Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Разработка методик анализа и изучение стабильности холина альфосцерата и мельдония в растворе для инъекций

Мудрецов:! Юлия Викторовна

РАЗРАБОТКА МЕТОДИК АНАЛИЗА II ИЗУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ ХОЛИ ПА АЛЬФОСЦЕРАТА И МЕЛЬДОНИЯ В РАСТВОРЕ ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙ

14.04.02 - Фармацешическан химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 7 ИЮЛ 2014 ШШ17П14 ^

Пятигорск - 2014

005550592

005550592

l'aôoia выполнена н Пятигорском медико-фармапсвчнческом инеппуге - фнли: I осударсткенного йюлжсч ного образовательного \чрсждения высш профессионального образования «Волгоградский гос\ дарственный меланине \HHBepenieii) .Мннистерс! на здравоохранения Российской Федерации. 1¡аучный руководитель кандидат фармацевтических наук

Сепченко Сергей Петрович

Официальные оппоненты:

Калёкии Роман Анатольевич - доктор фармацевтических наук, ФГКУ «Российсь центр судебно-медицинской экспертизы» Министерства здравоохранения Российа Федерации, старший научный сотрудник отдела судебно-химических и хими токсикологических научных и экспертных исследований.

Фомин Анатолий Николаевич - доктор фармацевтических наук, доцент. П»ОУ В Г «Ярославская государственная медицинская академия» Министерс, здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой фармацевтической токсикологической химии.

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацсвтическ академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Зашита состоится « /4 » сем/пЯ ?[lâs 2014 г. в /¿> ~~ часов

на заседании диссертационного совета Д 208.008.09 при ГБОУ ВПО Bo.ni'N Минздрава России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 1 I)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорского меди фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО ВолгГ.МУ Минздрава России на сайте http://www.pniedpharm.ru

Автореферат разослан _2014 г.

Ученый секретарь

У/

диссертационного совета f Ремезова Ирина 11етровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В настоящее время для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения широко используются ноотрошгые средства с различным механизмом действия. К таковым относятся препараты холина альфосцерата Кроме того, в медицинской практике для терапии данных заболеваний применяют препараты мельдония, которые улучшают метаболические процессы. В литературе имеются данные о совместном применении препаратов мельдония и холина альфосцерата в терапии острых и хронических нарушений мозгового кровообращения, поскольку, проявляя различную фармакологическую активность, они способны дополнять и потенцировать действие друг друга Особое значение имеют инъекционные лекарственные формы, поскольку при этом достигается максимальная биодоступность, что особенно важно в терапии острых состояний.

Таким образом, создание нового комбинированного лекарственного препарата на основе мельдония и холииа альфосцерата в виде раствора для инъекций является актуальной задачей. При этом помимо решения технологических вопросов необходима также разработка надежных методов оценки его качества Поскольку методики анализа исследуемых веществ различны, необходимо использование универсальных методов, позволяющих вести анализ обоих веществ в одной пробе.

В связи с тем, что мельдоний и холина апьфосцерат не имеют в своей структуре хромофорных групп, их детектирование в УФ области спектра невозможно. Известны методики анализа холина альфосцерата методом ВЭЖХ с использованием рефрактометрического или масс-спектрометрического детекторов. Однако, данные методы требуют использования уникального и дорогостоящего оборудования.

Альтернативным методу ВЭЖХ в современной практике считается метод капиллярного электрофореза, который позволяет с помощью косвенного детектирования определять вещества, непоглощающие в УФ области спектра.

Поэтому, для разработки методики анализа холина альфосцерата мельдония при их совместном присутствии в лекарственных препарат целесообразным является использование метода капиллярного электрофоре Учитывая, что помимо идентификации и количественного определения е одним немаловажным показателем качества лекарственных препаратов являе контроль содержания в них посторонних примесей, не менее актуальным являе изучение стабильности мельдония и холина альфосцерата в растворе , инъекций и условий, в которых данные вещества подвергаются деструкции.

Степень разработанности. Аналогам предлагаемого препарата являе фармацевтическая композиция, содержащая 3-оксипиридин и холи альфосцерат, дополнительно содержащая производное магния, пиридокс! никотинамид, идебенон, убихинон (коэнзим С>10) производное цинка (патент ] №2385722). Наиболее близкой к предлагаемому препарату является композици форме раствора для инъекций, содержащая в качестве активного ингредиен холина альфосцерат и в качестве носителя - повидон (патент 1Ш №2406506). доступных источниках отсутствуют сведения о содержании указанн комбинации холина альфосцерата и мельдония в выпускаемых разрабатываемых лекарственных препаратах, а также разработанной методики \ анализа при совместном присутствии.

