Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Мужская фертильность и генерация активных форм кислорода в семенной жидкости

г 8 с:-: /I

На правах рукописи

ГРОМЕНКО ДМИТРИЙ СЕРГЕЕВИЧ

МУЖСКАЯ ФЕРТИЛЬНОСТЬ И ГЕНЕРАЦИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В СЕМЕННОЙ ЖИДКОСТИ

14.00.16. - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2002

Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории Башкирского государственного медицинского университета и Центре планирования семьи и репродукции с медико-генетической консультацией Республиканской клинической больницы имени Г.Г.Куватова.

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор P.P. ФАРХУТДИНОВ

Научный консультант: доктор медицинских наук,

профессор М.А.НАРТАЙЛАКОВ

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор С.Б.АРТИФЕКСОВ

доктор медицинских наук, профессор Ю.Н.КОВАЛЕВ

Ведущее учреждение:

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

Защита диссертации состоится «__» 2002 г. в__часов на

заседании диссертационного совета Д-208.117-02 в Челябинской государственной медицинской академии по адресу: 454092, г.Челябинск, ул.Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан _»

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

2002 г. Л.В .Кривохижина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В последнее время уделяется Зольшое внимание проблемам репродукции, возможности прогнозирования детородной функции у человека. По мнению различных авторов (Тиктинский О,Л., 1999., В.И.Кулаков, Б.В.Леонов, 2000) частота бесплодных браков вставляет 15% - 19%, что отражается на демографических показателях. Примерно в половине случаев бесплодие обусловлено мужским фактором и отмечается дальнейшая тенденция к его увеличению (Felberbraun R., Diedrich ЕС., 1998).

В конце XX начале XXI века во всем мире происходит снижение качества репродуктивного здоровья мужчин (Тер-Аванесов Г.В., Назаренко Т.А., Кулаков В.Й., 2000), Снижение показателей сперматогенеза происходит со скоростью 2% в год при одновременном уменьшении доли подвижных и морфологически полноценных форм сперматозоидов (Auger J. et al., 1995., Irvine S. et al., 1996., Sharpe R.M. et al., 1995). Сперматогенез представляет собой процесс непрерывного деления клеток, наиболее уязвимых для патогенного воздействия неблагоприятных химических, физических и бытовых агентов. Явление снижения сперматогенной функции, по всей вероятности, служит отражением возрастающего воздействия на организм человека повреждающих факторов, встречающихся в окружающей среде, на производстве и бьпу (Быков В.Л., 2000). Выяснение механизмов, повлекших за собой бесплодие, в каждом конкретном случае важно для выбора оптимальной тактики лечения.

Общепринятым для оценки мужской фертильности является изучение параметров эякулята, куда входят макроскопические, микроскопические, биохимические и функциональные критерии. Оценка показателей спермограммы в значительной степени субъективна и зависит от характеристик исследуемого образца: чем выше концентрация сперматозоидов в эякуляте и чем меньше доля прогрессивно подвижных форм, тем менее согласуются результаты разных лаборантов. В ряде случаев низкая частота оплодотворения в культуре является следствием функциональных аномалий сперматозоидов, не выявляемых при анализе традиционных показателей спермограммы (Леонтьева О.А., Воробьева О.В., Козлов В,В., 2000). С другой стороны, стандартные методы диагностики не всегда позволяют судить о причинах изменения функций сперматозоидов (Руководство ВОЗ, 1999). Таким образом, результаты рутинных исследований эякулята недостаточно надежны с клинической точки зрения, так как в ряде случаев фертильность бывает не нарушена при значительных отклонениях спермограммы от нормы, в то время как бесплодие может наблюдаться у мужчин с нормозооспермией (Liu D., Baker H.W.G., 1992).

В последнее время появляются публикации, свидетельствующие о влиянии свободно-радикального окисления (СРО) на процессы репродукции (Conte G., Milandi D., De Marinis L., 1999). В частности, доказана способность сперматозоидов к образованию свободных радикалов (CP), получивших

обобщающее название - активные формы кислорода (АФК): супероксидный анион-радикал, анион-радикал гидроксила, синглентная форма кислорода, перекись водорода и гипохлорит. Проблема действия активных форм кислорода на сперматозоиды в настоящее время мало изучена. Ясно лишь, что избыток активных форм кислорода может оказать негативное влияние на половые клетки (Аккея ВЛ., 1999).

В последнее время для выявления АФК начинают использовать хемилюминесцентные методы с применением специальных индукторов свечения. В качестве индукторов, не влияющих непосредственно на ход процесса, а лишь увеличивающих интенсивность регистрируемой хемилюминесценции (люминофоров), используются люминол, люцигенин, аналоги люциферина. Другой тип индукторов ускоряет процессы свободно-радикального окисления, В частности, к ним относятся ионы металлов переменной валентности, например, соли двухвалентного железа, перекись водорода, перманганат калия, щелочи.

В этой связи теоретический и практический интерес представляют исследования, посвященные выявлению механизмов нарушений репродуктивной функции мужчин, разработке экспресс-методов оценки генерации активных форм кислорода в сперме и определению состояния свободно-радикального окисления в эякуляте.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценить состояние свободно-радикального окисления в семенной жидкости при мужском бесплодии.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить состояние генерации активных форм кислорода в эякуляте в норме и патологии.

2. Определить уровень суммарной антиокислительной активности спермоплазмьг.

3. Выбрать оптимальные условия определения состояния свободно-радикальиого окисления и антиокислитедьной активности в сперме, основанные на регистрации хемилюминесценции.

4. Клинически обосновать эффективность применения хемшиоминесцентных методов исследования как дополнительного критерия оценки мужской фертильности.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В результате проведенных исследований разработан экспресс-метод оценки состояния свободно-радикального окисления в эякуляте, заключающийся в определении интегральных показателей суммарной антиокислительной активности спермоплазмы в модельной системе, генерирующей активные формы кислорода, и спонтанного люминолзависимого свечения эякулята.

