Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Получение иммунопотенциирующей системы на основе липосомальной формы бактериального липополисахарида

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

/■> П

' !; ':

НАУЧНО-ЙССЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК иы. И. И. Мечникова

на правах рукописи УДК 576.8.097.001.5

Кошкина Надежда Владшшровна

ПОЛУЧЕНИЕ ИШУНОПОТЕНЩШРУЩЕЙ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ БАКТЕРИАЛЬНОГО ЛИПОПОЛИСАХАРИДА

14.00.36 - иммунология и аллергология 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на сиоскание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ -

доктор химических наук, профессор В.П.Торчилин кандидат медицинских наук А.Б.Петров ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ - кандидат биологических наук Е.Б.Лапина

доктор медицинских наук Н.Б.Егорова ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ - Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского.

Защита состоится 24 февраля 1994 г. на • заседании специализированного ученого совета (Д 001.38.01) при НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН по адресу: 103064 г. Москва, пер. Мечникова, 5а.

Автореферат разослан 24 января 1994 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

Н.Г.Кудрявцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В натоящее время получили развитие исследования по разработке вакцин на основе липополисахарида (ЛИС) грамотрицателышх бактерий. Однако использование нативного ЛПС в качестве иммуногена затруднено из-за его высокой токсичности. При включении ЛПС в липосош можно значительно снизить токсичность ЛПС, сохранив при этом его адъювантную активность. Возможность снижения токсичности или аллергических реакций антигенов при включении их в липосомы показана в ряде исследований (Gregoriadis G. 1990, Dijkstra «J. 1989, Alving 0. 1992).

Кроме того, известно, что для индукции иммунного ответа на короткие синтетические пептиды их необходимо ковалентно связывать с белковым носителем (ida G. 1988). Попытки усилить иммунный ответ на пептидный антиген при включении его в липосош проводились ранее. К сожалению, собственного адьювантного действия липосом в таких конструкциях не обнаруживалось или этот эффект был слабо выражен. Включением в липосомы одновременно мощного адъюванта, в частности ЛПС, и неиммуногенных в свободном состоянии синтетических или рекомбинантных пептидов, возможно индуцировать иммунный ответ на пептидный антиген. Цель и задачи исследования.

Цель работы состоит в разработке метода получения липосомалыюй формы бактериального ЛПС и изучении возможности использования такой конструкции в качестве иммунопотенциируицей системы.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Разработать метод, позволяющий полностью включать ЛПС, выделенный из бактерий менингококков серогругшы В, в мембрану лилосом.

2. Изучить физико-химические характеристики лилосомального ЛПС.

3. Оценить иммунобиологические свойства лилосомального ЛПС.

4. Создать иммуноготенциирущую систему на основе липосомальной формы ЛПС.

Научная новизна и практическая значимость проведенных

исследований.

В результате проведенных исследований Сил разработан метод дегидратации-регидратации (ДРВ), позволяющий практически полностью включать ЛПС, выделенный из бактерий Neisseria meningitidis серогрушш В, в липидный бислой липосом. Также разработаны методы контроля эффективности включения антигена в липосомы, и получен препарат в высушенном состоянии. Это позволяет длительно использовать его в стандартизованном виде.

Впервые било показано, что при включении ЛПС в липосомы происходит снижение его токсичности в системе in vitro в 1000 раз.

Показана возможность применения липосомальной формы ЛПС в качестве иммунопотенцииругацей системы. Одновременное включение ЛПС и неиммуногенного пептида в липосомы способствовало развитию иммунного ответа на пептидный антиген.

Полученные данные могут быть использованы для получения липосомальной менингококковой вакцины, а также мультивалентных профилактических средств против инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями и малярийным плазмодием.

Положения, выносимые на защиту.

Разработанный метод получения лигосомальной формы ЛПС позволяет полностью.включать антиген в липосош, и изменяет его физико-химические и иммунобиологические свойства.

