Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Разработка консервирующего раствора на основе модифицированного деионизированного желатина для пролонгированного хранения отмытых эритроцитов

На правах рукописи

КИРЬЯНОВА Галина Юрьевна

РАЗРАБОТКА КОНСЕРВИРУЮЩЕГО РАСТВОРА НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННОГО ДЕИОНИЗИРОВАННОГО ЖЕЛАТИ-НАДЛЯПРОЛОНГИРОВАННОГО ХРАНЕНИЯ ОТМЫТЫХ ЭРИТРОЦИТОВ

14.00.29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт- Петербург 2005

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском институте гематологии и трансфузиологии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации

Научный руководитель: Доктор медицинских наук,

профессор В.Н. Мельникова

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук,

ст. н. с. Н.В. Минеева

Доктор медицинских наук, профессор А.В. Нечеткий

Ведущая организация: Санкт-Петербургская медицинская

академия последипломного образования.

Защита диссертации состоится ((Л8» 2005 года в

_часов на заседании диссертационного совета Д 208.074.01

при Российском НИИ гематологии и трансфузиологии по адресу: 193024, Санкт-Петербург, 2-я Советская ул., д. 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.

Автореферат разослан « Л Л » . 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Т. В. Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Совершенствование гемокомпонентной терапии требует разработки новых методов заготовки и консервирования компонентов крови, в частности, отмытых эритроцитов, переливание которых стало неотъемлемой частью трансфузионного пособия. Метод отмывания эритроцитов является одним из самых доступных и эффективных способов обеднения эритроцитных сред плазмой, тромбоцитами и в значительной мере лейкоцитами.

Целью трансфузий эритрокомпонентов является коррекция анемического синдрома, поэтому плазменные белки и клетки - носители высо-коиммуногенных антигенов расцениваются как балласт и могут служить причиной возникновения общеизвестных иммунологических, аллергических и других посттрансфузионных осложнений (Н.В. Минеева, 2001; И.К. Никитин, ПИ. Козинец, 2002; А.Е. Biedler et al., 2002; Hong Chang et al., 2000; J.D. Smith, S.F. Leitman, 2000; C.B. Toth et al., 1998; E.M. Wood et al., 2000).

Лейкоциты, кроме того, могут стать непосредственным источником клеточно-ассоциированных вирусных и бактериальных инфекций (В.Н. Мельникова и соавт., 2002; К.Ю. Литманович и соавт., 2004; J.D. Roback, CD. Hiller, 1999). Снижение в эритроцитных средах примеси лейкоцитов существенно улучшает условия хранения красных клеток крови, замедляет формирование микросгустков (J.R. Hess et al., 2000; Ю.Л. Шевченко, В.Н. Шабалин, 2003).

Применение отмытых эритроцитов, представляющих собой среду со сниженной реактогенностью, является предпочтительным в детской и акушерской практике, у трансфузионнозависимых пациентов (гематологических, онкологических больных), при неблагоприятном трансфузио-логическом и аллергологическом анамнезе (К.М. Абдулкадыров, СИ. Моисеев, 2001).

Для снижения уровня белых клеток в дозе отмытых эритроцитов ниже иммуногенного представляется необходимой их предварительная фильтрация с использованием специальных лейкофильтров. Полученную среду можно применять не только у пациентов, которым противопоказано введение плазменных белков, но и у больных с наличием анти-HLA, а также специфичных антигранулоцитарных и антитромбоцитарных антител; ее переливание предупреждает развитие аллоиммунизации и перенос цито-мегаловирусной и других вирусных инфекции (СР. Engelfriet, 2001).

Потребности в этих трансфузионных средах значительно выше реально используемых в настоящее время объемов. Одна из важных причин подобного положения связана с невозможностью хранения отмытых эритроцитов, что не позволяет проводить их предварительную заготовку.

Основным препятствием этому не является опасность бактериальной контаминации отмытых эритроцитов при их заготовке, как считалось ранее. Этот рубеж сейчас можно считать преодоленным благодаря применению закрытой системы для отмывания красных клеток.

Главной проблемой хранения является быстро наступающий гемолиз и потеря функциональной полноценности эритроцитов при 4°С в изотоническом растворе натрия хлорида, который повсеместно используется в качестве отмывающего и ресуспендирующего раствора. Срок хранения отмытых эритроцитов в физиологическом растворе, согласно действующей инструкции, ограничен 24 часами.

Отсутствие эффективного консервирующего раствора, позволяющего длительно хранить отмытые, а тем более профильтрованные и отмытые клетки без потери их жизнеспособности, препятствует широкому использованию этих сред. За рубежом предлагались отдельные экспериментальные консерванты на глюкозосолевой основе, содержащие аденин, однако они не получили применения в практике. По результатам наших многолетних предшествующих исследований, основой такого препарата может стать раствор модифицированного деионизированного желатина.

Согласно вышеизложенному, создание специального консерванта для продленного хранения отмытых нативных эритроцитов при 4°С является важной научной проблемой, разрешение которой будет способствовать повышению эффективности, а также иммунологической и инфекционной безопасности гемотрансфузионной терапии многих патологических состояний.

Цель исследования: разработка ресуспендирующего и консервирующего раствора на основе модифицированного деионизированного желатина (Модежеля) для получения и пролонгированного хранения при 4°С взвеси отмытых эритроцитов, в том числе подвергнутых лейко-фильтрации.

Задачи исследования:

1. Разработать рецептуру консерванта на основе препарата Модежель.

2. Изучить физико-химические свойства взвеси отмытых эритроцитов в

предложенном консерванте Модежель-глюфосфат.

3. Исследовать морфофункциональные свойства отмытых эритроцитов, взвешенных в новом консерванте, в процессе их хранения при 4°С.

4. Изучить реологические свойства взвеси отмытых эритроцитов в препарате Модежель-глюфосфат in vitro в процессе хранения.

5. Провести экспериментальное изучение безвредности нового консерванта на животных.

6. Разработать метод получения эритроцитной среды, максимально обедненной примесями лейкоцитов (путем лейкофильтрации) и плазмы. Определить возможность и допустимые сроки ее хранения в консерванте Модежель-глюфосфат.

Научная новизна работы. Впервые разработан консервант для отмытых эритроцитов на коллоидной основе, обеспечивающий сохранность морфофункциональных свойств красных клеток в течение трех недель их хранения при 4°С.

Доказано, что взвесь отмытых эритроцитов в консерванте Модежель-глюфосфат по реологическим свойствам существенно не отличается от консервированной на «Глюгицире» донорской крови первых суток хранения, и динамика этих свойств в процессе хранения незначительна.

Новый консервант на основе Модежеля, обладающего гемодинамиче-ским, реологическим и детоксическим действием, позволяет использовать взвесь лишенных плазмы эритроцитов в течение 21-х суток хранения (вместо 24 часов по действующей инструкции).

В экспериментах на животных доказана безвредность нового консерванта (отсутствие острой и хронической токсичности препарата, аллерги-зирующего, анафилактогенного и местнораздражающего действия).

Разработан новый метод получения эритроцитной среды, максимально лишенной примеси как лейкоцитов (путем лейкофильтрации), так и плазмы (последующим отмыванием).

Получены новые данные о влиянии лейкофильтрации и отмывания на сохранность при 4°С морфофункциональных свойств эритроцитов при консервировании их в растворе Модежель-глюфосфат. Доказана возможность хранения при 4°С в предложенном консерванте отмытых после предварительной лейкофильтрации эритроцитов в течение трех недель.

Практическая значимость работы и ее реализация

Разработанный эритроконсервант Модежель-глюфосфат обеспечит возможность хранения отмытых, а также профильтрованных и отмытых эритроцитов в течение 3-х недель (вместо 24-х часов) при 4°С и создания

их запасов для проведения не только плановых, но и экстренных транс-фузий.

Пролонгированное хранение этих сред расширит возможности их реализации, снизит потери ценной фракции крови и позволит удовлетворить клинические потребности в обедненных лейкоцитами и плазмой эритро-компонентах.

Проведение предварительной лейкофильтрации при заготовке отмытых эритроцитов предотвратит накопление продуктов распада лейкоцитов и провоспалительных цитокинов в процессе хранения, позволит значительно повысить иммунологическую и инфекционную безопасность трансфузий этой эритроцитной среды, а также эффективность гемоком-понентной терапии анемий и кровопотери, особенно у аллосенсибилизи-рованных и трансфузионнозависимых больных.

