигреневого эффекта суматриптана

С помощью микроионофоретической техники установлено, что тропоксин является блокатором 5НТ-рецепторов возбуждающего (деполяризующего) типа, которые локализованы на нейронах сенсомоторной коры головного мозга

Для максимального проявления нейротропной антисеротониновой активности тропоксина необходимо сохранение конформации всей молекулы, так как угнетающий эффект его фрагментов выражен в меньшей степени

В опытах т vitro и ex vivo тропоксин проявляет выраженную антиагрегационную активность сопоставимую с дипиридамолом

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Т С Ганыиина, С Г Бежанян, В В Александрии, Л М Косточка Изменения регионарного и локального мозгового кровотока у крыс под влиянием серотонина и тропоксина // Фундаментальные проблемы фармакологии Сб тезисов 2-го Съезда Российского Научного Общества фармакологов Москва, 2003, часть 1, с 118

2. С Г Бежанян, В В Александрии, Т С Ганьшина, Л М Косточка, Р С Мирзоян Влияние соединения ЛК-728 и тропоксина на вызванные серотонином изменения локального кровотока в неокортексе крыс// Методология флоуметрии, 2003, вып 7, с 85-90

3. С Н Кожечкин, Р С Мирзоян, С Г Бежанян Электрофизиологическая идентификация серотониновых рецепторов, опосредующих цереброваскулярное действие тропоксина - нового противомигреневого средства // Материалы междконф «Проблемы интеграции функций в физиологии и медицине» Минск, ПЧУП «Бизнесофсет», 2004, с 184-186

4. С Н Кожечкин, Л М Косточка, С Г Бежанян, Р С Мирзоян, С Б Середенин Взаимодействие тропоксина и фрагментов его молекулы тропана и 3,4,5-триметоксибензоата, с серотониновьтми рецепторами нейронов коры головного мозга крысы (микроионофоретическое исследование) // Экспер и клин фармакол , 2005, т 68, №4, с 3-6

5. Т S Ganshina. S G Bezhanyan, L М Kostochka Comparative study on antimigraine activity of tropoxin and other antimigraine medicaments // Abstracts 8th European College of Neuropsychopharmacology , April 14-16, 2005, Moscow, Russia, S248

6. T M Васильева, Г H Петрухина, Н Т Мифтахова, В А Макаров, Т С Ганьшина, С Г Бежанян, Р С Мирзоян Действие противомигреневого препарата и антагониста серотониновых рецепторов - тропоксина на агрегацию тромбоцитов // Экспер и клин фармакол , 2005, т 68, №3, с 30-33

7. С Г Бежанян, Т С Ганьшина, Л М Косточка, В В Александрии, Р С Мирзоян Изучение связи между структурой и серотонинергической цереброваскулярной активностью среди новых производных тропана // Мат 4-ой Международной конф «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» 13-16 марта 2006, Москва, с 14

Подписано в печать 17 04 2007 г

Отпечатано в ЗАО «Оперативное тиражирование»,

ИНН 7710243829,

ул Бол Новодмитровская, д 28

Бумага офсетная, тираж 100 экз , зак № 104/17

Актуальность темы. Изыскание и изучение фармакологических средств для лечения больных мигренью является одной из приоритетных проблем современной медицины, так как мигрень относится к одному из наиболее распространенных и социально значимых заболеваний. В развитых странах Европы и Америки мигренью страдает от 3 до 16% населения, а по некоторым данным и до 30%. Мигренью страдают 18% женщин, 6% мужчин 4 % детей (Stewart W.F. et al., 1994; Rasmussen B.K., 1994; Вейн А.М.и соавт., 1995; Silberstein S.D. et al., 1998; Яхно H.H. и соавт., 2001; Амелин А.В. и соавт., 2001; Черняк З.В. и соавт., 2003). Показано, что лица трудоспособного возраста - 35-40 лет мигренью болеют чаще. Исследования последних лет выявили тенденцию к увеличению числа больных мигренью (Stewart W.F. et al., 1994; Амелин А.В. и соавт., 2001; Яхно Н.Н. и соавт., 2001; Яхно Н.Н., Штульман Д.Р., 2003).

