Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Преодоление лекарственной устойчивости липосомальными препаратами из группы нитрозоалкилмочевин

ГРИЩЕНКО НАТАЛИЯ ВИКТОРОВНА

ПРЕОДОЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ЛИПОСОМАЛЬНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ ИЗ ГРУППЫ НИТРОЗОАЛКИЛМОЧЕВИН

Специальность: 14.01.12 — Онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 1 Г"'' <

1 I , I

МОСКВА-2014

005556631

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» (директор - академик РАН, доктор медицинских наук, профессор Давыдов Михаил Иванович).

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор, академик РАН Давыдов Михаил Иванович

кандидат фармацевтических наук Барышникова Мария Анатольевна

Официальные оппоненты:

Якубовская Раиса Ивановна — доктор биологических наук, руководитель отделения модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена» Минздрава России.

Голенков Анатолий Константинович - доктор медицинских наук, профессор, руководитель отделения клинической гематологии и иммунотерапии ГБУЗ МО Московского областного научно-исследовательского клинического института имени М.Ф. Владимирского.

Ведущее научное учреждение:

Ведущее учреждение - Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова.

Защита диссертации состоится 014 г. в '/^часов на заседании

диссертационного Совета Д. 001.0^7.02 <#ГБНУ «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ «РОЬЩ им. Н.Н.Блохина».

Д. 24.

Ученый секретарь диссертацион доктор медицинских наук, проф>

Автореферат разослан « ой/»

Барсуков Юрий Андреевич

Введение

Актуальность проблемы

Химиотерапия является одним из основных методов лечения злокачественных новообразований. Однако у больных быстро развивается устойчивость к препаратам, используемым для терапии опухоли. Устойчивость к противоопухолевым лекарствам обусловлена многими механизмами, позволяющими опухоли избежать токсического действия химиопрепаратов. Среди этих механизмов наиболее изученным является гиперэкспрессия гена множественной лекарственной устойчивости MDR1 и его продукта гликопротеида pgp 170, которая проявляется уменьшением внутриклеточного накопления противоопухолевых препаратов и приводит к значительному снижению эффективности лечения. Другим механизмом развития лекарственной устойчивости является утрата различных рецепторов, через которые проходят сигналы клеточной гибели.

В настоящее время изменилось представление о механизмах клеточной гибели под воздействием химиопрепаратов. Были охарактеризованы новые виды программированной клеточной гибели, такие как внешний и внутренний апоптоз, аутофагия, кератоз и др. Было показано, что различные препараты и их лекарственные формы по разному убивают опухолевую клетку. Многие химиопрепараты вызывают гибель опухолевых клеток по механизму апоптоза, активируя при этом различные сигнальные пути клеточной смерти.

В последние годы было обнаружено, что липосомальная лекарственная форма препаратов преодолевает множественную лекарственную устойчивость. Однако механизм преодоления лекарственной устойчивости до конца не ясен. Липосомальная лекарственная форма имеет ряд преимуществ. Липосомы предохраняют препарат от воздействия агрессивной внешней среды, изменяют фармакокинетику препарата, способствуют избирательному накоплению препарата в опухоли. Они не токсичны и биодеградируемы. Липосомы изменяют цитофармакокинетику препарата и можно предположить, что они убивают опухолевую клетку по другому механизму по сравнению с традиционной лекарственной формой.

з

Хорошей моделью для изучения механизма действия противоопухолевых препаратов являются перевиваемые клеточные линии. В ФГБНУ «РОНЦ им.

H.Н.Блохина» получена большая панель культур клеток меланомы кожи человека. Некоторые из них устойчивы к препаратам группы нитрозоалкилмочевины. С помощью этих клеточных культур можно изучать механизм действия различных лекарственных форм, в том числе и липосомальных.

Цель исследования

Изучение преодоления лекарственной устойчивости лекарственной формой противоопухолевых препаратов нитрозоалкилмочевин.

Задачи исследования

I. Охарактеризовать клеточные линии меланомы кожи по экспрессии рецептора CD95/Fas, опосредующего апоптоз.

2. Охарактеризовать клеточные линии меланомы кожи по экспрессии гликопротеидов генов множественной лекарственной устойчивости.

3. Сравнить цитотоксическое действие липосомальных и традиционных лекарственных форм препаратов из группы нитрозоалкилмочевины аранозы и OR-2011 на линиях меланомы кожи человека mel Z, mel Mtp, mel Mtp clone X, mel Ibr, mel Kor.