Цель и задачи. Цель работы заключалась в разработке методик анали холина альфосцерата и мельдония при совместном присутствии, стандартизация изучение стабильности раствора для инъекций, содержащего холина альфосцер и мельдоний.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд задач:

• изучить возможности использования методов капиллярного зонно электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии дл установления подлинности и количественного определения холина апьфосцера и мельдония;

• изучить факторы, влияющие на поведение холина альфосцерата I

мельдония в условиях мицеллярной электрокинетической хроматографии,

4

целью оптимизации условий их электрофоретического разделения;

• с использованием выбранных условий разработать методику установления подлинности и количественного определения холина альфосцерата и мельдония при совместном присутствии в растворе для инъекций;

• осуществить валидационную оценку разработанной методики количественного определения холина альфосцерата и мельдония по показателям: специфичность, линейность, прецизионность, правильность, диапазон применения и робастность;

• разработать методики определения посторонних примесей холина альфосцерата и мельдония при их совместном присутствии в растворе для инъекций и провести ее валидационную оценку;

• с использованием стресс-тестов изучить процесс деструкции холина альфосцерата и мельдония при совместном присутствии в растворе для инъекций.

• провести исследования по стандартизации раствора для инъекций, содержащего холина альфосцерат и мельдоний;

• с использованием метода «ускоренного старения» лекарственных средств шучитъ стабильность раствора для инъекций, содержащего холина альфосцерат и мельдоний;

• в экспериментах на животных провести первичную фармакологическую оценку ноотропного и нейропротекторного действия раствора для инъекций, содержащего холина альфосцерат и мельдоний.

Научная новизна. На примере холина альфосцерата и мельдония теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены подходы для электрофоретического разделения цвиттер-ионных соединений. Показано, что в условиях использования мицеллярной электрокинетической хроматографии в боратном электролите возможно разделение как заряженных (холина альфосцерат), так и электронейтральных (мельдоний) цвиттер-ионных соединений. В качестве мицеллообразуюшей добавки необходимо использование натрия додецилсульфата в концентрации не менее 75 мМ.

Установлено, что повышение чувствительности анализа цвиттер-ионны веществ (в случае отсутствия хромофорных групп) возможно путем применен! косвенного детектирования, где в качестве оптимального хромофора выбран кислота ацетилсалициловая, обеспечивающая наилучшие услови детектирования.

Впервые предложена фармацевтическая композиция в форме раствора д/ инъекций, обладающая ноотропной и нейропротекторной активности содержащая холина альфосцерат и мельдоний.

На основе выбранных условий предложена методика анализа холин альфосцерата и мельдония в растворе для инъекций, валидационная оценк которой показала ее соответствие обоснованным критериям приемлемости п всем показателям: специфичность, линейность, прецизионность, правильность диапазон применения и робастность.

Проведено изучение стабильности раствора для инъекций, содержащег мельдоний и холина альфосцерат. При этом установлены сроки его годности которые составляют 2 года

Впервые, с использованием различных стресс-тестов, изучена кинетик процесса деструкции холина альфосцерата и мельдония. С помощью метода масс спектрометрии идентифицированы основные продукты деструкции холин альфосцерата и мельдония.

В опытах на животных изучена фармакологическая активность предлагаемого комплексного раствора для инъекций, в сравнении с холин альфосцератом и мельдонием, применяемыми по отдельности. Полученные данные свидетельствуют о потенцировании ноотропного и нейропротекторного действия веществ в полученной композиции.

Теоретическая и практическая значимость работы. Разработанная методика анализа с использованием капиллярного электрофореза может быть использована для качественного и количественного определения холина альфосцерата и мельдония в растворе для инъекций при их совместном присутствии. При проведении вапидации разработанной методики изучена

6

возможность построения контрольных карт Шухарта в оценке ее робастности. При этом выбраны условия, при которых достигается максимальная стабильность результатов в условиях использования мицеллярной электрокинетической хроматографии.

Полученные результаты по использованию мицеллярной электрокинетической хроматографии, а также варианта косвенного детектирования в анализе холина альфосцерата и мельдония могут быть применены для изучения электрофоретического поведения других лекарственных средств, являющихся цвиттер-нонами.

В Федеральную службу по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам подана заявка на изобретение фармацевтической композиции в форме раствора для инъекций, содержащего холина альфосцерат и мельдоний.

Методология и методы исследования. Для разработки методики количественного определения холина альфосцерата и мельдония при совместном присутствии в растворе для инъекций использовался метод капиллярного электрофореза в различных вариантах. Изучение процессов деструкции и стабильности холина альфосцерата и мельдония при совместном присутствии в растворе для инъекций проводили с применением методов мицеллярной электрокинетической хроматографии, тонкослойной хроматографии, а также методом ВЭЖХ-МС.