Важная роль генетического фактора в возникновении мигрени получила подтверждение в многочисленных молекулярно-биологических и клинических исследованиях. Поэтому мигрень считают заболеванием, обусловленным наследственно детерминированной дисфункцией вазомоторной регуляции, проявляющейся пароксизмальными приступами головной боли пульсирующего характера чаще в одной половине головы (Алексеев В.В., Яхно Н.Н., 1997; Амелин А.В. и соавт., 2001). Многочисленные исследования посвящены изучению мигрени и имеется значительный прогресс в понимании патогенеза этого заболевания, однако, многие аспекты этого страдания остаются невыясненными (Pietrobon D., Stressing J. 2003). Установлено, что в патогенезе этого заболевания существенную роль играет нейромедиатор - серотонин (Chugani D.C. et al., 1999). Серотонин, с одной стороны, оказывает выраженное влияние на мозговые сосуды, с другой - участвует в проведении болевых импульсов (Прусинский А., 1979;). В настоящее время обсуждаются следующие гипотезы формирования приступа мигрени. Сосудистую гипотезу развития приступа мигрени, которая не потеряла актуальность и в настоящее время, предложили Wolff H.G. и сотрудники (1963), по мнению которых для приступа мигрени характерно первоначальное повышение тонуса мозговых сосудов с последующим его понижением. Нейрогенную гипотезу, основанную на корреляции изменений мозгового кровообращения с распространяющейся кортикальной депрессией Leao, предложили Olesen J. В. и соавторы (1981). Наконец, согласно тригеминоваскулярной гипотезе, предложенной Moskowitz М.А. (1984), система тройничного нерва является ответственной за взаимодействие между центральной нервной системой и сосудами головного мозга во время приступа мигрени. Следовательно, несмотря на различия в представлениях о формировании приступа мигрени, большинство исследователей указывают на существенную роль серотонина и сосудов мозга в патогенезе этого заболевания. Вызывает сомнение лишь вопрос о первичном или вторичном значении сосудов мозга в реализации приступа мигрени.

В соответствии с вышеизложенным патогенетически обоснованным лечением больных мигренью является применение лекарственных препаратов, воздействующих на серотониновые рецепторы - агонистов 5HTib/id" и антагонистов бШтрецепторов. Однако указанные средства не всегда отличаются достаточной эффективностью и обладают выраженными нежелательными побочными свойствами. Поэтому поиск новых препаратов для профилактики и лечения приступа мигрени является важнейшей задачей современной фармакологии и медицины. Учитывая важную роль мозгового кровообращения и серотонина в патогенезе приступа мигрени, при поиске новых противомигреневых препаратов необходимо выявлять вещества, обладающие способностью воздействовать на серотониновые рецепторы сосудов мозга.

Ранее в ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН был создан оригинальный антагонист серотониновых рецепторов - тропоксин, который, блокируя 5НТ2 - рецепторы, предупреждает развитие констрикторных реакций мозговых сосудов, вызванных серотонином. Тропоксин является одним из производных тропана, которые были синтезированы в отделе химии ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН ведущим научным сотрудником, канд. хим. наук Л.М.Косточкой. Поэтому мы считали целесообразным проводить изыскание новых противомигреневых препаратов среди производных тропана. В целях понимания патогенеза мигрени представляет интерес более подробно изучить механизм действия применяемых для лечении мигрени препаратов. Поэтому представлялось важным провести дальнейшее изучение механизмов противомигреневой активности препарата - тропоксин, а также изучить цереброваскулярную серотонинергическую активность известного противомигреневого препарата-суматриптан.

Цель исследования. Изыскание новых противомигреневых препаратов среди производных тропана и изучение механизма действия тропоксина и суматриптана.

Задачи исследования.