4. Определить индукцию апоптоза в клеточных линиях липосомальными и традиционными лекарственными формами препаратов из группы нитрозоалкилмочевины.

Научная новизна

Впервые обнаружено, что липосомальная лекарственная форма противоопухолевого препарата аранозы индуцирует апоптоз.

Впервые продемонстрировано, что липосомальная лекарственная форма противоопухолевых препаратов не использует С095-зависимый путь индукции апоптоза.

липосомальной из труппы

Научно-практическая значимость

Данные, полученные в настоящем исследовании, могут быть использованы для обоснования применения липосомальных лекарственных форм противоопухолевых химиопрепаратов при лечении онкологических больных, а также повышения чувствительности опухолевых клеток к химиопрепаратам и преодоления множественной лекарственной устойчивости.

Апробация диссертационной работы

Апробация диссертационной работы состоялось 25 июня 2014 г. на совместной научной конференции лаборатории разработки лекарственных форм, лаборатории биомаркеров и механизмов опухолевого ангиогенеза, лаборатории фармакологии и токсикологии, лаборатории рекомбинантных опухолевых антигенов, лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории медицинской биотехнологии, лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБНУ «РОНЦ имени H.H. Блохина».

Материалы диссертационной работы были представлены на научно-практической конференции с международным участием «Противоопухолевая терапия: от эксперимента к клинике» Москва, 20-21 марта 2014 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 204 источника, из которых 60 отечественных и 144 зарубежных авторов. Материалы диссертации изложены на 154 машинописных страницах. Диссертация иллюстрирована 21 таблицей и 26 рисунками.

Диссертация выполнена в лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей (заведующий - доктор медицинских наук, профессор А.Ю. Барышников) ФГЪНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина».

Материалы и методы исследования Клеточные линии и их культивирование

Исследования проводили на 5 клеточных линиях диссеминированной меланомы человека: mel Z, mel Mtp, mel Mtp clone X, mel Ibr, mel Kor, полученных из банка клеточных культур ФГБНУ «РОНЦ им. H.H. Блохина».

Клеточные линии культивировали в полной среде RPMI-1640, при 37° С в атмосфере 5 % С02. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста постоянным пересевом культуры через 3-4 дня. Для снятия клеток с пластика использовали раствор Версена.

Химиопрепараты

«Араноза лиофилизат для приготовления раствора для инъекций» (араноза-лио) (Филиал «Наукопрофи» ФГБНУ РОНЦ им. H.H. Блохина), липосомальная араноза (лаборатория разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО), OR-2011-лио (лаборатория разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО), липосомальный OR-2011 (лаборатория экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО).

Изучение цитотоксического действия препаратов методом МТТ-тест

Клетки в концентрации 4*103 клеток на лунку в 180 мкл полной среды RPMI-1640 помещали в 96-луночные плоскодонные планшеты. Для оценки цитотоксического действия в каждую лунку добавляли по 20 мкл исследуемых препаратов в разных концентрациях и инкубировали с клетками в течение 24, 48 и 72 ч при 5% С02 и температуре 37° С. В контрольные лунки с клетками добавляли по 20 мкл среды RPMI-1640 или растворителя, в котором разводили препараты. Через 24,48 или 72 ч в каждую лунку вносили по 20 мкл раствора МТТ в исходной, концентрации 5 мг/мл (Sigma, Chemical Со, США) и инкубировали 4 ч в термостате при 37° С в атмосфере с 5% С02. По окончании инкубации планшеты

центрифугировали при 1500 оборотах/мин в течение 6 мин. Надосадочную жидкость удаляли. Осадок растворяли, внося в каждую лунку по 150 мкл диметилсульфоксида (DMSO, Sigma, Chemical Со, США). Планшеты помещали на 7 минут в термостат при температуре 37° С. Далее планшеты встряхивали на шейкере, после чего определяли оптическую плотность раствора формазана на фотометрическом анализаторе иммуноферментных реакций «АИФР - 01 Униплан» (ЗАО, «Пикон») при длине волны 530 нм. Величина поглощения прямо пропорциональна числу живых клеток.

Процент живых клеток вычисляли по формуле: N,

N0 = -х 100 %

N2

N0 — процент живых клеток;

N] — средняя оптическая плотность в лунках, содержащих клетки и препарат; N2 — средняя оптическая плотность в контрольных лунках, содержащих только клетки.