Положения, выносимые на защиту:

• исследования по разработке и вапидации методики количественного определения холина альфосцерата и мельдония при совместном присутствии в растворе для инъекций;

• результаты проведения процедуры стандартизации раствора для инъекций, содержащего холина альфосцерат и мельдоний;

• результаты исследования процессов деструкции и стабильности холина альфосцерата и мельдония при совместном присутствии в растворе для инъекций;

• данные по первичной фармакологической оценке ноотропного и

7

нейропротекторного действия раствора для инъекций, содержащего холин альфосцерат и мельдоний.

Степень достоверности и апробация результатов. Основные положеш диссертационной работы доложены па региональных конференциях по фармаци (Пятигорск, 2013 и 2014 гг.), а также на 2-й Всероссийской конфсрснци «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, мс 2013 года).

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 -журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

По результатам работы совместно с ООО «ФармИнтеллект» разработ проект ФСП на «Холина альфосцерат + Мельдоний», раствор для инъекций 4 м Данный проект был апробирован в ГУП РО «Фармацевтический центр» ( Ростов-на Дону).

Разработано информационное письмо на методику анализа мельдония холина альфосцерата при их совместном присутствии в растворе для инъекцш Методика апробирована ФГБУ «Информационно-методический центр п экспертизе, учету и анализу обращения средств медицинского применения Росздравнадзора (г. Ростов-на-Дону).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

Описана общая характеристика и применение холина альфосцерата мельдония в терапии острых и хронических нарушений мозговог кровообращения. Рассмотрены способы анализа четвертичных аммониевы оснований и цвиттер-ионов. Проведен анализ литературных данных о использовании методов капиллярного электрофореза и масс-спектрометрии анализе исследуемых веществ.

Экспериментальная часть

При разработке методики использовали рабочие стандартные образцы (PCO) холина альфосцерата гидрата (далее холина альфосцерат) и мельдония дигидрата (далее мельдоний), производства ООО «БИОН», г. Москв

8

предоставленные ООО «ФармИнтеллекг», г. Москва

В работе использовали систему для капиллярного электрофореза «Капель 103Р» производства фирмы «Люмэкс» со спектрофотометрнческим детектором (фиксированная длина волны 254 нм) и кварцевым капилляром длиной 65 см, эффективной длиной 55 см и диаметром 50 мкм. Ввод пробы осуществляли под давлением. Режим ввода пробы 30 мБар, 5 с. Масс-спектрометрический анализ осуществляли на квадрупольном масс-анапизаторе типа «ионная ловушка» (Amazon SL, производства фирмы Bruker, Германия), оснащенном источником ионов с электрораспылительной ионизацией при атмосферном давлении, автосамплером и программным обеспечением обработки данных Data analysis. Ионизацию осуществляли электрораспылением при атмосферном давлении в режиме регистрации положительных ионов. Напряжение на капилляре и противоэлектроде составляло 4,0 кВ и 500 В соответственно. Давление на распылителе составляло 1 атм. Скорость потока газа-осушителя (азот) - 5 л/мин. Температура в камере ионизации - 220°С.

Разработка методики. Изучение электрофоретичсской подвижности холина апьфосцерата и мельдония в условиях капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) показало, что холина альфосцерат в щелочном электролите мигрирует в катодную область капилляра после пика веществ, мигрирующих со скоростью электроосмотического потока (ЭОГТ), что может свидетельствовать о том, что в этих условиях холина альфосцерат ионизируется и приобретает отрицательный заряд, в то время как мельдоЕшй в щелочном электролите практически не ионизируется и, являясь электронейтральным, мигрирует со скоростью ЭОП. Это делает невозможным анализ исследуемых веществ методом КЗЭ и требует оптимизации условий. Далее для определения мельдония и холина альфосцерата использовался метод мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), применяемый для эффективного разделения как заряженных, так и нейтральных молекул. В качестве поверхностно-активной добавки обычно используется додецилсульфат натрия (ДДСН), образующим отрицательно заряженные мицеллы.

Рисунок 1 - Электрофореграмма раствора холина альфосцерата (2)

мельдоиия (1) в боратном буфере с добавлением 75 мМ ДДСН

Концентрация ДДСН варьировалась от 10 до 125 мМ. При это

установлено, что концентрация 75 мМ является оптимальной для разделени

указанных веществ (рисунок 1).