1. Проведение скрининга среди вновь синтезированных производных тропана и сравнительное изучение антисеротониновой цереброваскулярной активности соединения JIK-728 и тропоксина.

2. Сравнительное изучение серотонинергической цереброваскулярной активности производного тропана - JIK-769 в сравнении с суматриптаном.

3. Микроионофоретическое изучение механизма нейронального действия тропоксина и выяснение роли фрагментов молекулы препарата в реализации его антисеротониновой активности.

4. Изучение и сопоставление антиагрегационных свойств тропоксина и известного препарата - дипиридамол.

Научная новизна работы. Исследование связи между структурой и антисеротониновой цереброваскулярной активностью среди новых производных тропана позволило выявить как антагониста, так и агониста серотонина. Выявлены антисеротониновые цереброваскулярные свойства у соединения под шифром JIK-728, которое более продолжительно по сравнению с тропоксином ослабляет констрикторные реакции сосудов мозга и изменения артериального давления, вызванные серотонином.

Агонистические свойства выявлены у другого производного тропана -шифр JIK-769, которое, напротив, усиливает реакции сосудов мозга в ответ на введение серотонина. Эффект этого соединения сопоставим с известным агонистом серотониновых рецепторов суматриптаном. Выявлена способность суматриптана и соединения JIK-769 оказывать двухфазное влияние на мозговое кровообращение интактных животных - первоначально снижать уровень кровоснабжения мозга, а затем его увеличивать. Эта особенность суматриптана, по-видимому, также играет роль в механизме противомигреневого эффекта препарата.

С использованием техники микроионофореза установлено, что тропоксин является блокатором 5НТ-рецепторов возбуждающего (деполяризующего) типа, локализованных на нейронах сенсомоторной коры головного мозга. Исследование нейротропной активности отдельных фрагментов молекулы тропоксина показало, что для максимального проявления антисеротониновой и противомигреневой активности препарата необходимо сохранение конформации всей молекулы.

В опытах in vitro и ex vivo обнаружена антиагрегационная активность противомигреневого препарата - тропоксин, сопоставимая с эталонным антиагрегантом - дипиридамолом.

Научно-практическая значимость работы. Обнаруженная в работе способность соединений JIK-728 и JIK-769 оказывать выраженное влияние на серотонинергическую систему регуляции мозгового кровообращения указывает на целесообразность проведения их расширенного доклинического изучения. Установленная в результате исследований взаимосвязь между структурой и цереброваскулярной серотонинергической активностью среди производных тропана свидетельствует о целесообразности проведения дальнейших исследований в этом ряду соединений с целью создания новых препаратов с противомигреневой активностью.

Выявленная в работе зависимость антисеротониновой активности тропоксина от всей конформации молекулы препарата и способность тропоксина оказывать выраженное антиагрегационное действие расширяют наши представления о свойствах противомигреневого эффекта препарата. Обнаруженные в результате исследования особенности цереброваскулярного эффекта агониста серотониновых рецепторов - суматриптана, позволяют по-новому рассматривать механизм эффективности агониста 5НТт/о-рецепторов при лечении приступа мигрени.

ВЫВОДЫ

1. Изучение связи между структурой и серотонинергической цереброваскулярной активностью среди новых производных тропана позволило выявить соединения с антагонистической и агонистической активностью. Соединение JIK-728 обладает выраженной антисеротониновой цереброваскулярной активностью, сопоставимой с тропоксином, тогда как ЛК-769, напротив, усиливает реакции сосудов мозга на серотонин, что свидетельствует о его агонистических свойствах по отношению к серотонину, характерных для известного противомигреневого препарата -суматриптан.

2. Суматриптан и соединение JIK-769, в отличие от серотонина, оказывают двухфазное влияние на кровоснабжение коры головного мозга интактных животных - первоначальное снижение уровня кровоснабжения мозга сменяется последующим его увеличением, что играет важную роль в механизме противомигреневого эффекта суматриптана.

