Автореферат и диссертация по медицине (14.04.01) на тему:Разработка липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины
- Ученая степень
- кандидата фармацевтических наук
- ВАК РФ
- 14.04.01
Автореферат диссертации по медицине на тему Разработка липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины
На правах рукописи
Михайлова Татьяна Витальевна
РАЗРАБОТКА ЛИПОСОМАЛЫЮЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ПРОТИВОМЕЛАНОМНОЙ ВАКЦИНЫ
Специальность: 14.04.01 - технология получения лекарств
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук
1 1 ОКТ 2012
Москва - 2012
005053112
005053112
Работа выполнена в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Федерального Государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» РАМН («РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН)
Научные руководители:
доктор фармацевтических наук,
профессор Оборотова Наталия Александровна
доктор медицинских наук,
профессор Барышников Анатолий Юрьевич
Официальные оппоненты:
доктор фармацевтических наук, ведущий специалист отдела обеспечения качества ЗАО «Ретиноиды» Гузев Константин Сергеевич
кандидат фармацевтических наук, доцент, заведующая лабораторией биологически активных соединений НИИ Молекулярной медицины ГБОУ ВПО Первый МГМУ
им. И.М.Сеченова Павлова Людмила Анатольевна
Ведущая организация: ГБОУ ВПО Российский университет дружбы народов.
Защита состоится «/У » 2012 г. в У^ часов на заседании
Диссертационного совета Д.208.040.09 при Первом Московском государственном медицинском университете им. И.М. Сеченова (119991, г. Москва, Никитский б-р, д. 13).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (117997, г. Москва, Нахимовский пр-т, 49).
Автореферат разослан
Ученый секретарь
диссертационного совета Д.208.040.09 доктор фармацевтических наук профессор
Садчикова Наталья Петровна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы.
Меланома кожи еще 30-40 лет назад была сравнительно редким заболеванием в большинстве стран мира Однако за истекшее время частота возникновения этого заболевания значительно увеличилась и продолжает неуклонно возрастать. Меланома считается «антигенной опухолью», экспрессирующей так называемые опухолеассоциированные антигены. Эти антигены используются при вакцинотерапии, которая является одним из иммунологических подходов в лечении онкологических заболеваний.
Основной задачей противоопухолевой вакцинации является индукция и поддержание иммунного ответа, направленного на распознавание и элиминацию иммунорезистентных опухолевых клеток. Современные исследования в области создания противоопухолевых вакцин включают два основных направления: совершенствование существующих технологических этапов и разработку нового поколения вакцин на основе достижений молекулярной биологии и иммунологии.
В процессе поиска опухолеспецифических антигенов было установлено, что белки теплового шока (Ьэр) обладают высокой иммуногенной активностью. Установлено, что Шр70 играют важную роль в индуцировании клеточного иммунного ответа.
Липосомальная терапия - одно из наиболее активно развивающихся направлений в фармакологии и медицине. Липосомальная форма вакцины позволяет обеспечить сохранность антигенов, улучшает доставку антигенов к клеткам иммунной системы и способствует повышению иммуногенности.
Постановка проблемы в этих рамках позволит сконцентрировать экспериментальные данные для разработки НД, а, главное, сделать производство липосом и препаратов на их основе реальностью сегодняшнего и завтрашнего фармацевтического производства.
Цель и задачи исследования.
Получение и изучение биофармацевтических свойств липосомальной лекарственной формы вакцины, содержащей лизат клеточных линий меланомы человека.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. На основе химико-фармацевтических исследований разработать состав липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины;
2. Разработать способ получения устойчивой при хранении липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины;
3. Обосновать параметры и критерии качества готового препарата и разработать методики для установления стандартности липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины;
4. Изучить стабильность липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины в процессе хранения;
5. Оценить противоопухолевую активность липосомальной лекарственной формы
противомеланомной вакцины.
Научная новизна результатов исследования.
Впервые разработана липосомальная лекарственная форма противомеланомной вакцины, содержащая лизат клеточных линий меланомы человека Mel Mtp, Mel Is, Mel Z, Mel P, Mel Kor. Обоснованы требования к стандартизации липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины. Установлены критерии и параметры качества липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины. Отработаны методы очистки липосомальной лекарственной формы от невключившегося лизата и определена эффективность нагрузки лизата в липосомы. Определены режимы лиофильного высушивания и стерилизации липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины. Разработан проект ФСП «Липосомальная противомеланомная вакцина, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 2,5 мг». Показана стабильность лекарственной формы в процессе хранения в течение одного года при температуре +4 0 С. Получены данные об интенсивности иммунного ответа на липосомальную лекарственную форму противомеланомной вакцины методом ELISpot.
Новизна полученных результатов подтверждается заявкой на патент РФ «Липосомальная форма лизата клеточных линий меланомы человека» №2012115547 от 19.04.2012.
Практическая значимость и внедрение результатов исследования.
Создана новая липосомальная лекарственная форма противомеланомной вакцины. Получена лиофилизированная форма липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины и установлен режим стерилизации, при котором сохраняются основные физико-химические показатели липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины. Разработанные методики качественного и количественного определения Hsp70 могут быть использованы при проведении качественного и количественного анализа субстанции и лекарственных форм, полученных на ее основе. Разработан проект ФСП, в соответствии с которым проведена стандартизация препарта «Липосомальная противомеланомная вакцина, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 2,5 мг».
Апробация работы
Апробация диссертационной работы состоялась 18 мая 2012 г. на совместной научной конференции лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории разработки лекарственных форм, лаборатории трансгенных препаратов, лаборатории лучевых методов лечения опухолей, лаборатории иммунофармакологии, лаборатории фармакоцитокинетики, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН.
Материалы приведенных в диссертационной работе исследований представлены на следующих научных сообществах:
- Материалы заочной международной конференции «Приоритеты фармацевтической
науки и практики» г. Москва, 2006 г.
- Руснанотех 09 Нанотехнологии в медицине. Онкология и кардиология, г. Москва,
2009.
- Сборник трудов IV Всероссийской школы-семинара студентов, аспирантов и
молодых ученых по тематическому направлению развития ННС
«Нанобиотехнология» г. Белгород, 2011г.
Личный вклад автора
Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и внедрения в практику.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.01 -Технология получения лекарств. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1, 3 и 4 паспорта специальности технология получения лекарств.
Связь задач исследования с проблемным планом
Диссертационная работа выполнена в соответствии с комплексной научной темой НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Федерального Государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» РАМН («РОНЦ им.H.H.Блохина» РАМН) «Создание
противоопухолевых нановакцин нового поколения для профилактики и терапии злокачественных новообразований» (номер Государственной регистрации 01 20106 3844).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Положения, выносимые на защиту:
- Состав и технология получения лиофилизированной лекарственной формы
противомеланомной вакцины;
- Методы идентификации и количественного определения Hsp70 в субстанции и
готовых лекарственных формах;
- Результаты контроля качества наработанных серий препарата и изучения их
стабильности в процессе хранения.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из Введения, Обзора литературы, 4 глав экспериментальной части, Общих выводов и Списка литературы. Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 15 таблиц. Библиография включает 187 наименований, в том числе 155 иностранных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования
При проведении исследований по разработке состава и технологии получения липосомальной формы противомеланомной вакцины использовали лизат клеточных линий меланомы человека Mel Mtp, Mel Is, Mel Z, Mel P, Mel Kor (действующее вещество) и вспомогательные вещества, которые соответствовали требованиям нормативной документации: ГФ XI издания, ГФ XII издания, Фармакопеи США - USP-32, частных фармакопейных статей, ГОСТов.
1. Методы культивирования клеточных линий меланомы человека,
приготовление клеточного лизата, количественные методы определения
общего белка
1.1.Клеточные линии и их культивирование
Клетки меланомы человека были предоставлены лабораторией Экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей РОНЦ им. H.H. Блохина коллективом авторов (Михайлова H.H., Морозова Л.Ф., Бурова О.С. и соавт.).
Полученные 19 стабильных клеточных линий охарактеризованы по морфологическим, кариологическим, иммунологическим и генетическим параметрам.
Клеточные линии прошли более 30 пассажей, что характеризует клетки как обладающие неограниченным жизненным потенциалом.
Клетки культивировали в среде RPMI 1540, содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 2мМ L-глутамина, 1% HEPES, пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), комплекс аминокислот и витаминов (Flow Lab) в культуральных флаконах (Costar).
1.2.Получение опухолевого лизата
Для получения опухолевого лизата наращивали по 10 млн. клеток линий MelP, MelKor, MelMtp, Meli, Mells, MelSi, MelMe, MelGus, MelZ, MelGi, Mellbr, MelR, MelRac, MelCh, MelCher. Клетки ресуспендировали в среде и переносили в ампулы для криоконсервации. После этого клетки замораживали и размораживали, соответственно помещая ампулы вначале в жидкий азот, а потом в водяную баню (37°С); процедуру повторяли пять-шесть раз. Затем поврежденные клетки осаждали центрифугированием при 3000g в течение 10 минут. Определяли концентрацию белка, разливали на аликвоты и хранили при -20°С.
О.Определение концентрации белка в опухолевом лизате
Определение концентрации белка проводили на спектрофотометре Beckman Coulter (США) при 260 нм и 280 нм, а также модифицированным методом Лоури с бицинхониновой кислотой. Использовали набор ВСА Protein Assay Reagent Kit 23227 фирмы Pierce. Для проведения анализа готовили необходимое количество рабочего раствора— смешением растворов А и В в объемном соотношении 50:1. Если измерения проводили в больших (4 мл) кюветах спектрофотометра, то следующие манипуляции проводили в подходящих пробирках: смешивали 0,1 мл анализируемой пробы с 2 мл рабочего раствора, смесь инкубировали 30 минут при температуре 37°С и фотометрировали при 562 нм.
2. Методы идентификации и количественного определения Hsp70
Определяли уровень Hsp70 на клетках линий меланомы человека MelP, MelKor, MelMtp, Meli, Mells, MelSi, MelMe, MelGus, MelZ, MelGi, Mellbr, MelR, MelRac, MelCh, MelCher. Первая опытная группа клеток - интактные клетки. Вторая опытная группа -клетки, прогретые при 42 СС в течение 10 мин на водяной бане, после чего помещенные в С02.инкубатор на 30 мин. Третья опытная группа - клетки, предварительно замороженные при -80° С.