Уточнены механизмы, приводящие к некоторым формам мужского бесплодия. При мужской инфертильности происходит увеличение генерации

активных форм кислорода функционально неполноценными сперматозоидами при высокой антиокислнтельной активности спермоплазмы.

Определена патогенетическая роль нарушения процессов генерации активных форм кислорода при мужской инфертштьности. Показано, что при идиопатических формах мужского бесплодия происходит повышение генерации активных форм кислорода.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Предложен, апробирован и внедрен в практическую деятельность врачей-урологов неинвазивный экслресс-метод регистрации хемилюминесценции эякулята для изучения состояния генерации активных форм кислорода и антиокислительной активности спермоплазмы при мужском бесплодии.

С помощью разработанного метода установлены нормативные показатели хемилюминесценции при обследовании мужчин с доказанной фертильностью. В норме эякулят характеризуется низким уровнем свечения и высокой антиокислительной активностью спермоплазмы.

Намечены новые подходы к патогенетическому лечению мужского бесплодия с учетом роли свободно-радикального окисления, заключающиеся в проведении рациональной антиоксидантной терапии, коррекции генерации активных форм кислорода.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ВНЕДРЕНИЕ ЕЁ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ

Материалы диссертации доложены на:

1. Научно-практическом семинаре Российской ассоциации репродукции человека «Лечение бесплодия: нерешенные проблемы», Саратов, 2001г.;

2. Заседании общества урологов Республики Башкортостан, 2000г. и

2001г.;

3. Секционном заседании «Репродуктивное здоровье мужского населения РБ» съезда врачей акушеров-гинекологов и педиатров Республики Башкортостан, г.Уфа, 2001г.;

4. Республиканской молодежной научной конференции «Вопросы теоретической и практической медицины», г.Уфа, 2001г.;

5. I Международном Конгрессе «Новые медицинские технологии», г. Санкт-Петербург, 2001г.;

6. Национальной научно-практической конференции с международным участием «Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека», г. Смоленск, 2001г.

7. Семинаре акушеров-гинекологов «Современный взгляд на вагинальные инфекции. Хламидиоз. Кандидоз. Вопросы мужского бесплодия», г.Уфа, 2002г.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Разработанный метод регистрации активных форм кислорода в эякуляте используется для диагностики и определения тактики лечения

мужского бесплодия в Республиканском Центре планирования семьи и репродукции с медико-генетической консультацией г.Уфы. Материалы, полученные в диссертации, введены в учебную программу и включены в курс лекций для студентов Башкирского государственного медицинского университета, а также курсантов института последипломного образования Башкирского государственного медицинского университета.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Разработан метод оценки генерации активных форм кислорода в эякуляте и определения антиокислительной активности спермоплазмы, основанный на регистрации хемилюминееценции.

2. Усиление генерации активных форм кислорода в сперме выявлено при некоторых формах мужского бесплодия,

3. При исследовании свободно-радикального окисления в эякуляте выделена разновидность «патоспермии» при идиопатическом бесплодии, определить которую стандартными методами исследования эякулята не представляется возможным.

4. Выявление патогенетических механизмов, связанных с нарушением генерации активных форм кислорода в сперме и приведших к мужскому бесплодию, позволяют обосновать соответствующую тактику лечения, направленную на нормализацию свободно-радикального окисления в эякуляте.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, состоит да разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение полученных результатов», «Выводы», «Практические рекомендации», «Указатель литературы». Диссертация иллюстрирована 19 таблицами, 13 рисунками. В библиографический указатель включено 205 источников литературы, из которых 88 - отечественные и 117 - зарубежные.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В данной работе, в соответствии с поставленной целью и задачами, были выделены следующие основные этапы исследования (таблица 1). Было предварительно обследовано 160 мужчин, обратившихся в Республиканский Центр планирования семьи и репродукции с медико-генетической консультацией на базе Республиканской клинической больницы им. Г.Г.Куватова. Из них 10 человек - это мужчины с доказанной фертильностью (доноры спермы). Остальные 150 мужчин обратились по поводу бесплодия в браке. Из этого числа обследованных были исключены пациенты с азооспермией, генетическими аномалиями, острыми воспалительными процессами специфической и неспецифической этиологии (орхоэпидидимиты, простатиты, везикулиты, уретриты), с доказанными иммунологическими

факторами инфертильности, а также мужчины старше 40 лет. В группу наблюдения не вошли также мужчины, фертильность супруг которых была сомнительной (трубное бесплодие, нарушения менструального цикла, эндометриоз, лоликистоз яичников и т.д.).

В результате направленного отбора выделена группа соматически здоровых сексуально активных мужчин (41 пациент), которая явилась объектом углубленного клинико-лабораторного обследования. в настоящей работе. Основную группу составил 31 пациент с мужским фактором бесплодия, контрольную группу составили 10 пациентов с доказанной фертильностью (доноров спермы).

Таблица 1

Общая характеристика проведенного исследования _

№ Этапы и задачи исследования Объект и объем исследования Вид исследования

1 Определение показателей нормы ХЛ семенной жидкости и ее компонентов 10 здоровых доноров Исследование яюминолзависимой (ЛЗХЛ) и Ре2' индуцированной ХЛ семенной жидкости и ее компонентов.

2 Клинико-лабораторное обследование бесплодных мужчин, исследование ХЛ семенной жидкости и ее компонентов. 31 пациент, состоящий в бесплодном браке; 10 здоровых доноров Объективное обследование; общеклиническое, стандартный лабораторный анализ семенной жидкости. Регистрация люминолзависимой (ЛЗХЛ), Ге2+индуцированной ХЛ семенной жидкости, клеток и спермоплазмы.