Предложенный эритроконсервант Модежель-глюфосфат производится из доступного, недефицитного и недорогого сырья; технически возможно его получение в едином технологическом цикле с препаратом «Моде-жель», производство которого осуществлялось с 1994 г.

После разрешения ФК МЗ РФ на медицинское применение и промышленный выпуск и утверждения 08.11.2001 г. специализированной комиссией по инструкциям и номенклатуре изменения названия консерванта (Пр. № 40) разработана «Инструкция по медицинскому применению препарата Модежель-глюфосфат», представленная в ФК.

Препарат запатентован (патент на изобретение №2225692), зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 20.03.2004 г.

Разработана «Временная инструкция по методу заготовки эритроцит-ной массы, максимально лишенной примесей лейкоцитов (путем фильтрования) и плазмы (путем отмывания)», одобренная решением Ученого совета и утвержденная директором РосНИИГТ 20.11.2001г.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Раствор модифицированного деионизированного желатина является оптимальной основой консервирующих растворов для нативных, отмытых и профильтрованных эритроцитов. Введение в состав консерванта для нативных эритроцитов Модежель глюкозы (7 г/л) и натрия фосфата двузамещенного (4 г/л) повышает его консервирующие свойства в отношении отмытых эритроцитов и обеспечивает сохранность их морфофункциональных и реологических свойств в течение 21-х суток при 4°С.

2. Разработанный эритроконсервант Модежель-глюфосфат обусловливает гемодинамическое, реологическое и детоксическое действие взвеси отмытых эритроцитов.

3. Новый препарат обеспечивает возможность хранения при 4°С не только отмытых нативных эритроцитов, но и наименее иммуногенной и реактогенной эритроцитной среды - профильтрованных и отмытых эритроцитов - в течение 3-х недель. Взвесь профильтрованных отмытых эритроцитов в Модежель-глюфосфате после 21 суток хранения практически не содержит микросгустков и продуктов деградации лейкоцитов (миелопероксидазы и лактоферрина).

4. Морфофункциональная полноценность предлагаемых эритроцитных сред и безвредность нового консерванта обусловливают их пригодность для переливания больным. Эффективная лейкоредукция взвеси отмытых эритроцитов, подвергнутых предварительной фильтрации через отечественные лейкофильтры, обеспечивает ее максимальную иммунологическую и инфекционную безопасность.

Апробация и публикация материалов исследования. Основные положения диссертации обсуждены на научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 6-8 июня 2000 г.), на Российской научно-практической конференции, посвященной 70-летию РосНИИГТ (Санкт-Петербург, 18-20 июня 2002 г.), 12-ой международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, 24-28 мая 2004 г.) и на Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 8-10 июня 2004 г.). По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Личное участие автора в получении результатов. Автор непосредственно участвовала в заготовке взвесей отмытых, а также профильтрованных и отмытых эритроцитов; в изучении их основных морфофунк-циональных и реологических свойств в процессе хранения; в организации доклинического исследования консерванта; в анализе и статистической обработке полученных данных.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 168 страницах

машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Работа иллюстрирована 34 таблицами и 2 рисунками.

Библиографический указатель содержит 103 отечественных и 196 иностранных источников литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и объем исследований. Работа выполнена в лаборатории консервирования крови Российского НИИ гематологии и трансфу-зиологии при участии в проведении комплексных исследований сотрудников лабораторий экспериментальной патологии, патологоанатомиче-ской, бактериологии, свертывания крови и биохимии.

Основными объектами исследования служили взвеси отмытых эритроцитов в консервантах на основе Модежеля, в новом эритроконсерванте Модежель-глюфосфат (МГФ); профильтрованные и отмытые эритроциты в Модежель-глюфосфате; экспериментальные животные.

При разработке рецептуры консервирующего раствора отмытые красные клетки крови доноров (в соотношении 1:1) взвешивали в Модежеле (9 серий опытов), Модежеле-АФ (5 серий опытов) и исследовали в течение 21 суток; а также в ряде экспериментальных растворов на основе Модежеля (разные варианты) с добавками глюкозы, аденина и натрия фосфата двузамещенного в течение 7 суток хранения при 4°С.

Отмыванию подвергали эритроцитный концентрат (ЭК), полученный методом центрифугирования (ЦФ) из консервированной на «Глюгицире» крови 1-3 суток хранения, после удаления плазмы и лейкотромбослоя с подлежащим слоем эритроцитов («Инструкция по фракционированию консервированной крови на клеточные компоненты и плазму», М., 1987). Отмывание осуществлялось 2-3-кратно (ЦФ в течение 20 мин при 1250g) изотоническим раствором натрия хлорида в асептических условиях с использованием специального «Контейнера для отмывания эритроцитов методом центрифугирования» (ТУ 64-2-419-90, АО медицинских препаратов и изделий «Синтез», г. Курган).

Опытные партии нового препарата Модежель-глюфосфат производили в соответствии с разработанным технологическим регламентом в опытной лаборатории института. Состав: желатин пищевой - 80,0 г; натрия гидроцитрат двузамещенный - 1,0 г; натрия гидрокарбонат - до рН 6,5-7,4; натрия хлорид - 3,5 г; натрия фосфат двузамещенный - 4,0 г; глюкоза - 7,0 г; вода для инъекций - до 1 л. Молекулярная масса -1300021000 дальтон. Технологический процесс включал в себя набухание и расплавление желатина, его термодеструкцию при 120-124°С, обессоли-вание на йоннообменной колонке с катионитом КУ-2-8, гидролиз (с ис-

пользованием янтарного ангидрида), добавление компонентов, нейтрализацию и стерилизацию путем ультрафильтрации.

При изучении сохранности морфофункциональных свойств отмытых эритроцитов в разрабатываемом консерванте в процессе хранения при 4°С в течение 21 суток (пять серий экспериментов) контролем служили взвеси отмытых красных клеток крови тех же доноров в изотоническом растворе натрия хлорида и растворе Модежель, предназначенном для консервирования нативных эритроцитов. Дополнительно проведено 5 серий опытов по изучению реологических свойств взвесей отмытых эритроцитов в тех же растворах в процессе их хранения.

Стерильность взвесей отмытых эритроцитов в изучаемом препарате исследовали после 3-х недель хранения при 4°С.

Доклинические исследования разработанного консерванта для отмытых эритроцитов Модежель-глюфосфат (МГФ) проводили в опытах на 5-ти видах лабораторных животных: мышах, беспородных белых крысах, кроликах породы Шиншилла, морских свинках и беспородных собаках в соответствии с «Методическими рекомендациями по экспериментальному изучению противошоковых заменителей направленного и полифункционального действия» (М., 1984), «Требованиями к доклиническому изучению общетоксического действия новых фармакологических веществ» (М.,1984) и «Правилами доклинической оценки безопасности фармакологических средств» (М., 1992).

Эксперименты по изучению возможности хранения профильтрованных и отмытых эритроцитов в консерванте МГФ включали 10 серий опытов. Лейкофильтрация эритроцитной массы осуществлялась с использованием отечественного «Устройства для удаления лейкоцитов из консервированной крови и эритроцитных сред УЛЛ-01 «Интероко», разработанного нами совместно с НТЦ «Мепотекс», АО «Интероко» и ЦНИИ бумаги, с последующим отмыванием профильтрованных эритроцитов и взвешиванием их в консерванте МГФ в соотношении 1:1. Контролем служили взвеси не профильтрованных отмытых эритроцитов в растворе МГФ.

Методы исследований. Морфологию эритроцитов оценивали с помощью светового микроскопа МБИ-6. Морфологический индекс рассчитывался модифицированным методом КТ^гу.

Количество микроагрегатов во взвесях оценивали, используя комплекс методик, включавших определение фильтрационного времени, фильтрационной массы и микроскопию (В.Н. Мельникова, В.Т. Плешаков).

Содержание свободного гемоглобина определяли бензидиновым методом М.А. Рождественской на микроколориметре МКМФ-1. Содержание общего гемоглобина - спектрофотометрически аммиачным методом при длине волны 540 нм на СФ-46. Гематокритное число определяли центрифугированием (на микроцентрифуге МГ-8). Процент гемолиза рассчитывали по формуле Strumia.

Содержание осмотически неустойчивых эритроцитов (ОНЭ) в 0,6% растворе натрия хлорида выражали в процентах к полному гемолизу клеток в 0,04% растворе аммиака.

Концентрацию аденозинтрифосфата (АТФ) определяли энзимоспек-трофотометрическим методом в гексокиназной реакции на СФ-46 (И.С.Луганова, И.Ф.Сейц).