Выбор концентрации ведущего электролита и величин

прикладываемого напряжения. Следующим этапом оптимизации уеловi

анализа явилось изучение влияния концентрации ведущего электролита, а тагок

величины прикладываемого напряжение на разделение анализируемы

компонентов. В результате варьирования концентрацией электролита от 5 до 3

мг/мл и напряжением от 16 до 25 кВ, установлено, что оптимальныг.

параметрами являются: концентрация ведущего электролита 20±5 мг/мл

напряжение 20±2 кВ.

Так как холина альфосцерат и мельдоний являются веществами, в структур

которых отсутствуют хромофоры, их детектирования по поглощению в У

области спектра затруднено. В мировой практике для анализа подобных вешест

применяют косвенное детектирование. Поскольку анализ ведется пр

фиксированной длине волны (254 нм), то в состав ведущего электролита вводите

легко обнаруживаемое (детектируемое) при 254 нм вещество в концентрации

обеспечивающей необходимую оптическую плотность исходного электролита

качестве хромофора в составе ведущего электролита были выбраны кислота

бензойная, кислота салициловая, кислота ацетилсалициловая, натриевая соль

кислоты п-аминосалициловой и калия гидрофталата. Спектрофотометрически

10

были определены молярный коэффициент светопоглощения и удельный коэффициент светопоглощения выбранных веществ в боратном электролите. При этом установлено, что наибольшие значения показателей поглощения в боратом буфере наблюдаются у калия гидрофталата и кислоты ацетилсалициловой. Было также изучено влияние указанных хромофоров на такие электрофоретические характеристики холина альфосцерата и мельдония как площадь и асимметрия пика, что подтвердило ранее полученные данные о том, что наибольшим поглощением в УФ области обладают калия гидрофталат и кислота ацетилсалициловая. Однако, при относительно небольшой разнице в значениях площадей пиков анализируемых веществ, значение асимметрии пиков близко к оптимальному при использовании в качестве поглощающего компонента кислоты ацетилсалициловой. Кроме того, при использовании в качестве хромофора калия гидрофталата базовая линия менее стабильна, что может отрицательно сказаться на результатах анализа определяемых веществ. При использовании же в качестве хромофора кислоты ацетилсалициловой данной проблемы не возникает (рисунок 2).

шАО

3 1

тА1Т;

) 4

13 14 15 16 5,1111 _

Рисунок 2 - Электрофореграммы холина альфосцерата (2) и мельдония (1), в боратном буфере: а) с добавлением кислоты ацетилсалициловой; (б) с добавлением калия гидрофталата

Водный раствор холина альфосцерата и мельдония был проанализирован в буферных растворах, содержащих в качестве хромофора кислоту ацетилсалициловую в концентрациях 5, 10, 15, 20, 30, 35, 40 и 45 мМ Из полученных результатов следовало, что добавка кислоты ацетилсалициловой в

концентрации 30 мМ является оптимальной, так при этом достигалис максимальные значения площадей пиков для обоих компонентов.

Суммируя полученные данные об условиях, обеспечивающих оптимально разделение мельдония и холима альфосцерата, была разработана методи качественного и количественного определения исследуемых веществ в раство для инъекций, содержащем 10 г мельдония дигидрата, 25 г холина альфосцерат гидрата и воды очищенной до 100 мл.

Валидацнонная оценка разработанной методики. Методика анапи мельдония и холина альфосцерата в растворе для инъекций методо капиллярного электрофореза была валидирована по показателям: специфичност линейность, прецизионность, правильность, диапазон применения и робастность.

При определении специфичности времена миграции растворов СО мельдош и холина альфосцерата совпадали с временами миграции мельдония и холин альфосцерата в испытуемых растворах. На электрофореграмме растворител (раствора blank) нет мешающих пиков в зоне миграции определяемы компонентов. Результаты валидационной оценки разработанной методик показывают ее приемлемость по всем валидационным показателям (таблица 1).

Таблица 1 - Результаты валидационных показателей методики количественного определения мельдония и холина альфосцерата

Показатель Результат Критерии

Мельдоннй Холина альфосцерат приемлемости

Линейность у=1,0160х г = 0,9942 у=2,9448х г = 0,9994 г > 0,9900

Прецизионность SD=0,004423 RSD=0,88% SD=0,004808 RSD=0,96% RSD < 2,8%.

Правильность Rcp = 100,6% RSD=3,27% Rcp = 100,4% RSD=1,64% Rcp от 98 до 102,0%; RS D < 2,8%.

Диапазон применения 50-150% 50-150% От 80% до 120% от номинального содержания.

Для определения робастности разработанной методики количественного определения холина альфосцерата и мельдония были использованы карты Шухарта, контрольные линии которых вычислялись с использованием ранее полученных статистических данных.