Метод двойного окрашивания с использованием Аннексина V-FITC в комбинации с пропидием йодидом

Клетки выращивали в 6-луночных планшетах (Costar) в полной среде RPMI-1640. В лунки засевали по 2 мл клеточной суспензии, содержащей 1х105 клеток/мл. Через сутки в лунки с клетками добавляли аранозу-лио или липосомальную аранозу в концентрациях 450 мг/мл или 900 мг/мл. В контрольные лунки с клетками препараты не добавляли. Через 24 ч инкубации клетки снимали раствором Версена в пробирки со средой, в которой они росли, и осаждали центрифугированием 5 мин при 1000 оборотов/мин. Затем клетки отмывали, после чего помещали в пробирки по 250-500 тыс. клеток на пробирку в 100 мкл аннексин-связывающего буфера. В пробирки добавляли по 5 мкл Аннексина V-FITC и 5мкл пропидия йодида (PI). Образцы инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин. Далее к пробам добавляли 400 мкл аннексин-связывающего буфера и проводили анализ на проточном цитофлуориметре. Анализ апоптотических клеток, окрашенных Annexin V-FITC/PI,

основывался на регистрации раннего апоптоза Annexin V-FITC+/Pr и позднего апоптоза Annexin V-FITC+/PI+.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

Экспрессию антигенов определяли в прямой реакции иммунофлуоресценции. В пробирки с 50 мкл клеток в количестве 500 тыс. на пробирку добавляли по 10 мкл моноклональных антител, меченных фикоэритрином (РЕ) и инкубировали в течение 30 мин при 4° С, затем клетки дважды отмывали PBS и анализировали на проточном цитофлуориметре.

Проточный цитофлуориметрический анализ

Экспрессию антигенов определяли на проточном цитофлуориметре FACSCantoII (Becton Dickinson, США). В каждой пробе анализировали от 5000 до 10000 тысяч событий.

Определение мРНК mFas и sFas

200 мкл суспензии клеток смешивали с равным объемом лизирующего раствора (4 М гуанидин тиоционата, 250 мМ ацетата натрия, 0,5 % Triton Х-100), добавляли 400 мкл смеси фенола с хлороформом (1:1), преципитировали изопропанолом и промывали 75 % этиловым спиртом. Осадок разводили в 20 мкл воды, свободной от нуклеаз. Полученный препарат использовали в реакции обратной транскрипции с использованием MMLV ревертазы (AmpliSens, Россия), согласно рекомендациям производителя. В качестве затравки использовали поли-Т праймер.

Детекцию мРНК мембранной формы Fas антигена (мРНК Fas) и мРНК растворимой формы Fas антигена (мРНК sFas) и оценку относительных уровней проводили методом ПЦР в реальном времени. Для нормализации использовали уровень мРНК UBC. Реакционная смесь содержала ПЦР буфер, 5 единиц активности TaqF-полимеразы (ООО «ИнтерЛабСервис», Москва), 0,4 мМ каждого из дНТФ, по 10 пМ праймеров, по 5 пМ зондов специфичных к исследуемым мРНК. Первичная структура праймеров и зондов представлена в таблице 1. ПЦР проводили в анализаторе нуклеиновых кислот DTlite (ДНК технология, Москва)

при следующих температурных условиях: 94° С - 15 мин и 50 циклов при 94° С -30 с, 55° С - 40 с, 72° С - 45 с. Уровни мРНК компенсировались с учетом эффективности реакции и нормализовались относительно уровня мРНК 1ЛЗС.

Таблица 1

Первичная структура праймеров и зондов используемых в ИЦР в реальном

времени

Праймер Первичная структура (5' — З1)

Fas-F ACCAAATGTGAACATGGAAT

Fas-R TTCCTTTCTCTTCACCCAA

sFas-R TTCCTTTCTCTTCACTTCC

Fas-Z ROX-AGATCTAACTTGGGGTGGCTTTGTCTTCTT-BHQ2

sFas-Z FAM-AGAGGAAGTGAAGAGAAAGGAAGTACAGA-BHQ1

UBC-F CACAGCTAGTTCCGTCGCA

UBC-R GAAGATCTGCATTGTCAAGT

UBC-Z R6G-ATTTGGGTCGC AGTTCTTGTTTGTGG AT-BHQ1

Статистическая обработка результатов

Статистический анализ проводили с использованием программы BIOSTAT (Version 3.2), Microsoft Excel 2003, STATISTICA V. 8.0. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента. Различия считали статистически достоверными при р â0,Q5.