Дзета-потенциал эритроцитов изучали с помощью установки «Дзета-2». Кислотно-основное состояние взвесей определяли на аппарате «рН-340». Осмолярность среды исследовали с помощью осмометра ОМКА 1Ц-01.

Содержание лейкоцитов определяли путем подсчета под микроскопом в камере Горяева, а после лейкофильтрации - в специальной камере Nageotte (Poly-Optik GmbH, Germany) объемом 50 мкл.

Содержание белков плазмы исследовали биуретовым методом, по методике Лоури и модифицированным в лаборатории препаратов крови РосНИИГТ методом Брандберга с применением реактива Ларионовой.

Содержание миелопероксидазы (МПО) и лактоферрина (ЛФ) в над-стое взвесей отмытых эритроцитов определяли методом ИФА в ИЭМ АМН РФ (В.Н. Кокряков).

Динамическую вязкость сред при скоростях сдвига 1с"1, 9с", 25с", 100с'1 и 180с"1, а также индекс деформируемости эритроцитов при фильтрации, приведенный к нулевому значению (ИДЭ0) определяли по методикам, разработанным В.Н. Мельниковой, В.Т. Плешаковым, А.Н. Тулу-повым, В.И. Поповым и соавт. Показатель агрегации эритроцитов (А), односекундная структурная вязкость среды (а), кессоновская вязкость (К2), индекс деформируемости эритроцитов в потоке плазмы (Тк) рассчитывались по формулам (L. Dintenfass).

В экспериментах на лабораторных животных изучали острую и хроническую токсичность разработанного препарата, влияние на функции органов и систем, анафилактогенность, местнораздражающее действие, используя общие рутинные методы физикальных, инструментальных и лабораторных исследований.

Результаты исследований обработаны методами вариационной статистики с помощью программного обеспечения (Scientific Programmable Calculator, CITIZEN, SRP-175). Для сравнения средних значений двух совокупностей применяли t-критерий Стьюдента. Вероятность различий (р) определяли по таблице Стьюдента. О статистической достоверности различий свидетельствовал показатель р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При разработке рецептуры консервирующего раствора для отмытых эритроцитов нам представлялось целесообразным взять за основу Модежель (раствор модифицированного деионизированного желатина) -коллоидный препарат, разработанный в РосНИИГТ для нативных эритроцитов. Модежель обладает не только выраженными консервирующими свойствами, но и, по данным многочисленных клинических исследований, обеспечивает отчетливый гемодинамический и детоксический эффект, корригирует кислотно-основное состояние крови реципиента, снижает вязкость крови (особенно при малых скоростях сдвига), что способствует улучшению микроциркуляции. Препараты на основе желатина не кумулируются в организме, они абсолютно нетоксичны и даже у сенсибилизированных пациентов не вызывают анафилактических реакций. Модежель позволяет хранить взвесь нативных эритроцитов в течение 3-х недель при 4°С. Препарат разрешен к медицинскому применению в качестве кровезаменителя и консерванта и выпускался промышленностью с 1994 года. Созданный на его основе эритроконсервант Модежель-АФ (с добавками аденина и двузамещенного натрия фосфата), продлевающий срок хранения нативных эритроцитов до 6-ти недель, также успешно прошел клинические испытания и рекомендован к производству и медицинскому применению.

На первом этапе нашей работы была изучена возможность консервирования отмытых красных клеток крови в двух описанных выше растворах.

В результате проведенных исследований получены данные, свидетельствующие, что отмытые эритроциты, взвешенные в Модежеле без добавок, в процессе хранения при 4°С сохраняют свои морфофункцио-нальные свойства и энергетический обмен на высоком уровне (дискоци-ты - 68,0+7,6%, уровень свободного гемоглобина - 0,122+0,051 г/л, содержание ОНЭ - 2,0+0,75%, концентрация АТФ по отношению к исходной - 83,1+11,16%) в течение лишь 7 суток, что явно недостаточно для

достижения поставленной цели. При дальнейшем хранении большинство показателей резко ухудшается.

Добавка к Модежелю аденина и фосфата (в прописи «Модежель -АФ») несколько улучшает сохранность консервированных отмытых эритроцитов в процессе хранения, однако в основном лишь в отношении АТФ, содержание которой к 14 суткам хранения при 4°С составило 75,3+3,77 % от исходного уровня. Другие показатели к 14-м суткам хранения продолжали ухудшаться: дискоциты составили 52,0+1,74%, уровень свободного гемоглобина - 0,406+0,055 г/л, содержание ОНЭ -11,8+2,41%. Последние два показателя оказались даже выше, чем во взвеси отмытых эритроцитов того же срока хранения в Модежеле без добавок.

Анализируя полученные результаты, мы пришли к выводу, что главным неблагоприятным для сохранности эритроцитов фактором в изученных эритроконсервантах было резко сниженное количество глюкозы в приготовленных взвесях отмытых клеток (до 15% от содержания глюкозы в консервированной крови), которое продолжало падать по мере их хранения (до уровня 2,2+0,50 ммоль/л в Модежеле и 2,0+0,10 ммоль/л в Модежеле-АФ к 21 суткам, что составляет всего 6% от содержания в исходной крови), поэтому нам представилась очевидной необходимость включения глюкозы, как основного субстрата гликолиза, в разрабатываемый консервант.

С целью изучения роли глюкозы и выбора оптимальной рецептуры нового препарата был поставлен ряд скрининговых опытов. К Модеже-лю, выбранному в качестве основы консерванта, добавляли разные количества глюкозы, аденина и фосфата (в различных сочетаниях). Фосфат считали необходимым ввести в состав среды в качестве субстрата для ресинтеза в эритроцитах АТФ и 2,3-ДФГ, для активации ферментов гликолиза и поддержания в оптимальном диапазоне внутриклеточного рН.

Полученные данные свидетельствуют, что по изученным параметрам морфофункциональные свойства красных клеток значительно лучше сохранялись при хранении взвеси отмытых эритроцитов в Модежеле с добавкой глюкозы в концентрации 7,0 г/л и натрия фосфата двузамещенно-го - 4,0 г/л (осмолярность взвеси составила 330,6+2,36 мОсм/л). На 7-е сутки хранения (конец наблюдения) в этом растворе отмытые эритроциты сохраняли в основном дискоидную форму (91,3%), содержание ОНЭ было минимальным и составило 1,5+0,32%, концентрация свободного гемоглобина в надстое (0,097+0,023 г/л) оказалась в 3-5 раз ниже, чем в

других растворах на основе Модежеля и в 10 раз меньше, чем в физиологическом растворе.

Этот препарат был выбран для дальнейшего исследования и назван Моде-жель-ГФ, а затем, по рекомендации номенклатурной комиссии ФК МЗ РФ, - Модежель-глюфосфат (МГФ).

При комплексном исследовании морфофункциональных свойств отмытых эритроцитов в предложенном консерванте и двух контрольных сериях нами были получены следующие результаты. После 2-3-х кратного отмывания красных клеток и помещения их в ресуспендирующие растворы (1:1) остаточное содержание лейкоцитов в дозе взвесей (350 мл) составило в среднем 0,49±0,120х109. Следует отметить, что, по мнению большинства авторов, присутствие в клеточных компонентах крови лейкоцитов ниже уровня 0,5х109 предотвращает возникновение посттранс-фузионных температурных реакций негемолитического типа и снижает риск развития других осложнений.

Содержание плазменного белка составило лишь 0,25+0,147 г/л (0,09+ 0,051 г в дозе), что свидетельствовало о достаточной степени удаления плазмы и было значительно ниже уровня, требуемого Европейскими стандартами (0,5 г в дозе).

Во взвеси эритроцитов в предложенном консерванте отмечался наиболее высокий рН (7,05+0,081), как по сравнению с исходной консервированной кровью (6,88+0,029), так и с взвесью эритроцитов в физиологическом растворе (6,56+0,061) за счет основы консерванта - Модежеля (табл. 1). Содержание глюкозы в опытной взвеси непосредственно после ее приготовления составило достаточно высокую цифру - 21,2 ммоль/л, что соответствовало добавке глюкозы в эритроконсервант.