Помер под!рунпы

Рисунок 3 - А) Контрольные карты размахов для содержания мельдония; Б) Контрольные карты размахов для содержания холина альфосцерата.

Карты, представленные на рисунке 3, свидетельствуют о том, что разность между значениями открываемости мельдония и холина альфоцерата при анализе модельных смесей однородна в течение длительного времени, что позволяет говорить о стабильных показателях прецгоионности данной методики.

Для изучения изменений показателей правильности методики количественного определения мельдония и холина альфосцерата строили карты средних значений (рисунок 4).

Номер ПОЛ1"руиПЫ

г' 102

~ 1П1

о

7 10(1

2 90

'л

~ 9Я

10 15 20 15

Номер иолг руимы

Рисунок 4- А) Контрольные карты средних значений открываемости мельдония; Б) Контрольные карты средних значений открываемости холина альфосцерата. Как видно из рисунка 6, разброс средних значений открываемости однороден, ни одна из точек не выходит за пределы контрольных границ, и все

они расположены равномерно относительно центральной линии. Это говорит стабильности показателя правильности.

Установлено, что методика анализа мельдония и холина апьфосцерата растворе для инъекций при изменяющемся факторе «время» робастна

Определение посторонних примесей в комплексном препарат мельдония и холина альфосцерата методом ТСХ. Учитывая, что методи анализа холина альфосцерата и мельдония с использованием МЭКХ с косвенны детектированием не позволяет контролировать содержания примесей разрабатываемом растворе для инъекций, в связи с ее недостаточно чувствительностью, целесообразным явилось использование метода ТСХ. Д этого в качестве неподвижной фазы использовались хроматографически пластины ЮеБе^е! 60 Р254 фирмы «Мегк», размером 20x20 см, в качеств подвижной фазы применялась система растворителей ацетон - спирт метиловый вода - кислота уксусная ледяная (5:4:2:2). Хроматографирование проводилос! восходящим методом при комнатной температуре (18-22°С) в камерах насыщенных парами системы растворителей. В качестве проявител использовался водный раствор калия пермангалата Для холина альфосцерат значение составило 0,25, а для мельдония - 0,55, что свидетельствует высокой специфичности методики в отношении анализа каждого из веществ. Учитывая отсутствие стандартных образцов примесей, контроль их содержания определялся с использованием соответствующих концентрациГ фармацевтических субстанций.

Изучение стабильности мельдония и холина альфосцерата. Как мельдоний, так и холина альфосцерат относят к высокостабильным веществам. Поэтому были изучены условия, в которых данные вещества подвергаются разложению с целью идентификации возможных продуктов деструкции. Испытания включали такие эффекты как воздействие температуры, влажности, окисления (перекись водорода) и гидролиз в агрессивной среде. В результате проведенных исследований было установлено, что мельдоний и холина альфосцерат остаются стабильными при их хранении как в нейтральных

условиях, так и в присутствии окислителя.

Изучение стабильности мельдония н холина альфосцерата в условиях кислотного гидролиза. Согласно рекомендациям международной конференции по гармонизации (ICH), для моделирования стресс-условий использовали хлористоводородную кислоту 0,1 М, 0,5 Ми 1 М при нагревании. Стабильность мельдония и холина альфосцерата оценивали по изменению площади пиков и, соответственно, концентрации анализируемых веществ в растворах.

шА1: шЛЧ I

II.*-

0.711.6 0.5 0.J CU U.2-

(1.1 ...........

im u'.e п.« и'.и 12*2 и'.« i:'.s Мн'н п.'« п.к и.о ш uj u.« u!« мл"""

Рисунок 5 - Элекгрофореграммы Рисунок 6 - Электрофореграммы

растворов мельдония (1), при нагревании растворов холина альфосцерата (1),

с хлористоводородной кислотой в без нагревания с кислотой (а) и при

концентрации 0,1 М (а), 0,5 М (б) и нагревании с кислотой

IM (в) хлористоводородной в концентрации

0,1 М(б), 0,5 М (в) и 1 М (г).

Из полученных электрофореграмм следует, что только в среде 1 М раствора хлористоводородной кислоты пик мельдония существенно уменьшился. Кроме того, наблюдалось появление сателлитного пика, что может свидетельствовать о наличии продукта деструкции. Анализ электрофореграмм холина альфосцерата показал, что при термостатировании его растворов в среде 0,1 М кислоты хлористоводородной площадь и характер пика остаются неизменными. При нагревании с кислотой хлористоводородной 0,5 М площадь пика холина альфосцерата существенно уменьшилась, а в 1 М растворе кислоты холина альфосцерат был разрушен окончательно. Однако, полученные электрофореграммы не позволяют определить примеси холина альфосцерата,

образующиеся в результате процесса деструкции.

