Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Разработка метода количественного анализа незрелых половых клеток из эякулята и выяснение степени его информативности

" ] 11а правах рукописи

~ и 1 1

ГЛЕБА Татьяна Николаевна

РАЗРАБОТКА МЕТОД А КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА НЕЗРЕЛЫХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЗ ЭЯКУЛЯТА И ВЫЯСНЕНИЕ СТЕПЕНИ ЕГО ИНФОРМАТИВНОСТИ

(74.00.23. -гистология, цитология, эмбриология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-

1

997

Работа выполнена в Медико-генетическсм научном центре РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Л.Ф. Курило

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.В. Яглов

кандидат биологических наук Т.Р. Курносова

Ведущая организация: Московский Государственный университет им. М.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится 1997 г. в .час.

не заседании диссертационного совета Д 053.22.02 в Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, Медицинский факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая,-д. 6.

Автореферат разослан ЛИАрхйСи....... 1997 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор меднаингкг1х наук, профессор

В.Э.Торбек

Общая характеристика работы.

Настоящая работа посвящена разработке неинвязипного метода количественного анализа состава по стадиям развития незрелых полоных клеток из эякулята и i учению возможности его использовании при морфологической диагностике нарушения сперматогенеза при мужском бесплодии.

Актуальность темы. Нарушение сперматогек.за является с„ной из главных причин мужского бесплодия. При диагностике патологии сперматогенеза наиболее информативным- является анализ состояния сперматогенеза и половых желез на гистопрепаратах биоптата яичка. По применению этого метода имеются ограничения - его исиользуют не при всех связанных с нарушением сперматогенеза формах бесплодия, а лишь при олигозооспермии тяжелой степени и азооспермии (WHO, 1992; Oelminger, 1995). В связи с этим, для большей части пациентов практически невозможно установить причину нарушения сперматогенеза и изменения спермограммы. Этим объяснится необходимость разработки альтернативных биопсии яичка методов оценки состояния сперматогенеза при диагностическом обследовании и в процессе лече"мя патологии сперматогенеза.

В данной работе предложен неинвазивнын метод количественного анализа состава незрелых половых клеток из эякулята по стадиям их развития (КА НПК), количественные критерии оценки состояния сперматогенеза, показаны степень информативности : возможность использования этого метода при диагностике мужского бесплодия.

Исходной посылкой при разработке метода явилось наблюдение^ что в эякуляте, помимо сперматозоидов, содержится 2-4% незрелых половых клеток, а при нарушении сперматогенеза их число значительно возрастает (Sperling, Kaden, 1971). Применение количественного анализа этих клеток по стадиям сперматогенеза практически не имеет ограничения по диагнозу (исключение - обструктивная аспермия вследствие непроходимости или отсутствия семявыносящнх путей) и расширяет возможности как по диагностике, так и по определению схемы лечения пациента с применением современных методов репродуктивной технологии, а также ■ по возможности наблюдения за динамикой восстановления сперматогенеза в процессе лечения

Цель II задачи исследования. Цель исследования - разработать технику приготовления тотальных преп.^атов и проведения количественного анализа (KÄ) состава незрелых половых клеток (НПК) из эякулята по стадиям их развития; определить количественные критерии оценкн состояния сперматогенеза, степень информативности данного подхода и возможность его использования для диагноза и прогноза нарушения генеративной функции.

Для достижения данной цели были сформулированы следующие задачи:.

1. Разработать технику приготовления тотальных препарате суспензии половых оеток эякулята для их количественного цитологического анализа.

2. Отработать технику' количественного анализа и критерии оценки состава и состояния незрелых половы* клеток из эякулята по стадиям сперматогенеза. ■ .

3. Определить возможность проведения количественной оценю состояния сперматогенеза на препаратах из суспензии клеток зякулята i биоптата яичка.

4. Определить информативность количественного, анализа НИК н. примере исследования эякулята от пациентов с различными формам! ■этологии репродукции.

5. . Провести сравнение состояния сперматогенеза у мужчин бесплодием по результатам количественного анализа состава НПК и эякулпта, из суспензии клеток биоптата яичка и гистог.репаратов бйоптат яичка одних и тех же пациентов.

Научная новизна. Впервые, именно с помощью разработанного нам1 количественного анализа состава НПК из эякулята, без прииенени: биопсии яичка, выявлена гетерогенность нарушения сперматогенеза npi одинаковой хромосомной аномалии (ХА): носительстве одинаково! структурной ХА -транслокации хромосом 13 и 14 (при кариотипе 4В, XV t(13;l4)); носительстве одинаковой числовой ХА - лишней X хромосом! при синдроме Клайнфельтера (кариотип 47, XXY); при синдроме де л Шапелли (кариотип 46, XX и мужской фенотип), что требует дальнейшег те ретического изучения.

На основании КА состава НПК из эякулята пациентов олигозооспермией и азооспермией (без применения инвазивных методо исследования) обнаружены различия в патологии сперматогенеза пациентов с разными причинами и разными формами бесплодия: показанс что а ряде случаев развивается частичный блок в прелептотене, пахитен или диплотене профазы I мейоза, при других заболеваниях - в метафазе 1 , 11, '¡то Я1 яется предпосылкой для отработки техники снятия блока н разных стадиях сперматогенеза с помощью соответствующе гормонотерапии. ♦

Научно-практическая значимость: Разработан новый неинвазивны метод диагностики патологии сперматогенеза по НПК из эякулят: позволяющий многократно проводить количественный анализ состава п стадиям развития клеток сперматогенного эпителия, делать заключение причине патологии сперматогенеза и осуществлять наблюдение а динамикой восстановления сперматогенеза при лечении. Применен» Метода обеспечивает сохранение ннтактйости яичек, что. позволяв избежать развитие аутоиммунной реакции, которая возможна пр выполнении биопсии яичка. Метод применим практически ко все пациентам с нарушением генеративной функции н позволяет только п эякуляту получить достаточно объективную информацию о состояни сперматогенеза в яичках. KpoMt основного Назначения - для диагностики прогноза восстановления ' нератнвнон функции пациента, разработанный апробированный в данной работе метод и полученная с его помощь информация могут быть полезными для специалистов, работающих Области генетической и гормональной регуляции гаметогенеза, педик-генетического консультирования, репродуктивных техник и по другн направлениям репродукции человека и млекопитающих животных.