3. С помощью микроионофоретической техники установлено, что тропоксин является блокатором 5НТ-рецепторов возбуждающего (деполяризующего) типа, которые локализованы на нейронах сенсомоторной коры головного мозга.

4. Для максимального проявления нейротропной антисеротониновой активности тропоксина необходимо сохранение конформации всей молекулы, так как угнетающий эффект его фрагментов выражен в меньшей степени.

5. В опытах in vitro и ex vivo тропоксин проявляет выраженную антиагрегационную активность, сопоставимую с дипиридамолом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Согласно статистике мигренью страдает от 3 до 16% населения развитых стран Европы и Америки, из которых 18% женщин, 6% мужчин и 4 % детей. В основном, это лица трудоспособного возраста - 35-40 лет, число которых в последние годы возрастает. В связи с этим изыскание и изучение фармакологических средств лечения больных мигренью является одной из важнейших проблем современной медицины.

Мигрень является заболеванием, обусловленным наследственно детерминированной дисфункцией вазомоторной регуляции, проявляющейся пароксизмальными приступами головной боли пульсирующего характера, чаще в одной половине головы. Несмотря на значительный прогресс в понимании патогенеза этого заболевания, многие аспекты этого страдания остаются невыясненными. Не вызывает сомнений тот факт, что серотонин играет существенную роль в реализации приступа мигрени, так как этот нейромедиатор, с одной стороны, оказывает выраженное влияние на мозговые сосуды, с другой - участвует в проведении болевых импульсов. Для понимания генеза этого заболевания предложены три гипотезы. Это сосудистая, нейрогенная и тригеминоваскулярная гипотезы, которые отличаются друг от друга первичным характером сосудистого или нейрогенного компонента в реализации приступа мигрени. Таким образом, можно заключить, что сосуды мозга и серотонин являются общепризнанными факторами, которые лежат в основе патогенеза этого заболевания. Поэтому для лечения больных мигренью наиболее успешно применяются препараты, обладающие способностью воздействовать на серотониновые рецепторы сосудов мозга, стимулируя или угнетая эти рецепторы. Однако имеющиеся в распоряжении клиницистов серотонинергические препараты не всегда отличаются высокой эффективностью и обладают выраженными нежелательными побочными свойствами. Этим обусловлена актуальность исследований, посвященных поиску новых серотонинергических препаратов для профилактики и лечения приступа мигрени.

В настоящее время в ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН разрабатывается оригинальный антагонист серотонина - тропоксин (гидрохлорид 3-(3,4,5-триметоксибензоил-оксиимино)-8-метил-8-азабицикло [3,2,1] октана), который, блокируя 5НТ2 - рецепторы сосудов мозга, предупреждает развитие констрикторных реакций мозговых сосудов, вызванных серотонином.

Вышеизложенное явилось основанием для дальнейшего изыскания новых противомигреневых препаратов среди производных тропана и изучения особенностей противомигреневого эффекта тропоксина, многие стороны механизма действия которого продолжают оставаться невыясненными. В частности, отсутствуют сведения о механизме нейронального действия тропоксина и не выяснена роль фрагментов молекулы препарата в реализации его антисеротониновой активности.

Исследование было начато со скрининга вновь синтезированных производных тропана на модели констрикторных реакций сосудов мозга, вызванных серотонином. Для этой цели в отделе химии ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН ведущим научным сотрудником, канд. хим. наук Л.М.Косточкой были синтезированы новые производные тропана с различными ароматическими заместителями в третьем положении кольца. С целью повышения устойчивости к биотрансформации тропоксина и увеличения длительности его эффекта было синтезировано соединение под шифром ЛК-728, у которого в отличие от тропоксина тропинон и 3-метоксибензойная кислота соединены через амидную связь, а не сложно-эфирную как в тропоксине.