Кроме того, при анализе исследуемых растворов методом ТСХ н хроматограмме мельдония при его гидролизе в среде 0,1 М и 0,5 М кислот хлористоводородной посторонних пятен не наблюдалось. При анализе и раствора мельдония, подвергшегося гидролизу в среде I М кислот хлористоводородной, на хроматограмме наблюдалось появлеш дополнительного пятна с Яг 0,45, что свидетельствовало о наличии продуг деструкции. На хроматограмме холина альфосцерата при его гидролизе в сре 0,1 М кислоты хлор истою до родной также не наблюдалось посторонних пяте При анализе раствора, термостатируемого в среде 0,5 и I М кисло хлористоводородной, на хроматограмме наблюдалось появлеш дополнительного пятна с И0,33, что свидетельствовало об образовании проду! деструкции. При анализе раствора модельной смеси, термостатируемого в сре 1 М кислоты хлористоводородной на хроматограмме наблюдалось появлени двух дополнительных пятен с ¡1г 0,45 и 0,33, что свидетельствовало о образовании тех же продуктов деструкции мельдония и холина альфосцерата.

Полученные результаты свидетельствует о способности методики разделя анализируемые компоненты и между собой и с возможными примесямг образующимися в процессе хранения. Это говорит о специфичности выбранны условий и обуславливает возможность использования данной методики дл контроля содержания посторонних примесей в растворе для инъекций.

Изучение процесса деструкции мельдония и холина альфосцерата. Д дальнейшего изучения процесса деструкции готовили растворы мельдония холина альфосцерата (5 мг/мл) в 1 М и 0,5 М растворах кисло-хлористоводородной соответственно и нагревали их на кипящей водяной бан варьируя временем от 10 до 60 минут, после чего каждый из анализируемы, растворов затем использовали для количественного определения, результать которого представлены в виде кинетических кривых (рисунок 7).

о 1(1 20 jo 40 ?<) 60 70 "л ю ni jfy ;n r,o

Нреми жен« пиши. мим Ирмя жпшишии.иш!

Рисунок 7 - Кинетические кривые мельдония (а) и холина альфосцерата (б) при действии на них кислоты хлористоводородной при нагревании

Анализ полученных кривых показывает, что процесс деструкции мельдония сопровождается расщеплением его структуры через две последовательных стадии с константами скорости 0,0305 мин"1 для первой стадии и 0,0544 мин"1 для второй, что может говорить о наличии нескольких примесей, образующихся в процессе деструкции мельдония. Процесс деструкции холина альфосцерата также сопровождается расщеплением его структуры через две последовательных стадии с константами скорости 0,0642 мин"1 для первой стадии и 0,0364 мин'1 для второй. Однако константа скорости на 1-м этапе существенно выше таковой на втором. Низкое значение константы скорости на втором этапе деструкции может говорить о том, что основной процесс разрушения проходит на первой стадии, а на второй происходит окончательный распад молекулы холипа альфосцерата и накопление примеси, образовавшейся на 1-м этапе. Исходя из химической структуры данного соединения наиболее вероятно образование в данных условиях продуктов деметшшрования как для мельдония, так и для холина альфосцерата.

Идентификацию продутсгов деструкции мельдония проводили путем сопоставления значений молекулярных масс этих соединений со значениями miz сигналов мхс-спектра. Масс-спектры, полученные в вышеописанных условиях, представлены на рисунке 8.

Интенсивность :-:104

4 (141.1)

2 (119,2)

i 3(127,2)

-JL_К И____

SÖ 90 100 110 120 130

Рисунок 8 - Масс-спектр примесей мельдония, полученный в результа деструкции.

Анализ ионного тока показал наличие двух примесей с молекулярн массой 104 и 118, что подтверждается также наличием аддукт-ионов молекулярной массой 127 и 141 (таблица 2).

Таблица 2 - Возможные примеси мельдония, образующиеся в процессе

хранения (деструкции)

Структурная формула Наименование Относительная молекулярная масса, Mr

HjC— NH—NH—СН,—сн,—С он 3-(2-метилгидразин) пропионовая кислота 118

HjN—NH—СН- СН2 С ОН 3-гидразинпропионовая кислота 104

Таким образом, в результате проведенного исследования установлено, ч потенциально возможными примесями, образующимися в процессе хранен! препаратов мельдония могут быть 3-(2-метилгидразин) пропионовая кислота и 3 гидразинпропионовая кислота.