2.1. ДСН —электрофорез в полиакриламидном геле
Электрофорез лизата клеток меланомы проводили по методике, предложенной Лэммли в камере Mini-PROTEAN («Bio-Rad», США).
2.2. Определение уровня Н$р70 методом иммуноблот
Нитроцеллюлозную мембрану с перенесенными белками инкубировали при комнатной температуре в течение часа с 5% раствором сухого молока Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad) для блокирования неспецифического связывания в буфере А, состоящем из 2М трис, 0,5 М ЭДТА, 5М NaCl, 0,1 % реагент Tween 20 (BioRad). Затем мембрану дважды отмывали в 20 мл буфера А по 10 мин. Далее проводили инкубацию с антителами Mouse anti-heat shock Protein 70 Monoclonal Ig G (Abfrontier), разведенными в соотношении 1: 2000 в буфере А в течение 90 мин. После этого мембрану отмывали дважды по 15 мин в буфере А.
Инкубацию с антителами Blotting Grade Affinity Purified Goat Anti Mouse Ig G Alkaline Phosphatase conjugate (Bio-Rad), разведенными в соотношении 1:3000 в буфере А, проводили в течение 90 мин. Затем мембрану отмывали дважды по 15 мин в буфере А.
Мембрану детектировали с помощью красителя 1 Step NBT/BCIP (Thermo scientific). Результат и степень интенсивности окраски полос фиксировали на анализаторе Syngene с помощью программы Gene tools.
3. Методы получения и изучения физико-химических свойств липосом с
лизатом клеточных линий меланомы
3.1. Получение многослойных липосом
Многослойные липосомы готовили следующим образом: навески лецитина и холестерина (мольное соотношение компонентов 3:1) растворяли в небольшом объеме хлороформа. Для предотвращения окисления липидов добавляли антиоксидант - а-токоферола ацетат в количестве 0,01% от общего количества липидов. Полученную смесь липидов выдерживали, периодически помешивая, до полного растворения липидов. Растворитель отгоняли в вакууме водоструйного насоса (4±2 мм рт.ст.) на роторном испарителе, при температуре бани + 40°С. После полного удаления органического растворителя на стенках колбы образовывалась тонкая пленка фосфолипидов.
В качестве криопротектора использовали сахарозу в концентрации 10% от общего количества липидов. Для этого сахарозу растворяли в изотоническом растворе. Затем к раствору сахарозы прибавляли клеточный лизат в различных соотношениях лизат : липиды (1 : 108, 1 : 217 по весу). После чего липидную пленку смывали этим раствором при температуре 38°С до образования белой эмульсии (дисперсия многослойных липосом). Включение лизата проходило по принципу пассивной загрузки.
3.2. Определение размера липосом методом оптической микроскопии
Размеры липосом определяли методом оптической микроскопии с помощью интерференционно - поляризационного микроскопа иммерсионным методом. Использовали оптический микроскоп MPI-3, увеличение х20.
Пробу для микроскопирования готовили путем тщательного диспергирования 5 мг препарата в 5 мг инертной дисперсионной среды. В качестве дисперсионной среды использовали вазелиновое масло.
Каплю полученной суспензии наносили на предметное стекло пипеткой. Измеряли и изучали не менее 200 частиц, если частицы различались по размерам в несколько десятков раз, и 1000 частиц при большей полидисперсности образца. Размер частиц не превышал 100 мкм.
З.З.Определение структуры липосом методом электронной микроскопии
Регидратированные в дистиллированной воде образцы липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины (ЛЛФПВ) смешивали 1:1 с 1,5% раствором глютарового альдегида в фосфатном буфере. После 30 мин фиксации при 4°С препараты в количестве 5 мл центрифугировали 1 час при 30 000 об/мин на ультрацентрифуге L-8 Beckman. Осадок дважды отмывали от фиксатора дистиллированной водой и проводили постфиксацию 2,5% раствором тетраоксида осмия в фосфатном буфере. Препараты обезвоживали окисью пропилена и этанолом в возрастающих концентрациях и заливали в эпоскидную смолу (смесь эпон/аралдит). Ультратонкие срезы, полученные на ультрамикротоме Ultracut (Reichert, Austria), окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца.
Препараты просматривали на просвечивающем электронном микроскопе JEM-IOOS фирмы JEOL (Япония) при инструментальном увеличении 10 000 - 50 000.
3.4. Определение эффективности включения лизата в липосомы
Определение процента включения белка в липосомы проводили методом спектрофотометрии при длине волны 260 нм и 280 нм. Разделение липосом с лизатом от не включившихся белков проводили ультрацентрифугированием при 50 тыс. об/мин в течение 15 мин. Супернатант, содержащий не включившийся антиген, декантировали, а осадок липосом ресуспендировали в физиологическом растворе NaCl 0,9% и снова центрифугировали. Процесс промывания липосом повторяли до удаления остаточного количества белка в супернатанте, содержание которого контролировали на спектрофотометре. После последнего центрифугирования осадок липосом суспендировали в требуемом объеме физиологического раствора NaCl 0,9%, после чего разрушали 5% раствором Тритона Х-100.
Эффективность включения белка (В, %) рассчитывали по формуле:
В=(С х 100%)/СИОВ где С - концентрация белка, определенная после разрушения липосом; C„„- концентрация белка при включении в липосомы. 3.5. Определение степени окисления липидных компонентов. Степень окисления липидных компонентов определяли по количеству продуктов деградации лецитина с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК).
Для определения ТБК-активных продуктов в образцах 1 мл дисперсии липосом переносили в пробирку с притертой пробкой, добавляли 1 мл буферного раствора (0,15М KCl и ЮмМ Трис-НС1) 0,5 мл 30% трихлоруксусной кислоты и 1 мл 0,67%-ного водного раствора ТБК. Полученную смесь интенсивно встряхивали и нагревали на водяной бане в течение 30 минут при температуре 80°С, затем охлаждали в токе холодной воды до комнатной температуры и центрифугировали 10 мин при со = 3000 об/мин (225g). Полученный раствор переливали из пробирки в кварцевую кювету и измеряли оптическую плотность на длине волны 532 нм и 550 нм относительно контрольного опыта (дистиллированной воды). Концентрацию ТБК-активных продуктов определяли по формуле:
С = (AOD х Vz) / s х 1 х Vnp, где AOD - разность оптических плотностей раствора на длинах волн 532 и 550 нм; V£, Vnp - суммарный объем и объем пробы соответственно; s -коэффициент экстинции 1,56 х 105 л/(моль см); 1 - оптический путь, мм.
4. Оценка изменений числа ифн- у- продуцирующих лимфоцитов в ответ на стимуляцию ЛЛФПВ in vitro
Незрелые ДК получали путем культивации адгезивных моноцитов периферической крови здоровых доноров. Неадгезивные лейкоциты (обогащенную лимфоцитарную фракцию) замораживали для последующих экспериментов. Индукцию терминальной дифференцировки части ДК вызывали с помощью инкубации в присутствии цитокинового коктейля. Часть зрелых ДК нагружали опухолевым лизатом линий Mel Si, Mel Mtp, Mel Z, Mel Is, Mel Kor. Другую часть зрелых ДК сливали с липосомальным лизатом.
После получения зрелых и нагруженных ДК их использовали для активации лимфоцитов. Для этого лимфоциты, полученные от того же донора (аутологичные лимфоциты), размораживали и помещали в лунки 6-луночного планшета и смешивали со стимуляторами (незрелыми, зрелыми и нагруженными ДК) в нужном соотношении, подобранном в ходе предварительных опытов. В качестве положительного контроля использовали лимфоциты, стимулированные неспецифическим активатором —
10
фитогемагглютинином (ФГА) 10 мкг/мл. Негативным контролем служили аутологичные лимфоциты без добавления стимуляторов. После смешивания со стимуляторами планшеты с лимфоцитами инкубировали в течение 18 часов при 37°С в атмосфере 5% С02. Через 18 часов лимфоциты снимали с планшета и подсчитывали. Необходимое количество клеток отбирали и использовали для постановки реакции ELISpot.
Всего эксперимент был повторен на материалах от 3 доноров. Сравнивалось количество лимфоцитов, активирующихся в ответ на стимуляцию зрелыми ДК, дендритными клетками, нагруженными лизатом и дендритными клетками, нагруженными липосомальным лизатом. Для внутреннего контроля использовали пустые липосомы. Активация лимфоцитов оценивалась по продукции ими IFNy и выявлялась с помощью реакции ELISpot.
Статистическая обработка результатов. Относительную погрешность среднего результата измерения оценивали, используя критерий распределения Стьюдента (t(P,f)).
Результаты исследований
1. Определение уровня Hsp70 на клеточных линиях меланомы.
Во всех 15 анализируемых клеточных линиях меланомы был обнаружен белок с молекулярной массой 70 кДа, соответствующий полноразмерному белку Hsp70. Количество Hsp70 варьировало как в различных клеточных линиях, так и в зависимости от предварительной обработки клеток.
Так, самое низкое содержание Hsp70 в интактных клетках обнаружено на линиях Mel Si, Mel Kor, Mel Ibr, Mel Ch. Высокое содержание Hsp70 в интактных клетках зафиксировано в линиях Mel Me, Mel Is, Mel Z.
Высокий уровень экспрессии Hsp70 в клетках после прогревания при 42°С в течение 10 мин наблюдали на клеточных линиях Mel Me, Mel Si.
Наибольшее количество Hsp70 в клетках, подвергнутых предварительной заморозке, обнаружили на клеточных линиях Mel Mtp, Mel Is, Mel P, Mel Kor, Mel Z (Рис 1).
Полученные данные указывают на то, что наиболее высокий уровень Hsp70 имеют клетки после предварительной заморозки.
Анализ уровня Hsp70 использовали в процессе создания, хранения и контроле качества липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины.
Рис.1. Уровень Нзр70 на клеточных линиях меланомы человека
инт.- интактные клетки; I - клетки, прогретые при 42°С в течение 10 мин на водяной бане; Гг -клетки, замороженные при 1=-80°С.