Алробицш» работы.

Материалы диссертации докладывались на- научной конференци "Медик» психологические последствия аварии не. ЧАЭС и пути и ' преодоления" (С Петербург, апрель 1996); {II конгрессе Международнс

ассоциации морфологов (анртоМов, гистологов, эмбриологов) (Тверь, июнь 1996); научно-практической конференции "Проблемы профпатологин в Сибири" (Новокузнецк, сентябрь 1996), научных межлабораторных семинарах МГНЦ РАМН в мае 1995 г., июне 1996 г.

Публикации, По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы.

Положения, выдвигаемые На защиту.

1. Метод КА состава по стадиям развития НПК из эякулята информативен для оценки, с помощью предложенных количественных критериев, состояния сперматогенеза по эякуляту пациентов с мужским бесплодием.

2. С помощью КА состава НПК из эякулята выявлена гетерогенность Нарушения сперматогенеза у пациентов с одинаковой хромосомной патологией.

3. С помощью КА состава НПК из эякулята выявлен блок на разных стадиях сперматогенеза у лиц с разной причиной нарушения генеративной функции;

4. При определенных формах бесплодия, связанных с патологией сперматогенеза, КА состава НПК из эякулята позволяет получить данные, сопоставимые по степени информативности с получаемыми при выполнении односторонней биопсии яичка.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов И методой исследования, результатов собственных исследований, заключения и общего обсуждения, выводов, списка литературы.

Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц и 17 рисунков. Список литературы включает 156 рабо.т, из них 57 отечественных авторов.

МАТЕРИАЛЫ и методы

С целью отработки техники количественного анализа незрелых половых клеток из эякулята по стадиям их развития, определения количественных критериев оценки состояния сперматогенеза, степени информативности данного подхода и возможности его использова)(ля для диагноза и прогноза нарушения генеративной функции, были применены следующие методы исследования.

Клшшко-андрологлчсское обследован!» н семиологнчсский анализ.

Клинико-андрологйческое обследование осуществляли путем оформления медицинской карты: заносили данные анамнеза, результаты клинического обследования, первичный диагноз, результаты семиологического и цитогенетического анализа, эндокринологического н других методов обследования.

Семиологический анализ эякулгта выполняли для большинства пациентов как минимум дважды, по параметрам, рекомендованным ВОЗ (WHO, 1992).

Гистологический анализ препаратов биоптата яичка пациентов с бесплодием. Фрагменты ткани (полученные при биопени яичка, осуществляемой в урологических клиниках г. Москвы) фиксировали в фиксаторе Буэна, обезвоживали и заливали в парафин (Курило, 1985).

lia гистолрепаратах биоптатов яичка отмечали состояние оболочки и самих семенных канальцев, клеток Сертоли, клеток сперматогенного эпителия, клеток Лейдига и стромы.

ЦнтогснстичсскнП анализ лимфоцитов периферической крови пациентов проводили сотрудники МГНЦ РАМН. Данные анализа кариотипа использовали для дифференцирования генетически обусловленных нарушений репродукции и конкретных. нозологических форм хромосомной патологии от заболеваний иной природы.

Метод получения тотальных препаратов ядер незрелых половых клеток нз биоптата яичка отрабатывали для исследования клеток биоптата не на гистопрепаратах, а в суспензии клеток для сравнения полученных количественных данных с результатами количественного анализа половых клеток из эякулята этих же пациентов с планируемой целью выяснения информативности разрабатываемого метода КА НПК. В многократных предварительных экспериментах на секционном материале яичка человека и семенниках лабораторных животных (мышей, крыс) проводили испытание ряда методов (приготовление мазков, отпечатков биоптата, давленных н раскапанных препаратов) для получения равномерно, в один слой распластанных по предметному стеклу клеток. Наиболее удовлетворительными оказались методы приготовления тотальных препаратов половых клеток по Evans et al. (1964) и Templado et al. (1986), используемые обычно цитогеиетиками для анализа мейотических хромосом половых клеток из биоптата яичка. Препараты окрашивали красителем Гимза.

Количественный анализ состава по стадиям развития незрелых половых клеток из оякулдта.'Суховоздушные препараты из половых клеток эякулята, как и из суспензии биоптата яичка, готовили по методу Evans et al. (1964) и Templado et al. (1986) и окрашивали красителем Гимза. По методу, предложенному дли оогенеза Курило (1980, 1985) и применяемому нами в МГНЦ РАМН для сперматогенеза, отрабатывали технику количественного анализа состава по стадиям развития незрелых половых клеток и количественные критерии оценки состояния сперматогенеза обследуемых пациентов по препаратам из эякулята и суспензии клеток из биоптата яичка.

При отработке количественных критериев оценки состояния сперматогенеза приняли целесообразным дифференцировать и подсчитывать клетки сперматогенного эпителия по следующим стадиям их развития: сперматогонии (общий пул), сперматоциты 1 на стадиях предпахитены (прелептотены, лептотены, зиготены в общей сумме), пахитены, диплотены, метафазы 1 мейоза (Ml) и метафазы II мейоза (МП) (в сумме), суммарно сперматоциты II н сперматиды (в процентах относительно общего числа подсчитанных НПК), сперматозоиды (в процентах от общего числа всех подсчитанных половых клеток).

Среди сперматоцитов II и i .ерматид определяли долю неразошедшихся в I и II делениях созревания клеток (в процентах от числа подсчитанных клеток этих стадий). НПК с признаками дегенерации, затрудняющими идентификацию клеток определенных стадий развития, относили в группу неидектифицируемых половых клеток (определяли в процентах от общего числа подсчитанных НПК). Выделяли в отдельные группы также соматические клетки: лейкоциты, эпителиальные и др.