Идентификацию продуктов деструкции холина апьфосцерата такж проводили путем сопоставления значений молекулярных масс этих соединений с< значениями ni/z+ сигналов масс-спектра.

Полученные масс-спектры, представлены на рисунке 9.

+ ESI TIC 1 (105,2)

IIiiTcncimiKR-Ti.

400 j 2441

30(1

200

100

о--------------------------------

244.1 244.2 244.3

Рисунок 9 - Масс-спектр примеси холина альфосцерата, полученной в результате деструкции

В результате деструкции холина альфосцерата в среде 0,5 М кислоты хлористоводородной образуется примесь с массой 243, что соответствует продукту, образующемуся на 1-м этапе деметилирования и имеющего формулу:

г г

N-CH-СН,—о—р—о—сн,—сн—снрн

HjC II

1 о

Таким образом, в результате проведенного исследования установлена структура продукта деструкции холина альфосцерата, который может являться потенциально возможной примесью, образующейся в процессе хранения.

Стандартизация комплексного препарата на основе мельдоння и холина альфосцерата. Были проведены исследования по стандартизации комплексного препарата в форме раствора для инъекций, содержащего 100 мг/мл мельдония дигидрата и 250 мг/мл холина альфосцерата гидрата объемом 4 мл по показателям: описание, подлинность, прозрачность, цветность, рН (потенциометрическое определение), механические включения, номинальный объем, испытание на чистоту и допустимые пределы примесей, количественное определение мельдония и холина альфосцерата, а также сроки годности (согласно ОСТ 42-91500.05.001-00). Полученные данные представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Стандартизация раствора для инъекций, содержащей мельдоний и холина альфосцерат____

Показатели качества

Описание

Подлинность

Прозрачность

Цветность

рН (потенциометрически)

Механические включения

Извлекаемый объем

Посторонние примеси

Требования

Прозрачная бесцветная жидкость

1. Пятна на хромато грамме препарата должны находить на уровне пятен на хроматограммах стандартных образц веществ свидетелей (СОВС) холина альфосцерата мельдония соответственно.

2. Времена миграции пиков мельдония и хол(н альфосцерата на элекгрофореграмме испытуемого раство должны соответствовать временам миграции пик веществ наэлектрофореграммеРСО_

Раствор должен быть прозрачным

Раствор должен быть бесцветным

6,5-7,5

В соответствии с РД 42-501-98

Не менее 4 мл

Единичная примесь - не более 2,0% для холина альфосцера и не более 0,5% для мельдония Сумма примесей - не более 2,5 %

Количественное определение холина альфосцерата

Количественное определение мельдония

Срок годности

От 0,2375 до 0,2625 г в 1 мл препарата

От 0,095 до 0,105 г в 1 мл препарата

2 года

Анализируемые образцы соответствовали требованиям по вс

показателям. Исследование стабильности и срока годности комплексно

препарата мельдония и холина альфосцерата в форме раствора для иггьекц

проводили методом ускоренного старения. Установлено, что исследуем

раствор остается стабильным в течение двух лет.

Изучение фармаколопгческих свойств комплексного препарата

основе мельдония и холина альфосцерата. Фармакологические исследован

проводились на кафедре биологии и физиологии Пятигорской ГФА п

руководством кандидата фармацевтических паук Дьяковой ИК

Нейропротекторный эффект оценивали по выживаемости животных пос

билатеральной окклюзии общих сонных артерий. Ноотропный эффект определя

20

с помошью теста экстраполяционного избавления, а также оценивая психоэмоциональную и исследовательскую активности животных. В группе животных, которым вводили композицию мельдония и холина альфосцерата наблюдались более высокие показатели двигательной и исследовательской активности через сутки после операции. Полученные данные свидетельствовали о потенцировании ноотропного и нейропротекторного действия веществ в полученной композиции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По результатам проведенных научных исследований можно сделать следующие выводы:

1. Изучено электрофоретическое поведение мельдония и холина альфосцерата в условиях капиллярного зонного электрофореза и МЭКХ. Установлено, что разделение указанных веществ достигается только в условиях использования МЭКХ.

2. Показано, что основными факторами, влияющими на подвижность анализируемых веществ, является концентрация мицеллообразующего компонента, концентрация ведущего электролита и прикладываемое напряжение. Повышение чувствительности анализа обоих веществ возможно путем использования косвенного детектирования, где в качестве оптимального хромофора была выбрана кислота ацетилсалициловая, обеспечивающая наилучшие условия детектирования.

3. В выбранных условиях разработана методика установления подлинности и количественного определения мельдония и холина альфосцерата при совместном присутствии в растворе для инъекций. Выполнена валидационная оценка разработанной методики по показателям специфичность, линейность, прецизионность, правильность, диапазон применения и робастность. Установлено, что методика соответствует критериям приемлемости по всем показателям.