При морфологическом исследовании обращал на себя внимание тот факт, что уже в 1-е сутки после приготовления эритровзвеси в новом консерванте, а также в Модежеле без добавок достоверно уменьшилось содержание измененных («тутовых») форм эритроцитов - 4,0% и 2,8% (в исходной крови - 12%); сфероциты отсутствовали. По-видимому, часть «старых» предгемолитических форм клеток разрушается и удаляется в процессе отмывания, а благоприятное действие коллоидной среды консервантов на основе модифицированного желатина на мембрану эритроцитов способствует, в отличие от 0,9% раствора №С1, восстановлению нормальной формы эритроцитов при их помещении в аутоплазму. Вероятно, по этой же причине достоверно снижается и содержание ОНЭ во взвесях отмытых клеток по сравнению с исходной кровью.

Таблица 1

Морфофункциональные и физико-химические свойства отмытых эритроцитов, взвешенных в Модежель-глюфосфате (I серия), Модежеле (II серия) и в изотоническом растворе натрия хлорида (III серия) в день заготовки

Показатели Исходная кровь Взвеси отмытых эритроцитов

I серия II серия III серия

Форма эритроцитов (в аутолпазме), % Дискоциты Эхиноциты Сфероциты 88,0 ±2,41 12,0 ±2,25 0,0 96,0 ±1,53* 4,0 ±1,58* 0,0 97,2 ±1,27* 2,8 ± 1,11* 0,0 91,4 ±2,64 8,6 + 2,60 0,0

Свободный гемоглобин, г/л 0,029 ±0,006 0,076 ±0,022* 0,031 ± 0,007 0,105± 0,016*

Процент гемолиза 0,014 + 0,004 0,046 ±0,013* 0,015 ±0,004 0,057 ±0,010*

ОНЭ, % 7,9 ±1,73 1,3 ±0,50* 2,4 + 0,88* 2,3 ±0,47*

Дзета-потенциал, мВ 60,0 ±4,80 57,0 ±3,87 57,1 ± 3,43 65,9 ±4,87

Осмолярность, мОсм/л 295,0 ±5,02 330,6 ±2,36* 281,0 ±8,21 300,6 ±4,57

Глюкоза, мМоль/л 30,9 ±0,93 21,2 ±2,26* 4,8 ±1,43* 7,5 ±1,96*

рН 6,88 ±0,029 7,05 ±0,081 7,03 ±0,092 6,56 ±0,061*

Примечание: знаком * обозначено статистически достоверное различие (р < 0,05) по сравнению с исходной кровью.

При последующем изучении взвесей эритроцитов на протяжении 21 суток достоинства препарата Модежель-глюфосфат проявились еще более отчетливо. По мере хранения при 4°С количество измененных форм эритроцитов нарастало во взвеси в новом консерванте в меньшей степени, чем в контрольных сериях. В особенности это касалось сфероцитов, содержание которых в опытной серии к 21 суткам составило всего 4,0±1,77%, что оказалось в 5-7 раз меньшим, чем в физиологическом растворе и Модежеле без добавок.

Предложенный нами консервант позволяет хранить отмытые красные клетки без существенного гемолиза. Так, концентрация свободного гемоглобина через 2 недели хранения в МГФ составила 0,112±0,017 г/л (в первые сутки - 0,076 г/л) и 0,359+0,109 г/л - к 21 суткам, тогда как этот показатель в Модежеле без добавок к концу срока хранения оказался 0,815+0,258 г/л, а в изотоническом растворе натрия хлорида- на порядок

Таблица 2

Показатели функциональных и физико-химических свойств взвесей отмытых эритроцитов в Модежель-глюфосфате (серия I), в Модежеле (серия II) и в 0,9% растворе натрия хлорида (серия III) в процессе хранения при 4°С

Показатели s S Сроки хранения (сутки)

ф О 1 7 14 21

Свободный гемоглобин, г/л I II III 0,076±0,022* 0,031 ±0,007* 0,105±0,016 0,082 ±0,019 0,085 ±0,014 0,743 ±0,305 0,112+0,017* 0,198+0,059* 1,357±0,496 0,359+0,109* 0,815+0,258 3,578+1,201

Процент гемолиза I II III 0,046+0,013 0,015+0,004 0.057+0,010 0,054 ±0,012 0,064 + 0,020 0,386 ±0,151 0,066+0,010* 0,124±0,050* 0,763±0,268 0,214±0,075* 0,612+0,258 1,829+0,655

ОНЭ, % 1 II III 1.3 ±0.50 2.4 ±0,88 2,3 ±0,47 1,2 ±0,28* 1,9 ±0,38* 3,3 ±0,41 4,2 +1,17 6,7 ±1,55 11,9 ±3,73 10,2 + 2,24 15,9 ±4,03 14,5 ±1,37

АТФ эритроцитов, мкмоль/ г НЬ 1 II III 4,34 ±0,080 4,25 ±0,125 4,30 ±0,289 4,11 ±0,179* 3,30 ±0,630 2,54 + 0,155 3,55 ±0,388*' 1,29 ±0,668 0,75 ±0,143 3,26 ±0,522*' 0,86 + 0,513 0,34 ±0,080

АТФ эритроцитов, % от исходного 1 II III 100,0 100,0 100,0 94,7 ±4,06* 77,6 ±14,71 59,1 ± 3,61 81,8 ±8,92*' 30,4 ±15,81 17,4 ±3,32 75,1 ± 12,00*' 20,2 ±12,12 7,9 ±0,625

Дзета-потенциал эритроцитов, мВ 1 II III 57.0 ±3,87 57.1 ±3,43 65,9 ±4,84 55,9 ±2,90 67,0 ±4,11 72,8 ±2,49 49,2 ±1,77 49,8 ±2,02 56,6 ±2,33 58,1 ±2,51 49,6 ±1,87 52,5 ±1,30

Микросгустки, х 106/л 1 II III - - - 2,7 ±1,09 1,3 ±0,44* 2,9 ±0,22

рН среды 1 II III 7,02 ±0,051* 6,79+ 0,20 6,71 ±0,087 6,96 ±0,091* 6,80 ±0,203 6,58 ±0,069 6,93 ±0,083 6,82 ±0,213 6,70 ±0,102 7,01 + 0,099 6,87 ±0,217 6,72 ±0,122

Глюкоза, ммоль/л 1 II III 21,2 ±2,26*' 4,8 ±1,29 7,5 ±1,96 23,2 ±2,62*' 4.6 ±1,35 6.7 ±2,36 14,4 ±1,13*' 3.2 ±1,28 5.3 ±2,51 14,7 ±1,76*' 1,6 ±0,63 6,1 + 3,10

Осмолярность среды, мОсм/л 1 II III 330,6±2,36*' 281,0±8,21 300,6±4,57 340,8+4,15** 283,7+8,02 302,8+6,34 337,8+6,09*" 274,0+6,13 302,3±3,75 340,0±4,70*' 276,0+4,55* 306,5±6,29

Примечание: знаком * обозначено статистически достоверное различие (р < 0,05) по сравнению с серией опытов III; знаком * обозначено различие с серией опытов II (р < 0,05).

выше, чем в МГФ (табл. 2). Процент гемолиза в опытных сериях к окончанию срока исследования (0,214+0,075%) был ниже более чем в 8 раз по сравнению со взвесью в физиологическом растворе и в 3 раза сравнительно со взвесью в Модежеле, оставаясь почти в 4 раза ниже допустимого уровня (согласно Европейским стандартам - 0,8 %). Динамика нарастания количества ОНЭ по мере хранения была приблизительно одинаковой во всех сериях опытов, однако процентное их содержание в МГФ было наименьшим на всех исследованных сроках.

К концу срока хранения исходный дзета-потенциал эритроцитов в опытной серии экспериментов, в отличие от контрольных, не изменился, что свидетельствовало о сохранении физических свойств мембраны и суспензионной стабильности взвеси в предложенном консерванте. Особенно убедительно преимущества нового консерванта были подтверждены при изучении содержания в эритроцитах АТФ - основного показателя жизнеспособности, отражающего энергетический потенциал клеток и коррелирующего с их приживаемостью. В растворе Модежель-глюфосфат содержание АТФ эритроцитов к 21-м суткам хранения снизилось лишь до 75,1% от исходного (в изотоническом растворе натрия хлорида - до 7,9%, в Модежеле без добавок - до 20,2%). Уровень АТФ более 75% от исходного является общепринятым критерием хорошей сохранности жизнеспособности красных клеток после переливания их реципиенту.

Что касается микросгустков, то на 21-е сутки хранения обнаружили относительно малое их содержание (2,7+1,09х106/л), что является естественным результатом отмывания эритроцитов с повторным удалением лейкотромбоцитарного слоя.