2. Выбор оптимального соотношения липидов для создания липосомальной вакцины.
При изыскании оптимального соотношения ЯФХ:ХОЛ использовали соотношения 5:1, 3:1 и 2:1. Размер частиц и эффективность включения лизата в липосомы при различных соотношениях ЯФХ:ХОЛ представлены в табл. 1.
Средний диаметр липосом и эффективность нагрузки лизата в везикулы с липидным соотношением (5:1) составляли 8 мкм и 42,10% , с липидным соотношением (3:1) составили 6 мкм и 64,7%, а с (2:1) - 5 мкм и 51,5%.
Таблица 1
Эффективность включения лизата в липосомы и средний диаметр везикул с разными липидными соотношениями (п=5)
Молярное соотношение ЯФХ:ХОЛ 5:1 3:1 2:1
Эффективность включения лизата в липосомы (%) 42,10 ±2,2 64,70*'"± 1,3 51,50*±1,2
Средний диаметр липосом (мкм) 8 6 5
* - р< 0,05 (достоверность различий по отношению к составу 2:1)
# - р < 0,05 (достоверность различий по отношению к составу 3:1)
Липосомы состава №2 (3:1) оказались более однородными по размеру и имели большую эффективность включения. Таким образом, в результате технологических исследований подобрано оптимальное молярное соотношение липидов ЯФХ:ХОЛ - 3:1 для создания ЛЛФПВ.
3. Выбор оптимального соотношения суммарные липиды : лизатдля создания липосомальной формы вакцины
При использовании раствора лизата с концентрацией 2,5 мг/мл соотношение суммы липидов: лизат составляло 108:1 (по весу); а при 1,25 мг/мл - 217:1 (по весу). Полученные результаты представлены в табл.2.
Таблица 2
Выбор соотношения сумма липидов: лизатдля приготовления липосомальной
формы вакцины
Соотношения сумма липидов:лизат Компоненты липосом Молярное соотношение Молярная масса Масса (г)
108:1 яичный фосфатидилхолин 300 мкмоль 760 0,2280
Холестерин 100 мкмоль 386,66 0,0390
а-токоферола ацетат 10 мкмоль 472,74 0,0047
Лизат 0,0025
217:1 яичный фосфатидилхолин 300 мкмоль 760 0,2280
Холестерин 100 мкмоль 386,66 0,0390
а-токоферола ацетат 10 мкмоль 472,74 0,0047
Лизат 0,00125
Получали 2 липосомальных дисперсии, которые не расслаивались до 30 дней при температуре 10°С. Средний размер липосом состава 108:1 и состава 217:1, определенный методом оптической микроскопии, составлял 6 мкм.
В результате проведенных технологических исследований установлено, что устойчивость липосом и средний размер везикул липосомальной дисперсии двух составов не отличаются друг от друга.
Результаты эффективности включения лизата в липосомы приведены в таблице 3.
Таблица 3
Оценка влияния соотношения суммы липидов: лизат на эффективность включения
лизата в липосомы.
108:1 217: 1
эффективность метрологические эффективность метрологические
включения (%) характеристики включения (%) характеристики
64,3 X =63,5* 54,2 X =55,9
63,7 Sí = 1,05 58,7 Sí =2,52
62,0 Дх = 1,67 53,5 Дх =4,01
64,1 £ = 1,65 % 57,5 £ =4,51 %
Ошибка! Закладка не определена.
* - р<0,01 (достоверность различий по отношению к составу 108:1)
При соотношении 108:1 эффективность включения лизата в липосомы составила 63,5 %, что в 1,13 раза больше чем при соотношении 217:1. Таким образом, оптимальное суммарное соотношение (по весу) сумма липидов : лизат для создания липосом с лизатом оказалось 108:1.
4. Выбор криопротектора и разработка режима лиофилизации ЛФПВ
Для стабилизации липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины в процессе хранения разрабатывали методику лиофилизации. Исследовали разные режимы замораживания и сублимационной сушки препарата. Оценку влияния способа замораживания и сублимационной сушки липосомальной дисперсии на качество готового продукта проводили по таким критериям, как внешний вид лекарственной формы, остаточная влажность, размеры везикул и включение лизата в липосомы.
Лиофильное высушивание липосомальной дисперсии проводили в трех различных режимах. Графики сублимационной сушки представлены на рис. 2.
/
Время, час
Рис. 2. Графики сублимационной сушки липосомальной дисперсии.
На основании проведенных исследований выбрали постепенное замораживание полок сублимационной камеры от + до - 70 С и постепенное замораживание
препарата до - 40 ... - 45 °С с выдержкой при данной температуре в течение 3 ч. Продолжительность замораживания составляла 6 - 8ч. Общее время лиофильного высушивания составило 27 часов.
Использование в качестве криопротекторов лактозы и сахарозы в водной фазе липосомальной дисперсии (внутри и снаружи) с последующим замораживанием и сублимацией, позволило предупредить фазовое разделение липидной композиции, предохранить лизат от вытекания и сохранить способность липосом к регидратации. Проведенный эксперимент показал, что по внешнему виду дисперсии липосом с разными криопротекторами не различались друг от друга. После лиофильной сушки липосомальных дисперсий с лактозой и сахарозой структуры и средний размер липосом с лизатом практически не отличались от параметров определенных до лиофилизации.
Как видно из представленных в таблице 4 данных, после лиофилизации эффективность включения лизата в липосомы изменилась: с 55,8 % уменьшилась до 54,5 % в случае сахарозы, и с 55,2 % до 54,3 % в случае лактозы.
Таблица 4
Эффективность включения лизата в лиофильно-высушенные липосомы до и после лиофилизации
№ образца До лиофилизации После лиофилизации
Эффективность Метрологические Эффективность Метрологические
включения, % характеристки включения, % характеристки
Липосомы 52,1 59,5 X =55,8% S3? =2,35 55.5 54.6 X = 54,5 % S Зс = 0,99
с сахарозой 58,4 53,1 Дх = 3,74 £ = 4,21 % 54,6 53,1 Дх= 1,58 £=1,81 %
Липосомы 54,0 X =55,2% 54,0 X = 54,3 %
с 57,5 Sx = 2,35 55,6 Si= 0,91
лактозой 52,5 Дх = 3,74 53,5 Дх= 1,44
56,8 £ = 4,25 % 54,1 £ = 1,68 %
5. Использование гамма-облучения для стерилизации ЛЛФПВ-лио
Запаянные флаконы с образцами лиофильно-высушенных липосом как нагруженных клеточным лизатом, так и пустых, облучали на гамма-установке К-200000 с источником Со 60 в дозах 5, 12 , 17 и 25 кГр/мин.
Флаконы с лиофилизированным препаратом в завальцованном виде доставлялись в лабораторию микробиологической диагностики и лечения инфекций в онкологии НИИ КО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. В лаборатории был сделан посев разведенного физиологическим раствором препарата, затем, сразу после посева, во флаконы были внесены тест-культуры S.aureus, E.coli, С.albicans. После облучения проводился посев обработанного препарата
Результаты посева препарата после внесения тест-культур и последующей стерилизации представлены в табл. 5.
При облучении флаконов без препарата, содержащих только питательную среду и контрольные тест-культуры микроорганизмов, при 5 кГр также был зафиксирован рост С. albicans. При посеве препарата с тест-культурам и микроорганизмов без облучения выявлен рост контрольных микроорганизмов и Bacillus spp.
Таблица 5.
Результаты посева протеолипосом после внесения тест-культур и последующей
гамма-стерилизации
До стерилизации Режим стерилизации Результат посева после стерилизации
5 кГр 12 кГр 17 кГр 25кГр
Инокуляция 51. aureus ■ Роста нет
Инокуляция Е. coli ■ Роста нет
Инокуляция С. albicans ■ Рост С. albicans и Bacillus spp
Инокуляция 51. aureus ■ Роста нет
Инокуляция Е. coli ■ Роста нет
Инокуляция С. albicans ■ Роста нет
Инокуляция S. aureus ■ Роста нет
Инокуляция Е. coli ■ Роста нет
Инокуляция С. albicans ■ Роста нет
Инокуляция S. aureus ■ Роста нет
Инокуляция Е. coli ■ Роста нет
Инокуляция С. albicans ■ Роста нет
Гамма-облучение лиофильно-высушенного липосомального препарата, содержащего лизат клеточных линий Mel Р, Mel Mtp, Mel Is, Mel Z, Mel Kor, в дозах 5, 12, 17 и 25 кГр показало стерилизующее действие в дозе от 12 до 25 кГр с сохранением стабильности Hsp70 (Рис.3).
Рис. 3. Уровень Н$р70 в протеолипосомах после гамма-облучения (Со60): 1-контроль (образец ЛЛФПВ без облучения); 2- ЛЛФПВ, облученные при 5 кГр; 3-ЛЛФПВ, облученные при 12 кГр; 4- ЛЛФПВ, облученные при 17 кГр; 5- ЛЛФПВ, облученные при 25 кГр.
Оптимальная доза гамма-облучения протеолипоеом составила 12 кГр, т.к. при этом обеспечивается стерильность и сохраняются основные физико-химические показатели липосомального препарата.
6. Исследование биофармацевтических показателей ЛЛФПВ-лио после гамма-стерилизации.
До и после гамма-облучения ЛЛФПВ-лио определяли размер, форму, структуру, степень нагрузки лизата в липосомы, рН, остаточную влажность, продукты деградации лецитина с 2-ТБК, уровень Нзр70, а также оценивали степень биологической активности.
Форму и стуктуру липосом до и после гамма-облучения оценивали с помощью просвечивающем го электронного микроскопа ШМ-ЮОБ фирмы ЛЮЬ (Япония) при инструментальном увеличении 10 ООО - 50 ООО.
Рис. 4. Электронная микрофотография протеолипоеом до (А) и после(Б) гамма-облучения в дозе 12 кГр (х 50000). Размер частиц 6000 мкм.
Рис. 5. Размеры и форма протеолипоеом до (А) и после (Б) лиофильного высушивания и гамма-облучения в дозе 12 кГр (х20).
