Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Обоснование организационных принципов и оптимизация технологии производства лейкофильтрованных гемокомпонентов при массовой заготовке донорской крови

•/ г;

У

На правах рукописи

ДАНИЛОВА Анна Витальевна

ОБОСНОВАНИЕ ОРГАНИЗАЦИОННЫХ ПРИНЦИПОВ И ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ЛЕЙКОФИЛЬТРОВАННЫХ ГЕМОКОМПОНЕНТОВ ПРИ МАССОВОЙ ЗАГОТОВКЕ ДОНОРСКОЙ КРОВИ

" 1 ОКТ 2009

14.00.29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2009

003478188

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук профессор Александр Викторович Чечеткин Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Людмила Николаевна Бубнова доктор медицинских наук профессор Наталья Борисовна Серебряная Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Министерства здравоохранения и социального развития РФ»

Защита состоится « Ж^йШЩК2009 г. в ') т часов на заседании специализированного совета (шифр Д.208.074.01) при Федеральном государственном учреждении «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства» (193024, Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеку института

Автореферат разослан « » /а 2009 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

Т.В. Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Иммунологическая и инфекционная безопасность являются основными принципами гемотрансфузионной терапии у больных и пострадавших. Производство безопасных гемотрансфузионных сред составляет неотъемлемую часть профилактических мер по предупреждению постгрансфузионных осложнений (Голубева А.В., 2001; Литманович К.Ю. и соавт., 2004; Masse М., 2001; Seftel M.D. et al., 2004; Krailadsiri P. et al., 2006). Лейкоциты являются важным фактором передачи гемоконтактных инфекций, в частности, вируса Т-клеточного лейкоза человека, Эпштейна-Барр, цитомегаловируса, а также возбудителя болезни Крейцфельдта-Якоба (Минеева Н.В., 2001; Барышев Б.А., 2002; Мельникова В.Н. и соавт., 2003; Bemvil S.S. et al., 1994; Gresens C.J. et al., 1999; Roback J.D., Hillyer C.D., 1999; Schonewille H. et al., 1999; Bux J., 2005; Qu L. et al., 2005).

Доказано, что лейкоциты, лх фрагменты и вырабатываемые ими цитокины, содержащиеся в донорских гемокомпонентах, могут являться источником нежелательных иммунологических эффектов, таких как HLA-аплоиммунизация, фебрильные негемолитические реакции, реакция "трансплантат против хозяина", острое трансфузионное поражение легких и других (Селиванов Е.А, Данилова Т.Н., 2005; Blajchman М.А., Bordin J.O., 1994; Ohto Н. et al., 2000; Machuca A., Hewlett I., 2003; Taylor C. et al., 2008). Традиционные методы производства гемокомпонентов (центрифугирование, криоконсервирование, отмывание) не позволяют получать высокоочищенные от лейкоцитов трансфузионные среды (Сидоркевич С.В., 2002; Chudziak D. et al., 2008; Taylor С. et al., 2008). Для профилактики лейкоцитопосредованных побочных эффектов при гемотрансфузиях используется удаление лейкоцитов из гемокомпонентов с помощью фильтров (MullerN., 2001; Plante J. et al., 2001). Как правило, лейкофильтрованные гемокомпоненты производятся на станциях переливания крови (СПК) по предварительным заявкам лечебных учреждений. Применение универсальной лейкофильтрации трансфузионных сред является одним из перспективных направлений повышения безопасности гемотрансфузионной терапии (Masse М., 2001). Организационные, технологические и медицинские аспекты внедрения такой системы в производственную деятельность службы крови России практически не разработаны, а имеющиеся в литературе сведения не учитывают особенностей массовой заготовки крови в выездных и стационарных условиях. Данные об оптимальных сроках и температурных условиях выполнения лейкофильтрации консервированной крови и ее компонентов являются разноречивыми (Rock G.A. et al., 1988; Williamson L.M. et al., 1999; Chabanel A. et al., 2003). Остаются неясными возможности использования отечественных лейкофильтров для приготовления фильтрованной эритроциткой взвеси, не проводилось сравнительного анализа использования различных фильтров на производственных этапах приготовления лейкофильтрованных гемокомпонентов при массовой заготовке крови.

Цель исследования - изучение организационных, медицинских и технологических особенностей приготовления фильтрованных

гемокомпонентов из консервированной крови при ее массовой заготовке и разработка оптимальных режимов применения лейкофильтров для обеспечения высокого качества обедненных лейкоцитами трансфузионных сред.