Результаты исследования показали, что рН взвеси отмытых эритроцитов в предложенном консерванте в процессе хранения оставался выше соответствующего показателя в контрольных сериях опытов (7,01 +0,099 на 21-е сутки). Этот факт имеет значение для большей сохранности уровня 2,3-ДФГ в эритроцитах и, следовательно, лучшей кислородтранспорт-ной функции клеток, хранившихся в МГФ, после трансфузии взвеси. Потребление глюкозы за три недели хранения в опытной серии составило 6,5 ммоль/л (во взвеси в изотоническом растворе натрия хлорида - 1,4 ммоль/л, во взвеси в Модежеле - 3,2 ммоль/л), что свидетельствует о

большей активности процесса гликолиза и синтеза АТФ в эритроцитах в изучаемом консерванте.

Проведенное бактериологическое исследование взвесей эритроцитов в новом консерванте Модежель-глюфосфат после 21 суток хранения при 4°С роста микрофлоры не выявило.

При изучении реологических свойств отмытых эритроцитов, хранившихся в Модежель-глюфосфате, Модежеле и изотоническом растворе натрия хлорида, была отмечена их закономерная отрицательная динамика, однако в коллоидных растворах она была выражена в значительно меньшей степени, чем в физиологическом. Особенно это касалось взвеси красных клеток в предложенном консерванте. Через три недели хранения рассчитанная с учетом гематокрита односекундная вязкость взвеси в Мо-дежель-глюфосфате не превысила соответствующий показатель консервированной крови первых суток хранения (в опытном растворе в 1-е сутки она равнялась 7,45+0,73, на 21-е сутки - 7,91 +0,85, в контроле -8,21 +0,38 мПас), динамическая вязкость при средних и высоких скоростях сдвига была недостоверно выше вязкости свежезаготовленной крови, но ниже соответствующих показателей взвеси в Модежеле. Динамическая вязкость при низких скоростях сдвига, что особенно важно, даже на 21-е сутки в опытной серии была ниже вязкости свежей крови. Минимальное напряжение сдвига при хранении отмытых красных клеток в растворе на основе Модежеля увеличилось недостоверно и осталось ниже, чем в консервированной крови 1-х суток хранения (0,0104+0,0052 Па и 0,0185+ 0,0050 Па соответственно). Показатель агрегации эритроцитов (А) также по мере хранения в растворе Модежель-глюфосфат существенно не изменился (0,346+0,189х10-6 Па - через 21 сутки; 0,227+0,093х10-6 Па - в 1-й день) и остался ниже, чем в свежезаготовленной крови (0,488+0,176х10-6 Па). Индекс деформируемости эритроцитов в потоке плазмы (Тк) - показатель, на величину которого влияет вязкость самой среды, - в результате отмывания и консервирования также увеличился незначительно, статистически недостоверно.

Деформируемость эритроцитов (ИДЭо), хранившихся в растворе МГФ в течение 3-х недель (в отличие от взвеси в физиологическом растворе) практически не изменилась в отрицательную сторону.

Анализ комплекса приведенных данных свидетельствует, что Моде-жель с добавками глюкозы и фосфата, обладает выраженными консервирующими свойствами в отношении отмытых эритроцитов и обеспечивает сохранность их морфофункциональных и реологических свойств при 4°С в течение 21 суток, что указывает на целесообразность его применения в

трансфузионной медицине в качестве эритроконсерванта для лишенной плазмы эритроцитной среды.

С целью изучения возможности внедрения нового препарата в практику было проведено его доклиническое изучение на 5-ти видах лабораторных животных. Полученные экспериментальные данные показали, что Модежель-глюфосфат не обладает острой токсичностью и хорошо переносится животными при однократном введении в максимально допустимом для каждого вида объеме.

При изучении хронической токсичности многократное введение препарата крысам, кроликам и собакам в дозах 10-20 мл/кг, что в 2-4 раза превышает терапевтическую дозу, не отразилось на двигательной активности и пищевой возбудимости животных, не вызвало отставания в приросте веса опытных животных по сравнению с контрольными. МГФ существенно не влияет на состав периферической крови и состояние свертывающей системы, не приводит к изменению биохимических показателей крови и анализов мочи. После 10-кратного введения препарата не нарушаются функции печени, почек, деятельность сердечно-сосудистой и дыхательной систем. Патоморфологическое исследование внутренних органов животных позволило сделать заключение, что препарат не вызывает развития воспалительных, дистрофических и некротических изменений в сердце, легких, печени, почках и селезенке.

МГФ не обладает местнораздражающим действием. В опытах на морских свинках доказано отсутствие аллергизирующего и анафилактоген-ного действия. Обосновано отсутствие канцерогенного и тератогенного действия препарата. Проведенные исследования позволили сделать вывод о том, что разработанный эритроконсервант является безвредным.

Препарат апробирован в научном центре экспертизы и государственного контроля лекарственных средств МЗ России. Согласно акту №120 от 30.08.2000 г., образцы препарата соответствуют требованиям ВФС. По заключению токсикологической экспертизы № 787.Б от 04.07.2000 г. препарат нетоксичен. Фармакологическим комитетом консервант рекомендован к медицинскому применению. В институте доклинической и клинической экспертизы лекарственных средств 12.04. 2001 г. заверена инструкция по медицинскому применению на препарат Модежель-глюфосфат (пр.№ 6).

Таким образом, созданный ресуспендирующий и консервирующий раствор для отмытых эритроцитов на основе модифицированного деио-низированного желатина, имеющий в своем составе глюкозу (7 г/л) и натрия фосфат двузамещенный (4 г/л), обеспечивает морфофункциональ-

ную полноценность клеток и пригодность взвеси отмытых эритроцитов для трансфузии в течение 21 суток хранения при 4°С Взвесь эритроцитов в консерванте практически не содержит донорских белков, имеет сниженное (ниже минимальной реактогенной дозы) количество лейкоцитов, и, следовательно, резко уменьшенную, по сравнению с большинством эритроцитных сред, реактогенность

Показаниями к применению взвеси отмытых эритроцитов являются:

- аутоиммунные, апластические анемии, талассемия;

- пароксизмальная ночная гемоглобинурия;

- сенсибилизация к антигенам белков плазмы, в том числе при врожденном дефиците ^ А, гипогаммаглобулинемии;

- аллергопатии;

- посттрансфузионные негемолитические реакции на гемотрансфузии в анамнезе;

- трансфузионнозависимые пациенты (лейкемии, миелодиспластический синдром, другие гематологические и онкологические заболевания);

- иммунокомпрометированные больные;

- больные с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом (частые беременности, выкидыши).

Однако взвесь отмытых эритроцитов содержит около 5х108 остаточных лейкоцитов, что, естественно, не исключает возможности возникновения таких осложнений, как аллоиммунизация реципиента к антигенам гистосовместимости, иммуномодуляция, поражение легких, перенос ряда клеточно-ассоциированных вирусных инфекций (вызываемых ЦМВ, вирусами Эпштейна-Барр, Т-клеточного лейкоза и др.).

С целью профилактики этих осложнений нами впервые разработан метод получения эритроцитной среды с минимальной примесью не только плазмы и тромбоцитов, но и лейкоцитов (ниже минимальной иммуно-генной дозы) путем лейкофильтрации и последующего отмывания ЭМ; утверждена временная инструкция по его применению. При заготовке среды использовался первый отечественный лейкофильтр УЛЛ-01 «Ин-тероко». Учитывая результаты наших предшествующих исследований по созданию лейкофильтра и по отмыванию эритроцитов от плазмы, а также литературные данные, мы считали целесообразным на первом этапе заготовки новой среды осуществлять удаление лейкоцитов из эритро-цитной массы, а на втором - отмывание красных клеток. При такой последовательности процедур создаются более благоприятные условия для задержки лейкоцитов при фильтровании (в присутствии плазмы) и возникает возможность исключить из технологии отмывания удаление лей-

котромбослоя с подлежащим слоем эритроцитов, что уменьшает потерю красных клеток. Потери эритроцитов при таком способе заготовки составляют 12,4+0,20%.

Изучена возможность консервирования максимально лишенных примесей других компонентов крови красных клеток в разработанном нами для отмытых эритроцитов препарате Модежель-глюфосфат.

В результате лейкофильтрации и отмывания содержание остаточных лейкоцитов в дозе взвеси (300 мл) составило 1,08+0,329х106, что соответствует требованиям международных стандартов и обеспечивает профилактику не только фебрильных реакций, но и аллоиммунизации, а также переноса цитомегаловирусной инфекции при трансфузиях (табл. 3). Полученную среду можно использовать у больных с наличием анти-ИЬЛ, а также специфичных антигранулоцитарных и антитромбоцитарных антител.