Иммунопотенциирующий комплекс на основе липосомальной формы бактериального ЛПС способствует индукции иммунного ответа на неиммуногенный синтетический пептид при одновременном включении ЛПС и пептида в липосош.

Апробация работы.

Результаты исследований, представленных в данной работе, доложены на всероссийских и международных конференциях: на всесоюзной конференции по проблемам менингококковой инфекции и гнойных менингитов (Новосибирск, 1990), на vil международной конференции по патогенным нейссериям (Берлин, 1990), на международной конференции по липосомам (Санкт-Петербург, 1993).

Диссертация апробирована на научной конференции отдела " средств и методов иммунопрофилактики и .иммунодиагностики НИИ вакцин и сывороток им И.И.Мечникова РАМН.

Объем и структура диссертации

Диссертация включает введенйе, три главы обзора литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и список литературы. Работа содержит 89 страниц машинописного текста, 9 таблиц и 9 рисунков. Список литературы содержит 172 источника.

Содержание диссертации.

Материалы и-методы исследования.

Для приготовления лилосомалъной формы ЛПС использовали ЛПС, выделенный из Neisseria meningitidis методом фенольной экстракции (Westphal о, 1965) в НИИЭФ им. Н.Ф.Гамалеи (рук. проф. Б.А. Дмитриев), и очищали методом гель-фильтрации на сефакриле S-ЗОО. H+-, Mg2+- и триэтаноламиновую соли ЛПС получали методом диализа и элекродиализа.

Липофилшое производное олигопептида - фрагмента циркумспрозоитного белка Plsamodium falciparum - было синтезировано и предоставлено Б.Б.Ивановым, ИБХ им. М.М.Шеиякина (рук. Т.М.Андронова).

Липосомы получали из фосфатидилхолина (Предприятие по производству бактерийных препаратов, г. Харьков) и холестерола ("Sigma", США).

Реагенты для иммуноферментного анализа: конъюгаты пероксидазы хрена: поливалентный, анти-IgG и анти-lgM -препараты фирмы "Sigma", США. Определение оптической плотности в лунках иммунологических плат проводили на однолучевом автоматическом микроспектрофотометре "Dynatech", Германия.

Оценку эндогенной активности ЛПС и его липосомальной формы в системе in vitro проводили в лимулюс-тесте с помощью наборов фирмы "Atlas Bioscan", Великобритания. Токсичность липосомальных препаратов ЛПС in vivo проверяли на инбредной линии мышей СБА, полученных из питомника "Столбовая" РАМН.

Качественное и количественное определение ЛПС в образцах осуществляли двумя методами: элекрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) с последующим окрашиванием ионами серебра и

включением флуоресцентной метки в молекулу ЛПС. Интенсивность флуоресценции определяли на спектрофлуориметре "Hitachi F 300", Япония. Интенсивность окрашивания полос в ПААГ определяли на приборе "Ultrascan Laser Densitometer XL", LKB, Швеция.

Липосомы получали методами ДРВ, обращением фаз (Szoka р, 1978) и соозвучиванием. Для ультразвуковой обработки липосомальных препаратов использовали генератор "Labsonic. lab-Line Instruments", США, И ультразвуковую баню "Finnsonic W 181", Финляндия. Озвучивание проводили в токе аргона при 0°С. Полученные липосомы исследовали с помощью сканирующей электронной микроскопии на приборе "Philips PSEM-500", Голландия. Стабильность липосом в различных средах определяли инкапсулированием в липосомы кальцеина в концентрации самотушения.

Результаты исследований и обсуждение.

Получение липосомальной формы ЛПС и определение ее физико-химических свойств.

Используя различные методы получения липосом, различные количественные соотношения компонентов липосомальных препаратов, была разработана методика, позволяющая полностью включать ЛПС в состав липидной мембраны липосоМ. Известно, что активной частью молекулы ЛПС, ответственной за проявление пирогенности, токсичности, адъювантной активности и ряда других иммунобиологических свойств, является лшшд A (Rietschel • Е. 1988). Поэтому эффективность включения липофильной части молекулы ЛПС в липосомы имеет очень большое значение для изменения антигенности и адъювантного действия ЛПС. Кроме того,

присутствие даже небольшого количества несвязанного с лигосомами ЛПС, приводит к значительному увеличению токсичности препарата.