В каждом исследуемом случае анализировали по возможности не менее 200-300 НПК (долю НПК вычисляли в процентах от общего числа подсчитанных НПК и сперматозоидов). Все количественные данные обрабатывали с помощью критерия Фншера-Стъюдента с уровнем значимости 0,95 (Рокиикий, 1973).

Всего было обследовано 244 пациента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Формирование потока и групп пациентов по основному клиническому диагнозу, показателям семнологнчсского анализа п результатам цнгогсистнчсского обследования но лимфоцитам периферической кропи.

Нами проанализировано в зашифрованном виде 404 образца эякулята от 244 пациентов. В 1 группу входили 23 донора спермы для искусственном инсеминации. По состоянию сперматогенеза, оцениваемому рутинным ссмиологическнм анализом эякулята (WHO, 1992), пациентов с бесплодием распределяли в несколько групп: с олигозооспермией (89 человек - 2 группа); азооспермией (66 человек - 3 группа); астенозооспермиеи (24 человека ■ 4 группа); тератозооспермией (6 человек • 5 группа). Нами проанализировано в том числе 36 образцов эякулята от 36 пациентов • ликвидаторов последствии аварии (¿1ПА) на Чернобыльской атомной электростанции (ЧАЭС). Приготовлено и проанализировано 34 гистопрепарата бноптата пичка и проанализирован методом КА НПК 31 образец суспензии биоптата яичка.

2. КЛ состава НПК по стадиям их развития из эякулята хшшентоп о нормальным сперматогенезе.».!, Клрнопншм н фертадг.костьгз.

С помощью отработанной нами техники приготовления тотальных препаратов ядер НПК из эякулята и выбранных критериев оценки состояния сперматогенеза по эякуляту был изучен сперматогенез у доноров спермы, т.е. у лиц 1-й группы с нормальным кариотипом, спермограммой и фертильностью, принятой нами таким образом за условно-контрольную группу. Средний показатель НПК для данной группы составил 3,7%, остальные половые клетки были представлены сперматозбмдами, Сперматиды составляли подавляющее большинство НПК. Индекс неидентифицируемых НПК для 1-й группы составил 6,5% (тпбл. I).

3. Анализ сперматогенеза и КЛ состава по стадиям развития НПК у пациентов с нормальным кацшотшюн н нарушением генеративной функцнн.

В результате проведения сравнения данных по КА НПК у пациентов с различным (предварительным) диагнозом бесплодия по спермогрзмме (и с нормальным кариотипом), а также при сопоставлении этих данных с таковыми в 1-й группе, былн рчявлены некоторые особенности прохождения сперматогенеза у пациентов, относящихся к разным группам по степени нарушения сперматогенеза (табл.1).

У пациентов 2-й группы (с олигозооспермией), по сравнению с донорами спермы, число НПК в эякуляге возрастает до 26,4%, более чем вдвое увеличивается число сперматоинтов до стадии диплотеиы, з также число неидентифицируемых половых клеток и соматических клеток. Количество сперматид меньше, а доля неразошешнхея в делениях

- S -

Таблица 1

ДЛККЫЕ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА ПО СТАДИЯМ РАЗВИТИЯ ЛЕЗРЕЛЫХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЗ ЭЯКУЛЯТА РАЗНЫХ ГРУПП ПАЦИЕНТОВ И ДОНОРОВ СПЕРМЫ (%) (М±т)

Индекс Дала сперэтгтосдгтов I ка разных стадиях мейоза Сперма-тоцнты и Сперматады Нен-дептя-фкцн-руемые Нера-гоше-дпше-ся

ГРУППА НПК профаз; а • метафлгы разннз стадий позд-ка клетки снер-ма-

- развитая ста- ра2Е!1 -тия тиды

пре- лсп- 211- па- ' ДШЬ

леп- то- го- хи- ло- М1 м н

то- тена тепа тепа тека

тепа

1-я - донорм спермы (¡5 человек) 3.7 0,18 + 0,23 + 0,35 + 1,27 + 1,99 + 0 0 4,77 22,0 62,8 + 6,46 + 25,6 +

0^6 0,09 0.15 0,43 0,66 3.35 5,98 6,97 1,25 5.2

2-я - пациенты с 26,4 0,46 0,4Ь 0,68 2 41 4.52 0,23 0,04 8,07 21,1 53,9 9,85 22,2

олигсзооспермией (22 человека) + 0.17 + 0,12 + 0.17 + 1.31 + 1,14 + 0,07 + 0,03 + 1,41 Т зТвб + 4,34 + 2.55 + 4,65

3-я - пациента с 10,9 0,04 0.31 0,77 2,51 0,1 5,91 20,8 54,7 14,8 17,2

астенозоослермией (10 человек) 0 + 0,04 + 0.13 + 0,24 + 0,87 + 0,06 0 + 3,16 + 7,73 + 10,6 + 5,66 + 5,1

4-я - пациенты с 36.8 0,53 0,22 0,40 1,2 0,2 10,9 49,1 32,5 4,79 8,5

тератозооспермией (4 человека) 0 + 0,47 + 0,19 + 0,17 + 0,43 + 0,11 0 + 6,04 + 12,1 + 6,74 + 1,83 + 6,2

5-я - пациенты с 99,9 0,07 0,03 0,48 0,44 2,36 3,01 45,6 34,8 13,1 37,5

азооспермисл (17 человек) + 0,07 + 0,03 + 0,44 + 0,17 + 1.21, 0 0 + 2,0 + 6,9 + 6,64 + 2,45 + 6,3

созревания клеток на том же уровне, что и у лиц 1-й группы. Доля сперматоцитов в MI-MI1 достигает 0,3% (табл. I).

У пациентов с астенозооспермией (3-я группа), по сравнению с условной нормой, почти в 3 раза возрастает число НПК в эякуляте, в среднем на 10% увеличивается "Количество неидентнфицнруемых НПК, а число сперматид и сперматоцитов на стадиях профазы 1 мейоза приблизительно такое же, что и у доноров спермы. Доля сперматоцитов в MI-MI1 составляет 0,1 % (табл. 1).