Задачи исследования:

1) исследовать организационные особенности внедрения лейкофильтрационных технологий при переработке консервированной крови, заготовленной от доноров резерва;

2) определить пути обеспечения эффективности фильтрации и качества лейкофильтрованных эритроцитосодержащих гемокомпонентов при массовом донорстве;

3) провести сравнительную оценку организационно-технических и медицинских показателей при различных методах получения лейкофильтрованной плазмы из дозы консервированной крови;

4) разработать оптимальные технологические режимы получения лейкофильтрованного тромбоцитного концентрата из дозы консервированной крови;

5) изучить качество лейкофильтрованных гемокомпонентов, полученных с помощью отечественного и зарубежных фильтров, в течение нормированных сроков хранения.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование организационных и технологических особенностей производства лейкофильтрованных гемокомпонентов При массовой заготовке крови от доноров резерва с использованием зарубежных и отечественных лейкофильтров различной конфигурации в зависимости от этапа приготовления трансфузионных сред, сроков хранения, температурных условий, степени оснащения специальным медицинским оборудованием. Впервые научно обоснованы организационные принципы массовой заготовки крови в выездных и стационарных условиях с использованием полимерных контейнеров с встроенными лейкофильтрами и внедрения лейкофильтрационных технологий, в частности, с применением отечественных фильтров при переработке консервированной крови на компоненты. Выявлено, что массовая заготовка консервированной крови в полимерные контейнеры с встроенными лейкофильтрами и выполнение технологий лейкофильтрации сопряжены с увеличением трудозатрат, требующих привлечения дополнительного медицинского персонала и использования специального медицинского оборудования.

Разработана методика фильтрации эритроцитной взвеси после ее приготовления или с предварительной плазмофильтрацией с использованием отечественного комплекта устройств для удаления лейкоцитов и получения безлейкоцитных компонентов консервированной крови «Лейкосеп», позволяющая получать трансфузионную среду, обедненную лейкоцитами ниже 1x106 в дозе, отвечающую требованиям трансфузионной медицины.

Доказана необходимость повторной фильтрации предварительно обедненной лейкоцитами донорской плазмы перед применением системы для вирусинактивации с помощью метиленового синего.

Разработаны новые режимы получения фильтрованного тромбоцитного концентрата из дозы консервированной крови, заготовленной в выездных условиях в счетверенные полимерные контейнеры с встроенными фильтрами, и предложены алгоритмы действий медицинского персонала по выбору оптимальных параметров фракционирования консервированной крови. Выявлены новые закономерности зависимости технологических параметров и качества обедненной лейкоцитами плазмы, полученной из дозы фильтрованной консервированной крови, от температурных условий фильтрации донорской крови.

Практическая значимость. Доказано, что приготовленные лейкофильтрованные компоненты при массовой заготовке крови на СПК с помощью зарубежных и отечественного лейкофильтров соответствуют требованиям стандартов службы крови.

Конкретизирован состав выездной 5ригады СПК для массовой заготовки донорской крови в полимерные контейнеры, содержащие встроенные лейкофильтры, уточнены требования к оснащению рабочих мест для приготовления лейкофильтрованных гемокомпонентов из консервированной крови.

Доказано, что устройство-лейкофильтр отечественного производства «Лейкосеп» может применяться для приготовления фильтрованной эритроцитной взвеси с ресуспендирующим раствором БАвМ и обеспечивать высокое качество трансфузионной среды во время ее хранения до 42 суток.

Установлено, что соблюдение температурного режима фильтрации и максимальное сокращение сроков предфильтрационного хранения консервированной крови и ее компонентов позволяет повысить качество лейкофильтрованных трансфузионных сред.

Показано, что использование в производственной деятельности СПК алгоритмов выбора режимов приготовления тромбоцитного концентрата с последующей лейкофильтрацией позволяет получать из консервированной крови трансфузионную среду, обедненную лейкоцитами ниже 1хЮ5 на дозу, при сохранении ее биологической полноценности в течение 5 суток хранения.

Положения, выносимые на защиту

1. Организационными принципами внедрения метода лейкофильтрации в производственную деятельность СПК при массовой заготовке донорской крови являются:

- привлечение дополнительного медицинского персонала к заготовке крови в полимерные контейнеры с встроенными лейкофильтрами и приготовлению фильтрованных гемокомпонентов;

- оснащение рабочих мест специальным оборудованием для проведения фильтрации консервированной крови и ее компонентов;

- соблюдение температурного режима предфильтрационного хранения и выполнения фильтрации трансфузионных сред в зависимости от типа фильтра и получаемого компонента;

- максимальное сокращение сроков предфильтрационного хранения консервированной крови и ее компонентов.

2. Обеспечение эффективности фильтрации и качества лейкофильтрованных гемокомпонентов, полученных из консервированной крови, основывается на дифференцированном использовании систем полимерных контейнеров различной конфигурации с разными типами фильтров с учетом производственного этапа их применения, сроков и температурных условий хранения, степени внедрения специальных технических средств.