При сравнении формы и структуры липосом до и после облучения методами оптической и электронной микроскопии не было выявлено значительных изменений. Средний размер протеолипосом, определенный с помощью оптической микроскопии (интерференционно-поляризационный микроскоп MPI -3), до и после облучения в дозах 5 кГр, 12 кГр, 17 кГр и 25 кГр составил 6 мкм (Рис.5).
При определении продуктов, дающих характерную реакцию с ТБК, было установлено, что после облучения протеолипосом в дозе 12 кГр концентрация малонового диальдегида (МДА) не изменилась и составила 3,5 нмоль/мл. После облучения протеолипосом в дозах 5 кГр концентрация МДА составила 3,5 нмоль/мл, 17 кГр - 4,1 нмоль/мл, 25кГр - 4,8 нмоль/мл (Рис. 6).
О □ 1-Многослойные протеолипосомы без облучения
~ В 2-Многослойные протеолипосомы, облученные при 5 кГр
□ 3-Многослойные протеолипосомы, облученные при 12 кГр
□ 4-Многослойные протеолипосомы, облученные при 17 кГр
■ 5-Многослойные протеолипосомы, облученные при 25 кГр
Рис 6. Определение продуктов деградации лецитина с 2-тиобарбитуровой кислотой
Проект Фармакопейной статьи предприятия на «Липосомальная противомеланомная вакцина, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 2,5 мг» разработан в соответствии с требованиями ОСТа 91400.05.001-00 "Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения", ОСТа 42-2-72 "Лекарственные средства. Порядок установления сроков годности" и Государственной фармакопеи XI иХП издания.
Приведенные ниже критерии и параметры качества, а также методы исследования
приняты на основании действующих нормативных документов и результатов
экспериментального изучения образцов лекарственной формы «Липосомальная
противомеланомная вакцина, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 2,5
мг». ФСП предусматривает определение в препарате следующих показателей:
19
Все испытанные серии препарата представляли собой лиофилизированнуго сухую пористую массу белого цвета. При растворении содержимого флакона в воде получали дисперсию белого цвета.
Анализ уровня Нвр70 в образцах ЛЛФПВ - лио показал, что образцы вакцины стабильны по содержанию Шр70. Уровень Нзр70 находился в пределах 14 - 16% от уровня (3- актина (Рис.7).
1 2 345 6789 Рис.7. Уровень Hsp70 в образцах ЛЛФПВ-лио:
1- маркеры молекулярных весов, 42кДа - ß- актин, 70кДа- Hsp70;
2- электрофореграмма лизата клеточных линий меланомы человека Mel Is, Mel Mtp, Mel P, Mel Z, Mel Kor;
3- лизат клеточных линий меланомы человека Mel Is, Mel Mtp, Mel P, Mel Z, Mel Kor (иммуноблот);
4- образцы ЛЛФПВ-лио.
Определение pH проводили потенциометрически согласно требованиям ГФ XI,
вып.1, с.113. Для всех испытанных серий препарата значение pH неразбавленных
растворов препарата находилось в пределах 5,7 - 6,7.
По фактическим данным в каждом флаконе содержалось количество препарата,
соответствующее требованиям ГФ XI, вып.2, с. 140. Средняя масса содержимого флакона
находилась в пределах 90 - 100мг. Отклонение от средней массы не превышало ±10 %.
Средний размер везикул находился в пределах 6 мкм. Размер частиц не изменился
при хранении ЛЛФПВ-лио в течение 12 месяцев.
Во всех исследованных образцах лекарственной формы эффективность включения
активного вещества в липосомы не менее 53% (Табл. 6).
20
Таблица 6
Эффективность включения лизата в лиофильно-высушенные липосомы после
гамма-облучения
№ образца Криопротектор - сахароза Криопротектор - лактоза
Эффективность Метрологические Эффективность Метрологические
включения, % характеристики включения, % характеристики
1 55,3 X = 55,1 % 1(Р, 0 = 2,57 8*= 1,09 Дх= 1,14 1 = 1,97 % 52,0 X -53,7% 1(р, 0 = 2,57 5*= 1,85 Дх = 1,95 1 = 3,4 %
2 54,5 55,6
3 55,0 53,2
4 53,6 51,5
5 55,7 54,3
6 56,8 56,0
Проведенные исследования показали, что количество малонового диальдегида в лиофильно-высушенных липосомах противомеланомной вакцины с антиоксидантом составляло - 3,54 ± 0,025 нмоль/мл в случае использования криопротектора сахарозы и 3,62 ± 0,06 нмоль/мл с криопротектором лактозой (табл.7).
Таблица 7
Количество МДА в лиофильно-высушенных липосомах противомеланомной
вакцины с а-токоферола ацетатом.
№ Криопротектор-сахароза Криопротектор-лактоза
образца Содержание МДА Метроло гические Содержание Метрологические
в образцах, нмоль/мл характеристики МДА в образцах, нмоль/мл характеристики
1 3,51 3,57
2 3,55 X =3,54 3,64 X = 3,62
3 3,52 8* = 0,023 3,68 Б* = 0,059
4 3,57 Дх = 0,025 3,65 Дх = 0,061
5 3,53 1 =0,65% 3,53 1 = 1,63%
6 3,56 3,66
Маркировка и транспортирование полученного лекарственного средства предусмотрена в соответствии с действующими в настоящее время ОСТами и Инструкциями.
Выбор условий хранения осуществлен на основе изучения свойств «Липосомальной противомеланомной вакцины, лиофилизата для приготовления раствора для инъекций 2,5 мг», а именно: при температуре не выше +4°С.
Определение качества препарата при хранении проводили через каждые три месяца хранения по методикам, разработанным для стандартизации препарата. В течение 12 месяцев хранения все серии данной лекарственной формы сохраняли химико-фармацевтические характеристики.
7. Результаты изменений числа ифн- у- продуцирующих лимфоцитов в
ответ на стимуляцию ЛЛФПВ.
Среднее число (±8Б) ГПЧу-продуцирующих нестимулированных лимфоцитов на 100 000 после исключения крайних значений составило 3,415 (±2,043); при добавлении стимуляторов (цитокин-активированные ДК, нагруженные ДК лизатом и нагруженные ДК липосомальным лизатом) среднее число (±вО) П-Ыу-продуцирующих лимфоцитов на 100 000 клеток после исключения крайних значений составило 7 (±2,541), 9.7 (±3,764), 10,21 (±2,54) соответственно (Табл. 8).
Таблица 8
Активация донорских лимфоцитов при стимуляции дендритными клетками,
стимулированными различными методами.
Активатор Число 1Шу-продуцирующих лимфоцитов на 100 000 клеток
Среднее (±БО) Медиана (диапазон)
Нестимулированные лимфоциты 3,415 (±2,043) 3,6 ( 0 - 6);
Лимфоциты + цитокин-активированные ДК 7 (±2,541) 7,4 (2-13);
Лимфоциты + ДК, нагруженные лизатом 9,7 (±3,764) 9,8 (4-15)
Лимфоциты + ДК, нагруженные липосомальным лизатом 10,21 (±2,54) 10,3 (7-16)
Медиана числа 1П\'у-продуцирующих нестимулированных лимфоцитов на 100 000 после исключения крайних значений (выпадающих за пределы ±2с) составила 3,6 (диапазон от 0 до 6): при добавлении стимуляторов (цитокин-активированные ДК, нагруженные ДК лизатом и нагруженные ДК липосомальным лизатом) медиана числа
IFNy-продуцирующих лимфоцитов на 100 ООО клеток после исключения крайних значений
составила 7,4 (диапазон от 2 до 13), 9,8 (4-15) и 10,3 (7-16), соответственно.
Общие выводы
1. Разработаны стандартные липосомальные лекарственные формы противомеланомной вакцины, содержащей лизат клеточных линий меланомы человека Mel Р, Mel Mtp, Mel Is, Mel Z, Mel Kor.
2. Определены параметры и критерии стандартности липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины. Разработаны хроматографические методики для качественного и спектрофотометрические для количественного определения препаратов в новой липосомальной лекарственной форме.
3. На основании разработанного режима сублимационной сушки липосомальной формы противомеланомной вакцины выбран состав липосом с криопротектором сахарозой. Установлен режим гамма-облучения липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины для обеспечения стерильности, при которой сохраняются основные физико-химические показатели липосомального препарата. Методом иммуноблот показано, что стабильность Hsp70 в липосомальной лекарственной форме противомеланомной вакцины сохраняется.
4. Разработан проект ФСП на «Липосомальная противомеланомная вакцина, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 2,5 мг и проведен контроль качества шести наработанных серий препарата при хранении при температуре +4° С в течение одного года.
5. Показано, что число IFNy-продуцирующих лимфоцитов статистически значимо увеличивается в ответ на стимуляцию ДК, нагруженными лизатом (по сравнению с негативным контролем). Отмечена тенденция к увеличению количества IFNy-продуцирующих лимфоцитов при стимуляции ДК липосомальным лизатом по сравнению с ДК, нагруженными лизатом.
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
1. Baryshnikov A.Y., Kosorukov V.S., Sokolova D.V., Mikhailova T.V., Sokolova Z.A., Kosobokova E.N., Skrypnik E.A., Dorokhov Y.L. Monoclonal antibodies as a tool for drug delivery system // Abstracts of the Second Nanotechnology international Forum participants. -Moscow, 2009. - P.524-525.
2. Михайлова T.B., Барышникова M.A., Бурова O.C., Морозова Л.Ф, Михайлова И.Н., Барышников А.Ю. Сравнение уровня экспрессии Hsp70 на клеточных линиях меланомы // Российский Биотерапевтический Журнал. -2010. -№1. -С.43-47.
3. Михайлова Т.В., Барышникова М.А., Бурова О.С., Морозова Л.Ф., Михайлова И.Н., Барышников А.Ю. Экспрессия Hsp70 на клеточных линиях меланомы человека // Российский Биотерапевтический Журнал. -2010. -№2. -С.54.
4. Михайлова Т.В., Барышникова М.А., Клименко О.В., Оборотова H.A., Барышников А.Ю. Разработка липосомальной формы антимеланомной вакцины // Сборник трудов IV Всероссийской школы-семинара студентов, аспирантов и молодых ученых по тематическому направлению развития ННС «Нанобиотехнология». - Белгород, 2011. -С. 55-57.