В 4-й группе пациентов с тератозооспермией показатель НПК почти в 10 раз выше нормы (1-я группа). Количественные показатели сперматоцитов на стадиях прелептотены-пах'итены, нендентифнцнруемых и соматических клеток сопоставимы с таковыми в 1-й группе, но в трое ниже количество неразошедшихся при делении в мейозе клеток. Доля сперматоцитов о М1-М11 составляет 0,2% (табл. 1).

У пациентов с азооспермией (5-я группа) данные подсчета НПК по стадиям сперматогенеза близки к показателям 1-й группы. Выявлены следующие существенные отличия: самый высокий, по сравнению с группами 1-4, индекс НПК (99,9%), уменьшение количества сперматоцитов на стадиях прелептотены-пахитены, вдвое большее число неразошедшнхея сперматид, увеличение количества неидентнфицнруемых клеток, в 3 раза большее количество соматических клеток (табл. 1).

С целью выяснения информативности разработанного нами метода КА НПК был проведен анализ состояния сперматогенеза по составу НПК разных стадий развития из эякулята у здоровых фертильных мужчин и пациентов с бесплодием и различными причинами нарушения сперматогенеза (доноры спермы, ЛПА на ЧАЭС, пациенты с хроническим простатитом, пациенты, перенесшие гонорею, пациенты с варикоцеле). В работе проводили рутинный семнологическнй анализ (WHO, 1992), исследование форм патологии головок сперматозоидов (Mortimer, 1985), а также количественный анализ по стадиям развития НПК из эякулята (табл.2).

В соответствии с полученными результатами сделан вывод о том,0что: семиологическнн анализ дает информацию о количестве и качестве . сперматозоидов • их двигательной активности, патологии, но не позволяет оценить сперматогенез постадийно. Метод оценки нарушения спермиогенеза по аномалии головок сперматозоидов информативен, но степень и объем поражения гамет при более сильных воздействиях при этом подходе, по-видимому, оценить сложно, и с его помощью провести анализ состояния сперматогенеза о целом невозможно. И только при использовании КА НПК. были выявлены особенности нарушения конкретных стадий сперматогенеза для пациентов различных групп (табл. 2). По сравнению с показателями в уело, но-контрольной группе, в группе д ЛПА на ЧАЭС был определен частичный блок профазы мейоза на предпахитенных стадиях и снижение числа сперматоцитов о пахнтене (по-видимому, в результате опосредованного действия облучения на ранние стадии профазы I мейоза). У лиц, перенесших гонорею,, обнаружен частичный блок в метафазе 1 и II делений созревания (т.е. нарушение веретена деления). У пациентов с хроническим простатитом и варикоиеле . статистически значимых отклонений по использованным нами

, Таблица 2

ХАРАКТЕРИСТИКА СОСТАВА НЕЗРЕЛЫХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЗ ЭЯКУЛЯТА

ОБСЛЕДОВА1Г1ЫХ МУЖЧИН. _(Воля в % от таслз иолсчктитыт. клеток)_

»

да

I

Группы падаев-тов Число проанализирован иьп. везрелых полоны* клеток из 1 твлеетта Количественные данные по составу незрелых половых клеток различных стаднй развития в эякуляте обследованных пациентов

Сперматепзт^ в профаз I мейоза Спермато-питы в ме-тафазе 1,11 Спермато-цкты II и еперматиды Сперматоцн -ты,неразо-шедшиеся в ала- хелофазе Нендеа- • тнфици- руекые ник

Дргдшшь тека Пахзетепа Дяпяотена

Доноры N-23 345.53 ± 4.07 0.66 + 0.16 0.45 + 0.10 1.11 + 0.26 0.04 + 0.02 91.99 + 0.89 22.98 + 2.65 5.85 + 0.85

ЛПА ЧАЭС N - 27 331.07 + 21.35 * 1.18 + 0.42 * ело + о.оз 1.58 + 0.37 0.01 + 0.01 * 87.06 + 1.93 22.60 ± 3.65 5.72 i 0.99

Хроничес. простатит N=14 258.57 + 42.09 0.93 + О.'"1 0.55 + 0.27 1.28 + 0.33 0.10 + 0.07 88.35 ± 2.83 24.70 + 4.38 8.22 + 2.19

Гонорея N = 10 307.80 + 47.76 * 0.19 + 0.11 0.20 + 0:11 1.24 + 0.48 * 0.61 + 0.42 * 85.44 + 4.84 29.56 ± 6.74 * 13.67 +5.66

Варико-целе N=13 232.38 + 29.31 0.41 + 0.14 0.28 + 0.25 1.47 + 1.30 0.21 ± 0.16 91.59 + 3.15 24.86 + 4.30 6.66 + 2.10

* Показатели, достоверно отличающиеся от соответствующих показателей доноров (Р < 0.05)

количественным критериям оценки сперматогенеза от условной нормы не выявлено.

Результаты, полученные при помощи КА НПК позволили, не прибегая к биопсии яичка (для подавляющего большинства обследованных во всех группах пациентов она не показана) получить новую информацию о сперматогенезе пациента и нередко • специфике его поражения. Это говорит в пользу информативности данного количественного подхода. Метод позволяет Проводить анализ эякулята нужное число раз без ущерба для здоровья пациента. Преимуществом метода является также возможность его использования с целью наблюдения за динамикой восстановления сперматогенеза при лечении. Он прост в исполнении, экономичен, доступен для использования в лабораториях клиник различного профиля, может также применяться и качестие экспресс-диагностики повреждающего сперматогенез действия при возникновении аварийных ситуации.

4. Гетерогенность нарушений с-Яерматогеиеза' при одинаковой хромосомной патология.