4. Разработана методика установления подлинности и контроля содержания посторонних примесей в растворе для инъекций, содержащем мельдоний и холина альфосцерат методом ТСХ. Показана специфичность и высокая чувствительность разработанной методики.

5. Изучен процесс деструкции мельдония и холина альфосцерата в растворе

21

для инъекций с использованием стресс-тестов (в нейтральных условиях, присутствии окислителя и при нагревании с кислотой). Установлено, что мельдони подвергается разрушению только при кипячении в среде 1 М хлористоводородно кислоты, а холинаапьфосцерат в среде 0,5 и 1 М хлористоводородной кислоты.

6. С помощью разработанной методики количественного определени мельдония и холина альфосцерата изучена кинетика процесса деструкции обои веществ при их гидролизе в среде кислоты хлористоводородной. Методом мае спектрометрии идентифицированы основные продукты деструкции исследуемы веществ.

7. Проведена стандартизация комплексного препарата мельдония и холи альфосцерата в форме раствора для внутривенного и внутримышечного введения, мл. Согласно требованиям ОСТа91500.05.001-00 установлены нормы его качества.

8. Методом «ускоренного старения» изучена стабильность раствора д инъекций, содержащего мельдоний и холина апьфосцерат. При этом срок годносп препарата составил 2 года

9. Проведена первичная фармакологическая оценка раствора для инъекци" содержащего мельдоний и холина альфосцерат. Установлено, что ноотропный I нейропротекторный эффект анализируемой композиции достоверно превыша! таковые у каждого из веществ по отдельности.

Проведенные исследования по разработке методик анализа и изученш стабильности холина альфосцерата и мельдония в растворе для инъекций являютс основой для создания иоотропного препарата, содержащего лекарственны вещества, проявляющие различный механизм действия.

Список работ, опубликованных по теме диссертацнн:

1. Разработка методики количественного определения холина альфосцерата мельдония методом капиллярного электрофореза / М.В. Гаврилин, ГО.В Мудрецова, С.П. Сенченко [и др.] // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии - 2012. - № 4. - С. 12-16.

2. Гаврилин, М.В. Определение стабильности показателей правильности и прецизионности методики анализа мельдония и холина альфосцерата с

22

использованием контрольных карт Шухарта / М.В. Гавршшн, Ю.В. Мудрецова И Современные проблемы науки и образования: [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://\vww.science-edncntion гц/106-7711.

3. Гавршшн, М.В. Изучение стабильности мельдония в водных растворах методами мицеллярной электрокинетической хроматографии и масс-спектрометрии/М.В. Гавршшн, Ю.В. Мудрецова// Хим.-фармац. жури. -2014. -Том 88, №2.-С. 52-56.

4. Гавршшн, МВ. Исследование электрофоретическога поведения холина альфосцерата и мельдония при использовании метола мицеллярной электрокинетической хроматографии в условиях косвенного детектирования / М.В. Гавршшн, С.П. Сенченко, Ю.В. Мудрецова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2012. -Вып. 67. - С. 226-229.

5. Дьякова, И. И. Изучение поотропного и нейропротекгорного действия холина альфосцсрата и мельдония при совместном применении /' И. 11. Дьякова, Ю.В. Мудрецова, МВ. Гавршшн // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2012 - Вып. 67. - С. 326-327.

6. Мудрецова, Ю.В. Изучение зависимости электрофоретической подвижности мельдония и холина альфосцерата от электропроводности системы / Ю.В. Мудрецова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2013. - Вып. 68. - С. 272-273.

7. Гавршшн, МВ. Изучение влияния электропроводности на электрофоретическую подвижность мельдония и холина альфосцерата / МВ. Гаврилин, Ю.В. Мудрецова // Материалы Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез». - Краснодар, 2013. - С. 63.

Автор выражает искреннюю 6лаг<х)арноапъ кандидату фармацатичеасих наук, старшему преподавателю кафедры физиологии и патологии Пятигсрского медико-фармацевтическою института Дьяковой И.Н. за помои(ь в проведении фармакологических исслед/хиит/.

МУДРЕЦОВЛ ЮЛИЯ ВИКТОРОВНА

разработка методик анализа и изучение стабильности холи на альфосцерата и мельдония в растворе для инъекций

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано в печать: ШоИЛ 2014 год Формат бумаги 60*84 1/16

Бумага книжно-журначьная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 50 экз. Заказ № Ч\Ъ

Отпечатано в Пятигорском медико-фармацевтическом институте - филиаг ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации ~

357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11