5. Михайлова Т.В., Барышникова М.А., Багирова Н.С., Дуфлот В.Р., Барышников А.Ю. Разработка липосомальной формы противоопухолевой вакцины // Российский Биотерапевтический Журнал. -2011. -№4. -С. 61-65.
6. Михайлова Т.В., Барышникова М.А., Багирова Н.С., Дуфлот В.Р., Барышников А.Ю. Использование гамма-облучения для стерилизации многослойных протеолипосом // Российский Биотерапевтическин Журнал. -2012. 1. -С - 64-66.
Подписано в печать 10.09.2012
Объем 1,5 усл.п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 7162 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, ул. Ленинский проспект, д. 2 (495) 978-66-63; \vww.reglet.ru
Оглавление диссертации Михайлова, Татьяна Витальевна :: 2012 :: Москва
Список сокращений.
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Биотерапия опухолей.
1.2. Меланома - клиническая и иммунологическая характеристика.
1.3 .Характеристика белков теплового шока НБр-70.
1.4. Липосомальные вакцины.
1.5.Технологические этапы получения липосомальных препаратов.
1.5.1. Методы получения многослойных липосом.
1 .б.Сушка липосомальной дисперсии.
1.7.Методы стерилизации липосомальных вакцин.
1.8.Контроль качества липосомальных препаратов.
1.8.1. Определение размеров липосом.
1.8.2.Количественное определение включенного вещества в липосомы.
1.8.3. Определение степени окисления липидных компонентов.
1.9. Исследование иммунного ответа методом ЕЫБро!.
Введение диссертации по теме "Технология получения лекарств", Михайлова, Татьяна Витальевна, автореферат
Актуальность темы
Еще 30-40 лет назад меланома кожи была сравнительно редким заболеванием в большинстве стран мира. Однако за истекшее время частота возникновения этой болезни значительно увеличилась и продолжает неуклонно возрастать. Среднегодовой темп прироста заболеваемости этой опухолью в мире составляет около 5 % (в США - 4 %, в России - 3,9 %) и может считаться одним из самых высоких среди всех злокачественных опухолей, кроме рака легкого [19].
Меланома считается «антигенной опухолью», экспрессирующей так называемые опухолеассоциированные антигены. Эти антигены используются при вакцинотерапии, которая является одним из иммунологических подходов в лечении онкологических заболеваний [3].
В настоящее время активная иммунотерапия с использованием специфических вакцин является признанным методом профилактики и лечения некоторых видов злокачественных новообразований. Основной задачей противоопухолевой вакцинации является индукция и поддержание иммунного ответа, направленного на распознавание и элиминацию иммунорезистентных опухолевых клеток [11; 12].
В процессе поиска опухолеспецифических антигенов было установлено, что белки теплового шока (Ъбр) обладают высокой иммуногенной активностью [48].
Наиболее широко распространены и лучше изучены Ьэр с молекулярным весом 70 кДа. Представители этого семейства участвуют во многих внутриклеточных процессах. Действуя как молекулярные шапероны, они способствуют образованию мульти-белковых комплексов, принимающих участие в транслокации полипептидов через клеточную мембрану в ядро, а также обеспечивают правильное сворачивание полипептидной цепи. Недавно было установлено, что, локализованные экстрацеллюлярно, Ьэр 70 играют ключевую роль в индуцировании клеточного иммунного ответа [48; 66].
Современные исследования в области создания противоопухолевых вакцин включают два основных направления: совершенствование существующих технологических этапов и разработку нового поколения вакцин на основе достижений молекулярной биологии и иммунологии.
Липосомальная терапия - одно из наиболее активно развивающихся направлений в фармакологии и медицине. Способность липосом включать в себя различные вещества практически без каких-либо ограничений в отношении их химической природы, свойств и размера молекул дает поистине уникальные возможности для решения многих медицинских проблем[13].
В 1971 году впервые была произведена попытка включить в липосомы вещество белковой природы. Протеолипосомы - белково-липидные структуры, получаемые путем встраивания белков в липосомы. Включенные в готовые липосомы путем простой инкубации альбумин, инсулин, иммуноглобулины оставались связанными с ними даже после гель-фильтрации, что свидетельствует о прочной ковалентной связи между ними[157].
Липосомальная форма вакцины позволяет обеспечить сохранность антигенов, улучшает доставку антигенов к клеткам иммунной системы и способствует повышению иммуногенности [143].
В настоящее время возможно спроектировать липосомы различной ламеллярности, размера и объема загрузки антигена [89].
Для преодоления химической и физической неустойчивости и достижения долгосрочной стабильности, используется лиофильная сушка липосом [35]. В процессе лиофилизации происходит удаление воды из системы, что предотвращает гидролиз фосфолипидов, кроме того на выходе получают твердый продукт с низкой молекулярной подвижностью, что также ведет к подавлению как химической, так и физической нестабильности.
Сублимационная сушка является основным процессом, используемым для 9 получения стабильных белков и полипептидов, которые физически и / или химически неустойчивы в водном растворе [16].
Цель исследования - разработка и изучение биофармацевтических свойств липосомальной лекарственной формы вакцины, содержащей лизат клеточных линий меланомы человека.
Задачи исследования:
1. На основе химико-фармацевтических исследований разработать состав липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины;
2. Разработать способ получения устойчивой при хранении липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины;
3. Обосновать параметры и критерии качества готового препарата и разработать методики для установления стандартности липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины;
4. Оценить противоопухолевую активность липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины;
5. Изучить стабильность липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины в процессе хранения.
Научная новизна работы
Впервые разработана новая липосомальная лекарственная форма противомеланомной вакцины, содержащей лизат клеточных линий меланомы человека Mel Mtp, Mel Is, Mel Z, Mel P, Mel Kor . Обоснованы требования к стандартизации липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины. Установлены критерии и параметры качества липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины.
Отработаны методы очистки липосомальной лекарственной формы от невключившегося лизата и определена эффективность нагрузки лизата в липосомы. Определены режимы лиофильного высушивания и стерилизации
10 липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины. Получены данные об интенсивности иммунного ответа на липосомальную лекарственную форму противомеланомной вакцины методом ELISpot.
Научно-практическая значимость
Для углубленного доклинического изучения получена липосомальная лекарственная форма противомеланомной вакцины. Получена лиофилизированная форма липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины и установлен режим стерилизации, при котором сохраняются физико-химические показатели липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 статьи в рекомендованных ВАКом журналах, 1 заявка на изобретение и 5 тезисов на Всероссийских и международных конференциях и съездах.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, включая библиографию и иллюстрации. Состоит из введения, литературного обзора, общей характеристики материалов и методов исследования, трех глав описания собственных исследований, главы обсуждения результатов и выводов. Список литературы включает 188 источников, в том числе 155 публикаций зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 22 рисунками и сопровождается 15 таблицами.
Заключение диссертационного исследования на тему "Разработка липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины"
Общие выводы
1. Разработаны стандартные липосомальные лекарственные формы противомеланомной вакцины, содержащей лизат клеточных линий меланомы человека Mel Р, Mel Mtp, Mel Is, Mel Z, Mel Kor.
2. Определены параметры и критерии стандартности липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины. Разработаны хроматографические методики для качественного и спектрофотометрические для количественного определения препаратов в новой липосомальной лекарственной форме.
3. На основании разработанного режима сублимационной сушки липосомальной формы потивомеланомной вакцины выбран состав липосом с криопротектором сахарозой. Установлен режим гамма-облучения липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины для обеспечения стерильности, при которой сохраняются основные физико-химические показатели липосомального препарата. Методом иммуноблот показано, что стабильность hsp-70 в липосомальной лекарственной форме противомеланомной вакцины сохраняется.
4. Разработан проект ФСП на «Липосомальная противомеланомная вакцина, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 2,5 мг и проведен контроль качества шести наработанных серий препарата при хранении при температуре +4° С в течение одного года.
5. Показано, что число IFNy-продуцирующих лимфоцитов статистически значимо увеличивается в ответ на стимуляцию ДК, нагруженными лизатом (по сравнению с негативным контролем). Отмечена тенденция к увеличению количества IFNy-продуцирующих лимфоцитов при стимуляции ДК липосомальным лизатом по сравнению с ДК, нагруженными лизатом.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2012 года, Михайлова, Татьяна Витальевна
1. Арзамасцев А.П., Дорофеев Д.Л. Современные требования к стандартизации и контролю качества лекарственных средств.// Материалы конференции "Человек и лекарство". 2008. - - р.
2. Барышников, А.Ю. Вакцинотерапия рака: от эксперимента к клинике / А.Ю. Барышников, Л.В. Демидов, И.Н. Михайлова, H.H. Петенко // Вестник Российской академии медицинских наук. 2007. - № 10. - С. 46-48.
3. Бережной А.Е., Закеева И.Р., Барышников А.Ю. и др. Анализ экспрессии молекул HLA-E в клетках меланомы человека // Российский Биотерапевтический Журнал. 2006. - №3. - С. 66-71.
4. Бистрин Ж.-К., Оратц Р., Шапиро Р. Вакцины из частично очищенных опухолевых антигенов. Биологические методы лечения онкологических заболеваний: принципы и практическое применение. Под ред. Винсента Т. Де Вита мл., С. Хеллмана, С.А.Розенберга.- 2009.
5. Государственная фармакопея СССР. XI издание. М., вып. 2. - 1990. - С. 140.
6. Государственная фармакопея РФ. XII издание. М., Часть 1 - 2007. - С. 105.
7. Грегориадис Г., Зади Б., Джайасекера П.Н. Способ получения липосом. Патент РФ, № 2216316. -1999.
8. Гужова И.В. Механизмы работы шаперона Hsp70 в нормальных клетках и при клеточной патологии: Автореф. дис. .д-ра биол.наук. СПб,2004. — 40 с.
9. Демидов, JI.B. Профилактическая иммунотерапия метастатической меланомы (N1-2 МО) препаратом POLY-A/POLY-U после радикального хирургического лечения / JI.B. Демидов, И.Г. Богуш // Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. 1994. - Т. 5, № s. - С. 80-82.
10. Дудниченко A.C. Новые возможности в лечении рака.// Провизор. 2000. -№ 6. - С. 18-19.