Целью данной части исследования явилось не выявлег 'е частоты или типа хромосомных аберрации у мужчин с бесплодием, а попытка проанализировать, имеется ли корреляция между характером нарушения кариотмпа (т.е. нарушением определенных хромосом) и особенностями патологии сперматогенеза, определяемой нашим методом.

На нашем материале было йыявлено, что у мужчин бесплодием и нарушением сперматогенеза наиболее частыми из структурных хромосомных аномалий (ХА) являются Транслокацин хромосом (8 случаев из 9), причем в большинстве случаев (5 из 8 ) затронуты хромосомы 13 и 14, в одном - 14 и 15. То есть, очевидно, нарушения среди акроцентрических хромосом группы 13-15 не опасны для жизни носителя, но при наступлении половозрелости эти нарушения отражаются на сперматогенезе, на функциональной полноценности гамет.

Подавляющее большинство случаев с числовыми ХА составили пациенты с синдромом Кланнфельтера н кариотипом 47, ХХУ (т.е. С лишней X хромосомой). В четырех случаях был установлен синдром де ля Шапелля (женский карнотип 4В, XX и мужской фенотип).

Помимо трад! '.ионного семиологнЧеского исследования у пациентов трех групп (1-я группа - носители транслокацни хромосомы 13 на 14; 2-я группа - пациенты с синдромом Кланнфельтера, 3-я группа • пациенты с синдромом де ля Шалёлля), был проведен КА НПК (табл. 3).

Во всех трех группах у пациентов с мужским бесплодием при одинаковой ХА была Выявлена разная степень нарушения сперматогенеза.

Так, у пацнента с диагнозом "азооспермия" из 1-й группы (носители транслакашш) с помощью КА НПК было обнаружено 7 сперматозоидов, а у четырех других с диагнозьм "олигозооспермня" - выявлен механизм олигозооспермии: полный или частичный блок на разных стадиях сперматогенеза (табл. 3).

Во 2-й группе - из 10 пациентов с синдромом Клайнфельтера и предварительным диагнозом по семиологическому анализу "азооспермия" • у трех пациентов при помойхи КА НПК были выявлены все типы половых клеток и единичные сперматозоиды (табл. 3).

Таблица 3

РЕЗУЛЬТАТЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА СОСТАВА КГОС ИЗ ЭШГУЛЯТА ПАЦИЕНТОВ С НЕКОТОРЫМИ ФОРМАМИ ХА

ДАННЫЕ СПЕРМИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ДАННЫЕ К А ПИК

Ni образца Количе- Сперматоштгн П Неидеп-

эякулята ство Подзиясяость СПЕРМАТОЦИТЫ + тифшзя-

пациента; Объел сперматозоидов Сперматиды руекые

заклгачеккв со ¡>яху- сперма- Неразо- незре-

сеинологеческо лята тозои- Аятвз- Мало- Непод-: Пред- Пахз- Дипло- Мета- шедшие- лые

иу анализу (ил) дов в во- подви- ЕКЖ- пахи- теиа тена фаза Всего ся при половые

1 кл вод- жные m-is тена (%) (%) I, П (%) делениях клетки

(илп) вжя- (%) (%) н%> (%> созрева-

пьге 1 ЕН»(%)

(%) i

1 2 3 i S 6 Й 7 S 9 19 п U 13

КОНТРОЛЬНАЯ ГРУППА (ДОНОРЫ ЭЯКУЛЯТ AI

3,85 105.67 67,46 12,30 22,50 | j.0,66 0,45 1,11 0,04 91.99 22,93 5,85

V 0,23 + 7,32 - 2,84 i 0,98 1 2.38 Ii 0.16 ±0,10 + 0.26 + 0,02 -0,89 ± 2,65 + 0.85

ПАЦИЕНТЫ С СИНДРОМОМ КЛАЙНФЕЛЬТЕРА (КАРИОТИП 47 , XXY ) - 2-ая группа

jw 1 олигозсо-

спермия тяже- 3,0 1,0 50,0 0 50,0 Анализ не проводили

лой стеленh

№ 238 2,5 0 0 0 0 0 0 0 0 91,0 20,0 9,0

(<187) 1,0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1С0.0

атооспермия

.V 485 1,2 0 0 0 0 !0 0 0 0 67,0 20,0 33,0

(235) 1,2 0 0 0 0 0 0 0 0 , 0 0

азооспермия

480 0,7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100,0

(227) 1.8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

азооспермия

№460 2.2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

(252) 4.0 0 0 0 0 1° 0 0 0 0 0 0

азооспермия

i » г 3 4 i 5 e ' Й 7 8 9 10 | 11 12 Í3

N» 44G (281) азаиспевмкя 38 4.0 0 0 0 ) 0 0 j 0 1 0 t¿ 4.0 H 6,0 0 E 2,7 0 ДННИЧН1 1.4 i 0 0 1 98,8 je сперматозоид! 0 7,0 j 85,8 1,2

jV? 430 азооспер. 1.0 0 0 0 0 ü-0 0 0 0 0 0 0

Jw 244 азооспер. (247) (273) 1.0 1,2 1.0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Й.0 0 Í40 0 i! 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 79,0 0 0 16,0 0 0 21,0

№ 205 азооспер. (207 > 1,0 1,0 0 0 t 0 0 0 o ¡jo o [jo 0 0 37 0 ^ДИНИЧ* 0 0 jje сперм. 25.9 0 1ТОЭОИД1 0 0 Л 70,4 0

ЛЬ 866 азооспермия 3.0 0 0 0 0 Г . 0 !}5 0 ' 1 I 82,0 ¡26,0- Единичны«, сперматозоиды 13,0

ПАЦИЕНТЫ С КАРИОТНПОМ 4Z.XV ШЗ: 14) - НОСИТЕЛИ ТРАНСЛОКЛЦИН 13 И 14 ХРОМОСОМ -'/-я гриппа

>«3 76 азооспермия 1,0 0 0 ■ 0 í'i i ! 1 ' I • 0 h0 ¡0 lo jo i 31.0 135.0 . I 69,0 jl Выявлено 7 сперматозоидов на 200 полей зрения