3 Анализ результатов сравнения, выбор наиболее информативных показателей для оценки фертильносги 31 пациент, состоящий в бесплодном браке; 10 здоровых доноров Статистическая обработка данных с использованием 1-критерия Стьюдента, сравнение показателей ХЛ семенной жидкости с традиционными клинико-лабораторными данными.

Было проведено определение показателей нормы ХЛ семенной жидкости и её компонентов путем обследования мужчин контрольной группы. Далее выполнено клинико-лабораторное обследование, исследование ХЛ спермы и её компонентов мужчин основной группы. После статистической обработки полученных результатов, анализа полученных данных проведен

выбор наиболее информативных показателей, характеризующих функциональное состояние спермы.

Всем' пациентам проведено комплексное клинико-лабораторное обследование с применением инфекционного скрининга (путем полимеразной цепной реакции), гормональных методов диагностики (определение фолликулостимулирующего гормона, тестостерона, пролактина), трансректального ультразвукового исследования предстательной железы и семенных пузырьков, доплерографии сосудов мошонки. Проводилось исследование сока предстательной железы. Донорам спермы и пациентам с олигозооспермией выполнено кариотипирование с целью исключения генетической патологии. Всем пациентам проводились общеклинические исследования эякулята, включающие двукратную оценку семенной жидкости, полученную с интервалом 14 дней. В обеих группах регистрировали ЛЗХЛ и Fe2 '-индуцированную ХЛ цельной спермы и её компонентов. Разделение клеток семенной жидкости проводили методом изопикнотического центрифугирования в градиенте плотности,

Регистрацию люминолзависимой хемнлюминесценции (ЛЗХЛ) и Fe2*-индуцированной ХЛ эякулята проводили на аппарате «Хемилюминомер - 003» с компьютерным обеспечением, изготовлешшм в Межвузовской лаборатории технических систем медико-биологических исследований. Об интенсивности ЛЗХЛ судили по ряду параметров, в первую очередь, по светосумме (СС) и максимальной амплитуде свечения (МсС), которые соответствовали скорости образования АФК. Перед измерением свечения определенный исследуемый объем спермы смешивали с 2 мл физиологического раствора, содержащего люашмол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазинднон) в конечной концентрации 105 М, и помещали в светоизолированную камеру прибора. Тщательно перемешивали и вели запись ХЛ при 37 °С в течение 5 мин.

Для оценки антиокислительной активности 0,1 мл спермоплазмы добавляли к модельной системе (МС). В качестве модельной системы использовали 20 мл фосфатного буфера (КН2РО4- 20 rtiM, КС1 - 105 шМ, рН доводили до 7,45 титрованием насыщенным раствором КОН) с цитратом (50 гпМ) и люминолом (10'? М). В течение 10 секунд записывали темповой ток, после чего вносили инициатор образования АФК - 1 мл 50 шМ раствора сернокислого железа (FeS0471120). Конечная концентрация FeS04 в среде инкубации составляла 2,5 тМ, Запись свечения проводили в течение 5 минут при постоянном перемешивании. При оценке Ре2+-индуцированной ХЛ определяли величину спонтанного свечения (СпС), продолжительности латентного периода от момента введения ионов железа до начала развития медленной вспышки. Также оценивали амплитуды быстрой и медленной вспышек.

С целью определения источника АФК в эякуляте проводили разделение клеток спермы в градиенте плотности путем изопикнотического центрифугирования в градиенте плотности. В качестве градиента использовали фиколл/гипак: 20мл 9% фиколла ■+■ 10,0 мл 50% гипака; плотность 1,12 г/мл. рН

приготовленного градиента доводилась до 7.5. Раствор фиколла обладает незначительным осмотическим давлением во избежании повреждения разделяемых клеток. Для разделения клеток 1мл эякулята наслаивали на 1мл приготовленного градиента и центрифугировали при 500 g в течение 20 минут. Убирали надосадок, оставляя 0,2 мл центрифугата, который встряхивали и измеряли концентрацию сперматозоидов. Также проводили окраску полученных мазков с целью определения полиморфноядерных лейкоцитов. Для исследования концентрацию сперматозоидов доводили до исходной величины, то есть до уровня концентрации в нативном эякуляте, путем разведения известного объема осадка физиологическим раствором. В последующем вели регистрацию ЛЗХЛ. При использовании данной методики нейтрофилы оседали с частотой 94-95%.

Статистическая обработка полученных данных проводилась по группам мужчин методами, принятыми стандартной статистикой с использованием ПЭВМ Pentium II-200. В каждой клинической группе для оценки определенных показателей составляли вариационные ряды с последующей их обработкой: расчетом показателей структуры (в %), определением средней арифметической (М), квадратического отклонения (б), ошибки репрезентативности средней или относительной величины (т). Оценка достоверности результатов проводилась с применением критерия Стьюдента (t).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Средний возраст мужчин с доказанной фертильностью (контрольная группа) составил 28,7±0,8 лет, мужчин, обследованных по поводу бесплодия (основная группа) - 29,3±0,7 лет.

Мужчины основной группы состояли в бесплодном браке от 1 года до 13 лет (45,2% обследованных свыше 2,5 лет), В анамнезе у них наиболее часто встречались хронический простатит, заболевания, передающиеся половым путем, варикозное расширение вен семенного канатика. 10 (32,3%) мужчин имели факторы производственной вредности.

Мужчины контрольной группы не имели в анамнезе вышеперечисленных заболеваний, состояли в браке, имели здоровое потомство (1-3 ребенка). Сперма этих мужчин использовалась для донорской инсеминации.

Показатели спермограмм мужчин контрольной группы соответствовали нормативным требованиям.