11. Дудниченко A.C., Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Липосомальные лекарственные препараты в эксперименте и в клинике. Харьков: «РА-Каравелла». 2001 - С. 13-18.
12. Каплун А.П., Шон Л.Б., Краснопольский Ю.М., В.И., Ш. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ.// Вопросы медицинской химии. 1999. - № 1(45). - С. 3-12.
13. Кельнер Р. Аналитическая химия. Проблемы и подходы. М: Мир. ООО «Издательство ACT» - Т.1. 2004 - С.99.
14. Лыков A.B. Сублимационная сушка. Теория сушки. М., Энергия., 1968 .
15. Мансурова Н.Л., Чупринина Р. П., Егорова Н.Б. и др. Антигенспецифическая активность поликомпонентной вакцины при оральном и подкожном введениях.//Журн. Микробиол. 1995. - №1. -с.37-39.
16. Михайлова, И.Н. Первая фаза клинических испытаний противоопухолевой геномодифицированной вакцины, оценка иммунного статуса / И.Н. Михайлова, К.А. Барышников, О.С. Бурова, М.И. Лукашина, А.Л.
17. Смирнова, H.H. Петенко, H.A. Утяшев, JI.В. Демидов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. 2006. - Т. 5, № 3. - С. 51-54.
18. Михайлова, И.Н. Вакцинотерапия меланомы дендритными клетками / И.Н. Михайлова, H.H. Петенко, JI.B. Демидов // Российский биотерапевтический журнал. 2007. - Т. 6, № 3. - С. 8-18.
19. Парсункова К.А. Цитокиновый профиль у больных с диссеминированной меланомой в ходе вакцинотерапии. Автореферат дисс. канд. мед. наук. М., 2010-143 с.
20. Семенов Г.В. Вакуумная сублимационная сушка. Основные понятия и определения.// Материалы научно-технической конференции. Москва. -2005. - - С. 92.
21. Торчилин В.П., Смирнов В.Н., Чазов Е.И. Проблемы и перспективы использования липосом для направленного транспорта лекарств (обзор).// Вопросы медицинской химии. 1982. - № 1(28). - С. 3-12.
22. Фаллер Д.М., Шилдс Д. Молекулярная биология клетки. Руководство для врачей. Пер.с англ. — М.: Бином-Пресс, 2004. С. 69.
23. Финдлея Дж., Эванза У. Биологические мембраны. Методы. Мир, Москва. 1990-С.
24. Харкевич, Г.Ю. Интерфероны альфа в адъювантной терапии меланомы кожи неблагоприятного прогноза: проблемы и перспективы высокодозных режимов / Г.Ю. Харкевич, Л.В. Демидов // Фарматека. 2008. - № 18. - С. 34-41.
25. Шевелев К.Ю. Сублимационная сушка. Описание технологии.// Материалы научно-технической конференции-Москва. 2005. - С. 114.
26. Шубина, И.Ж. Адоптивная иммунотерапия злокачественных новообразований / И.Ж. Шубина, А.Г. Блюменберг, С.М. Волков, JI.B. Демидов, М.В. Киселевский // Вестник Российской академии медицинских наук. 2007. - № 11.-С. 9-15.
27. Aderem A., and Ulevitch, R.L. // Nature 2000. - Vol. 406. - P. 782-787
28. Afzal R. Mohammed Vincent W. Bramwell, Allan G.A. Coombes and Yvonne Perrie Lyophilisation and sterilisation of liposomal vaccines to produce stable and sterile products// Methods Vol. 40, Issue 1, September 2006, Pages 30-38
29. Akasaki Y. Antitumor effect of immunizations with fusions of dendritic and glioma cells in a mouse brain tumor model. / Akasaki Y., Kikuchi Т., Homma S., Abe Т., Kofe D. and Ohno T. // J. Immunother. — 2001 — 24, 106-113
30. Akiyama Y. Clinical response in Japanese metastatic melanoma patients treated with peptide cocktail-pulsed dendritic cells /Akiyama Y, Tanosaki R, Inoue N et al. // J Transl Med — 2005 3:4
31. Albertini G. and Rustichelli F. Effect of gamma irradiation on the liposomal structure.// Liposome Technology. 1993. - Vol.l. - P. 399-428.
32. Asea A, Kraeft SK, Kurt-Jones EA, Stevenson M.A., Chen L.B., Finberg RW. Hsp 70 stimulates cytokine production through a CD 14-dependent pathway, demonstrating its dual role as a chaperone and cytokine. // Nat.Med. 2000. -Vol.6. -P.435-442.
33. Avigan D. Fusion cell vaccination of patients with metastatic breast and renal cancer induces immunological and clinical responses / Avigan D, Vasir B, Gong J et al. // Clin. Cancer Res. 2004; 10: 4699-708.
34. Balch CM. Prognostic factors analysis of 17,600 melanoma patients: validation of the American Joint Committee on Cancer melanoma staging system. / Balch CM, et al // J Clin Oncol — 2001 —19: 36223634
35. Baldo M. Spontaneous regression of subcutaneous metastasis of cutaneous melanoma / Baldo M., Schiavon M. // Plast. Reconstr. Surg. 1992. - 90. - P. 1073-6
36. Banchereau J. Immune and clinical responses in patients with metastatic melanoma to CD34(+) progenitor-derived dendritic cell vaccine. / Banchereau J, Palucka AK, Dhodapkar M et al. // Cancer Res — 2001 — 61:6451-6458
37. Banchereau J. Dendritic cells and the control of immunity / Banchereau J, Steinman RM // Nature 1998, 392:245-252.
38. Bangham A.D., Standish M.M., Watkins J.C. Diffusion of Univalent Ions across the lamellae of Swollen Phospholipids.// J. Mol. Biol. 1965. - No 13. - P. 238-252.
39. Barbuto J. Dendritic cell-tumor cell hybrid vaccination for metastatic cancer / Barbuto JA, Ensina LF, Neves AR et al. // Cancer Immunol. Immunother. 2004; 53: 1111-18.
40. Bastiaannet E. Level of fluorodeoxyglucose uptake predicts risk for recurrence in melanoma patients presenting with lymph node metastases / Bastiaannet E, Hoekstra OS, Oyen WJ, Jager PL, Wobbes T, Hoekstra HJ. // Ann Surg Oncol. 2006;13:919-26
41. Basu S., Binder R.J., Ramalingam T., Srivastava P.K. Heat shock proteins as novel mediators of cytokine secretion by macrophages // Cell Stress Chaperones. 1998.-Vol.3.-P. 11.
42. Blachere N., Li Z., Chandawarcar R. et al. Heat shock protein-peptide complexes, reconstituted in vitro, elicit peptide-specific cytotoxic T lymphocyte response and tumor immunity // J.Exp. Med. 1997. - Vol. 186. - P. 1315-22.
43. Boczkowski D. Dendritic cells pulsed with RNA are potent antigen-presenting cells in vitro and in vivo / Boczkowski D, Nair SK, Snyder D, Gilboa E. // J Exp Med 1996; 184:465-72.
44. Bodurtha A. Spontaneous regression of malig nant melanoma / Bodurtha A. // In: Clarke WH, Goldman M, Mastrangelo JM (eds) Human malignant melanoma. Grune & Stratton, New York, 1979. 227
45. Boon T. Human T cell responses against melanoma / Boon T, Coulie PG, Van den Eynde BJ, et al. // Annu Rev Immunol 24:175-208, 2006
46. Boon T. Human T-Cell Responses Against Melanoma / Boon T., Pierre C., Benoiit J. et al. // Annu. Rev. Immunol. 2006. - 24. - 6.1-6.3
47. Brüggen P. Tumor-specific shared antigenic peptides recognized by human T cells / Brüggen P., Zhang Y., Chaux P. et al. // Immunol. Rev. 2002. - 188. - P. 51-64;
48. Carracosa C., Espejo L., Torrado S. et al. Effect of gamma-sterilization process on PLGA microspheres loaded with insulin-like growth factor-1 (IGF-1) // J. Biomater. Appl. 2003. - Oct. 18(2): 95-108.
49. Celluzzi C. Peptide-pulsed dendritic cells induce antigen-specific; CTL-mediated protective tumor immunity. / Celluzzi CM, Mayordomo JI, Storkus WJ, et al. // J Exp Med 1996;183:283-7
50. Cerundolo V. Dendritic cells: a journey from laboratory to clinic. / Cerundolo V, Hermans IF, Salio M. // Nat Immunol 2004;5:7-10
51. Chang AE. A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer / Chang AE, Redman BG, Whitfield JR et al. // Clin. Cancer Res. 2002; 8: 1021-32.
52. Chengjun Chen, Dandan Han, Cuifang Cai, Xing Tang. An overview of liposome lyophilization and its future potential// J. of Controlled Release -2010. Vol.142. -P.299-311.
53. Copier J. Improving the efficacy of cancer immunotherapy. / Copier J, Dalgleish AG, Britten CM, et al. // Eur J Cancer. 2009;45(8): 1424-1431.
54. Corveleyn S., And Remon J.P. Formulation of a lyophilized dry emultion tablet for delivery of poorly soluble drugs.// Int.J.Pharm. 1998. - No 1(166). - P. 65-70.
55. Costantino H.R., Curley J.G., Wu S., Hsu C.C. Water sorbtion behavior of lyophilized protein/sugar systems and implications for solid-state interactions.// Int.J.Pharm. 1998. - No 2(166). - p. 211-217.
56. Craig E.A., Gross C.A. Is HSP70 the cellular thermometer? // Trends Biochem.Science. 1991.- Vol. 16.-P. 135-40.
57. Crowe L.M., Womersley C., Crowe, J. H. Preservation of Freeze-Dried Liposomes by Trehalose.// Arch. Biochem. Biophys. 1985. - No 242. - p. 240-247.
58. Cullis P., Hope M., Bally M. et al. Liposomes as pharmaceuticals // In: Ostro M. (Ed.). Liposomes from biophysics to therapeutics. New York, Marcel Dekker, -1987.