Результаты собственных исследований Исследование фенотипа клеточных линий меланомы

Были исследованы клеточные линии mel Mtp, mel Mtp clone X, mel Kor, mel Z и mel Ibr. Ранее было показано, что клетки линии mel Mtp cloneX не экспрессируют рецептор CD95/Fas и резистентны к действию аранозы. Для более детальной характеристики этих клеточных линий было проведено изучение экспрессии антигена CD95/Fas и гликопротеида pgpl70 (продукта гена множественной лекарственной устойчивости MDR1) методом проточной цитофлуориметрии, а также наличие в меланомных клетках мРНК генов CD95/Fas

и MDR1 методом ПЦР. Кроме того, была исследована функция гликопротеида pgpl70 по выбросу родамина.

Статус CD95/Fas рецептора

В результате проведенной работы было обнаружено, что клетки линий клеток mel Mtp, mel Mtp clone X и mel Z не экспрессируют антиген CD95/Fas, a клетки линии mel Kor и mel Ibr — экспрессируют. Результаты представлены на рисунке 1.

Контроль CD95

Контроль

CD95

Specimen 001-Tube t

а _ А

Ä РЗ

¡и . á \

' J.J.2 '

Specimen 001 -Tube. 008

. о ю^ 10 1 о ID

PE-A Г Контроль

Specimen OOl-Tut

SLI a =

> ' Jr., 1

§н / \

Д Контроль

................. i""L11 iii"i_ ■

0 10 10 10* 10s PE-A

CD95

Specimen 001-Tube 008

CD95

Рис. 1. Гистограммы распределения клеток меланомы кожи, окрашенных моноклональными антителами против антигена CD95/Fas, меченными фикоэритрином: А - mel Mtp; Б - mel Mtp clone X; В - mel Z; Г - mel Kor; Д-mel Ibr.

Как видно из рисунка 1, контрольные изоспецифические моноклональные антитела не окрашивали клетки ни одной клеточной линии. Моноклональные антитела анти-С095-РЕ реагировали с клетками только двух клеточных линий -mel Ког и mel Ibr. Клеточная линия mel Kor содержала 39 % антиген-положительных клеток, а mel Ibr — 64,7 % антиген-положительных клеток.

Таким образом, из 5 исследованных линий клеток меланомы кожи человека только две линии экспрессировали рецептор CD95/Fas, опосредующий апоптоз.

Известно, что отсутствие экспрессии белка не всегда отражает активность гена. В связи с этим нами было проведено изучение наличия мРНК гена CD95/Fas в вышеуказанных клеточных линиях. Оценку уровней мРИК проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Определяли два вида тРНК — мембраносвязанную (mFas) и растворимую (sFas) формы. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Значения относительных уровней мРНК mFas и sFas

Уровень мРНК Линии клеток меланомы

Mtp Mtp clone X Ibr Kor Z

mFas/UBC 0 0 0,25 0,13 0,19

sFas/UBC 0 0 0,14 0,15 0,28

mFas/sFas 0 0 1,76 0,89 0,67

Оба вида мРНК отсутствовали в клетках mel Mtp и mel Mtp clone X. В клетках mel Z уровень mFas был ниже уровня sFas (0,19 и 0,28 ед. соотвественно). Соотношение mFas/sFas - 0,67. Таким образом, клетки линии mel Z имеют мРНК антигена CD95/Fas, но не экспрессируют белок. Клетки линии mel Kor имеют мРНК mFas и sFas (0,13 и 0,15 соответственно). Соотношение этих мРНК было 0,89. Клетки линии mel Ibr содержат больше mFas мРНК, чем sFas мРНК (0,25 и 0,14 соответственно). Их соотношение составило 1,76. Фенотип статуса CD95/Fas рецептора представлен в таблице 3

Таблица 3

Фенотип CD95/Fas рецептора в клеточных линиях меланомы

Клеточные линии mel Mtp mel Mtp clone X melZ mel Kor mel Ibr

Антиген CD95/Fas — — - + +

mFas mPHK CD95/Fas — — + + +

sFas мРНК CD95/Fas — + + +

Таким образом, клеточные линии меланомы кожи различались по экспрессии CD95/Fas рецептора, опосредующего апоптоз. Клетки линий mel Kor и mel Ibr экспрессировали белок и имели мРНК этого рецептора, клетки линий mel

12

Mtp, mel Mtp clone X и mel Z не экспрессировали на своей поверхности антиген. Клетки линии mel Z имели мРНК антигена CD95/Fas, а клетки линий mel Mtp и mel Mtp clone X - не имели мРНК антигена CD95/Fas.