Таблица 3

Содержание лейкоцитов и плазменных белков во взвесях эритроцитов в Модежель-глюфосфате в опытной (профильтрованные отмытые) и контрольной (отмытые) сериях экспериментов в день заготовки

Двукратное отмывание эритроцитов после лейкофильтрации резко снизило содержание донорского белка в дозе взвесей (до 0,06+0,035 г), что в 8 раз меньше допустимой международными стандартами величины.

Комплексное исследование морфофункциональных свойств взвесей эритроцитов, подвергнутых предварительной лейкофильтрации, в процессе хранения при 4°С свидетельствовало, что Модежель-глюфосфат обеспечивает сохранность биологической полноценности профильтрованных отмытых эритроцитов в течение 3-х недель как по морфологическому индексу (92,0+1,43), индексу деформируемости эритроцитов (3,16+0,207) и уровню АТФ (76,8+6,96% от исходного), так и по степени гемолиза (0,259+0,085% к 21 суткам).

Необходимо отметить, что в серии профильтрованных отмытых эритроцитов в течение всего срока хранения отсутствовали микросгустки и

продукты деградации лейкоцитов (МГТО и ЛФ). Лишь в одном из опытов на 21-е сутки было обнаружено крайне низкое содержание миелоперок-сидазы (23 нг/мл при норме 160+15 нг/мл) и лактоферрина (32 нг/мл при норме 1000 +140 нг/мл).

Таким образом, методом фильтрования ЭМ через отечественные лей-кофильтры с последующим отмыванием эритроцитов и взвешиванием их в консерванте Модежель-глюфосфат нами впервые получена новая эрит-роцитная среда с минимальным содержанием лейкоцитов и плазмы, обладающая за счет высоких коллоидно-осмотических свойств консерванта гемодинамическим, реологическим и детоксическим действием.

Возможность хранения при 4°С отмытых и профильтрованных-отмытых эритроцитов в разработанном нами препарате в течение 21 суток (вместо 24-х часов в изотоническом растворе натрия хлорида по действующей инструкции) делает реальным создание запасов ареактоген-ных эритроцитных сред полифункционального действия. Это будет способствовать обеспечению клинических потребностей в данных средах, расширит возможности их применения, в том числе и в экстремальных ситуациях, снизит частоту посттрансфузионных реакций и осложнений.

ВЫВОДЫ

1. Впервые разработан консервант для отмытых эритроцитов на коллоидной основе, обеспечивающий сохранность морфофункциональных свойств лишенных плазмы красных клеток крови в течение 21-х суток хранения при 4°С.

2. В экспериментах на 5-ти видах лабораторных животных доказана безвредность нового эритроконсерванта на основе модифицированного деионизированного желатина (отсутствие острой и хронической токсичности препарата при внутривенном введении, отсутствие аллерги-зирующего, анафилактогенного и местнораздражающего действия).

3. Предложенный консервант на основе Модежеля, обладающего гемо-динамическим, реологическим, буферным и детоксическим действием, открывает перспективу применения взвеси отмытых эритроцитов в течение трех недель (вместо 24 часов при использовании изотонического раствора натрия хлорида) и расширяет показания к ее применению для лечения не только анемий, но и острой кровопотери.

4. Разработана технология получения новой эритроцитной среды, максимально лишенной примесей не только плазмы и тромбоцитов, но и лейкоцитов путем лейкофильтрации, последующего отмывания и взвешивания красных клеток в предложенном консерванте, позво-

ляющая обеспечить иммунологическую и инфекционную ее безопасность. Обоснована возможность хранения этой среды при 4°С в течение трех недель.

5. Доказано, что лейкодеплеция резко замедляет процессы образования микросгустков и накопления продуктов деградации лейкоцитов (в частности, миелопероксидазы и лактоферрина) во взвеси профильтрованных и отмытых эритроцитов в Модежель-глюфосфате в процессе хранения.

6. Применение нового раствора для отмытых и профильтрованных-отмытых эритроцитов, значительно продлевающего сроки их хранения, позволит удовлетворить клинические потребности в обедненных лейкоцитами и плазмой эритроцитных средах и максимально снизить риск развития посттрансфузионных реакций и осложнений, а также откроет новые перспективы для оптимальной утилизации этих сред и создания их запасов.

Практические рекомендации

1. Внедрение в практику эритроконсерванта Модежель-глюфосфат позволит рекомендовать СПК и ОПК более широкое использование взвесей отмытых эритроцитов (в течение 3-х недель хранения вместо 1-х суток) и создание запасов отмытых эритроцитов, в первую очередь, группы 0(1), которые можно использовать не только по предварительным заявкам, но и при оказании экстренной трансфузиологиче-ской помощи.

2. Взвесь отмытых эритроцитов в новом консерванте показана анемизи-рованным пациентам, имевшим в анамнезе посттрансфузионные температурные реакции негемолитического типа, аллергические реакции на введение плазменных белков, больным ПНГ, талассемией, аутоиммунными анемиями и др. гематологическими заболеваниями, при врожденном дефиците ^ А, а также, при наличии резерва ЭВ, в экстренных ситуациях широкому контингенту хирургических больных для возмещения острой кровопотери.

3. Взвесь профильтрованных отмытых эритроцитов в предложенном консерванте рекомендуется пациентам, сенсибилизированным не только к белкам плазмы, но и при наличии анти-ИЬЛ, специфичных антигранулоцитарных и антитромбоцитарных антител; трансфузион-нозависимым больным с целью профилактики аллоиммунизации и острого поражения легких; иммунокомпрометированным лицам для

предупреждения переноса ряда вирусных инфекций, а также по показаниям больным с острой кровопотерей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мельникова В.Н. Функциональные свойства эритроцитной взвеси, лишенной примеси лейкоцитов, в процессе консервирования при температуре 4°С / В.Н. Мельникова, В.Т. Плешаков, З.П. Беляева, И.Н. Дегтерева, К.А Гербут, Г.Ю. Кирьянова, А.В. Горкун // Актуальные проблемы патофизиологии экстремальных состояний: Тез. докл. конф. ВМА им. СМ. Кирова. - СПб., 1993. - С. 28.

2. Мельникова В.Н. Итоги и перспективы разработки эритроцитных сред с использованием консервирующих растворов на основе модифицированного желатина / В.Н. Мельникова, В.Т. Плешаков, ЕА Селиванов, И.Н. Дегтерева, З.П. Беляева, Т.Н. Карташевская, Н.И. Кочетыгов, Г.Ю. Кирьянова, К.А Гербут, А.В. Горкун // Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии: Тез. докл. - СПб., 1995. — С. 218 — 219.

3. Мельникова В.Н. Удаление лейкоцитов и тромбоцитов из эритроцит-ных трансфузионных сред / В.Н. Мельникова, В.Т. Плешаков, ЕА Селиванов, З.П. Беляева, И.Н. Дегтерева, С.Д. Волкова, Е.Ф. Ильина, Г.Ю. Кирьянова, В.Н. Кокряков, Э.И. Семененко, Н.М. Шишов, Г.Н. Сапкова, А.В. Канарский, Л.П. Папаян, А.С. Шитикова // Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии: Тез. докл. - СПб., 1995. -С. 219-220.

4. Селиванов Е.А. Консервант для отмытых эритроцитов / Е.А. Селиванов, В.Н. Мельникова, Н.И. Кочетыгов, В.Т. Плешаков, Г.Ю. Кирьянова, З.П. Беляева, К.А. Гербут, В.И. Ругаль, В.А. Гончар // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: Матер, науч.-практич. конф. - СПб., 2000 - С. 262.

5. Мельникова В.Н. Изучение эритроцитсодержащих сред, профильтрованных через лейкофильтр УЛЛ-01 «Интероко», в процессе хранения при 4°С / В.Н. Мельникова, В.Т. Плешаков, З.П. Беляева, С.Д. Волкова, Г.Ю. Кирьянова // Трансфузиологии. - 2002. - Т.З, №4. - С. 54 -61.

6. Мельникова В.Н. Метод получения эритроцитной среды, максимально лишенной примесей лейкоцитов и плазмы / В.Н. Мельникова, В.Т. Плешаков, Г.Ю. Кирьянова, З.П. Беляева, С.Д. Волкова // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: Тез. докл. - СПб., 2002. - С. 266-267.