Результаты, представленные в табл. I, демонстрируют преимущество использования ДРВ метода в сравнении с другими широко используемыми методами получения липосом. При определении оптимального состава липосомального ЛПС было установлено, что наиболее эффективно в липосомы, состоящие из фосфатидилхолина (ФХ) и холестерола (Хол) включается кислая соль ЛПС (более 99,9%).

Величину включения ЛПС в липосомы оценивали по включению в молекулу антигена флуоресцентной метки.

Таблица I

Эффективность встраивания ЛПС в липосомы, получаемые различными методами.

Метод получения липосомального ЛПС

Метод обращения фаз Метод соозвучивания .. Метод ДРВ

Включение ЛПС в липосомы

_(%)_

33,0+3,0 55,0+г,5 99,0+1,0

На этом этапе работы было показано, что использование флуоресцеинизотиоцианат-ЛПС позволяет не только с достаточно высокой точностью определять эффективность включения ЛПС в липосомы, но и успешно применять его для изучения кинетики встраивания его в липидный Сислой липосомальной мембраны.

Однако более точно судить о качестве и' количестве включенного антигена в липосомы (до 10 нг ЛПС) можно с помощью электрофореза с последующим окрашиванием ионами серебра, хотя

этот метод является более трудоемким по сравнению с флуоресцентным.

Были проведены исследования по определению оптимального состава липосомальной конструкции ЛПС. Для этого оценивалась стабильность липосомальннх образцов различного состава в забуференном физиологическом растЕоре (ЗФР), рН 8,0 при 4°С и в ЗФР, содержащем сыворотку человека (10% об.) при 37°С. Липосомы, содержащие холестерол, имели фосфолипидный состав ФХ/Хол 7:3 (мол), липосомы без холестерола получали только из яичного лецитина.

а X X -100 - т

® а Л «5 во -

Ж г 1

К X I БО -

X <0 ь 2 Л 40 • / А

X го ■

® я о

0* с 0 1 2

ч

г

"I

—7

7

сутки

Рис. 1. Зависимость целостности липидной мембраны липосом от ее состава'в ЗФР, рН 8,0 при 4°С.

• - липосомы без холестерола, состав липиды/ЛПС 10:1 (мае); т - липосомы с холестеролом, состав липиды/ЛПС 1000:1 (мае); о - липосомы с холестеролом, состав липиды/ЛПС 100:1 (мае); х - -липосомы без ЛПС и холестерола;

♦ - липосомы с холестеролом без ЛПС.

Стабильность лшюсомальной системы можно увеличить путем введения в липидннй состав холестерола. Липосомы с жидкокристаллической структурой мембраны, состоящие только из ФХ, были нестабильны даже в ЗФР без сыворотки при 4°С (рис. I).

Бри инкубации липосом в условиях, приближенных к условиям в организме, стабильность липосом резко снижалась. Увеличение содержания ЛПС в липосомах оказывало отрицательный эффект на целостность лшюсомальной мембраны (рис. 1,2). Таким образом, методом последовательного приближения был определени оптимальный состав компонентов лшюсомальной конструкции: лишдный состав липосом ФХ/Хол 7:3 (мол), массовое соотношение лжмды/ЛПС 10:1.

я

X 9) Л

с;

а *

к

5 Е

0

X

®

н

А

а ь

X

01 Я" о о. п

Рис. 2. Зависимость целостности мембраны липосом от массового соотношения в ней липидов и ЛПО в среде содержащей сыворотку крови человека (10% раствор сыворотки в ЗФР) при 37°С. Массовое соотношение липиды/ЛПС (1) 10:1; (2) 100:1; (3) 1000:1; (4) липосомы без ЛПС.