Статус MDR1 гена

Одним из механизмов защиты опухоли от противоопухолевых препаратов является гиперэкспрессия ABC-транспортеров. Среди них наиболее изученным является ген множественной лекарственной устойчивости MDR1 и его продукт гликопротеид pgp 170. Исследование было проведено на трех клеточных линиях меланомы mel Ког, mel Mtp clone X и mel Ibr. Эти культуры клеток были охарактеризованы по экспрессии белков множественной лекарственной устойчивости, по экспрессии мРНК этих генов и выбросу родамина 123.

Исследование экспрессии продукта гена MDR1 гликопротеида pgp 170 показало, что только клетки mel Ibr экспрессировали pgpl70 на 35 - 50 % клеток (Рис. 2). На других клетках реакция моноклональных антител к pgp 170 отсутствовала. Моноклональные антитела против MRP1 не реагировали с этими клетками.

2,96!

10" 10' 10г 10' 10'

Ik

2,92!

А Контроль

pgp170

Ik

3.46?

10' 10=

34.2%

Б Контроль

pgp170

Рис. 2. Гистограммы распределения клеток, окрашенных моноклональными антителами к рдр170, меченными фикоэритрином: А - ше1 Ког; Б - те11Ьг.

При исследовании уровня мРНК генов MDR1 и MRP1 за контроль фонового уровня были выбраны клетки mel Kor (Табл. 4). Значение в таблице показывает, во сколько раз относительно контроля изменяется экспрессия мРНК исследуемого гена.

Таблица 4

Сравнение уровней мРНК генов MDR1 и MRP1 в меланомных клеточных

линиях

Линии клеток меланомы Гены транспортеры

MDR1 MRP1

Mel Ког Контроль контроль

Mel Ibr 12,46663 1,505247

Mel Mtp clone X 38,05463 -2,39496

Функциональную активность гликопротеидов pgpl70 vi MRP 1 определяли по выбросу родамина 123. Исследование выброса родамина 123 показало, что клетки линии mel Ког накапливают родамин 123 и не выбрасывают его (Рис. 3, Табл. 5). Средний канал флуоресценции был равен 1157 без верапамила и 1146 с верапамилом. Таким образом, клетки mel Ког не экспрессируют pgpl70, не имеют мРНК генов MDR1 и не выбрасывают родамин 123.

Таблица 5

Выброс родамина 123 клетками линий меланомы (средний капал флуоресценции)

Линия клеток Накопление родамина 123 Выброс родамина 123

mel Kor 1157 1146

mel Ibr 1175 533

mel Mtp clone X 177 23

Mean 1157

10'

накопление родамина 123

Mean 1175

накопление родамина 123

Mean 177 L

A

10' 10' 101 10" 10'

В накопление родамина 123

Mean 1146

10е 10' ID'

выброс родамина 123

Mean 533

выброс родамина 123

еап 23

выброс родамина 123

Рис. 3. Накопление и выброс родамина 123 (mean - средний канал флуоресценции): А - mel Ког; Б - mel Ibr; В - mel Mtp clone X.

Клетки линии mel Ibr выбрасывали половину родамина 123 (Рис. 3, табл. 5). Средний канал флуоресценции был 1175 с верапамилом и 533 без верапамила. Таким образом, эти клетки экспрессируют гликопротеид pgpl70 на 35 — 50 % клеток, имеют повышенный уровень мРНК гена MDR1 и выбрасывали родамин 123.

Клетки линии mel Mtp clone X накапливали лишь 174 ед. родамина 123 в течение 15 мин и почти весь его выбрасывали (Табл. 5, Рис. 3). Таким образом, клетки меланомы линии mel Mtp clone X имеют мРНК гена MDR1 в 38 раз выше контрольных клеток, не экспрессируют pgpl70, но интенсивно выбрасывают родамин 123.

Цитотоксическое действие двух лекарственных форм производных нитрозоалкилмочевины на меланомные клеточные линии

Описанные выше меланомные клеточные линии использовали для сравнения цитотоксического действия липосомальной аранозы и аранозы-лио. Различия в экспрессии рецептора CD95/Fas, опосредующего внешний апоптоз, и гликопротеида pgpl70, позволяют определить возможный механизм действия липосомальных препаратов. Клетки линии mel Mtp clone X помимо утраты CD95/Fas рецептора имеют гиперэкспрессию гликопротеида pgpl70, опосредующего множественную лекарственную устойчивость. Для изучения механизма действия лекарственных форм аранозы в исследование включили другие клеточные линии с разным статусом рецептора CD95/Fas и pgpl70. На первом этапе работы изучили чувствительность клеточных культур меланомы к цитотоксическому действию аранозы-лио. Результаты представлены на рисунке 4.