Jw380 олито- :иу:чнет>м ня 2.5 3.2 0 11.0 ■i 89.0 i|0.2 1,0 1,0 0,7 94.5 38,7 2.5

.\т51 алигьзоос. (52) (55) (166) (220) 4.0 5,0 5.0 2.0 8.0 0,1 0.2 ' 8,8 0,8 0,2 8,0 40.0 20.0 7S.Ú-0 15,0 20,0 • 13,0 25,0 0 77.0 40,0 67.0 0 100,0 J 1,0 lo lo 1,0 0 0 ко 0.7 • 5,7 2.0 2,4 1.0 3,4 0 КО 1,2 2,0 0 85,3 87,0 86,0 88.0 88:2 10,0 20,0 16,0 • 26.0 29,0 7,0 10,0 10,4 8,0 •7.6

33 олигозоос. (JOS) • 5.2 7,0 4,2 Кб 0 0 28.6 0 71.4 ^0.7 100,0 $ 0.8 0.7 0.4 2.2 ,4 0,7 0 82,1 54,1 21.1 44,3

172 ллигоэоо. í 4,0 . 0.8- 25.0 i 25.0 50,0 B2 2 ¡0.4 3.1 К» 86,7 39.8 5.8

ПАЦИЕНТЫ С КАРИОТНПОМ 46. XX (МУЖСКОЙ ФЕНОТИП) - СИНДРОМ ДЕ ЛЯ ШЛПЕЛЛЯ 3 'Я гриппа

S" 307 азооспер. 308) 3.1 2.2 0 I 0 | 0 0 ] 0 10 0 |}0 0 30 0 0 0 0 0 0 41,2 0 18.0 0 58, в 0

>fc 718 азооспер. 0,8 0 0 jo 0 t|0 0 о 0 0 0 100,0

.Si 787 азооспер. (793) 5,0 0 о jo о Jo jo 0 jio 0 но и 0 Выявлено 0 0 14 cneD 0 0 маго' она. 79.0 93,0 эв на 30 10,5 17.5 0 полей эг> 21,0 7,0 ?ния

.N» 540 азооспер 0,5 0 i 0 10 0 II í 1 Единичные сперматсзонДЬ$ |

Впервые п результате КА НПК из эякулята четырех пациентов с синдромом де ля Шапелля и диагнозом по спермограмме "азооспермия" в двух случаях было выяилено наличие сперматозоидов (табл.3). В литературе сообщения о таких находках при этом синдроме отсутствуют.

С практической точки зрения выявление даже единичных сперматозоидов в эякуляте пациентов с диагнозом "азооспермия" и кариотипом 47, ХХУ и 46, XX (с мужским фенотипом) принципиально важно для пациента и его лечащего врача. В этом случае прогноз деторождения может быть иным', поскольку становится возможным применение одного из методов вспомогательной репродукции внутрицнтоплазматического (в ооцнт in vitro) введения сперматозоида или слерматиды (ИКСИ), проведения затем предымплантацноиного анализа и, при определении нормального кариэтипа, перенос раннего эмбриона в полость матки супруги.

В научном плане эти находки имеют еще большее значение, поскольку свидетельствуют о факте полного прохождения сперматогенеза частью половых клеток у лиц с такими аномалиями кариотипа. Возможно, это объясняется тем, что часть спсрматогоний имеет нормальный кариотип (гонадный мозаицизм), либо является результатом потери лишней X хромосомы на самых ранних этапах обособления половых клеток, отчего часть их имеет нормальный кариотип. Эта важная теоретическая проблема регуляции гаметогенеза ждет своих исследователей.

5. Результаты морфологического анализа шстоирспаратоп биоптата яичка и сравнение данных с результатами соличсстЬснного анализа состава IUllC пз кякулятс и суспензии биингата яичка.

Поскольку проведение биопсии несет для пациента определенный риск развития посттравматического иммуноорхнта и имеет ограничения (только для пациентов с азооспермией и олигозооспермией тяжелой степени), для 2/3 потока лиц с проблемами мужского бесплодия выяснение степени и стадий нарушения сперматогенеза сказывается невозможным.

С целью определения информативности КА НПК из эякулята мы сопоставили полученные при его проведении данные с результатами количественного анализа НПК из суспензии биоптата яичка и данными анализа гистопрепаратов биоптата яичка этих же пациентов. При получении бкоптат делили на два фрагмента: один из ннх использовали для приготовлений гнетопрепаратов биоптата яичка, из другого делали суспензию клеток и затем - сухоаоздушные препараты для проведения количественного анализа состава НПК. У шести пациентов с тяжелым поражением сперматогенеза, которым была сделана биопсия, на гистопрепаратах биоптата яичка выявлены ИСК только с клетками Сертоли, утолщение мембраны ИСК и гиалинизация последних. При проведении КА НПК из эякулята, полученного утром, до проведения биопсии, у этих шести пациентов выявлено небольшое количество НПК, единичные сперматозоиды, иногда чномальные. Предпринятый сравнительный анализ с данными КА состава НПК из суспензии клеток фрагмента биоптата яичка этих же пациентов показал практически подобную картину - наличие единичных НПК, в основном сперматид и реже • сперматозоидов, что подтверждает информативность предложенного метода. Расхождение в результатах анализа гистопрепарата и количественного анализа, выполненного на клетках из эякулята и

биоптата, вероятно, могут быть следствием того, что НПК из суспензии биоптата яичка, выявленные с помощью КА, имели локализацию в других ИСК, нежели те, которые попали на гистопрепарат биоптата. Это подтверждает точку зрения некоторых исследователей, считающих, что нарушение сперматогенеза в семенных" канальцах может носить очаговый характер. Поскольку в эякуляте содержатся НПК из обеих гонад то. Вероятно, это отражает общую, более объективную картину состояния сперматогенеза у пациента.

С помощью КА НПК ( который выполняли до операции, а также на 72-й и 260-й день после нее) нами было проведено наблюдение за восстановлением сперматогенеза у двух пациентов, перенесших операцию биопсии яичка. Результаты этих исследований позволили сделать вывод о степени информативности разработанного нами метода.'