3. Методом выбора приготовления лейкофильтрованных гемокомпонентов при массовой заготовке донорской крови является использование систем полимерных контейнеров с встроенными лейкофильтрами, позволяющими получать из одной дозы консервированной крови обедненные лейкоцитами эритроцитну;о взвесь, плазму и тромбоцитный концентрат, качество которых соответствует требованиям национальных и международных стандартов на всем протяжении регламентированных сроков хранения.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на Втором съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных Сил Российской Федерации (Санкт-Петербург, 2006), на съезде гематологов и трансфузиологов с международным участием «Совершенствование гематологии и трансфузиологии в современных условиях» (Москва, 2006), VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2007), Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2007), заседании подсекции трансфузиологии Ученого Медицинского Совета ГВМУ МО РФ «Состояние и пути повышения качества производства и безопасности применения компонентов и препаратов крови в военно-лечебных учреждениях» (Москва, 2007), III Всероссийской конференции «Организация донорства и эффективное использование крови» (Москва, 2007), на сборе главных трансфузиологов видов Вооруженных Сил, округов и флотов Министерства обороны Российской Федерации ««О состоянии донорства крови и ее компонентов в Вооруженных Силах РФ и основных направлениях по его развитию» (Санкт-Петербург, 2008), IX Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2009), Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2009).

Материалы исследования реализованы при выполнении в рамках Гособоронзаказа научно-исследовательской работы «Исследования по разработке устройства для проведения фильтрации гемотрансфузионных сред в учреждениях службы крови МО РФ», шифр «Фильтрация», для нужд

Минобороны РФ (Постановление Правительства РФ от 30.12.2004 г. № 876-48 «О государственном оборонном заказе на 2005 год».

Результаты исследования использованы в материалах 2 тем НИР, проводимых в соответствии с планом научной работы ГВМУ МО РФ:

«Получение и клиническое применение лейкофильтрованных гемокомпонентов в военно-медицинских учреждениях» № УМА. 02.06.0507/0181;

- «Оптимизация получения и хранения тромбоцитного концентрата в военно-медицинских учреждениях», № УМА. 02.06.08/0170.

Основные материалы исследования опубликованы в 23 научных работах, из них 11 - в журналах, рекомендованных перечнем ВАК.

По материалам диссертации внедрено 32 рационализаторских предложения.

Реализация работы. Результаты работы внедрены в практическую работу СПК ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова».

На основе материалов исследования подготовлены методические рекомендации, утвержденные начальником Главного военно-медицинского управления МО РФ:

1. Организация карантинизации свежезамороженной плазмы в военно-медицинских учреждениях (2007);

2. Организация работы станции переливания крови окружного военного клинического госпиталя (военно-морского клинического госпиталя флота) (2008).

Результаты работы используются в учебном процессе на факультете последипломного и дополнительного профессионального образования ВМедА на циклах усовершенствования «Избранные вопросы трансфузиологии», «Клиническая трансфузиология», профессиональной переподготовки «Трансфузиология».

Личное участие автора в получении результатов. Автор непосредственно выполняла сбор материала, разрабатывала и оценивала эффективность режимов приготовления гемокомпонентов, лично производила лейкофильтрацию трансфузионных сред, отбирала образцы для контроля качества и анализировала результаты лабораторных исследований, проводила статистический анализ полученных результатов и подготовку материалов к публикациям.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 192 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации и список литературы, который включает 64 отечественных и 160 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 43 таблицами и 38 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Были исследованы медико-технические показатели производства и качественный состав 743 доз компонентов крови, полученных от доноров резерва. Отбор и обследование доноров осуществляли в соответствии с требованиями «Порядка медицинского обследования донора крови и ее компонентов», введенного в действие Приказом МЗ РФ от 14 сентября 2001 г. №364. Для разделения консервированной крови на компоненты использовали рефрижераторные центрифуги Sorvall RC - ЗС Plus («Kendro-Sorvall», США) и Jouan KR 4i («Jouan», Франция). Приготовление лейкофильтрованных компонентов осуществляли с использованием фильтров, номенклатура которых указана в таблице 1.

Таблица 1 - Номенклатура фильтров и количество исследованных лейкофильтрованных и нефильтрованных гемокомпонентоз

Технология приготовления Компоненты крови, доз Всего

ЭМ ЭВ плазма 1ОТП ТК

Нефильтрованные компоненты 63 61 82 1 8 138 352

С использованием фильтров:

Leukotrap WB 38 49 87

Leucoflex LST1 36 23 59

Leukotrap RCPL 40 36 10 36 122

Leukotrap RC 9 3 12

Лейкосеп 28 22 12 62

Bio 1 plus BBS 10 10

Plasmaflex PLAS4 30 30

Blueflex 9 9

Всего фильтрованных компонентов, доз 28 155 159 10 36 391

Всего компонентов, доз 91 216 241 18 177 743

Лейкофильтрацию консервированной крови и ее компонентов осуществляли по методике, рекомендованной производителями фильтров. Для приготовления фильтрованной ЭВ с помощью «Комплектов устройств полимерных для удаления лейкоцитов и получения безлейкоцитных компонентов консервированной крови однократного применения «Лейкосеп» (ЗАО «НПП «Интероко», Россия) было произведено поисковое исследование возможности фильтрации ЭВ во взвешивающем растворе $АОМ после фильтрации плазмы, а также фильтрации ЭВ непосредственно через фильтр.