Несмотря на низкую стабильность липосом в растворах, при получении липосом методом ДРВ, их можно было длительное время хранить в лиофильно высушенном состоянии (по нашим наблюдениям заметных изменений при хранении высушенных препаратов в заампулированном под вакуумом виде - в течение 3 лет не происходит). Лилосомальные суспензии готовились непосредственно перед началом экспериментов.

При изучении липосомальной формы ЛПС с помощью сканирующей электронной микроскопии было обнаружено, что средний размер получаемой конструкции составляет 0,1-0,5 мкм. Включение ЛПС в лилосомы способствует изменению адгезивных свойств липосом: по сравнению с "пустыми" липосомами величина сорбции липосомального ЛПС на поверхности иммунологических плат была значительно ниже.

Иммунобиологические свойства липосомального ЛПС.

Возможность изменения ряда биологических свойств ЛПС, в частности липоолиго- и липополисахаридов R- и s-типов грамотрицательных бактерий, путем включения их в лилосомы показана рядом авторов (Dijkstra J. 1987, 1989, Alvirig С. 1980, 1990). Нами с этой целью были проведены эксперименты по определению токсичности ЛПС in vitro с помощью лимулюс-теста и токсичности in vivo при внутрибркишдаом введении липосомального ЖС мышам СВА/Са lac sto, обработанных актиномицином D. Высокая степень включения ЛПС в лилосомы косвенно подтверждалась снижением его активности в лимулюс тесте (таб. 2). В наших исследованиях пирогенность липосомального ЛПС была в 1000 роз ниже.по сравнению с нативной формой ЛПС.

Таблица 2

Активность ЛИС N.. meningitidis, включенного в липосомы, в лимулюс-тесте.

Мелирование лизата при конценрации ЛПС (мкг/мл)

Образец

4 X 10 8 4 X 10 7 4X 10 6 4 X 10 5 4X 10

ЛПС

Смесь липосом и ЛПС

Лилосомальный ЛПС при соотношении липиды/ЛПС: 0,1:1,0 1,0:1,0 10,0:1,0 100,0:1,0 1000,0:1,0

+

+

f

+

+

+

+

+

В работах Diákstra J. было показано, что липосомальный ЛПС снижает летальность эндотоксина в опытах на мышах, обработанных актиномицином D, более чем в 10 раз по сравнению с нативным ЛПС.

Проведя аналогичный опыт на мышах с использованием липосомального ЛПС, полученного ДРВ методом , удалось снизить токсичность препарата более, чем в 200 раз (таб. 3).

В основе патофизиологического действия ЛПС лекит механизм, опосредованный через клетки моноцитарно-макрофагальной системы. При этом предполагается следующая цепочка взаимодействий: гидрофобная часть ЛПС (липид А), выполняющая сигнальную функцию,

Таблица 3

Токсичность нативной и липосомальной форм ЛПС в опытах на инбредннх мышах линии СВА/Са 1ао Б1;о, обработанных актиномицином-л.

Кол-во мышей, погибших при дозе ЛПС Т11 Образцы ' (мкг/мышь) 50

Ю-3 ю-2 Ю-1 1,0 1ШИ )

Смесь липидов и ЛПС

(неозвученная) I 3 5 5 5,0 X Ю-3

То же после 5 мин.

соозвучивания 0 о. 2 4 2,0 X Ю-1

То же после 10 мин.

соозвучивания 0 0 2 3 3,2 X Ю-1

То же после 35 мин.

соозвучивания 0 0 г 5 1,2 X Ю-1

Липосомальный ЛПС 0 0 0 2 ' 2,0

Липосомальный ЛПС

после 35" мин. озву-

чивания 0 0 I 5 2,0 X Ю-1

ЛПС 0 3 5 5 5,0 X 10~3

распознается специальными бежовыми рецепторами на мембране макрофагов, затем запускается механизм интенсивного синтеза и выделения монокинов и, в частности, одного из основных медиаторов септического шока - туморнекротизиругацего фактора. Поэтому для детоксикации ЛПС используются методические приемы, связанные с удалением лилида А, частичной детоксикацией в

результате деацилирования или дефосфорилирования липида А , а также его экранированием гидрофобными веществами, в частности фосфолипидами. В последнем случае ЛПС фагоцитируется макрофагами нераспознанным как эндотоксин и запуска патофизиологического механизма эндотоксического шока не происходит. В том случае, когда ЛПС не встроен в липидный бислой липосом, как показано нами на .примере контрольной смеси неозвученных вместе ЛПС и липосом, токсичность сохраняется на уровне, присущем свободному ЛПС.