59. Czerkinsky C. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. / Czerkinsky C, Nilsson L, Nygren H, Ouchterlony O, Tarkowski A. // J Immunol Methods — 1983 — 65 (1-2): 109-21
60. Douglas S. Watson, Aaron N. Endsley, Leaf Huang . Design considerations for liposomal vaccines: Influence of formulation parameters on antibody and cell-mediated immune responses to liposome associated antigens // Vaccine. 2012 Mar 16;30(13):2256-72.
61. Dutoit V. Degeneracy of antigen recognition as the molecular basis for the high frequency of naive A2/Melan-A peptide multimer+ CD8+ T cells in humans / DutoitV., Rubio-Godoy V., PittetM. etal. //J. Exp. Med. 2002. - 196.-P. 207-16
62. Eggermont MM. Randomized trials in melanoma: An update. / Eggermont MM // Surg Oncol Clin N Am 15:439-451, 2006
63. Eigentier TK. Palliative treatment of disseminated malignant melanoma: A systemic review of 41 randomised clinical trials / Eigentler TK, Caroli UM, Radny P, et al // Lancet Oncol 4:748-759, 2003
64. Erdogan S., Ozer A., et al. Gamma Irradiation of Liposomal Phospholipids //J.Pharm. Science, 31, 2006 - P. 182-190.
65. Escobar A. Dendritic cell immunizations alone or combined with low doses of interleukin-2 induce speciWc immune responses in melanoma patients / Escobar A, Lopez M, Serrano A et al. // Clin Exp Immunol — 2005 — 142:555-568
66. Eynde B.J. T cell defined tumor antigens / Eynde B J., Bruggen P. // Curr. Opin. Immunol. 1997. - 9(5). - 684-93;
67. Ferrini U., Falcioni R., Delpino A. et al. Heat-shock proteins produced by two human melanoma cell lines: Absence of correlation with thermosensitivity // Int. J. of Cancer. 2006. - Vol. 34. - P. 651-5.
68. Finke LH. Lessons from randomized phase III studies with active cancer immunotherapies—outcomes from the 2006 meeting of the Cancer Vaccine Consortium (CVC) / Finke LH, Wentworth K, Blumenstein B, et al. // Vaccine. 2007;25(suppl 2):B97-B109.
69. Francis Puisieux, Patrick Couvreur, Jacques Delattre, Jean-Pjilippe Devissaguet. Liposome, new systems and new trends in their application. Editions de Sante. 1995 -P.797.
70. Franks F. Freeze-dryind of bioproducts. Putting principles into practice.// Eur.J.Pharm.Biopharm. 1998. - No 3(45). - P. 231-237.
71. Gitlitz BJ. A pilot trial of tumor lysate-loaded dendritic cells for the treatment of metastatic renal cell carcinoma / Gitlitz BJ, Belldegrun AS, Zisman A et al. // J. Immunother. 2003; 26: 412-19.
72. Gogas H. Prognostic significance of autoimmunity during treatment of melanoma with interferon / Gogas, H., Ioannovich, J., Dafni, U., et al. // N Engl J Med 2006;354:709-18
73. Gong J. Induction of antigen-specific antitumor immunity with adenovirus transduced dendritic cells / Gong J, Chen L, Chen D, et al. // Gene Ther 1997;4:1023-8
74. Gong J. Reversal of tolerance to human MUC1 antigen in MUC1 transgenic mice immunized with fusions of dendritic and carcinoma cells / Gong J., Chen D., Kashiwaba M., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998; 95:6279-83
75. Gong J. Fusions of human ovarian carcinoma cells with autologous or allogeneic dendritic cells induce antitumor immunity / Gong J., Nikrui N., Chen D., et al. // J. Immunol., 2000; 165:1705-11
76. Gregoriadis G. Engineering liposomes for drug delivery progress and problems//Tibtech Dec.1995. - Vol. 13. - P.527-537.
77. Gregoriadis G. Liposome technology. Volume I. Liposome preparation and related techniques. 3rd edition Informa Healthcare USA. 2006 - P.324.
78. Gregoriadis G. Liposome technology. Volume II. Entrapment of Drugs and Other Materials into Liposomes. 3rd edition. Informa Healthcare USA. 2006 - 397 p.
79. Guidance for industry. Liposome Drug Products» FDA. 2002.
80. Guo G. Antitumor activity of a fusion of esophageal carcinoma cells with dendritic cells derived from cord blood / Guo G., Chen S., Zhang J., Luo L., Yu J., Dong H., Xu H., Su Z. Wu L. // Vaccine — 2005 — 23, 5225-5230
81. Guo HB. Clinical significance of serum S100 in metastatic malignant melanoma / Guo HB, Stoffel-Wagner B, Bierwirth T, Mezger J, Klingmuller D. // Eur J Cancer. 1995;31A:924-8
82. Hanagiri T. Analysis of one of the rare melanoma patients with a spontaneous CTL response to a MAGE-A3 peptide presented by HLA-A1 / Hanagiri T., Bar en N., Neyns B. et al. // Cancer Immunol Immunother. 2006. - 55(2). - P. 178-8
83. Harris M. Monoclonal antibodies as therapeutic agents for cancer. / Harris M. // Lancet Oncol 2004; 5:292-302
84. Hauschild A. Predictive value of serum S100B for monitoring patients with metastatic melanoma during chemotherapy and/or immunotherapy / Hauschild A, etal.//Br J Dermatol — 1999 — 140: 1065-1071
85. Hauser H., Strauss G. Stabilization of small unilamellar phospholipid vesicles during spray-drying.// Biochim. Biophys. Acta. 1987. - No 897. - p. 331-334.
86. He L., Guan K., Ye H Heat shock protein 70 expression in relation to apoptosis in primary bladder transitional cell carcinoma // Cninese Med. J. — 2005. Vol. 118(24). - P. 2093-6.
87. Hersey P. Phase I/II study of treatment with dendritic cell vaccines in patients with disseminated melanoma / Hersey P, Menzies SW, Halliday GM et al. // Cancer Immunol Immunother — 2004 — 53:125-134
88. Hirschowitz EA. Immunization of NSCLC patients with antigen-pulsed immature autologous dendritic cells. / Hirschowitz EA, Foody T, Hidalgo GE, Yannelli JR. // Lung Cancer. 2007 Sep;57(3):365-72.
89. Hobeika AC. Enumerating antigen-specific T-cell responses in peripheral blood: a comparison of peptide MHC Tetramer, ELISpot, and intracellular cytokine analysis. / Hobeika AC, Morse MA, Osada T, et al. // J Immunother. 2005;28(l):63-72.
90. Holtl L. Allogeneic dendritic cell vaccination against metastatic renal cell carcinoma with or without cyclophosphamide / Holtl L, Ramoner R, Zelle-Rieser C et al. // Cancer Immunol. Immunother. 2005; 54: 663-70.
91. Holtl L. Immunotherapy of metastatic renal cell carcinoma with tumor lysate-pulsed autologous dendritic cell / Holtl L, Zelle-Rieser C, Gander H et al. // Clin. Cancer Res. 2002; 8: 3369-76.
92. Hoos A. A clinical development paradigm for cancer vaccines and related biologies. / Hoos A, Parmiani G, Hege K et al. // J Immunother — 2007 — 30:1-15
93. Hoos A. Improved Endpoints for Cancer Immunotherapy Trials. / Hoos, A., Eggermont, A., Janetzki, S., Wolchok, J. et al. // J Natl Cancer Inst. 2010 Sep 22; 102(18): 1388-1397.
94. Houghton N. Immunity against cancer: lessons learned from melanoma / Houghton N., Gold J., Blachere N. et al. //Curr. Opin. Immunol. 2001. - 13(2). -P. 134-40
95. Hsu FJ. Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic cells / Hsu FJ, Benike C, Fagnoni F, et al. // Nat Med 1996;2:52-8
96. Iinuma T. Prevention of gastrointestinal tumors based on adenomatous polyposis coli gene mutation by dendritic cell vaccine. / Iinuma T., Homma S., Noda T., Kufe D., Ohno T. and Toda G. // J. Clin. Invest. — 2004 — 113, 1307-1317
97. Jackel A. S-100 beta protein in serum, a tumor marker in malignant melanoma — current state of knowledge and clinical experience. / Jackel A, Deichmann M, Waldmann V, Bock M, Naher H. // Hautarzt. 1999;50:250-6
98. Janetzki S. MIATA—minimal information about T cell assays. / Janetzki S, Britten CM, Kalos M, et al. // Immunity. 2009;31(4):527-528.
99. Jiang S., Nail S.L. Effect of process conditions on recovery of protein activity after freezing and freeze-drying.// Eur.J.Pharm.Biopharm. 1998. - No 3(45). - P. 249-256.
100. John N.Abelson, Melvin I. Simon. Methods in Enzymology -2003.- Vol. 373.
101. Kagawa Y., Racker E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation.// J Biol Chem. - No 246. - P. 5477-5487.
102. Keilholz U. Immunologic monitoring of cancer vaccine therapy: results of a workshop sponsored by the Society for Biological Therapy. / Keilholz U, Weber J, Finke LH, et al. // J Immunother. 2002;25(2):97-138.
103. Kikuchi T. Results of a phase I clinical trial of vaccination of glioma patients with fusions of dendritic and glioma cells. / Kikuchi T, Akasaki Y, Irie M, Homma S, Abe T, Ohno T. // Cancer Immunol Immunother. 2001 Sep;50(7):337-44
104. Kirby, Gregoriadis. Dehydration-Rehydration Vesicles: A Simple Method for High Yield Drug Entrapment in Liposomes.// Biotechnology. 1984. - No 2. - P. 979-984.