На этапе лейкофильтрации трансфузионных сред изучали медико-технические параметры технологии получения гемокомпонентов, включающие время, скорость фильтрации, объем полученного гемокомпонента, время, затраченное на необходимые сопутствующие операции при фильтрации (подготовка фильтра, перемещение среды из контейнера в контейнер и т.д.), потери трансфузионной среды в фильтре и магистралях.

Для оценки соответствия существующей системы заготовки крови в выездных и стационарных условиях требованиям производства фильтрованных гемокомпонентов использовали метод организационной диагностики.

В гемокомпонентах определяли гематокрит, содержание гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов с помощью унифицированных методов. Некоторые морфологические характеристики были получены с помощью автоматического гематологического анализатора Advia 60 («Bayer HealthCare», Ирландия). Подсчет количества остаточных лейкоцитов в фильтрованных компонентах осуществляли с помощью гемоцитометра Nageotte (Dumont J., Dzik W„ 1996) по модифицированной методике E.A. Перфильевой и соавт. (2003).

Содержание общего белка в плазме оценивали с помощью биохимических анализаторов «Spectrum ТО - 12» («Abbott», США) и «SMА 1260» («Techikon», США). Концентрацию свободного гемоглобина определяли на спектрофотометре по методу Singera (Меньшиков В.В., 1987).

Степень гемолиза в гемокомпоненте оценивали по соотношению свободного гемоглобина к количеству общего гемоглобина, содержащихся в гемокомпоненте (Akerblom О., Högman C.F, 1974; Sowemimo-Cokcr S.O., 2002).

В образцах ТК определяли pH при помощи стеклянного электрода измерительной системы иономера универсального ЭВ-74. Оценку индуцированной агрегации тромбоцитов проводили количественным методом на агрегометре «Chronolog-400» с имидазольным буфером и индуктором -0,02% раствором коллагена (НПО "РЕНАМ").

Активность фактора свертывания VIII в плазме определяли с помощью наборов НПО «РЕНАМ» в соответствии с инструкцией производителя.

Концентрацию ИЛ-lß в супернатанте ТК определяли с помощью наборов реактивов ОАО «Протеиновый контур» (Россия) с использованием иммуноферментного автоматического анализатора Stat Fax 2100 («Awareness Technology», США).

Морфологические особенности клеток оценивали при помощи компьютеризированной электронно-оптической системы на основе инвертированного люминесцентного микроскопа БИОЛАМ - П-1 (Россия) с использованием светового канала видимого диапазона и цифровой видеокамеры для анализа формы и структуры клеток (Кидалов В.Н. и соавт., 2006).

В качестве контрольных групп использовали результаты исследования нефильтрованных гемокомпонентов, полученных при аналогичных режимах центрифугирования и с использованием стандартных полимерных контейнеров, применяемых в службе крови России.

Полученные в процессе исследования медико-биологические данные обрабатывали на персональном компьютере с помощью программ Microsoft Excel и Statistica-б for Windows (Боровиков В.П., 2003).

Результаты собственных исследований

Фильтрованные гемокомпоненты получали из консервированной донорской крови на различных этапах ее переработки. Технологические и организационные вопросы приготовления фильтрованных компонентов решали в зависимости от времени поступления заявок на выдачу этого компонента, регулярности потребления и объема трансфузий, необходимости получения других фильтрованных или нефильтрованных трансфузионных сред (табл. 2).

Таблица 2 - Характеристика технологий приготовления фильтрованных эритроцитных компонентов______

Наименование фильтра Характер заготовки компонента Место фильтрации на этапах производства компонента Фильтруемая среда Возможности получения компонентов

эритро-цитосо-держащие плазма тк

Leukotrap WB Плановый . ____.J До приготовления компонента Консервированная кровь ЭВф СЗПф -

Leucoflex LST1

Leukotrap RC В процессе приготовления компонента ЭВ ЭВф СЗП тк

Leukotrap RCPL ЭВ, ОТП СЗПф ТКф

Лейкосеп По заявкам После приготовления компонента ЭМ, ЭВ, плазма ЭМф ЭВф СЗПф -

BioR 01 plus BBS ЭВ ЭВф -

На начальном этапе работы были исследованы организационные особенности внедрения технологий лейкофильтрации гемокомпонентов при массовой заготовке донорской крови. Установлено, что заготовка консервированной крови в полимерные контейнеры с встроенными фильтрами сопровождается увеличением времени работы выездной бригады (табл. 3). Общее время, необходимое для заготовки одной дозы консервированной крови увеличивалось на 35-48% за счет удлинения всех этапов заготовки (подготовки контейнера к работе, времени эксфузии, укладки для транспортировки и т.д.). Время, необходимое для приготовления одной дозы эритроцитной взвеси из фильтрованной консервированной крови, увеличивалось в 2-2,3 раза преимущественно за счет длительности процесса фильтрации. При транспортировке полимерные счетверенные контейнеры с фильтром занимали больше места в 1,5-2 раза, что надо учитывать при оснащении бригады термоконтейнерами для перевозки крови.