При иммунизации животных липосомальным ЛПС, полученным ДРВ методом, токсичность ЛПС снижалась в 250 раз, тогда как при длительном озвучивании такого препарата наблюдалось 10-кратное повышение токсичности. Установлено, что снижение токсичности ЛПС при включении в липосомы происходит в связи с уменьшением времени циркуляции препарата в организме и ускорением процессинга при инъецировании липосомального ЛПС животным (Баетеп Т. 1989). Осуществление процесса фагоцитоза и выведение из организма с большей интенсивностью присуще липосомам большого размера. Это объясняет тот факт, что липосомальный ЛПС, полученный ДРВ методом, обладает более низкой токсичностью, чем ЛПС-содержащие липосомы, полученные соозвучиванием (табл. 3).

Изменение токсичности в - процессе озвучивания можно объяснить совокупностью двух факторов: в начале токсичность снижается благодаря тому, что ЛПС встраивается в мембрану больших ДРВ-липосом, а при более продолжительном озвучивании вновь несколько повышается из-за уменьшения размеров везикул, что в конечном итоге приводит к снижению скорости процессинга ЛПС при фагоцитозе.

Таким образом, нам удалось показать, что детоксикация ЛПС с помощью включения его в липосомы в значительной степени определяется полнотой встраивания ЛПС в липосомы и размером получаемой конструкции.

Получение иммунопотенциирующего комплекса (ИПК) на основе липосомалыюй формы бактериального ЛПС.

Возможность получения ИПК на основе липосом и ЛПС как иммуноадъюванта была исследована на модели синтетического липофйльного производного олигопептида (ЛПО) - фрагмента cs-белка малярийного плазмодидия,• который преспективен для получения синтетической вакцины против малярии. Сам по себе олигопептид не обладает свойствами Т-эпитопа и неиммуногенен в свободном состоянии, иными словами, является гаптеном.

В настоящее время признано, что для индукции ответа к олигопептидам их необходимо коньюгировать с белковым носителем. В этом случав носитель служит источником эпитопов для Т-лимфоцитов (Ada G.ii. 198В). Как правило, эти подхода, оправданные для экспериментальных исследований, неприменимы для создания вакцин, главным образом, вследствие изменения исходной конформации олигопептида после конъюгации, а также отсутствия эффективных адъювантов.

В нашем случае для повышения иммуногенности пептидный антигена его ассоциировали за счет гидрофобного взаимодействия с фосфолипидной мембраной липосом. Одновременно в состав липосом включали бактериальный ЛПС.

Основным требованием к получению липоеомальной конструкции, содержащей одновременно пептид и ЛПС является полное включение обоих компонентов в липидную мембрану. Для этого мы использовали

результаты, полученные на этапе формирования липосомальной формы ЛПС, Практически полное включение антигенов в ДРВ липосомы, состава ФХ/Хол 7:3 (мол), происходило при соотношении компонентов липиды/ЛПС/ЛПО по массе как 100:1:1. При увеличении содержания ЛПС в конструкции происходит вытеснение липофильного производного пептида.

В иммунобиологических исследованиях нами показано, что одновременное включение ЛПС и липоолигопептида в состав липосом способствовало развитию более сильного иммунного ответа на пептид в опытах на мышах линии сва, по сравнению с иммунным ответом, индуцируемым стандартным белково-пептидным (ГЛУЧГОО) конъюгатом (таб. 4).

Таблица 4

Антител к СЗ-белку Р.1а1с1рагит после введения различных

конструкций ЛПО.

Образцы* Титр антител

1ёМ 1ва

дни 7 14 7 14 .