По результатам анализа спермограмм у мужчин с бесплодием нами в основной группе были выделены следующие подгруппы:

• Нормозооспермия - (показатели соответствуют нормативным значениям) - 17 человек (54,8%);

• Олигозооспермия - (снижение концентрации сперматозоидов ниже 20 млн/мл) - В человек (25,8%);

• Астенозооспермия - (снижение подвижности сперматозоидов категории А-В менее 50%) - 6 человек (19,4%);

• Тератозооспермия - (увеличение доли патологических форм

сперматозоидов более 40%) - определялась у 5 (16,1%) человек. Изолированно тератозооспермия не выявлялась, а сочеталась с олигозооспермией в двух случаях (6,5%) и астенозооспермией в трех случаях (9,7%).

Эти данные представлены графически на рисунках 1 и 2.

Рис. 1 Структура результатов спермограммы пациентов основной

54,87,

В нормозооспермия

Ш астенозооспермия

группы

50%

19,4%

тератозооспермия 16.1%

■= 25,8%

о%

□ астенозооспермия

□ олигозооспермия

Рис. 2 Структура патоспермии в основной группе

Сравнительные характеристики эякулята основной и контрольной групп представлены в таблице 2. Выявлено достоверное отличие по содержанию клеток сперматогенеза в обследуемых группах: 4,7±0,7 млн/мл в

основной группе и 2±0,6 млн/мл в контрольной группе. Также выявлены достоверное уменьшение числа сперматозоидов категории «А» и увеличение числа сперматозоидов категории «О» в основной группе, по сравнению с контрольной. В обеих группах число лейкоцитов не превышало 1х 106/ мл. Достоверных отличий по содержанию лейкоцитов в анализируемых группах не выявлено.

Таблица 2

Показатели спермограммы в основной и контрольной группах

Показатели спермограммы основная группа (п-31) контрольная группа (п-1Р)

Концентрация сперматозоидов, млн/мл 54,9±8,1 81,2+11,2

Подвижность сперматозоидов, %: категории «А» 43,4±2,8*** 57,6±2,0

категории «В» 15±1,1 12,1 ±2,4

категории «С» 6,9±1,6 3,1±1,б

категории «Б» 34,7±1,9** 27,2±1,3

Морфологически полноценные, формы % 67,1+1,7 71,2+1,3

Объем, мл 3,3±0,2 3,1±0,2

Клетки сперматогенеза, млн/мл 4,7±0,7** 2+0,6

Примечание: ** -р<0,03; ***- р<0,001.

Для разработки оптимальной тактики ХЛ исследования семенной жидкости было валено выяснить, как влияют на показатели свечения изменение объема и длительность хранения исследуемого материала. Значимым моментом исследования является определение основного источника АФК в эякуляте. С этой целью на первом этапе проводили разделение эякулята на спермоплазму и клетки, в дальнейшем для отделения полиморфноядерных лейкоцитов Осуществляли изопикнотическое центрифугирование в градиенте плотности. Отдельно проводилась оценка суммарной аитиокислительной активности (АО А) спермонлазмы, степень которой оценивалась по способности подавлять свечение модельной системы.

Влияние изменения объема и длительности хранения эякулята на уровень ЛЗХЛ.

С целью выработки нормативных показателей ЛЗХЛ семенной жидкости были обследованы пациенты контрольной группы. Для регистрации ЛЗХЛ исследуемый материал забирался в следующих объемах: 0,05; 0,1 и 0,3 мл. По мере увеличения объема исследуемого материала шел рост основных параметров ХЛ. Ввиду невозможности получения большого количества материала и необходимости его использования для других анализов решено

ограничиться объемом исследуемого образца равным 0,1мл. С целью исключения изменений ЛЗХЛ в процессе хранения проведена оценка ХЛ в контрольной группе. Запись ЛЗХЛ вели через 15; 30; 45; 60 мин. Характер ХЛ спермы не меняется в течение 60 минут. Следовательно, в течение часа от момента сбора эякулята, при соблюдении правил сбора, транспортировки, хранения можно проводить измерение ХЛ эякулята.

Определение источника АФК в эякуляте.

Возможными источниками АФК в эякуляте могут являться сперматозоиды и круглые клетки. В качестве материала для исследования использовали 0,1мл взвеси клеток и 0,1 мл спермоплазмы, полученные после центрифугирования 1 мл эякулята при 500g в течение 20 минут. Каждый образец помещали в физиологический раствор люминола в конечной концентрации 10'5 М, вели запись по разработанному протоколу. Полученные данные представлены в таблице 3. На основе полученных данных можно сделать вывод, что источником АФК в эякуляте являются клетки. Уровень показателей светосуммы и максимальной светимости достоверно отличаются от соответствующих показателей полученных при исследовании спермоплазмы.

Таблица 3

Уровень ЛЗХЛ клеток и спермоплазмы в контрольной группе ........... >=10)........

Показатели ЛЗХЛ Диапазон значений Среднее значение М±т Уровень достоверности отличий

клетки плазма клетки плазма

светосумма, отн.ед. 4.2918.75 0.351,73 8.6±2.8 0.9±03 р< 0,05

спонтанная светимость, отн.ед. 0.172.11 0.062.62 1.0*0.5 0.5±0.5 -

максимальная светимость, отн.ед. 1.125.41 0.160.57 2.4±0.8 0.4±0.1 р< 0,05

Для определения уровня генерации АФК различными клетками семенной жидкости 1 мл эякулята подвергали изопикнотическому центрифугированию в градиенте плотности. При использовании данной методики нейтрофилы оседали с частотой 94-95%. Результаты исследования эякулята в контрольной группе представлены в таблице 4.

Таблица 4

Уровень ЛЗХЛ нативной спермы и отмытых сперматозоидов в контрольной группе (п~10)

---— Показатели ЛЗХЛ Нативная сперма Отмытые сперматозоиды Уровень достоверности отличий

светосумма, отн.ед. 2,9±0,8 2,8±0,4

спонтанная светимость, отн.ед. 0,9±0,27 1Л±0,07 —

максимальная светимость, отн.ед. 0,7+0,17 0,6±0,1 —

Таким образом, можно сделать вывод о том, что примесь лейкоцитов в эякуляте здоровых доноров достоверно не влияет на суммарный уровень ХЛ семенной жидкости.