Исходя из анализа результатов медико-технических параметров заготовки крови в полимерные контейнеры с встроенными фильтрами, обоснован оптимальный состав выездной бригады для эффективной работы с 100 донорами: руководитель выездной бригады -1, врач-трансфузиолог - 1,

медицинский регистратор - 1, лаборант - I, медицинская сестра - 3, санитар -2, водитель выездной бригады - 1.

Таблица 3 - Медико-технические характеристики процесса заготовки и фильтрации консервированной крови с помощью встроенных в системы полимерных контейнеров лейкофильтров_________

Этапы работы Контрольная группа Ьеико1гар \УВ ЬеисоАех

Общее время заготовки одной дозы консервированной крови, с 517,6±43,4 699,2±56,4* 767,4±66,4*

Потери среды при фильтрации, мл 0 42,0+1,0 48,2±1,5**

Общее время на приготовление дозы эритроцитной взвеси, мин 26,7±2,7 53,2±4,7* 61,9±5,7*

Длительность фильтрации, мин 0 27,2±1,7 34,97±2,23**

Примечание: * - различия достоверны по отношению к контрольной группе, ** - различия достоверны между типами фильтров (р<0,05).

Установлено, что использование современных технических средств (стойки для лейкофильтрации) сопровождалось уменьшением потерь среды на 30% и длительности фильтрации в 1,5 раза (рис. ]).

СМИ Потери среды в фильтре, мл

Время фильтрации, мин

Рисунок 1 - Зависимость времени фильтрации и потерь среды от технических условий фильтрации

Установлено, что фильтрация консервированной крови с использованием встроенных фильтров, проводимая в сроки от 4 до 18 ч после охлаждения до +4 °С, характеризуется более низкой скоростью по сравнению с проводимой в первые 2-3 часа после заготовки донорской крови (табл. 4). Предложенный способ подготовки контейнеров к фильтрации (хранение не более 1 часа после заготовки при +4°С) позволял оптимизировать скорость и длительность

фильтрации. Фильтрация, проводимая в стационарных условиях СПК по мере окончания заготовки, сокращала затраты времени на ее проведение на 30% по сравнению с проводимой аналогичной процедурой через 4,5 часа.

Таблица 4 - Медико-технические показатели фильтрации донорской крови с использованием встроенных фильтров _

Показатели Заготовка крови в выездных условиях Заготовка крови в стационарных условиях

фильтрация через 2-3 ч фильтрация через 18 ч фильтрация через 1 ч фильтрация через 4,5 ч

Длительность фильтрации, мин 22,0+1,7 47,0±0,4* 20,2±1,9 29,0±0,8*

Скорость фильтрации, мл/мин 22,7+1,8 10,6±0,8* 25,5±1,9 17,2+1,3*

Примечание:'' - различия достоверны между группами (р<0,05)

При фильтрации консервированной крови задерживалось 99,99% лейкоцитов безотносительно к типу фильтра и температурным условиям фильтрации. При этом гематологические показатели ЭВф соответствовали требованиям (стандартам), изложенным в нормативных документах. Существенных различий значений гематологических показателей фильтрованной ЭВ в зависимости от температуры хранения консервированной крови до фильтрации не выявлено.

Морфологические показатели фильтрованной ЭВ существенно не отличались от показателей контрольной ЭВ, необратимо измененные формы эритроцитов составляли 3,2+0,9% и 1,7±0,7% соответственно.

При анализе динамики степени гемолиза и уровня свободного гемоглобина установлено, что к 21 суткам хранения в фильтрованных дозах они оставались ниже показателя нефильтрованной ЭВ на 42% и 39% соответственно, а к концу срока хранения в фильтрованных дозах - в 2 раза ниже, чем в контрольных образцах вне зависимости от типа фильтра (рис. 2).

сутки 21 сутки 42 сутки

□ ЭВ с удаленным ЛТС

Ш ЭВ, фильтрованная с помощью ЬеикоКар ^/В

В ЭВ, фильтрованная с помощью ЬеисоЛех ЬБТ1

Рисунок 2 - Степень гемолиза (%) эритроцитов в процессе хранения фильтрованной и нефильтрованной эритроцитной взвеси

Для фильтрации готовой для переливания эритроцитной взвеси использовали фильтры BioR 01 plus BBS и «Лейкосеп». Была исследована возможность получения фильтрованной эритроцитной взвеси с помощью отечественного устройства «Лейкосеп» по усовершенствованной методике, отличительной особенностью которой являлось использование эритроцитной взвеси вместо эритроцитной массы, в предложенных нами двух модификациях:

1 - по методике с предварительно разделенными плазмой и ЭВ; в части исследований из предварительно разделенной ЭВ удаляли ЛТС;

2 - по модифицированной методике фильтрации готовой ЭВ.