Проведенные опыты позволили установить, что ЛК-728 в дозах 5 и 10 мг/кг так же, как и тропоксин, обладает выраженной антисеротониновой цереброваскулярной активностью. Оказалось, что через 20 минут после внутривенного введения соединения Ж- 728 существенно ослабляются, а к концу эксперимента полностью устраняются серотониновые спазмы сосудов мозга, а также реакции артериального давления на серотонин. Показано, что эффект соединения JIK-728 является более продолжительным (в течение 2-х часов) по сравнению с тропоксином.

При изучении влияния соединения JIK-728 и тропоксина на локальный мозговой кровоток у интактных крыс было показано, что оба вещества сразу же после введения вызывают снижение мозгового кровотока, т.е. вызывают повышение тонуса сосудов мозга, что характерно для серотонина. Это позволяет предположить, что наряду с антисеротониновой активностью, указанные соединения первоначально стимулируют серотониновые рецепторы.

Далее было синтезировано другое производное тропана под шифром ЛК-769, где в качестве заместителя в третьем положении кольца была использована 1 -(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1 Н-индол-3 -уксусная кислота (индометацин). Индометацин, угнетая активность циклооксигеназы и снижая синтез простагландинов, обладает противовоспалительным и анальгетическим действием. По-видимому, эти свойства индометацина лежат в основе его применения у больных мигренью, так как в литературе мы не обнаружили сведений о его влиянии на серотонинергическую систему. Важно также отметить, что в индольном фрагменте индометацина, в отличие от серотонина, оксигруппа в 5 положении кольца заменена на метокси группу. Можно было допустить, что использование в качестве заместителя в третьем положении тропанового кольца 1-(4-хлорбензоил)-5-метокси-2-метил-1 Н-индол-3-уксусной кислоты, где метокси группа находится в 5 положении индольного фрагмента, будет способствовать проявлению агонистических свойств по отношению к серотониновым рецепторам. На это указывает также наличие метансульфонамидной группы в 5 положении индольного кольца агониста серотониновых рецепторов -суматриптана. Здесь уместно также отметить, что одно из производных тропана, включающее в себя индольный гетероцикл - препарат трописетрон является антагонистом серотонина.

Изучение влияния соединения JIK-769 на модели констрикторных реакций сосудов мозга, вызванных серотонином, показало, что это производное тропана, в отличие от известных тропановых производных, которые обладают антисеротониновой активностью, напротив, усиливает констрикторные реакции сосудов мозга, вызванные серотонином. В соответствии с этим, было изучено влияние известного агониста 5НТш/о -рецепторов суматриптана на констрикторные реакции сосудов мозга, вызванные серотонином, в сопоставлении с эффектами соединения JIK-769. Проведенные опыты позволили установить, что суматриптан в большинстве экспериментов вдвое усиливает снижение мозгового кровотока, вызванное серотонином. Если серотонин в контроле вызывает уменьшение локального мозгового кровотока у крыс в среднем на 17,0±2,9%, то после введения суматриптана снижение кровотока под влиянием серотонина составляло в среднем 34,0±4,9%, Р<0,01). Суматриптан не оказывает влияние на реакции артериального давления, вызванные серотонином. Аналогичное действие на цереброваскулярные эффекты серотонина оказывает и JIK-769, который также существенно усиливает констрикторное влияние серотонина на сосуды мозга. Так, через 20 минут после введения соединения ЛК-769 серотонин вызывает уменьшение локального мозгового кровотока на 32,0±2,9% (контроль 18,0±2,5%, Р<0,01). Следует отметить, что соединение ЛК-769, в отличие от суматриптана, ослабляет реакции артериального давления на серотонин. Полученные данные показывают, что как соединение JIK-769, так и суматриптан усиливают реакции сосудов мозга на серотонинн, т.е. обладают агонистическими свойствами по отношению к серотониновым рецепторам сосудов мозга.

Обнаружена способность суматриптана и соединения ЛК-769 оказывать двухфазное влияние на кровоснабжение коры головного мозга интактных животных - первоначальное снижение уровня кровоснабжения мозга с последующим его существенным увеличением, что, по-видимому, также играет важную роль в механизме противомигреневого эффекта суматриптана.