7. Селиванов Е.А. Разработка консерванта для отмытых эритроцитов / ЕА Селиванов, Н.И. Кочетыгов, В.Н. Мельникова, В.Т. Плешаков, Г.Ю. Кирьянова, З.П. Беляева, К.А. Гербут, ГА Хмылова, Н.Д. Сидорова, В.И. Ругаль, В.А Гончар, Ю.В. Крылова // Трансфузиология. -2001.-№4.-С. 8-16.

8. Мельникова В.Н. Получение и хранение взвеси профильтрованных отмытых эритроцитов в консерванте Модежель-глюфосфат / В.Н. Мельникова, Е.А. Селиванов, Г.Ю. Кирьянова, В.Т. Плешаков // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: Матер. Российск. науч.-практич. конф. - СПб., 2004. - С. 158.

9. Мельникова В.Н. Новый эффективный метод лейкодеплеции эритро-массы и плазмы консервированной крови / В.Н. Мельникова, Е.А Селиванов, В.Т. Плешаков, Г.Ю. Кирьянова, Н.М. Шишов // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: Матер. Российск. науч.-практич. конф. - СПб., 2004 г. - С. 158 - 159.

10.Плешаков В.Т. Количественное определение содержания белка донорской крови во взвеси отмытых эритроцитов в растворе модифицированного деионизированного желатина (МДЖ) / В.Т. Плешаков, Г.Ю. Кирьянова // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиоло-гии: Матер. Российск. науч.-практич. конф. -СПб., 2004. - С. 160.

11. Мельникова В.Н. Метод заготовки и консервирования лейкоредуци-рованной взвеси отмытых эритроцитов в «Модежель-глюфосфате» / В.Н. Мельникова, Е.А. Селиванов, В.Т. Плешаков, Г.Ю. Кирьянова // Трансфузиология. - 2004. - Т.5, № 3. - С. 24 - 32.

Подписано в печать 18.02.2005 г.

Формат 60 х 84 1/16. Тираж 100 экз.

Объем 1,5 п.л. Заказ № 7/11

Отпечатано в издательстве «Геликон Плюс» 199053, Санкт-Петербург, В.О 1-ая линия, д. 28. Тел.:(812)327-46-13

22

180

Актуальность проблемы

Отмывание эритроцитов в настоящее время является наиболее доступным и эффективным методом удаления из эритроцитных трансфузионных сред плазмы, а также способом обеднения их лейкоцитами и тромбоцитами - теми компонентами крови, которые могут стать причиной возникновения постгрансфузионных реакций и осложнений.

Переливаемая в составе эритрокомпонентов плазма может явиться причиной гемолитических осложнений у больных с комплементзависимыми анемиями (пароксизмальная ночная гемоглобинурия), аллергических и анафилактических реакций, острого поражения легких, синдрома аллогенной крови, стать источником гемотрансмиссивных инфекций (И.А. Лисуков и соавт., 1999; C.B. Toth et al., 1998).

Наличие лейкоцитов и продуктов их деградации в компонентах крови может привести к развитию неспецифических и иммунологических негемолитических температурных реакций, а также таких осложнений, как рефрактерность к алло-генным тромбоцитам, острая легочная недостаточность, болезнь «трансплантат против хозяина» (Е.Б. Жибурт, 2000; Н.В. Минеева, 2001; Е.М. Wood et al., 2000; А.Е. Biedler et al., 2002). Перелитые лейкоциты в дозе более 1х106 могут вызвать аллоиммунизацию реципиента, иммуномодуляцию (иммуносупрессию) и, вследствие этого, привести к активации дремлющей вирусной и бактериальной инфекции, генерализации опухолевого процесса (И.К. Никитин, Г.И. Козинец, 2002; Hong Chang et al., 2000; J. D. Smith, S.F. Leitman, 2000).

Важно отметить, что лейкоциты могут служить непосредственными переносчиками ассоциированных с ними вирусов и бактерий (В.Н. Мельникова и соавт., 2002; И.К. Никитин и соавт., 2001; J.D. Roback, C.D. Hiller, 1999).

В современной трансфузионной терапии применение отмытых эритроцитов занимает весьма значительное место (К.М. Абдулкадыров, С.И. Моисеев, 2001). Это объясняется тем, что взвесь отмытых эритроцитов практически не содержит чужеродного реципиенту плазменного белка и значительно обеднена лейкоцитами и тромбоцитами. В связи с этим отмытые эритроциты представляют собой среду со сниженной (по сравнению с ЭМ и ЭК) иммуногенностью и реактогенностью, практически не содержащую микросгустков. В детской практике, у трансфузионнозависимых пациентов (гематологических, онкологических больных) и даже в общей хирургии применение отмытых эритроцитов в значительной степени вытесняет использование других эритроцитных сред. Так, по мнению С.Е. Ь^тап (1999), использование взвеси отмытых эритроцитов в комбинации с кровезаменителями может полностью обеспечить возмещение операционной кровопотери.

Для снижения уровня белых клеток в дозе отмытых эритроцитов ниже иммуногенного представляется необходимой их предварительная фильтрация с использованием специальных лейкофильтров. Полученную среду можно применять не только у пациентов, которым противопоказано введение плазменных белков, но и у больных с наличием анти-НЬА, а также специфичных антигранулоцитарных и антитромбоцитарных антител; ее переливание исключает аллоиммунизацию и перенос цитомегаловирусной инфекции (С.Р. Еп^еШе!:, 2001).

Потребности в этих трансфузионных средах значительно выше реально используемых в настоящее время объемов. Одна из важных причин подобного положения связана с невозможностью хранения отмытых эритроцитов, что не позволяет проводить их предварительную заготовку. Основным препятствием этому не является опасность бактериальной контаминации отмытых эритроцитов при их заготовке, как считалось до последнего времени. Этот рубеж сейчас можно считать преодоленным благодаря применению системы из трех-четырех спаренных контейнеров для отмывания красных клеток и специальных устройств для стерильного подсоединения к контейнерам с исходным эритроконцентратом (эритромассой) и растворами для отмывания и консервирования. Включение в эту систему лейкоцитарного фильтра позволит стерильно получить среду, максимально лишенную не только плазмы и тромбоцитов, но и лейкоцитов.

Главной проблемой хранения является быстро наступающий гемолиз и потеря функциональной полноценности эритроцитов при 4°С в изотоническом растворе натрия хлорида, который используется (в нашей стране и за рубежом) в качестве отмывающего и ресусиендирующего раствора. Срок хранения отмытых эритроцитов в физиологическом растворе, согласно действующей инструкции, ограничен 24 часами.

Отсутствие эффективного консервирующего раствора, позволяющего длительно хранить отмытые, а тем более профильтрованные и отмытые клетки без потери их жизнеспособности, препятствует широкому использованию этих сред. В единичных сообщениях на уровне лабораторных исследований за рубежом предлагались эритроконсерванты на солевой основе, содержащие аденин, которые не получили применения в практике. По результатам наших предшествующих исследований, основой такого препарата может стать раствор модифицированного деионизированного желатина.

Согласно вышеизложенному, создание специального консерванта для пролонгированного хранения отмытых нативных эритроцитов при 4°С является важной научной проблемой, разрешение которой будет способствовать повышению эффективности, а также иммунологической и инфекционной безопасности гемотрансфузионной терапии многих патологических состояний.

Решение этого вопроса делает реальной и разработку метода получения и хранения отмытых профильтрованных эритроцитов.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилась разработка эффективного ресуспен-дирующего и консервирующего раствора на основе модифицированного деионизированного желатина (Модежеля) для получения и продленного хранения при 4°С взвеси отмытых эритроцитов, в том числе подвергнутых лейкофильтрации.

В процессе исследования решались следующие задачи:

1. Разработка рецептуры консерванта на основе препарата Мо деже ль.

2. Изучение физико-химических свойств предложенного консерванта Модежель-глюфосфат.

3. Исследование морфофункциональных свойств отмытых эритроцитов, взвешенных в новом консерванте, в процессе их хранения при 4°С.

4. Изучение реологических свойств взвеси эритроцитов в препарате Модежель-глюфосфат in vitro в процессе хранения.

5. Экспериментальное изучение безвредности нового консерванта для отмытых эритроцитов на лабораторных животных (определение острой и хронической токсичности, местнораздражающего и аллергизирующего действия препарата).

6. Разработка метода получения максимально обедненной примесями лейкоцитов (путем лейкофильтрации) и плазмы эритроцитной среды. Определение возможности и допустимых сроков ее хранения в консерванте Модежель-глюфосфат.

Научная новизна исследования

Впервые разработан консервант для отмытых эритроцитов на коллоидной основе, обеспечивающий сохранность морфофуякциональных свойств красных клеток в течение грех недель их хранения при 4°С.