Было установлено, что после операции биопсии яичка сперматогенез не достигает дооперационного уровня. Оперативное вмешательство можно считать оправданным в том случае, когда только результаты анализа гистопрепаратов биоптата яичка позволяют сделать вывод о причине заболевания.

Результаты проведенного сравнения данных КА НПК из эякулята и суспензии биоптата, а также оценка состояния сперматогенеза на гистопрепаратах биоптата яичка свидетельствуют о том, что анализ КА НПК дополняет и расширяет сведения, получаемые с помощью исследования биоптата яичка, хотя и не дает информацию о состоянии иных, чем половые клетки, гистоструктур яичка.

6. Статистический сравнительный анализ соотношения НПК разных стадий по биоптату яичка н эякуляту пациента.

Следующим этапом исследования явилось сравнение статистических данных количественного анализа соотношения НПК разных стадий дифференцировки из эякулята с таковыми, полученными при анализе суспензии клеток из биоптата яичка тех же пациентов.

Нами прорабатывались разные статистические модели для сравнения количественных данных по составу НПК между эякулятом и биоптатом яичка. Наибольший интерес для сопоставления данных по б/гОптату яичка и клеток в эякуляте представляет анализ соотношения клеток, представляющих последовательные стадии сперматогенеза. Были вычислены частоты встречаемости каждого типа клеток для каждого пациента в биоптате и эякуляте. После этого найдена средняя разность частот для клеток каждой стадии и определено стандартное отклонение (о).

Результаты этого анализа представлены в таблице 4. Из данных таблицы следует, что разность частот встречаемости НПК всех стадий сперматогенеза лежит в пределах стандартного отклонения, за исключением сперматид. Но и для кл-ток этого этапа дифференцировки средняя разность в частотах встречаемости не выходит за 2а.

Таким образом, разность в частотах встречаемости для клеток всех стадий сперматогенеза между биоптатом и эякулятом практически не отличается от 0. Следовательно, по частотам встречаемости НПК, наблюдаемым в эякуляте, можно дать верный прогноз встречаемости НПК в биоптате, т.е. в яичках. Это свидетельствует об информативности разработанного нами КА НПК из эякулята, предлагаемого в качеств« дополнительного подхода для исследования состояния сперматогенеза бег

оперативного вмешательства (т.е. для тех 2/3 пациентов с нарушением сперматогенеза, для которых биопсия яичка не показана (WHO, 1992).

Разнообразие возможных причин и особенности нарушения сперматогенеза у мужчин с бесплодием, представленные в настоящей работе, свидетельствуют о необходимости комплексного подхода при обследовании таких пациентов. Нами отработана для практического использования схема последовательности обследования пациентов с мужским бесплодием и нарушением сперматогенеза. После проведения клинико-андрологического обследования и семиологического анализа с установлении предварительного диагноза по спермограмме, предложено проводить цитогенетический анализ лимфоцитов крови пациента для исключения наличия ХА как причины бесплодия и затем • количественный анализ НПК из эякулята. По результатам этого анализа возможно либо уже на данной стадии обследования определить этап нарушения сперматогенеза и уточнить предварительный диагноз, либо выбрать наиболее оптимальный путь дальнейшего обследования пациента.

Таблица 4.

РАЗНОСТЬ МЕЖДУ ЧАСТОТАМИ ВСТРЕЧАЕМОСТИ HtlK НА РАЗЛИЧНЫХ • СТАДИЯХ ИХ ДИФФЕРЕНЦИРОВкИ В БИОПТАТЕ И ЭЯКУЛЯТЕ ПАЦИЕНТОВ С АЗООСПЕРМИЕЙ И ОЛЙГОЗООСПЕРМНЕЙ

Статистика Гонки Допа-хитена Пахи-тена Дипло-тена H 1 + Mil Citeр-мато-цига H Слср-матйды

Азооспермия

Среднее аначение Стандартное отклонение (о) 0.0149 0.0316 0.0142 0.0350 0.0309 0.0437 0.02Î8 0.0325 0.0004 ООО 19 0.0286 0.3721 -0.1109 0.3805

Олигозоосп ермия

Среднее значение Стандартное отклонение (о) 0.0097 0.0392 0.0275 0.0586 0.1277 0.1107 0.0041 0.0656 -0.0002 0.0005 -0.0953 0.2785 -0.0735 0.2007

ВЫВОДЫ

1. Разработан неинвазивный метод количественного анализа (КА) состава по стадиям развития незрелых половых клеток (НПК) из эякулята и определены количественные критерии оценки состояния сперматогенеза, позволяющие выявлять этапы его нарушений. В определенной степени Метод КА НПК является альтернативой анализу сперматогенеза по гистопрепаратам биоптата яичка.

. 2. Сравнение характеристик сперматогенеза путем КА состава НПК из эякулята и состава НПК из суспензии биоптата яичка тех же пациентов свидетельствует о том, Что:

- разность в частотах встречаемости половых клеток на разных стадиях дифференцировки между биоптатом и эякулятом практически не отличается от 0, то есть о тождественности количественных результатов;

- при помощи КА НПК из эякулята реально выявить полный или частичный блок сперматогенеза на определенных его стадиях или иные

- 14 -

нарушения этого многоэтапного процесса;

- по результатам КА НПК из эякулята возможно дать прогноз частоты встречаемости клеток соответствующих стадий сперматогенеза в яичках.

3.'Впервые, с помощью применения метода КА НПК была выявлена гетерогенность нарушения сперматогенеза у пациентов с одинаковой хромосомной патологией: транслокацией хромосом 13 и 14, с синдромом Клайнфельтера (47, XXY) и с синдромом де ла Ц1апелля (46, XX, мужской фенотип).