Концентрация, ж/мл

А

—♦—Mel mtp

-»-Mel Z —й— Mel Kor -Mel Ibr

Б

Концентрация, мг/мл

Концентрация, мг/мл

В

Рис. 4. Цитотоксическое действие лекарственной формы аранозы-лио на клетки линии меланомы: А - инкубация 24 ч; Б - инкубация 48 ч; В - инкубация 72 ч.

Было обнаружено, что клетки линий меланомы различаются по чувствительности к цитотоксическому действию аранозы. Наиболее чувствительными были клетки линии mel Kor, которые экспрессируют рецептор CD95 и у которых не гиперэкспрессирован ген MDR1. Наиболее устойчивыми были клетки линии mel Mtp clone X, у которых нет рецептора CD95/Fas и имеется гиперэкспрессия гена MDR1.

Цитотоксическое действие липосомальной аранозы определяли в МТТ-тесте после инкубации клеток с аранозой в течение 24, 48 и 72 ч. Обе лекарственные формы аранозы использовали в концентрациях от 0,056 до 0,9 мг/мл.

Сравнение цитотокснческого действия двух лекарственных форм аранозы на клетки mel Mtp, не экспрессирующие антиген CD95/Fas, показало, что липосомальная араноза проявляла цитотоксический эффект, а араноза-лио - нет. Клетки линии mel Mtp clone X, не экспрессирующие рецептор CD95/Fas и гиперэкспрессирующие pgpl70, были устойчивы к аранозе-лио после инкубации в течение 24 и 48 ч. ИК50 не была достигнута. Однако они были чувствительны к цитотоксическому действию липосомальной аранозы (Рис. 5).

* 20 :.......-......-.........V- _._.,„„ £ » I- ■ Л

сомальнан —^-Липосомалыгая

0 *• —.....------------------------<-------------- »I»™» 0 4--,---------Г--. «мной

J' J »' £ „#> »' ^

Концентр л ция, мг/мл х.

Концентрация, шг/мл

Рис. 5. Цитотоксическое действие двух лекарственных форм аранозы на клетки линии mel Mtp clone X: А - 24 ч инкубации; Б - 48 ч инкубации.

Клетки mel Z характеризуются отсутствием на своей поверхности рецептора CD95/Fas, но содержат мРНК этого рецептора. Эти клетки также были устойчивы к аранозе-лио, но чувствительны к липосомальной.

Клетки mel Kor, имеющие CD95/Fas рецептор и нормальный уровень pgpl70, были чувствительны к действию аранозы-лио и липосомальной аранозы. После инкубации клеток в присутствии препаратов аранозы в течение 24 ч, 48 ч, 72 ч цитотоксический эффект был дозо-зависимым.

Таким образом, сравнение цитотоксического действия двух лекарственных форм аранозы показало, что липосомальная араноза более эффективна по сравнению с аранозой-лио и на ее цитотоксическое действие не влияет ни отсутствие CD95/Fas рецептора, ни гиперэкспрессия гена множественной лекарственной устойчивости. Графики и таблицы, подтверждающие результаты исследований представлены в диссертационной работе в третьей главе с детальным описанием.

Цитотоксическое действие двух лекарственных форм OR-2011 на меланомные клеточные линии

Нами было проведено сравнение цитотоксического действия двух лекарственных форм нового противоопухолевого вещества из класса производных нитрозоалкилмочевины OR-2011.

Исследование проводили на 3 клеточных линиях: mel Kor, mel Z, mel Ibr. Результаты представлены на рисунке 7. OR-2011 оказывает цитотоксическое действие при меньших концентрациях по сравнению с аранозой. Также как

18

липосомальная араноза, липосомальный OR-2011 оказывает большее цитотокеическое действие по сравнению с OR-2011-лио. Цитотоксическое действие липосомального OR-2011 проявляется на С095/Раз-отрицательной линии и р£р170-положительной линии клеток.

Влияние двух лекарственных форм аранозы на индукцию апоптоза в клеточных линиях меланомы человека

Исследование проводили на СБ95-положительной линии mel Kor и на CD95-отрицательных клеточных линиях меланомы человека mel Mtp clone X и mel Z. Кроме того в клетках mel Mtp clone X была гиперэкспрессия гена MDR1. Индукцию апоптоза определяли после инкубации клеток с препаратами в течение 24 ч.