Таким образом, среди производных тропана выявлены новые соединения, которые проявляют как антагонистические, так и агонистические по отношению к серотониновым рецепторам сосудов мозга свойства. Необходимо продолжить исследовательские работы по выявлению особенностей действия этих производных и их отличий от известных препаратов, для того, чтобы решить вопрос о целесообразности разработки на их основе новых лекарственных препаратов.

Вторая часть настоящего исследования посвящена дальнейшему изучению механизма действия тропоксина, в частности, углубленному изучению его нейронального эффекта. Согласно нейрональной гипотезе патогенеза мигрени серотонин, выделяющийся из пресинаптических терминалий в периваскулярные пространства коры головного мозга, может вызывать не только спазм сосудов мозга, но участвовать в реализации болевой реакции - одного из основных симптомов мигрени. Известно, что кора головного мозга является последним пунктом ноцицептивных нервных путей, ответственных за субъективное ощущение боли. Вместе с тем, периферическая серотониновая рецепция подобна таковой в неокортексе, что делает последний удобным объектом для изучения механизма действия антисеротониновых лекарственных препаратов. Введение же химических агентов в ток крови может вызывать отраженные, непрямые эффекты на нервную систему регуляции сосудов мозга, опосредуемые внешними экстраваскулярными структурами, в том числе и центральной нервной системой. Для того, чтобы судить о непосредственном воздействии препаратов на неокортекс в настоящем исследовании была использована техника микроионофореза.

Проведенные опыты позволили установить, что наиболее сильным угнетающим действием на спонтанную активность корковых нейронов обладает кетансерин, за ним следуют тропоксин и метисергид. Тропоксин оказывал выраженное угнетающее влияние на возбуждающие (деполяризующие) 5НТ-ответы серотониновых рецепторов, локализованных на нейронах сенсомоторной коры головного мозга. По влиянию как на спонтанную активность нейронов, так и на 5НТ-ответы возбуждающего типа ципрогептадин существенно уступает указанным выше препаратам. Следовательно, из всех исследованных блокаторов 5НТ2-рецепторов тропоксин наиболее близок к метисергиду. Известно, что метисергид является одним из противомигреневых препаратов, который эффективно блокирует реакции сосудов головного мозга на серотонин и (Ганьшина Т.С., 2004). Таким образом, тропоксин является блокатором 5НТ-рецепторов возбуждающего (деполяризующего) типа, локализованных на нейронах сенсомоторной коры головного мозга.

Далее представлялось важным выяснить с каким участком молекулы тропоксина связан вышеуказанный эффект. Известно, что тропан включен в структуру многих веществ, обладающих значительной нейро- и психотропной активностью. К таковым следует в первую очередь отнести кокаин, экгонин, атропин и др. Еще в 1954г. Gaddum J.H. и Hamed К.А. обнаружили антисеротониновую активность кокаина на кишке морской свинки. Позже такой же эффект кокаина был обнаружен на других тканях, в частности, на клетках нервной системы. Исходя из этого, позднее был синтезирован ряд блокаторов серотониновых рецепторов, содержащих бицикл тропана с различными заместителями в 3-м положении: трописетрон, MDL 72222, BRL 43694 и др. У этих веществ найдена или предполагается многообразная нейротропная активность: антипсихотическая, анксиолитическая, анальгетическая, противорвотная и др. (Peroutka S.J., 1988; Waiting K.J., 1989). Места радиолигандного связывания указанных веществ обнаружены в коре большого мозга (Peroutka S.J., Hamik А., 1988).

Триметоксибензоат - другой фрагмент молекулы тропоксина, также входит в состав многих известных нейро- и психотропных веществ, таких как мескалин, резерпин, френолон, триметоксин (триоксазин) и др. Об антисеротониновых свойствах триметоксибензоата и упомянутых соединений литературных данных нет.