ЛПО-ЛПС-липосомы 1:9728 1:4480 1:960 1:2560

ЛПО-липосомы 1:240 - - -

Смесь ЛПО и ЛПС - - - -

ГЛУ-ЛПО 1:640 1:433 1:4бб 1:720

ЛПО - - - -

ЛПС-липосомы - - - -

ЛПС - - - -

*

содержание ЛПЭ в каждой дозе соответствовало 10 мкг

Из всех остальных конструкций только ЛПО в составе липосом индуцировал незначительный синтез 1ем антител на 7 сутки после иммунизации. Таким образом, собственный адъювантный эффект липосом в ИПК не проявлялся.

Гемоцианин улитки (ГЛУ) является Т-зависимым антигеном. Поэтому максимальный уровень антител к СБ-белку был зафиксирован при повторной иммунизации мышей ГЛУ-ЛПО, вводимым с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ). При этом титр антител был гораздо выше титра 1ёМ антител. По сравнению с этими данными титр антител, индуцируемый в результате однократной иммунизации животных ИПК, был на порядок выше. Высокий титр 1ёМ антител

Рис. з. Титр антител к СБ-белку после иммунизации мышей конъюгатом ГЛУ-ЛПО и липосомальным ИПК.

I - повторная иммунизация конъюгатом ГЛУ-ЛПО с ПАФ; 2 - то же без ПАФ; 3,4 - однократная иммунизация липосомальным ИПК; 5 -однократная иммунизация ЛПО. 1,2,3,5 - отбор сыворотки осуществляли на 7-й день после иммунизации; 4 - сыворотка отбиралась на 14-й день после иммунизации. Черные столбики - титр Ig.fi антител; белые столбики - титр

антител.

сохранялся и на 14 день после иммунизации. Уровень з^с антител на 7 день после иммунизации ШЖ был невысок, однако на 14 день он увеличился вдвое и стал сравним с титром 1§о антител, индуцируемым после повторной иммунизации-ГЛУ-ЛПО (рис. 3).

Таким образом, для индукции иммунного ответа на неиммуногешшй в свободном состоянии олигопептид ковалентноэ связывание его с белковым носителем не является обязательным условием. Иммуногенносгь пептидов, не содержащих Т-эпитопов, не повышается при включении их в липосомы за счет адъювантных свойств последних. При включении в них ЛПС наблюдалось значительное повышение иммуногенносги к пептиду. Поэтому при использовании такого подхода возможно получение ИПК, которые послужат базой для создания мультивалентных профилактических средств против заболеваний, вызываемых малярийным плазмодием и грамотрицательными бактериями, а также, возможно, и другими микроорганизмами.

Выводы

I. Разработан метод дегидратзции-регидратацш, позволяющий полностью включать ЛПС в липосомн, и получать препараты в лиофильно высушенном виде.

2.Определены физико-химические характеристики получаемого препарата.

3.,Токсичность эндотоксина, включенного в лилосомы, более чем в 200 раз ниже токсичности нативной формы ЛПС в системе in vivo. Его пирогенная активность на три порядка ниже, чем у свободного ЛПС, в системе in vitro.

4. Доказана возможность использования липосомальвой формы ЛПС в качестве адъюванта при получении на" его основе липосомальной иммунопотенциирувдей системы. Разработана методика, позволяющая за счет гидрофобного взаимодействия одновременно ассоциировать синтетический липоолигопептид и ЛПС с лилидным бислоем липосом.

5. Полученная липосомальная иммунупотенциирующая система способствует индукции иммунного ответа in vivo на пептидный антиген, который в свободном состоянии или в конструкции с липосомами неиммуногенен.

Список работ, опубликованных по тепе диссертации.

1. Semenov B.F., Petrov А.В., Torchilin Y.P., Trubetskoi V.S., Koshkina N.V. .AncLronova T.M., Chulok Т.A., Ivanov В.В. Development of the Immunopotentiating system for oligopeptide antigens on the basis of the liposomal form of Neisseria meningitidis lipopolysaccharide. Proceedings of the Seventh Int. Pathogenic Neisseria Conf. September 9-14, 1990, West Berlin, p.110.