При исследовании возможности фильтрации ЭВ устройством «Лейкосеп» по усовершенствованной методике установлено, что удаление ЛТС не влияло на длительность фильтрации и потери среды в фильтре. Последовательная фильтрация компонентов с помощью устройства «Лейкосеп» приводила к увеличению времени получения фильтрованной ЭВ в 2,7 раза по сравнению с фильтром BioR, а потери в фильтре были такими же и составляли 11% от исходного объема. Время фильтрации эритроцитной взвеси по модифицированной методике достоверно не отличалось от длительности фильтрации фильтром BioR. После фильтрации в дозе ЭВф содержание лейкоцитов уменьшалось более чем в 5000 раз (BioR 01 plus BBS и «Лейкосеп») и составляло 0,432±0,027х106 и 0,383+0,036 х106 клеток соответственно. Удаление ЛТС не влияло на содержание свободного гемоглобина и степень гемолиза в ЭВф при последовательной фильтрации компонентов, содержание лейкоцитов в дозе оставалось выше при неудаленном ЛТС в 1,6 раз (0,565±0,064 х106 клеток, последовательная фильтрация компонентов) и в 1,4 раза (0,551±0,14б хЮ6 клеток, модифицированная методика) но сравнению с ЭВф с предварительно удаленным ЛТС (0,383+0,036 хЮ6 клеток). Установлено, что содержание свободного гемоглобина и степень гемолиза к концу срока хранения ЭВф оставались в пределах допустимых величин при всех методиках фильтрации с помощью «Лейкосеп». При модифицированной методике содержание свободного гемоглобина к 42 суткам возрастало на 12% и составляло 0,37+0,01 г/л. За период хранения содержание свободного гемоглобина в ЭВ с предварительно удаленным ЛТС увеличилось на 84% (0,46±0,02 г/л). Сохраненный ЛТС в фильтруемой последовательно после плазмы ЭВ способствовал значительному повышению (в 1,7 раза) содержания свободного гемоглобина, который к концу срока хранения составил 0,60±0,01 г/л. Степень гемолиза имела аналогичную динамику. К концу срока хранения содержание свободного гемоглобина в ЭВ, фильтрованной по методике с предварительно удаленным ЛТС, было ниже, чем в ЭВ, на 36%, а в эритроцитной взвеси, фильтрованной по модифицированной методике - на 49%.

Следовательно, с помощью устройства «Лейкосеп» возможна фильтрация ЭВ с получением фильтрованного компонента, отвечающего стандартам качества и сроком хранения 42_сут. Предпочтительной является методика

последовательной фильтрации компонентов с предварительным удалением ЛТС.

Приготовление фильтрованной плазмы осуществляли с помощью фракционирования фильтрованной консервированной крови, центрифугирования ОТП и использования присоединенных внешних фильтров. Выявлено, что после фракционирования фильтрованной консервированной крови показатели объема, процента выхода плазмы, содержания белка и активности фактора свертывания VIII в фильтрованной плазме не имели статистически значимых различий по сравнению с нефильтрованной плазмой (табл. 5). Доза плазмы содержала лейкоциты ниже 1х106, однако при получении плазмы из фильтрованной консервированной крови содержание свободного гемоглобина было в 1,5 раза выше, чем в контрольной группе образцов.

Установлено, что в плазме, полученной из консервированной крови, фильтрованной при температуре +4°С, содержание свободного гемоглобина было меньше в 1,4 раза, балластных эритроцитов - в 3,4 раза по сравнению с компонентами, приготовленными из фильтрованной при +22°С крови (табл. 6).

Таблица 5 - Показатели плазмы, полученной фракционированием фильтрованной консервированной крови____

Показатели Плазма Фильтрованная плазма

Leukotrap WB Leucoflex LST1

Объем, мл 247,517,2 266,3±3,6 267,9+6,2

Выход плазмы, % 48,3+1,4 51,9±0,7 51,7+1,1

Содержание общего белка, г/л 57,6+1,0 56,09±1,408 55,5+1,5

Содержание свободного гемоглобина, г/л 0,080±0,008 0,12510,018* 0,13710,013*

Содержание лейкоцитов, х105/доза 41,60+6,09 1,0210,23* 1,2810,19*

Содержание тромбоцитов, х109/доза 8,915+0,842 0,166+0,028* 0,784+0,230**

Активность фактора VIII, МЕ/мл 0,82±0,09 0,8410,07 0,86+0,08

Таблица 6 - Показатели плазмы, полученной фракционированием

консервированной крови, фильтрованной при различной температуре

Показатели Результаты фильтрации

при +22и при +4и

Выход плазмы, % 51,9±0,7 48,4± 2,4

Содержание общего белка, г/л 56,111,4 56,0±0,7

Содержание свободного гемоглобина, г/л 0,125+0,018 0,092+0,009*

Содержание лейкоцитов, х105/доза 1,02+0,23 0,73+0,12

Содержание эритроцитов, х109/доза 0,55+0,09 0,16+0,02*

Содержание тромбоцитов, х 109/доза 0,166+0,028 0,133+0,034

Активность фактора VIII, МЕ/мл 0,84+0,07 0,89+0,06

Примечание: * - достоверность различий между группами (р<0,05).