Маловероятна значительная роль иминового фрагмента молекулы тропоксина в его антисеротониновом эффекте. Подтверждением этого, а также важной роли тропана в антисеротониновом эффекте тропоксина может служить тропафен - блокатор серотониновых рецепторов, содержащий в своей структуре тропан. Несмотря на отсутствие в его молекуле триметоксибензоата и имино - фрагмента, он эффективно блокирует сосудо -и бронхосуживающее действие серотонина (Машковский М.Д., Шварц Г.Я., 1979). Триметоксибензоат и иминогруппа также отсутствуют в молекулах упомянутых блокаторов серотониновых рецепторов тропанового ряда: трописетрона и др.

Исходя из вышесказанного, были исследованы фрагменты молекулы тропоксина: тропановый бицикл и ароматическая часть - 3-метоксибензойная кислота (натриевая соль). Оказалось, что как тропоксин, так и основные структурные компоненты его молекулы - тропан и 3-метоксибензойная кислота являются блокаторами рецепторов постсинаптической мембраны нейронов коры большого мозга, чувствительных к серотонину. Все три вещества в зависимости от дозы уменьшают лишь возбуждающие ответы клеток на микроионофоретически подводимый серотонин, выражающиеся в увеличении частоты потенциалов действия нейронов. Однако, наибольшей антисеротониновой активностью обладал тропоксин. Антагонизм с серотонином проявляют также тропан, и в меньшей степени, 3-метоксибензойная кислота. Можно полагать, что антисеротониновая активность тропоксина обусловлена преимущественно тропановой частью его молекулы. Однако, для максимального проявления антагонизма с серотонином необходимо сохранение конформации всей молекулы тропоксина. Только в этом случае может быть обеспечена ее наибольшая комплементарность к серотониновым рецепторам.

Заключительный раздел диссертационного исследования посвящен изучению антиагрегационной активности тропоксина. Хорошо известно, что серотонин является не только важным патогенетическим звеном приступа мигрени, но и сильным естественным проагрегантом. Поэтому способность препаратов ингибировать агрегационную способность тромбоцитов является важной составляющей эффективности противомигреневых средств. Серотонин, связываясь со специфическими 5-HT2 рецепторами, усиливает агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ, тромбином, коллагеном, адреналином, арахидоновой кислотой и другими агонистами. Для лечения больных мигренью широко используются блокаторы 5НТ2-рецепторов -метисергид и пизотифен. Из литературы известно, что эти препараты обладают антиагрегационными свойствами. Инкубирование тромбоцитов с метисергидом приводит к ингибированию агрегации, индуцированной арахидоновой кислотой, и реакции высвобождения (Li B.Y. et al.,1998). Показано, что пизотифен также как и метисергид уменьшает АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека, стимулированную серотонином (Hladovec J., 1986). Эффективность пизотифена продемонстрирована не только в опытах in vitro, но и in vivo. Снижение спонтанной агрегации тромбоцитов выявлено у пациентов, получавших пизотифен в течение двух месяцев (Mazal S., Rachmilewitz Е.А.,1980).