105. Koido S. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1RNA. / Koido S, Kashiwaba M, Chen D, et al. // J Immunol 2000;165:5713-9
106. Koido S. Induction of antigen-specific CD4 and CD8 mediated T cell responses by fusion of autologous dendritic cells and metastatic colorectal cancer cells. / Koido S., Hara E., Torii A., Homma S., Toyama Y., Kawahara H., Ogawa
107. M., Watanabe M., Yanaga K., Fujise K., Gong J., Toda G. // Int. J. Cancer, 2005; 117,587-595.
108. Koido S. Dendritic cells fused with human cancer cells: morphology, antigen expression and T cell stimulation. / Koido S., Ohana M., Liu C., Nikrui N., Durfee J., Lerner A., Gong J. // Clin. Immunol., 2004; 113, 261-269
109. Koido S. The kinetics of in vivo priming of CD4 and CD8 T cells by dendritic/tumor fusion cells in MUC1-transgenic mice. / Koido S., Tanaka Y., Chen D., Kufe D., Gong J. // J. Immunol. 2002; 168:2111-7
110. Kruijff S. S-100B concentrations predict disease-free survival in stage III melanoma patients. / Kruijff S, Bastiaannet E, Kobold AC, van Ginkel RJ, Suurmeijer AJ, Hoekstra HJ.// Ann Surg Oncol. 2009 Dec;16(12):3455-62
111. Kyte J. T cell responses in melanoma patients after vaccination with tumor-mRNA transfected dendritic cells. / Kyte JA, Kvalheim G, Lislerud K. //Cancer Immunol Immunother 56:659-675, 2007
112. Linette GP. Immunization using autologous dendritic cells pulsed with the melanoma-associated antigen gplOO-derived G280-9V peptide elicits CD8+ immunity. / Linette GP, Zhang D, Hodi FS et al // Clin Cancer Res — 2005 — 11:7692-7699
113. Liu Y. Hierarchy of alpha fetoprotein (AFP)-specific T cell responses in subjects with AFP-positive hepatocellular cancer. / Liu Y, Daley S, Evdokimova VN, Zdobinski DD, Potter DM, Butterfield LH. // J Immunol 2006;177: 712-721
114. Lonchay C. Correlation between tumor regression and T cell responses in melanoma patients vaccinated with a MAGE antigen / Lonchay C., Bruggen P.,
115. Connerotte T. et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2004. - 101 (Suppl.2).-P. 14631-8
116. Lotze MT. Clinical effects and toxicity of interleukin-2 in patients with cancer. / Lotze MT, Matoiy YL, Rayner AA et al. // Cancer 1986; 58:2764-72.
117. Lutsiak C., Glen S. Kwon, and John Samuel Analysis of Peptide and Lipopeptide Content in Liposomes// J Pharm Pharmaceut Sei 2002,-Vol.5-P.279-284.
118. Maecker HT. The role of immune monitoring in evaluating cancer immunotherapy. / Maecker HT. // In: Disis ML, eds. Cancer Drug Discovery and Development: Immunotherapy of Cancer.Totowa, NJ: Humana Press; 2005:59-72.
119. Mohammad Riaz Liposome es preparation methods// Pakistan Journal of Pharm.Sciences 1996. - Vol.l9(l). - P.65-77.
120. Mohammad Riaz Stability and uses of liposomes //Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences-1995.-Vol. 8(2), pp.69-79.
121. Moore A. Clinical significance of serum SI00 in metastatic malignant melanoma. / Moore et al. // Eur J Cancer — 1995 — 31A: 1898-1902
122. Morton D. Vaccine Therapy for Malignant Melanoma / Morton D., Barth A. // CA Cancer J. Clin. 1996. - 46(4). - P. 225
123. Nestle FO. Vaccination of melanoma patients with peptide-or tumor lysate-pulsed dendritic cells. / Nestle FO, Alijagic S, Gilliet M et al. // Nat. Med. 1998; 4: 328-32.
124. O'Neill D. Manipulating dendritic cell biology for the active immunotherapy of cancer. / O'Neill DW, Adams S, Bhardwaj N. // Blood 2004;104:2235-2246.
125. O'Rourke MG. Durable complete clinical responses in a phase I/II trial using an autologous melanoma cell/dendritic cell vaccine. / O'Rourke MG, Johnson M, Lanagan C, et al.// Cancer Immunol Immunother 52:387-395, 2003
126. Osanto S. Vaccine Trials for the Clinician: Prospects for Tumor Antigens/ Osanto S. // The Oncologist. 1997. - 2. - P. 284-99
127. Paglia P. Murine dendritic cells loaded in vitro with soluble protein prime cytotoxic T lymphocytes against tumor antigen in vivo. / Paglia P, Chiodoni C, Rodolfo, M, et al. // J Exp Med 183:317-322, 1996
128. Rapoport AP. Restoration of immunity in lymphopenic individuals with cancer by vaccination and adoptive T-cell transfer. / Rapoport AP, Stadtmauer EA, Aqui N et al. // Nat Med — 2005—11:1230-1237
129. Ribas A. Update on immunotherapy for melanoma. / Ribas A. // J Natl Compr Cane. Netw 2006, 4:687-694.
130. Rickwood D., Hames B.D. Liposomes : a practical approach. Practical Approach Series. Oil Press at Oxford University Press. 1990 - P. 231 .
131. Ridolfi R. Improved overall survival in dendritic cell vaccination-induced immunoreactive subgroup of advanced melanoma patients. / Ridolfi R, Petrini M, Fiammenghi L et al. // J Transl Med — 2006 — 4:36
132. Romero P. Monitoring tumor antigen specific T-cell responses in cancer patients and phase I clinical trials of peptide-based vaccination. / Romero P, Cerottini JC, Speiser DE. // Cancer Immunol Immunother. 2004 Mar;53(3):249-55.
133. Roncarolo MG. Differentiation of T regulatory cells by immature dendritic cell. / Roncarolo MG, Levings MK, Traversari C. // J. Exp. Med. 2001; 193: F5-9.
134. Rosenberg SA. Cancer immunotherapy: moving beyond current vaccines. / Rosenberg SA, Yang JC, Restifo NP // Nat Med. 2004;10(9):909-915.
135. Salcedo M. Vaccination of melanoma patients using dendritic cells loaded with an allogeneic tumor cell lysate. / Salcedo M, Bercovici N, Taylor R, et al. // Cancer Immunol Immunother 55:819-829, 2006
136. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning: A Laboratory Manualj2 edn). Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989. -P. 1847.
137. Seliger B., Ritz U., Ferron S. Molecular mechanisms of HLA class I antigen abnormalities following viral infection and transformation // Int. J. Cancer. -2006.-Vol. 118.-P. 129-38.
138. Su Z. Immunological and clinical responses in metastatic renal cancer patients vaccinated with tumor RNA-transfected dendritic cells. / Su Z, Dannull J, Heiser A et al. // Cancer Res. 2003; 63: 2127-33.
139. Subhash C. Basu, Manju Basu Methods in Molecular Biology.Liposome Methods and Protocols.-2010.-Vol. 199.
140. Suzue K., Zhou X., Eisen H.N., Young R.A. Heat shock fusion proteins as vehicles for antigen delivery into magor histocompatibility complex class I presentation pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997. - Vol. 94. - P. 13146-51.
141. Szoka F., Papahadjopoulos Jr. D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation.// Proc Natl Acad Sci USA.- 1978. No 75(9). - p. 4194-4198.
142. Takahashi T. Dendritic cell vaccination for patients with chronic myelogenous leukemia. / Takahashi T, Tanaka Y, Nieda M et al. // Leuk. Res. 2003; 27: 795-802.
143. Takeuchi H., Kojima H., Yamamoto H., Kawashima Y. Evaluation of circulation profiles of liposomes coated with hydrophilic polymers having different molecular weights in rats.// J. Control. Release. 2001. - No 75. - p. 83.-91.
144. Tanaka Y. Vaccination with allogeneic dendritic cells fused to carcinoma cells induces antitumor immunity in MUC1 transgenic mice. / Tanaka Y., Koido S.,
145. Chen D., Gendler S. J., Kufe D. and Gong J. // Clin. Immunol. — 2001 — 101, 192-200.
146. Toma K., Vetter O. Pharmaceutical quality of liposomes, requirements for applicability // In: Puisieux F., Couvreur P., Delattre J., Devissaguet J.P. (Eds.). Liposomes, New systems fnd new trends in their applications. Editions de Sante. , - 1995.
147. Trefzer U. Tumour-dendritic hybrid cell vaccination for the treatment of patients with malignant melanoma: Immunological effects and clinical results. / Trefzer U, Herberth G, Wohlan K, et al // Vaccine 23:2367-2373, 2005
148. Vemuri S., Yu C.D., de Groottt J.S. et al. Effect of sugars on freeze Thaw and lyophilization of liposomes // Drug Dev.Ind.Pharm. 1991. - No 3(17). - P. 327-348.
149. Volkman Weissig Liposomes Methods and Protocols. Biological membrane models.-2010.-Vol.2.
150. Walker EB. Monitoring immune responses in cancer patients receiving tumor vaccines. / Walker EB, Disis ML. // Int Rev Immunol. 2003;22(3^):283-319.
151. Wang J. Eliciting T cell immunity against poorly immunogenic tumors by immunization with dendritic cell-tumor fusion vaccines. / Wang J., Saffold S., Cao X. T., Krauss J. and Chen W. // J. Immunol. — 1998 — 161, 5516-5524
152. Wheeler CJ. Vaccination elicits correlated immune and clinical responses in glioblastoma multiforme patients. / Wheeler CJ, Black KL, Liu G, et al. // Cancer Res 2008;68(14):5955-64.
153. Wierecky J. Immunologic and clinical responses after vaccinations with peptide-pulsed dendritic cells in metastatic renal cancer patients. / Wierecky J, Muller MR, Wirths S. // Cancer Res. 2006; 66: 5910-18.
154. Willemer H. Troubleshooting Lyophilisation.// Pharm. Techn. Europe. 1999. -No 5(11).-P. 15-22.
155. Yin Hwa Lai & Chong Wang. Delivery strategies of melanoma vaccines: an overview//Expert Opin. Drug Deliv. -2008.- 5(9):979-1001.
156. Zhengua Zhong, Xin Wei, Baowen Q. et al. A novel liposomal vaccine improves humoral immunity and prevents tumor pulmonary metastasis in mice // Int.J.Pharm. 2010. - Oct. - P. 156-162.
157. Zorn E. A MAGE-6-encoded peptide is recognized by expanded lymphocytes infiltrating a spontaneously regressing human primary melanoma lesion. / Zorn E, Hercend T. // Eur. J.Immunol. 1999. - 29. - P. 602-7.
158. Zuidam NJ, Lee SSL, Crommelin DJA. Gamma irradiation of non-frozen, frozen and freeze-dried liposomes. //Pharm Res.- 1995.-12 P.1761-1768.