Показано, что взвесь отмытых эритроцитов в консерванте Модежель-глюфосфат по реологическим свойствам практически не отличается от консервированной на «Глюгшщре» донорской крови первых суток хранения, и динамика этих свойств в процессе хранения незначительна.

Новый консервант на основе Модежеля, обладающего гемодинамическим, реологическим и детоксическим действием, позволяет использовать взвесь лишенных плазмы эритроцитов в течение 21-х суток хранения (вместо 24 часов по действующей инструкции).

В экспериментах на животных доказана безвредность нового консерванта (отсутствие острой и хронической токсичности препарата при внутривенном введении, отсутствие аллергизирующего, анафилактогенного и местно-раздражающего действия).

Разработан новый метод получения эритроцитной среды, максимально лишенной примеси как лейкоцитов (путем лейкофильтрации), так и плазмы (путем последующего отмывания). Получены новые данные о влиянии лейкофильтрации и отмывания на сохранность при 4°С морфофункциональных свойств эритроцитов при консервировании их в растворе Модежель-глюфосфат. Доказана возможность хранения при 4°С в предложенном консерванте отмытых после предварительной лейкофильтрации эритроцитов в течение трех недель.

Практическая значимость работы

Разработанный эритроконсервант Модежель-глюфосфат обеспечит возможность хранения отмытых, а также профильтрованных и отмытых эритроцитов в течение 3-х недель (вместо 24-х часов) при 4°С и создания их запасов для проведения не только плановых, но и экстренных трансфузий. Пролонгированное хранение этих сред расширит возможности их реализации, снизит потери ценной фракции крови и позволит удовлетворить клинические потребности в обедненных лейкоцитами и плазмой эритрокомпонентах.

Проведение предварительной лейкофильтрации при заготовке отмытых эритроцитов предотвратит накопление продуктов распада лейкоцитов и провоспалительных цитокинов в процессе хранения, позволит значительно повысить иммунологическую и инфекционную безопасность трансфузий этой эритроцитной среды, а также эффективность гемокомпонентной терапии анемий и кровопотери, особенно у аллосенсибилизированных и трансфузионнозависимых больных.

Предложенный эритроконсервант Модежель-гшофосфат производят из доступного, недефицитного и недорогого сырья, технически возможно его получение в едином технологическом цикле с препаратом «Модежель», производство которого осуществлялось с 1994 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Раствор модифицированного деионизированного желатина является оптимальной основой консервантов для нативных, отмытых и профильтрованных эритроцитов. Введение в состав эритроконсерванга и кровезаменителя Модежель глюкозы (в концентрации 7 г/л) и натрия фосфата двузамещенного (4 г/л) повышает его консервирующие свойства в отношении отмытых эритроцитов и обеспечивает сохранность (при изучении in vitro) их морфофункциональных и реологических свойств в течение 21-х суток (вместо 24-х часов в изотоническом растворе натрия хлорида) при условии хранения взвеси при 4°С.

2. Разработанный эритроконсервант Модежель-гшофосфат обусловливает гемодинамическое, реологическое и детоксическое действие взвеси отмытых эритроцитов.

3. Новый препарат обеспечивает возможность хранения при 4°С не только отмытых нативных эритроцитов, но и наименее иммуногенной и реактогенной эритроцитной среды - профильтрованных и отмытых эритроцитов - в течение 3-х недель. Взвесь профильтрованных отмытых эритроцитов в Модежель-глюфосфате после 21 суток хранения практически не содержит микросгустков и продуктов деградации лейкоцитов (миелопероксидазы и лактоферрина).

4. Морфофункциональная полноценность предлагаемых эритроцитных сред и безвредность нового консерванта обусловливают их пригодность для переливания больным. Эффективная лейкоредукция взвеси отмытых эритроцитов, подвергнутых предварительной фильтрации через отечественные лейкофильтры, обеспечивает ее максимальную иммунологическую и инфекционную безопасность.

Апробация и реализация результатов работы. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ. Материалы исследования обсуждены на научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 6-8 июня 2000 г.), на Российской научно-практической конференции, посвященной 70-летию РосНИИГТ (Санкт-Петербург, 18-20 июня 2002 г.) и на Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 8-10 июня 2004 г.).

После разрешения ФК МЗ РФ на медицинское применение и промышленный выпуск и утверждения 08.11.2001 г. специализированной комиссией по инструкциям и номенклатуре изменения названия консерванта (Пр. № 40) разработана «Инструкция по медицинскому применению препарата Модежель-глюфосфат», представленная в ФК.

Препарат запатентован (патент на изобретение №2225692), зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 20.03.2004 г.

Разработана «Временная инструкция по методу заготовки эритроцитной массы, максимально лишенной примесей лейкоцитов (путем фильтрования) и плазмы (путем отмывания)», одобренная решением Ученого совета и утвержденная директором РосНИИ гематологии и трансфузиологии 20.11.2001г.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 168 страницах машинописи и состоит из введения, шести глав, заключения, выводов и практических рекомендаций. Библиографический указатель содержит 103 отечественных и 196 иностранных источников литературы. Работа иллюстрирована 2 рисунками и 34 таблицами.

139 Выводы

1. Впервые разработан консервант для отмытых эритроцитов на коллоидной основе, обеспечивающий сохранность морфофункциональных свойств лишенных плазмы красных клеток крови в течение 21-х суток хранения при 4°С.

2. В экспериментах на 5-ти видах лабораторных животных доказана безвредность нового эритроконсерванта на основе модифицированного деионизированного желатина (отсутствие острой и хронической токсичности препарата при внутривенном введении, отсутствие аллергизирующего, анафилактогенного и местнораздражающего действия).

3. Предложенный консервант на основе Модежеля, обладающего гемо-динамическим, реологическим, буферным и детоксическим действием, открывает перспективу применения взвеси отмытых эритроцитов в течение трех недель при условии ее хранения при 4°С (вместо 24 часов при использовании изотонического раствора натрия хлорида) и расширяет показания к применению этой среды для лечения не только анемий, но и острой кровопотери.

4. Разработана технология получения новой эритроцитпой среды, максимально лишенной примесей не только плазмы и тромбоцитов, но и лейкоцитов путем лейкофильтрации, последующего отмывания и взвешивания красных клеток в предложенном консерванте, позволяющая обеспечить иммунологическую и инфекционную ее безопасность. Обоснована возможность хранения этой среды при 4°С в течение трех недель.

5. Доказано, что удаление лейкоцитов резко замедляет процессы образования микросгустков и накопления продуктов деградации лейкоцитов (в частности миелопероксидазы и лактоферрина) во взвеси профильтрованных и отмытых эритроцитов в Модежель-глюфосфате в процессе хранения.

6. Внедрение в практику нового раствора для отмытых и профильтрованных-отмытых эритроцитов, значительно продлевающего сроки их хранения, позволит удовлетворить клинические потребности в обедненных лейкоцитами и плазмой эритроцигных средах и максимально снизить риск развития посттрансфузионных реакций и осложнений, а также откроет новые перспективы для оптимальной утилизации этих сред и создания их запасов.

Практические рекомендации

1. Внедрение в практику эритроконсерванта Модежель-глюфосфат позволит рекомендовать СПК и ОПК более широкое использование взвесей отмытых красных клеток крови (в течение 3-х недель хранения вместо 1-х суток) и создание запасов отмытых эритроцитов, в первую очередь, группы 0 (I), которые можно использовать не только по предварительным заявкам, но и при оказании экстренной трансфузиологической помощи.

2. Взвесь отмытых эритроцитов в консерванте Модежель-глюфосфат показана анемизированным пациентам, имевшим в анамнезе посттрансфузионные температурные реакции негемолитического типа, аллергические реакции на введение плазменных белков, больным ПНГ, талассемией, аутоиммунными анемиями, при врожденном дефиците ^Аи др., а также, при наличии резерва ЭВ, в экстренных ситуациях широкому контингенту хирургических больных для возмещения острой кровопотери.

3. Взвесь профильтрованных отмытых эритроцитов в предложенном консерванте рекомендуется пациентам, сенсибилизированным не только к белкам плазмы, но и при наличии анти-НЬА, специфичных антигранулоцитарных и анти-тромбоцитарных антител; трансфузионнозависимым больным с целью профилактики аллоиммунизации и острого поражения легких; иммуно-компрометированным лицам для предупреждения переноса ряда вирусных инфекций, а также по дифференцированным показаниям больным с острой кровопотерей.