Для определения роли лейкоцитов в генерации АФК проведено обследование 5 пациентов с лейкоспермией, которые не вошли ни в основную, ни в контрольную группы. Уровень лейкоцитов у этих мужчин превышал 1x106, и составил в среднем 2,5±0,ЗхЮ'5. Обследование проводилось по вышеуказанной методике. Полученные результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5

Уровень ЛЗХЛ нативной спермы и отмытых сперматозоидов у ___пациентов с лейкоспермией _________

Показатели ЛЗХЛ Лейкоспермия Нативная сперма в контр, группе

Нативная сперма Отмытые сперматозоиды

светосумма, отн.ед. 30,2±6,5* 4,4±1,2 2,9±0,8

спонтанная светимость, отн.ед. 7,1±1>3* 1,23±0,7 0,9±0,3

максимальная светимость, отн.ед. 9,3±2,1* 2,6±0,8** 0,7±0,2

Примечание: * - р<0,05 в сравнении с отмытыми сперматозоидами;

**- р<0,05 в сравнении с контрольной группой. Получены

достоверные различия по всем показателям ЛЗХЛ после выделения отмытых сперматозоидов у пациентов с лейкоспермией. Сравнивая уровни показателей ЛЗХЛ нативной спермы в контрольной группе и уровни показателей ЛЗХЛ отмытых сперматозоидов у пациентов с лейкоспермией, достоверные различия получили по уровню МсС. Уровни СС и СпС достоверно не различались. Так как источником АФК в эякуляте являются сперматозоиды и лейкоциты, то в случаях лейкоспермии у пациентов методика ЛЗХЛ спер мы может быть выполнена после разделения клеток методом изопикнотического центрифугирования в градиенте плотности.

Определение антиокислительной активности спермоплазмы.

Интегральной величиной антиоксидантного потенциала семенной

плазмы является способность спермоплазмы угнетать свечение модельной системы, в которой протекают реакции СРО.

Антиокислительные свойства спермоплазмы оценивали в % от величины угнетения свечения МС, при добавлении к последней 0,1мл спермоплазмы. Расчет проводили по формуле:

SAOA= 100% - (SMC - SMCCIT)/ SMCrl00%, где SAOA - суммарная антиокислигельная активность; SMC - светосумма модельной системы; SMCCI1 - светосумма модельной системы + спермоплазма. Суммарная АО А спермоплазмы доноров составила в среднем 41,9 %. Суммарная АОА спермоплазмы пациентов основной группы составила в среднем 41,6%.

На рисунке 3 представлен алгоритм проведения экспресс-метода регистрации ХЛ эякулята.

Рис. 3. Алгоритм определения АФК и АОА эякулята.

Изучение процессов генерации АФК спермы в норме было выполнено у 10 пациентов контрольной группы (здоровых доноров спермы). В дальнейших исследованиях использовались полученные результаты в качестве нормативов для сравнения с показателями ЛЗХЛ и Ре2 индуцированной ХЛ мужчин, состоящих в бесплодном браке. Изучение процессов генерации АФК спермы при патологии было выполнено у 31 пациента основной группы (мужчин с бесплодием).

В таблице 6 представлены основные показатели ЛЗХЛ в основной и контрольной группах до и после разделения клеток. Выявлены достоверные различия между уровнями ХЛ основной и контрольной групп. Повышение параметров СС в основной группе, вероятно, связано с различной способностью лейкоцитов генерировать АФК, а также с патоспермией, выявляемой у пациентов основной группы. Для исключения роли лейкоцитов в генерации АФК проведен сравнительный анализ после разделения клеток в градиенте плотности. В результате показатели ЛЗХЛ в основной группе после отмывания оказались значительно ниже, чем в нативной сперме, но достоверность различий с контрольной группой сохранялась.

Таблица 6

Основные показатели ЛЗХЛ в наблюдаемых группах

Основные показатели ЛЗХЛ Основная группа (п-31) Контрольная группа (п*10)

напшная г сперма 1 Сяетосумма свечения,отн.ед 28,9±8,5** 2.9±0,8

Спонтанное свечение,отаед 4,8±1,5* 0,9А0,3

Максимальная светимость,отн.ед 6,7±1,9** 0,7±0,2

отмытые сперматозоид Свстосумма свечения,отн.ед 12,1±1,9*** 2,8±0,4

Спонтанное свечение,отн.ед 2,5±0,5** 1,1±0Д

Максимальная светимость,отн.ед 4,1±0,8*** 0,6±0,)

Примечание: *- р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001.

На следующем этапе исследования сопоставляли морфо-функциональные параметры эякулята пациентов основной группы со способностью к генерации АФК сперматозоидами. В таблице 7 представлены сводные данные по всем подгруппам основной группы до и после разделения клеток, а также аналогичные данные обследования контрольной группы.