Вышеизложенное явилось основанием для изучения влияния противомигреневого препарата и антагониста 5-НТ2-рецепторов -тропоксина - на агрегационную активность тромбоцитов. Исследовалось влияние тропоксина как на параметры агрегации in vitro, так и проводилось изучение влияния тропоксина на агрегацию тромбоцитов ex vivo, где его действие сравнивали с антиагрегационным эффектом дипиридамола -препаратом, который часто применяется в клинической практике для ингибирования тромбоцитарного взаимодействия. Инкубирование богатой тромбоцитами плазмы вместе с тропоксином приводило к достоверному снижению АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов in vitro во всем диапазоне изученных концентраций. При этом заметное ингибирование агрегации наблюдалось только при высоких концентрациях тропоксина. Более выраженный антиагрегационный эффект был выявлен у тропоксина (в концентрациях 2-7 мг/мл) при агрегации, индуцированной адреналином. Следовательно, тропоксин в опытах in vitro достоверно ингибирует агрегацию, индуцированную АДФ и адреналином. Как известно, под влиянием проагрегантов происходит активация тромбоцитов, в ходе которой развивается экзоцитоз множества вешеств, стимулирующих агрегационный процесс. В том числе из плотных тромбоцитарных гранул высвобождается серотонин, который затем связывается с 5-НТ2-рецепторами и, таким образом, стимулирует активность тромбоцитов. По-видимому, тропоксин, являясь антагонистом 5НТ2-рецепторов (Ганьшина Т.С., 2003) блокирует взаимодействие серотонина с одноименным рецептором и снижает способность тромбоцитов к агрегации. Выявленная в наших экспериментах способность тропоксина уменьшать скорость агрегации тромбоцитов, индуцированной адреналином, при инкубировании богатой тромбоцитами плазмы с этим препаратом указывает на наличие у него механизма, сопряженного с влиянием на реакцию высвобождения. Необходимо подчеркнуть, что тропоксин достоверно ингибирует АДФ-индуцированную агрегацию во всем диапазоне исследованных концентраций, в то время как подавление адреналин-индуцированной агрегации наблюдается только при высоких дозах. Этот эффект, по-видимому, обусловлен различной природой тромбоцитарной активации, которые инициируются АДФ и адреналином, в частности, участием пуринергических механизмов и агд-адренорецепторов (Casserly I.P., Topol E.J., 2002).

Изучение влияния тропоксина на агрегационную способность тромбоцитов ex vivo позволило установить, что тропоксин через 45 мин после инъекции приводит к снижению агрегации тромбоцитов. Действие препарата сохранялось в течение 30 мин и прекращалось спустя 90 мин после его введения. Антиагрегационный эффект тропоксина сопоставляли с ингибирующим влиянием дипиридамола, механизм действия которого хорошо известен. Антиагрегационный эффект дипиридамола связан с его способностью избирательно угнетать активность цГМФ-зависимую фосфодиэстеразы 5 типа и потенцировать действие N0 на тромбоциты (Aktas В., 2003). Опыты показали, что дипиридамол вызывает угнетение функциональной активности тромбоцитов в 1,2-1,7 раза, тогда как под влиянием тропоксина наблюдается уменьшение агрегационной активности тромбоцитов в 1,2-1,4 раза по сравнению с контрольной величиной.

Следовательно, противомигреневый препарат и антагонист бШУ рецепторов тропоксин наряду с выраженной цереброваскулярной антисеротониновой активностью обладает антиагрегационными свойствами, сопоставимыми с ингибирующим влиянием дипиридамола.

Таким образом, среди вновь синтезированных производных тропана выявлены как антагонист, так и агонист серотониновых рецепторов. Антисеротониновые цереброваскулярные свойства, обнаруженные у соединения JIK-728, которое существенно ослабляет констрикторные реакции сосудов мозга и изменения артериального давления, вызванные серотонином, сравнимы с тропоксином. Другое производное тропана - JIK-769, напротив, усиливает реакции сосудов мозга на серотонин, что свидетельствует о его агонистических свойствах по отношению к серотониновым рецепторам. Действие этого соединения сопоставимо с известным агонистом серотониновых рецепторов суматриптаном. Суматриптан и соединение ЛК-769 оказывают двухфазное влияние на кровоснабжение коры головного мозга интактных животных -первоначальное снижение уровня кровоснабжения мозга с последующим его существенным увеличением, что, по-видимому, может играть важную роль в механизме противомигреневого эффекта суматриптана. Использование микроионофоретической методики позволило установить, что тропоксин является блокатором 5НТ-рецепторов возбуждающего (деполяризующего) типа, которые локализованы на нейронах сенсомоторной коры головного мозга. Максимальное проявление нейротропной антисеротониновой активности характерно для всей молекулы тропоксина, так как эффект его фрагментов выражен в меньшей степени. В опытах in vitro и ex vivo обнаружена выраженная антиагрегационная активность противомигреневого препарата - тропоксин, сопоставимая с эталонным антиагрегантом -дипиридамолом.