Было обнаружено, что в СВ95/Раз-положительных клетках mel Kor араноза-лио в концентрации 450 мг/мл индуцировала ранний и поздний апоптоз в 14,8 % и 20,4 % клеток соответственно. Липосомальная араноза в этой же концентрации индуцировала ранний апопотоз в 9,8 % клеток, а поздний апоптоз - в 27,5 % клеток. Араноза-лио в концентрации 900 мг/мл вызывала поздний апоптоз и некроз в 49,3 % и 21,5 % клеток соответственно. Липосомальная араноза также индуцировала поздний апоптоз в 48,9 % клеток и некроз в 33,5 % клеток (Табл. 6). Таким образом, обе лекарственные формы аранозы в дозе 450 мг/мл вызывали ранний и поздний апоптоз, а в дозе 900 мг/мл - поздний апоптоз и некроз. Различий между индукцией апоптоза двумя лекарственными формами в этих клетках не было.

Араноза-лио не индуцировала апоптоз в С095/Раз-отрицателышх клетках линии mel Z (Табл. б). После инкубации этих клеток с липосомальцой аранозой в концентрации 450 мг/мл количество клеток в раннем апоптозе составлило 11,1%, в позднем апоптозе - 20,6%, а после инкубации с препаратом в концентрации 900 мг/мл количество клеток в раннем апоптозе возрасло до 26,0%, в позднем апоптозе - до 52,6%. Некротической гибели клеток в этой клеточной линии не наблюдали (Табл. 6). Таким образом, результаты определения индукции апоптоза двумя лекарственными формами аранозы отличались от результатов, полученных на С095/Ра8-положительных клетках mel Kor. Араноза-лио не индуцировала апоптоз,

а липосомальная араноза - индуцировала. Кроме того, не наблюдали некротической гибели клеток.

В клетках CD95/Fas-OTpmiaraibnofl линии mel Mtp clone X араноза-лио в концентрациях 450 и 900 мг/мл также не индуцировала апопгоз. Однако липосомальная араноза в концентрации 450 мг/мл вызывала ранний апопгоз в 28,7 % клеток, а поздний апопгоз - в 28,6 %. Липосомальная араноза в концентрации 900 мг/мл вызывала ранний апоптоз в 82,8 % клеток. В отличие от клеток mel Ког, на этой линии не обнаружили клеток в позднем апоптозе и некрозе (Табл. 6).

Таким образом, способность вызвать апоптоз двумя лекарственными формами аранозы зависела от экспрессии рецептора CD95/Fas, опосредующего внешний сигнальный путь индукции апоптоза. Араноза-лио не индуцировала гибель CD95/Fas-OTpHHaTenbHbix клеток, а липосомальная араноза вызывала ранний и поздний апоптоз, но не некроз.

те1 Ког 24 ч

120 г

.л л л ? <у

Концентрация, мг/мл

-Пустые липосомы -ОМОН лио

-Липосомальный

0я-2011

—Пус1 ые липосомы

—ОИ-2011 лио

—Липосомальный 0й-2011

Концентрация, мг/мч

г „г а?

Концентрация, мг/мл

-Пустые липосомы -ОЯ- 2011 лио

—Липосомальный ОЙ-2011

-Пустые липосомы -0Я- 2011 лио

-Липосомальный ОЯ- 2011

—Пустые липосомы —ОЯ-2011 лио

—л—Липосомальный ОЯ-2011

-Пустые липосомы —2011 лио

-Липосомальный (Ж-2011

О' О1 О' о'

Концентрация, мг/мл

те1 Ъ 72 ч

-Пустые липосомы -ОЯ-2011 лио

—Л и посома л ьны й ОЯ-2011

— Пус1ые липосомы

Концентрация, мг/мч

те1 1Ьг 72 ч

а л л л л л \

СГ <Г V о. о*

О- О' о- о- 0

Концентрация, мг/мч

-Пустые ЛИПОСОМЫ —ОЯ- 2011 ЛИО

—Липосомальный 011- 2011

Рис. 7. Цитотоксическое действие лекарственных форм ОК - 2011 на клетки линии меланомы