4. Впервые, с помощью КА выявлены особенности патологии сперматогенеза у лиц с определенными нарушениями репродуктивной функции, что позволяет предполагать различные механизмы развития генеративной недостаточности :

- частичный блок сперматогенеза на стадиях предпахитены и снижение числа сперматоцитов 1 в пахитене у ЛПД на ЧЛЭС;

- увеличение числа неидентифицигуемых НПК у лиц, перенесших гонорею

5. Неинвазивный метод КА НПК из эякулята р сширяет круг пациентов, для которых становится возможным получить характеристику сперматогенеза и его нарушений минуя биопсию яичка, повторять stot анализ многократно без опасности для здоровья пациента. Метод может быть использован также при лечении нарушений сперматогенеза для Наблюдения за динамикой его восстановления и при разли' .ых аварийных ситуациях для выявления степени опасного воздействия последних на Генеративную функцию мужчин.

6. При планировании схемы последовательного комплексного обследования пациентов с мужским бесплодием и нарушением сперматогенеза целесообразно после проведения семиологического и цитогенетического анализа по лимфоцитам периферической крови, проводить КА состава по стадиям развития НПК из эякулята.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кариологический анализ состава незрелых половых клеток эякулята.// Урол и нефрол-1993.-№2.-с.45-47 (соавторы Курило Л.Ф., Любашевская И.А., Дубинская В.П.).

' 2. Использование незрелых половых клеток эякулята для' количественной оценки состояния сперматогенеза.//Тр. III Конгресса Международн. ассоц. морфол. (АГЭ) (Тверь, нюнь 1996); Морфология.-1996 №2.-0.64 (соавторы Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Остроумова Т В., Мхитаров В.А.).

3. Сравнительный анализ соотношения незрелых половых клеток на разных стадиях их дифференцировки в биоптаге яичка и эякуляте у пациентов с азооспермией и олигозооспермией.// Пробл. реп|)од.-1997.-ЛЯ.-с.80-ЭД (соавторы Курило Л,Ф., Чеботарев А.Н., Шилейко Л.В., Остроумова Т.В., Мхитаров В.А ).

Tatiana N. Gacva (Russia)

DEVELOPMENT OF QUANTITATIVE ANALYSIS OF IMMATURE GERM CELLS FROM EJACULATE METHOD AND EVALUATION OF ITS INFORMATIVITY VALUE

A new non-invasive method of quantitative analysis (QA) and evaluation criteria of the ejaculate immature germ cells (IGC) on the successive spermatogenesis stages has been developed. The method makes it possible to reveal definite stages o( spermatogenesis pathology. To a certain extent the QA IGC method presents an alternative to the testes biopsy.

The comparison of spermatogenesis characteristics obtained by QA of IGC from ejaculate and bioptate suspension of same patients shows the identity of quantitative data and thus the possibility to reveal using QA IGC method different distortions of spermatogenesis , including full and partial blocks on its definite stages as well as to forecast how often the cells of these particular stages can be met in testes.

The application of the method enabled for the first time to reveal the he'erogeneity of spermatogenesis distortion in patients with the same chromosomal pathology: translocation of chromosomes 13 and 1«; Kleinfelter syndrome (47, XXY), de la Cliapelle syndrome (46, XX and male phenotype).

For the first time the peculiarities of spermotogenesis pathology in patients with reproductive function disturbances have been revealed.- a partial spermatogenesis block on the pre-pachytene stages and reduction of spermatocytes 1 on pachytene stage in liquidators of Tchemobyl disaster; growth of unidentified IGC in patients with honorrea anamnesis.

The non-invasive QA IGC method permits to perform the repeated analysis both for diarnosis and inutility treatment monitoring.

When planning the scheme of a complex successive observation of patients with male infertility and spermotogenesis pathology the semiologic and cytogenetic analysis of peripheral blood lymphocytes must be followed by the QA- IGC from ejaculate.

Т. II. Гаева (Россия)

РАЗРАБОТКА МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА

НПЛРРЛЫХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЗ ЭЯКУЛЯТА И ВЫЯСНЕНИЕ СТЕПЕНИ ЕГО ИНФОРМАТИВНОСТИ

Разработан новый неинвазивный метод количественного анализа (КА) и критерии опенки незрелых половых клеток из эякулята (НПК) по стадиям сперматогенеза. Метод позволяет выявлять этапы нарушения сперматогенеза. В определенной степени метод КЛ НПК является альтернативой анализу сперматогенеза по гистопрепаратам биоптата яичка.

Сравнение результатов КА незрелых половых клеток из эякулята и суспензии биоптата яичка тех же пациентов показало показало идентичность полученных количественных данных и возможность, таким образом с помощью метода КА НПК выявлять различные нарушения сперматогенеза, в том числе полный или частичны блок нг различных стадиях сперматогенеза, а также давать прогноз частоты встречаемости половых клеток соответствующих стадий сперматогенеза в яичках.

Впервые, с помощью применения метода КА НПК была выявлена гетерогенность нарушения сперматогенеза у паци.чтов с одинаковой хромосомной патологией: транслокацней хромосом 13 и 14, с синдромом Клайнфельтера (47, ХХУ) н с синдромом де ла Шапелля (46, XX, мужско фенотип).

Впервые, с помощью - КА НПК выявлены особенности патологии сперматогенеза у лиц с нарушениями репродуктивной функции, в том числе частичный блок сперматогенеза на стадиях предпахитены и снижение числа сперматоцитов I в пахитене у ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской атомной станции: увеличение числа неидентифицируемых НПК улиц, перенесших гонорею.

Неинвазивный метод КА НПК может применяться как в диагностических целях, так и для мониторинга лечения мужчин с бесплодием.

При планировании схемы пос. довательного комплексного обследовании пациентов с мужским бесплодием и нарушением сперматогенеза целесообразно после проведения семнологического и цитогенетического анализа по лимфоцитам периферической крови, проводить КА состава по стадиям развития НПК из эякулята.

12.03.97т>.

Сл'/ьед 1г, л. _'"'р. ГО»

Тип. ^аН, Спп*г>иик!П1?р . Я

3 ;-•!;, ¡06