Морфо-функцноналъные показатели и показатели ХЛ основной и контрольной групп

Таблица 7

Тератоэоспермия (п-5) Нормозооспермия (п=17) Одигозооспермия (п=8) Астаюзоспермда (п=6) Основная группа (0=31) контрольная группа <п=10)

отмыт, клетки натив. сперма отмыт, клетки iMTHB. сперма отмыт, клепаг натив. сперма ОТМЫТ. клетки наша, сперма ошьгг. клетки натии. сперма ОТМЫТ. клегги натив. сперма

Кол-во- клеток млн/мл - 27,6±6,5 - 71,4+ 13,5 - П.Ш.8 - 50,5+7,1* - 54,9± 8,1 - 81,2±IU

а - 2S,4±4,4 **+ - 54,6+2,2 - 41,9±4,5 - 21,3±4,6 - 43,4± 2,8*** - 57,612,0

1 Ь - 19+5,7 - 14,8±1,б 16,1+2,8 - 14+1,4 - 15±1,1 - I2,t±2,4

"s с - 7Д±3,1 4,8±1,1 - 7,3£2,9 16,714,9* - 6,9±1,6 3,Ш,6

? d - 48,4±7,8* - 25,8±2.1 - 34,7±1,6 - 4816,6** - 34,71 1,9** - 27,2+1,3

Морфология % - 47,4±1,8 - 73,1 ±0,9 - 62,9±4,2 - 60,2±5,4 - 67,111, 7 - 71,211,3

Кол-во лейкоцитов 0 менее Ылв'мд 0 менее 1мяа'мл 0 менее 1 млн/мл 0 менее 1 млнмл 0 менее 1млн/м 0 менее 1мли'юг

а о СС 23,3± 3,90"** 39,3+11,3 12,9± 2,8** 38,3± 14,9* 8,2±3,2 13,4 ±6,8 15.3+ 53* 22,9±Ш,9 12,1+ 1 д*** 28,9± 8,5** 2,8±0,4 2,9+0,8

§ 3 2 s СпС 3,03±0.6 3,910,7** 3,3±0,8 ** 7,1±2,7* 1,4+0,4 1.Ш.7 1,810,7 2,110,7 2,510,5 4,8+1,5 * 1,1+0,1 0,910,3

Ы s MC 8,242,6* 9,9+3,1** 4,5+1,2 »* 8,7±3,4* 2,6+1,3 3,4±1,9 5,02± 2,5 5,612,8 4,110,8 6,7+1,9 ** 0,6±0,1 0,7±0,2

S а СС - 29,3±1.8 - ЗЗ.Ш.0 - 30,1 ±3,2 - 32,Э±2,1 - 31,7± 1,1 - Э1,9±1,9

т Ш СпС - 7,4+1,3 - 7,5+1,9 - 8,9±!,6 - 8,0±},8 - 8,8±] - б,9±1,2

Ьз Я £ а а.? Мс - 13,9±0,9 - 15ДЮ.8 - 14,8+0,6 - 15,6+0,7 14,8± 0,3 - 15,Ш,0

Из таблицы видно, что в целом морфо-функциональные параметры эякулята основной группы достоверно отличались от контрольной лишь по подвижности: по категории «А» (быстрое поступательное движение сперматозоидов) - р<0,001, и по категории «В» (неподвижные сперматозоиды) - р<0,01. Различия при анализе морфо-функциональных характеристик в подгруппах соответствовали принципу, по которому было проведено разделение на данные подгруппы. Так, в подгруппе с олигозооспермией достоверные различия по сравнению с контрольной группой были выявлены по количеству клеток (р<0,001) и по подвижности (по категориям «А» и «О» - р<0,01), при этом концентрация сперматозоидов была ниже нормативных показателей ВОЗ, а процент подвижных сперматозоидов соответствовал нормам ВОЗ. В подгруппе с астенозооспермией достоверные различия по сравнению с контрольной группой были выявлены по уровню подвижности (категории «А» - р<0,001, категории «С» - р<0,05, категории «О» - р<0,01) и по количеству клеток - р<0,05, хотя в среднем концентрация сперматозоидов в этой подгруппе соответствовала нормам ВОЗ, В подгруппе с нормозооспермией достоверных различий по сравнению с контрольной группой не было.

В подгруппе с тератозооспермней достоверные различия выявлены, в отличие от остальных подгрупп, по морфологическим параметрам (р<0,001), а также по показателям прогрессивно подвижных сперматозоидов (р<0,001), концентрации половых клеток (р<0,01).

При анализе показателей ЛЗХЛ нативной спермы пациентов основной группы выявлены достоверные отличия по уровню СС (р<0,01), СпС (р<0,05), Мс (р<0,01) в сравнении с контрольной группой. Различия сохранились и после разделения клеток в градиенте плотности; СС (р<0,003), СпС (р<0,01), Мс (р<0,001). Однако, не во всех подгруппах основной группы были получены аналогичные результаты, достоверные различия выявлены при нормозооспермии и тератозооспермии. Основные показатели ЛЗХЛ при тератозооспермии достоверно отличались от соответствующих показателей контрольной группы (СС - р<0,01, СпС - р<0,01, Мс - р<0,01). Различия сохранились и после разделения клеток в градиенте плотности: СС (р<0,001), СпС (р<0,01), Мс (р<0,05). Видимо, увеличение показателей ЛЗХЛ обусловлено большей способностью сперматозоидов с измененной морфологией к генерации АФК.

При исследовании нативной спермы пациентов с олигозооспермией и астенозооспермией по сравнению с контрольной группой достоверных различий не выявлено. В то же время после разделения клеток показатели СС в подгруппе с астенозооспермией стали достоверно отличаться от контрольной группы (р<0,05). На увеличение среднего показателя светосуммы повлияло наличие в данной подгруппе пациентов с тератозооспермией. Как уже было указано выше, изолированно тератозооспермия не выявлялась, а сочеталась с олигозооспермией в 6,5% случаев и астенозооспермией в 9,7%случаев.

При сравнении показателей ЛЗХЛ у пациентов основной группы с нормозооспермией и пациентов контрольной группы были получены достоверные различия по уровню СС (р<0,05), СпС (р<0,05), Мс (р<0,05). Различия увеличились после разделения клеток в градиенте плотности: СС (р<0,01), СпС (р<0,01), Мс (р<0,01). Таким образом, у пациентов основной группы с нормозооспермией не было выявлено достоверных отличий с контрольной группой по основным морфо-функциональным характеристикам эякулята, но обнаружены достоверные отличия по показателям ЛЗХЛ.