Таблица 6

Определение соотношения Аннексина V-FITC и PI на клеточных линиях

меланомы после 24 ч инкубации с лекарственными формами аранозы

Клеточные линии меланом Препараты Живые клетки (АпУТРГ), % Ранние апоптотичес-кие клетки (AnV+/Pr), % Поздние апоптоти-ческие клетки (AnV+/PI+), % Некротические клетки (AnVTPf), %

mel Kor Интактный контроль 90,1 2,8 6,8 0,3

Араноза-лио, 450 мг/мл 63,5 14,8 20,4 1,3

Араноза-лио, 900 мг/мл 25,4 4,2 49,3 21,2

Липосомальная араноза, 450 мг/мл 58,2 9,8 27,5 4,4

Липосомальная араноза, 900 мг/мл 15,4 2,3 48,9 33,5

mel Z Интактный контроль 92,8 1,2 5,8 0,1

Араноза-лио, 450 мг/мл 92,0 1,4 5,6 0,1

Араноза-лио, 900 мг/мл 92,9 2,6 4,4 0,2

Липосомальная араноза, 450 мг/мл 66,8 11,1 20,6 1,5

Липосомальная араноза, 900 мг/мл 18,7 26,0 52,6 2,6

mel Mtp clone X Интактный контроль 88,0 4,6 4,5 2,8

Араноза-лио, 450 мг/мл 84,8 8,2 4,4 2,5

Араноза-лио, 900 мг/мл 80,8 10,3 7,5 1,4

Липосомальная араноза, 450 мг/мл 40,9 28,7 28,6 1,8

Липосомальная араноза, 900 мг/мл 11,3 82,8 5,7 0,1

выводы

1. Клеточные линии меланомы кожи различаются по экспрессии CD95/Fas рецептора, опосредующего апоптоз. Клетки линий mel Mtp и mel Mtp clone X не экснрессируют CD95/Fas рецептор и не содержат мРНК гена этого рецептора. Клетки линии mel Z не экспрессируют рецептор, но содержат мРНК гена этого рецептора. Клетки линий mel К.ог и mel Ibr экспрессируют CD95/Fas рецептор и имеют мРНК гена этого рецептора.

2. В клеточных линиях mel Mtp clone X и mel Ibr гиперэкспрессирован ген MDR1 множественной лекарственной устойчивости.

3. Клетки линий меланомы различаются по чувствительности к цитотоксическому действию аранозы: клетки линии mel Kor чувствительны, а клетки линий mel Mtp clone X, mel Mtp, mel Z и mel Ibr - резистентны.

4. Липосомальная араноза индуцирует апоптоз в клетках меланомы независимо от экспрессии CD95/Fas рецептора внешнего апоигоза.

5. Липосомальная араноза индуцирует апоптоз в клетках меланомы независимо от экспрессии pgpl70 - продукта гена MDR1 множественной лекарственной устойчивости.

6. Липосомальная араноза более эффективна по сравнению с традиционной лекарственной формой, и на ее цитотоксическое действие не влияет ни отсутствие CD95/Fas рецептора, ни гиперэкспрессия гена множественной лекарственной устойчивости.

7. В механизм цитотоксического действия липосомальной аранозы не вовлекается CD95/Fas сигнальный путь апоптоза.

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Грищенко, Н.В. Липосомальные противоопухолевые препараты не используют С095-зависимый сигнальный путь апоптоза / Н.В. Гршценко, М.А Барышникова, А.П. Полозкова, H.A. Оборотова, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, № 1. - С. 37-41.

2. Грищенко, Н.В. Сравнение цитотоксического действия лекарственных форм противоопухолевых препаратов из класса нитрозомочевины / Н.В. Грищенко, Б. Альбассит, М.А. Барышникова, JI.B. Ланцова, А.П. Полозкова, H.A. Оборотова, В.П. Краснов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, № 1. - С. 49-53.

3. Альбассит, Б. Липосомальный противоопухолевый препарат OR-2011 из класса нитрозомочевины для лечения""меланомы / Б. Альбассит, М.Т. Зангиева, Н.В. Грищенко. М.А Барышникова, Е.В. Игнатьева, B.C. Косоруков, В.П. Краснов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, № 1. - С. 59.

4. Барышникова, М.А. Влияние лекарственных форм аранозы на индукцию апоптоза / М.А. Барышникова, Н.В. Грищенко. А.П. Полозкова // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, № 1. - С. 64.

5. Барышникова, М.А. Роль CD95/Fas-pe4eirropa в индукции апоптоза противоопухолевыми препаратами / М.А.Барышникова, Н.В. Грищенко. О.С. Бурова, Д.В. Новиков, Д.А. Афанасьева, С.А. Полозкова, А.П. Полозкова, H.A. Оборотова, В.В. Новиков, А.Ю. Барышников, М.И. Давыдов // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, № 3. - С. 3-7.

Подписано в печать 10.10.14 Формат 60x84/16. Бумага офисная «БуеЮСору». Тираж 100 экз. Заказ № 565 Отпечатано на участке множительной техники ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24