2. Semenov B.F., Petrov А.В., Chulok T.A., Torchilin V.P., Trubetskoy V.S., Koshina N.Y., Ivanov V.T., Andronova T.M., Ivanov B.B. Immunomodulating complex of oligopeptide antigen and liposomal form of Neisseria meningitidis lipooligosaccharide.-Proceedings of the Seventh Int. Pathogenic Neisseria Conf. Eds M. Achtman et al, Berlin, FRG, September 9-14, 1990.- Walter de Gruyter. Berlin, New York. 1991, p. 277-231.

3. Petrov А.В., Semenov B.P., Vartanyan Yu.P., Torchilin V.P., Trubetskoi V.S., Koshkina N.V., L'vov V.L., Dmitriev B.A. Development of liposomal vaocine on the basis of Neisseria meningitidis lipopolysaccharide.- Proceedings of the Seventh Int. Pathogenic Neisseria Conf. September 9-14, 1990. West Berlin, p.126.

4. Petrov А.В., Semenov B.F., Vartanyan Yu.P., Torchilin V.P., Trubetskoi V.S., Koshkina N.V., Dmitriev B.A., L'vov V.L., Lopyrev I.V. Development of liposomal vaccine on the basis of Neisseria meningitidis 1 ipoo1igosaccharide.- Proceedings of the

Seventh Int. Pathogenic Neisseria Conf. Eds M. Achtman et al, Berlin, FRG, September 9-14, 1990, Walter de Gruyter. Berlin, New York, 1991, p. 259-263.

5. Trubetskoy Y.S., Koshkina N.Y., Torchilin Y.P., Petrov A.B. Liposomes with meningococcal lipooligosaccharide: possible use as a vaccine.- International . Meeting on the Development of Biotechnological Products ior Use in Humans, RAI Congress Centre Amsterdam, the Netherlands, 19-22 March, 1990.

6. Irubetskoy Y.S., Koshkina N.Y., Omel'yanenko V.G., L'vov V.L., Dmitriev B.A., Petrov A.B., Torchilin Y.P. FITC-labeled lipopolysaccharide: use as a probe for liposomal membrane incorporation studies.- FEBS Letters. 1990, v. 299, No.1, p.79-82

7. Petrov A.B., Semenov B.P., Vartanjan Yu.P., Zakirov M.M. , Torchilin V.P., Trubetskoy Y.S., Koshkina N.V., L"vov V.L., Yerner I.K., Lopyrev I.V., Dmitriev В. A. Toxicity and immunogenicity of Neisseria meningitidis lipopolysaccharide incorporated into liposomes.- Infection and Immunity. 1992, v. 60, No 9, p. 3897-3903.

8. Петров А.Б., Вартанян Ю.П., Трубецкой B.C., Торчилин В.П., Закиров М.М., Бугаев Л.В., Боровкова В.М., Кошкина Н.В. Иммунологические и токсикологические свойства липоголисахарида Neisseria meningitidis группы В.- Менингококковая инфекция и гнойные менингиты (диагностика, профилактика и лечение). Тезисы докладов, 9-10 окт. 1990 г. Новосибирск. Т. I, стр. 84-86.

9. Koshkina N.V. , Petrov A.B., Kolenko V.M., Zakirov M.M., Bugaev L.V. Xmrnunornodulating activity of neisseria meningitidis

m

lipopolysaccharide incorporated inti liposomes.- Liposome Conferense in Saint-Petersburg. New Concepts, Perspectives and Clinical Applications. June 9-11. 1993, p. 23.

ilosn. d nei, 30/in 1993 r. Oopm? 60x84 I/I6 Ofoer.i 1,25 n.Ji. 0,88 yH.-Ji3fl.ji.

BfflCPX. I0I925, HocKBa, yjr. ApxunoBa, 4/2

Tiipaxc 100 Saicas 1173