Приготовление плазмы из фильтрованной ОТП характеризовалось увеличением потерь среды в среднем на 11 мл. Общая продолжительность работ по приготовлению плазмы из фильтрованной ОТП была на 4% больше по сравнению со стандартной процедурой получения плазмы из ОТП (табл. 7).

Анализ гематологических показателей плазмы, полученной из ОТПф при производстве ТК с помощью встроенного фильтра Ьеико1гар ЯСРЦ не выявил различий между фильтрованной и нефильтрованной плазмой по содержанию свободного гемоглобина и балластных эритроцитов (табл. 8). Количество лейкоцитов в фильтрованной плазме снижалось в 34,3 раза.

Анализ медико-технических показателей фильтрации плазмы из дозы крови с помощью устройства «Лейкосеп» установил, что в структуре затрат времени на получение плазмы до замораживания основную часть (87% времени) занимают манипуляции, связанные с перемещением и фильтрацией ЭМ, так как технологически плазму нельзя отделить до момента окончания фильтрации двух компонентов.

Таблица 7 - Медико-технические показатели получения плазмы из лейкофильтрованной ОТП__________

Показатели и этапы работы Стандартные контейнеры Ьеико№ар ИСРЬ

Потери ОТП, мл 0,94±0,05 12,2±0,4*

Вес плазмы, мл 154,78±4,63 159,9±5,6

Выход плазмы, % 31,19± 1,14 30,48±1,38*

Общее время приготовления, мин 102,64±0,63 106,74+0,62*

в том числе: подготовка контейнера, мин 0,95±0,03 1,585+0,133*

время укладки в центрифугу, мин 1,58±0,54 2,55±0,19*

подготовка к выделению ОТП, мин 0,71±0,11 1,09±0,14

выделение (фильтрация) ОТП, мин 1,91±0,17 3,05±0,3*

укладка ОТП в центрифугу, мин 1,68±0,18 2,98±0,19*

Примечание: * - достоверность различий между группами компонентов (р<0,05)

Таблица 8 - Гематологические показатели фильтрованной плазмы при получении ее из ОТПф при производстве тромбоцитного концентрата____

Показатели Плазма нефильтрованная из ОТП Плазма фильтрованная из ОТПф

Содержание свободного гемоглобина, г/л 0,102±0,008 0,108±0,008

Содержание эритроцитов, х 10У/доза 0,151+0,050 0,092±0,029

Содержание лейкоцитов, х105/доза 2б,4±10,7 0,77±0,11*

Содержание тромбоцитов, х 10'7доза 5,90+1,13 2,11+0,62*

Примечание: * - достоверность различий между группами фильтрованных и нефильтрованных компонентов (р<0,05).

Фильтрация плазмы с помощью устройства «Лейкосеп» увеличивала затраты времени на приготовление дозы плазмы в 1,6 раз по сравнению с длительностью приготовления нефильтрованных доз плазмы.

Анализ гематологических показателей фильтрованной плазмы с помощью устройства «Лейкосеп» не выявил изменений уровня свободного гемоглобина в плазме после фильтрации (табл. 9), при этом содержание балластных клеток значительно уменьшилось: эритроцитов - в 2,9 раза, тромбоцитов - в 1,6 раза, лейкоцитов - в 30 раз.

Фильтрация плазмы как часть технологического процесса использовалась при инактивации в ней патогенов, в частности при использовании аппарата «Масо^ошс V4» («МасорЬагша», Франция). При подготовке к инактивации плазмы с помощью фильтрации через Р1азтаПсх РЬАБ4 выявлено снижение уровня свободного гемоглобина в 2,3 раза и содержания тромбоцитов в 2,2 раза, содержание лейкоцитов в плазме уменьшилось в 1000 раз (табл. 10).

Таблица 9 - Гематологические показатели фильтрованной плазмы с помощью устройства «Лейкосеп»________

Показатели Плазма исходная Плазма фильтрованная (Лейкосеп)

Объем, мл 251,9±7,2 213,816,7*

Содержание общего белка, г/л 57,6±1,0 56,810,8

Содержание свободного г емоглобина, г/л 0,082±0,004 0,081 ±0,005

Содержание лейкоцитов, х!05/доза 41,60±6,09 1,3810,45*

Концентрация эритроцитов, х109/л 0,2610,05 0,0910,01*

Концентрация тромбоцитов, х109/л 36,7513,73 23,312,5*

Примечание: * - достоверность различий между группами фильтрованных и нефильтрованных компонентов (р<0,05).

Таблица 10 - Гематологические показатели фильтрованной плазмы с помощью лейкофильтра РкятаПех РЬА84

Показатели Плазма до фильтрации Плазма после однократной фильтрации

Объем, мл 276,0±6,7 228,8±4,8*

Содержание общего белка, г/л 58,3±1,7 56,6 ±0,5

Содержание свободного гемоглобина, г/л 0,07±0,01 0,03±0,01*

Содержание лейкоцитов, х105/доза 622,3± 140,3 0,580±0,168*

Содержание эритроцитов, х10ч/доза 0,643±0,188 0,018±0,003*

Содержание тромбоцитов, х109/доза 5,54±1,00 2,47±0,34*

Примечание: * - достоверность различий между группами фильтрованных и нефильтрованных компонентов (р<0,05).