На основании этого можно сделать вывод, что имеется разновидность «патоепермии» при бесплодии, установить которую стандартными методами исследования эякулята не представляется возможным. При проведении анализа была выявлена большая способность к генерации АФК сперматозоидов с неполноценной морфологической структурой, что изолированно не определялось, а сочеталось с другими видами патоепермии. Это является доказательством того, что АФК на этапе созревания половых клеток могут служить непосредственной причиной патоепермии. Этап дозревания сперматозоидов проходит на уровне придатка яичка. Наибольшее число пациентов с патоспермией имели различные нарушения на уровне эпидидимиса с одной или двух сторон, следовательно, действие патологических факторов именно на уровне придатка яичка приводит к формированию патологических форм сперматозоидов, которые в последующем оказывают повреждающее действие на более полноценные формы. Это проявляется в виде увеличения содержания неподвижных форм сперматозоидов в эякулятах с высоким уровнем СРО.

В исследовании показана способность спермоплазмы угнетать свечение модельной системы. Данный феномен ингибирующего влияния биологической жидкости на генерацию АФК можно объяснить наличием в ней антиоксидантов, угнетающих образование радикалов на различных фазах цепной реакции СРО. Спермоплазма пациентов основной и контрольной групп в одинаковой степени влияла на показатели СС и Мс модельной системы. Таким образом, нарушение процессов свободно-радикального окисления в эякуляте связано с повышенной генерацией АФК клетками (морфологически и функционально аномальные сперматозоиды и лейкоциты), при этом суммарная антиокислительная активность остается стабильной в отсутствии поражения добавочных половых желез.

Изучение фракций семенной жидкости в процессах СРО, выявление их участия в ХЛ представляло интерес для уточнения причин, ведущих к нарушению состояния СРО при некоторых нозологиях, оцененных по нормативам ВОЗ. Обнаружено увеличение основных показателей ЛЗХЛ как осадка, так и цельного эякулята у инфертильных мужчин по сравнению с контрольной группой. Не выявлено достоверных различий при исследовании суммарной АОА семенной плазмы в указанных группах. По данным литературы, процент объемных компонентов эякулята, образующийся в яичках, составляет в среднем 5%. Основная масса эякулята формируется на

уровне добавочных половых желез (предстательная железа, семенные пузырьки, Куперовы железы) и представлена в основном жидкой частью эякулята (спермоплазма). Спермоплазма формирует основную массу АО потенциала семенной жидкости. Можно предположить, что АОА спермоплазмы не влияет на формирование половых клеток, так как образование основного объема спермоплазмы происходит на уровне добавочных половых желез. Незрелые сперматозоиды с повышенной способностью к генерации АФК могут оказывать свое повреждающее действие на полноценные половые клетки до того момента, как последние смешаются с основным объемом спермоплазмы, являющейся основным источником антиоксидантов в эякуляте. Учитывая то, что различий между основной и контрольной группой по уровню суммарной АОА не было выявлено, а уровень определяемых показателей хемилюминесценцин (СС, СпС, Мс) достоверно различался, можно заключить, что АФК играют роль в патогенезе мужского бесплодия и применение антиоксидантных препаратов клинически оправдано. С целью дифференцированного подхода к антиоксидантной терапии мужского бесплодия целесообразно предварительно определять состояние свободно-радикального статуса. При наличии дисбаланса процессов окисления необходимо проводить коррекцию генерации АФК в зависимости от локализации поражения, действуя либо на уровне придатков яичек, либо на уровне добавочных половых желез.

Таким образом, на основе обобщения данных литературы и результатов собственных исследований можно прийти к выводу, что АФК играют важную роль в патогенезе мужского бесплодия. Разработан эффективный экспресс-метод определения АФК в сперме, основанный на регистрации ХЛ. Проведена оценка уровня антиокислительной активности в спермоплазме. Клинически обоснована эффективность применения хемилюминесцентных методов исследования как дополнительного критерия оценки мужского фертильности. Намечены патогенетические механизмы к лечению некоторых видов мужского бесплодия антиоксидантами.

20

ВЫВОДЫ

1. Разработан и апробирован в клинических условиях комплексный подход для выявления мужской инфертильности, основанный на оценке состояния свободно-радикального окисления в эякуляте путем определения генерации активных форм кислорода в сперме и антиокислительной активности в спермоплазме.

2. Выбраны оптимальные условия для измерения активных форм кислорода методом регистрации люминолзависимой хемилюминесценции эякулята и определения антиокислительной активности спермоплазмы в модельной системе, генерирующей активные формы кислорода,

3. В норме сперматозоиды характеризуются низкой способностью к генерации активных форм кислорода, а спермоплазма обладает высокой антиокислительной активностью.

4. При патологии (мужской инфертильности) происходит увеличение интенсивности свободно-радикального окисления в эякуляте за счет повышенной генерации активных форм кислорода функционально неполноценными сперматозоидами на фоне неизмененной антиокислительной активности спермоплазмы при отсутствии воспаления в урогенитальной зоне.

5. Метод регистрации спонтанного люминолзависимого свечения эякулята и определения общей антиокислительной активности спермоплазмы является эффективным дополнительным критерием при оценке мужской инфертильности, наряду с традиционными клинико-лабораторными методами исследования.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанный комплексный метод хемилюминесцентного исследования процессов генерации активных форм кислорода в эякуляте и определения общей антиокислительной активности спермоплазмы рекомендуется применять для оценки мужской инфертильности в клинической урологии, как эффективный дополнительный метод диагностики.

2. Рекомендуется следующая методика комплексного исследования состояния генерации активных форм кислорода в сперме:

• перед измерением свечения 0,1 мл исследуемой спермы следует смешать с 2 мл физиологического раствора, содержащего люмииол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион) в конечной концентрации 10-5 М, тщательно перемешать и вести запись хемилюминесценцин при 37 °С в течение 5 мин;

• исследование может быть проведено в течение 1 часа после разжижения;

• при величине светосуммы, превышающей 2,9±0.8 спн.ед., даже при нормативном" содержании лейкоцитов, необходимо проведение разделения клеток путем изопикнотического центрифугирования в градиенте плотности с

последующим определением уровня люминолзависимой

хемилюминесценции;

• в качестве градиента плотности используется фиколл/гипак: 20мл 9% фиколла + 10,0 мл 50% гипака; плотность 1,12 г/мл. рН приготовленного градиента доводится до 7.5. Для разделения клеток 1мл эякулята наслаивается на 1мл приготовленного градиента и центрифугируется при 500 g в течение 20 минут.

3. Рекомендуется следующая методика изучения антиокислительной активности в слермоплаэме:

• в качестве модельной системы используется 20 мл фосфатного буфера (КН2Р04 - 20 mM, КС1 - 105 тМ) с цитратом (50 тМ) и люминолом (10-5 М). В течение 10 секунд длится запись темнового тока, после чего вносится инициатор XJI - 1 мл 50 шМ раствора сернокислого железа (FeS047H20). Запись свечения проводится в течение 5 минут;

• спермоплазму, полученную после центрифугирования семенной жидкости, в объеме 0,1 мл следует добавить к модельной системе. В течение 10 секунд длится запись темнового тока, после чего вносится инициатор XJI -1 мл 50 шМ раствора сернокислого железа. Конечная концентрат« сернокислого железа в среде инкубации составляет 2,5 тМ, Запись свечения проводится в течение 5 минут при постоянном перемешивании;

• антиокислительные свойства спермоплазмы оцениваются в процентах от величины угнетения свечения МС, при добавлении к последней спермоплазмы по формуле:

S АОА= 100% - (SMC - SMCCn)/ SMC г 100%,

где SAOA - суммарная антиокислительная активность;

SMC - светосумма модельной системы;

SMCCn - светосумма модельной системы + спермоплазма.

4. Применение антиоксидантных препаратов при терапии мужской инфертильности целесообразно при повышении генерации активных форм кислорода в эякуляте, сопровождающемся увеличением интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции сперматозоидов, или уменьшении суммарной антиокислительной активности спермоплазмы, оценивающейся по угнетению свечения модельной системы.

22 I

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ !

1. Методы оценки репродуктивной функции мужчин. - Уфа: Здравоохранение Башкортостана, 2001. - 48с. (соавт.: Р.Р.Фархутдинов, Ш.Н.Галимов, Ф.Х.Камилов, Э.Ф.Аглетдинов, Х.Г.Валеева, А.П.Голощапова, Н.Й.Симонова,

B.И.Иваха)

2. Метод регистрации хемилюминесценции для оценки мужской фертильности// Новые медицинские технологии: Материалы 1-го Международного конгресса. - СПб., 2001. - С.62. (соавт.: Р.Р.Фархутдинов, Р.Р.Садыков)

3. Репродуктивное здоровье мужчин как индикатор экологического неблагополучия'/ Лечение бесплодия: нерешенные проблемы: Сборню научных трудов. - Саратов, 2001. - С.15-16, (соавт.: Ш.Н.Галимов Ф.Х.Камилов, Э.Ф.Аглетдинов, Х.Г.Валеева, В.И.Иваха)

4. Влияние активных форм кислорода на мужскую фертильность.// Вопрось теоретической и практической медицины: Материалы 66-й Республиканец научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ. - Уфа, 2001, -

C.10.

5. Свободнорадикальное окисление в патогенезе мужского бесплодия/. Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека: Материалы научно практической конференции с международным участием. - Смоленск, 2001. -С.176-177. (соавт.: Р.Р.Фархутдинов, Р.Р.Садыков)

6. Активные формы кислорода в эякуляте// Здравоохранение Башкортостана -2001. - Спец. выпуск Х»5.: Неотложные состояния в урологии. - С.92. (соавт. Р.Р.Садыков Р.Р.Фархутдинов, М..А. Нартайлаков)

7. Оценка репродуктивного здоровья мужчин-рабочих одного из предприятий г Туймазы// Здравоохранение Башкортостана. - 2001. - Спец. выпуск №8. ■ С.28-32. (соавт.: А.В,Варшавский, Э.Ф.Аглетдинов, М.И.Павлов, А.А.Ракчаев

8. Оценка риска репродуктивному здоровью мужчин в Республик Башкортостан// Проблемы интеграции науки, образования и производств южного региона Республики Башкортостан: Сборник научных трудов Peer научно-практической конф. - Уфа: Кзд-во «Тилем», 2001. - С. 13-16. (соавт. Ш.Н.Галимов, Ф.Х.Камилов, Э Ф.Аглетдинов, Х.Г.Валеева, А.П Голощапош И.И.Симонова, А.Р.Мавзютов, В.И.Иваха)

9. Антропогенное загрязнение среды обитания и репродуктивное здоровь мужчины// Химическая экология: Материалы школы-семинара. - Уфа, 2001. С. 163-166. (соавт.: Ш.Н.Галимов, Ф.Х.Камилов, Э.Ф.Аглетдинов)

10. Анализ риска репродуктивному здоровью мужчин в экологическ неблагополучном регионе: критерии оценки .//Научные аспект] экологических проблем России: Тез. докл. Всероссийской конф. - СПб., 200 -С. 140. (соавт/. Ш.Н.Галимов, Ф.Х.Камилов, Э.Ф.Аглетдинов,Н.И.Симонов; Х.Г.Валеева,. П.Голощапов, В.И.Иваха)

11, Синдром андрогенной недостаточности как маркер техногенног загрязнения среды обитання//Проблемы репродукции, - 2002. -Т.8, №1, С.46-50. (соавт.: Ш.Н.Галимов, Ф.Х.Камилов, Э.Ф.Аглетдинов, Х.Г.Валеев А,П.Голощапов, В.И.Иваха).