Лейкофильтр РЫтаАех РЬАБ4 эффективно задерживал эритроциты, количество примесных эритроцитов в фильтрованной плазме уменьшалось в

35,7 раза по сравнению с исходными значениями. Потери плазмы составляли 17% от ее объема.

Были изучены результаты повторной фильтрации перед инактивацией предварительно фильтрованной лейкоцитарным фильтром для консервированной крови ЬеисоПех ЬБТ1 плазмы (табл. 11).

Установлено, что повторная фильтрация плазмы не влияла на содержание общего белка. В процессе повторной фильтрации уменьшалось в 2 раза содержание свободного гемоглобина, в 1,4 раза снижалось содержание лейкоцитов в дозе плазмы, в 1,3 раза - содержание тромбоцитов, в 8 раз -содержание эритроцитов.

Таблица 11 - Показатели плазмы в процессе последовательной фильтрации двумя фильтрами перед инактивацией патогенов___

Показатели Фильтрованная плазма Повторно фильтрованная плазма

Объем, мл 242,9±4,7 220,0±12,1*

Содержание общего белка, г/л 60,7± 1,4 59,7±1,4

Содержание свободного гемоглобина, г/л 0,13±0,01 0,06±0,01*

Содержание лейкоцитов, х105/ доза 0,562±0,062 0,396±0,061*

Содержание эритроцитов, х109/доза 0,167±0,030 0,022±0,003*

Содержание тромбоцитов, х109/доза 4,51±0,25 3,57±0,19*

Примечание: * - достоверность различий между группами (р<0,05).

После фильтрации с помощью устройства В1иеЯех для удаления метиленового синего исследуемые гематологические показатели не изменялись, а потери плазмы составляли 25% от общих потерь среды при сопутствующих инактивации манипуляциях.

Для получения фильтрованного ТК из дозы крови были проведены исследования по выбору оптимальных режимов его получения с использованием рефрижераторных центрифуг. Проводили сравнительное изучение показателей ТК, выделенного из ЛТС и ОТП дозы консервированной крови, а также получаемых при этом ЭВ и плазмы. В ходе исследования разработаны алгоритмы выбора режима получения тромбоцитного концентрата, позволяющие медицинскому персоналу определить локализацию потерь тромбоцитов при производстве и направленность изменения режимов центрифугирования на каждом из этапов, для оптимизации получения фильтрованного компонента.

Установлено, что получение ТК из фильтрованной ОТП с помощью систем полимерных контейнеров с встроенными фильтрами (типа Ьеико1гар КСРЬ) требовало значительно больше времени (118,1±3,4 мин) по сравнению с приготовлением ТК из ОТП (81,9±3,4 мин). Это обусловлено удлинением этапов подготовки контейнеров с фильтрами к работе (в 1,7 раза), укладки в стаканы ротора центрифуги (на 60%), выделения/фильтрации ОТП (на 63%), укладки ОТП в центрифугу (в 1,8 раз). При сравнении гематологических показателей фильтрованного и нефильтрованного ТК из ОТП не выявлено

существенных различий между концентрацией свободного гемоглобина, содержанием тромбоцитов и их агрегационной активностью (табл. 12).

Отмечены значительные различия по содержанию балластных лейкоцитов в ТК: после фильтрации их содержалось в 260 раз меньше по сравнению с показателем нефильтрованного ТК. При этом зарегистрированы более высокое содержание эритроцитов (в 2,2 раза) и увепичение показателя кислотности среды в пределах нормированных стандартами качества значений.

Выявлено отсутствие существенных изменений показателя рН в ТКф при хранении в течение 5 суток как по сравнению с исходным значением, так и по отношению к контрольному нефильтрованному компоненту.

Таблица 12 - Показатели фильтрованного тромбоцитного концентрата, выделенного из ОТП дозы крови________

Показатели ТК из ОТП ТКф из ОТПф

Объем, мл 51,3±0,7 54,3±0,6

Концентрация свободного гемоглобина, г/л 0,096±0,005 0,113+0,008

рН, ед. 7,12±0,05 7,30+0,02*

Содержание тромбоцитов, х109/доза 82,1 ±4,7 1 76,7±5,8

Содержание лейкоцитов, х105/доза 207,1 ±24,3 0,82±0,21*

Содержание эритроцитов, х109/доза 0,69±0,17 1,52+0,26*

Агрегация с коллагеном, % 75,32+1,9 77,2±1,8

Примечание: * - достоверность различий между группами (р<0,05).

Бактериологический контроль стерильности в конце срока годности ТКф был отрицательным. Содержание тромбоцитов по мере хранения ТК существенно не изменялось по сравнению с исходными значениями, и к 5 суткам в ТКф составляло 68,4±3,4 х109/доза, а в ТК - 74,3±4,2 х109/доза. Агрегационная активность тромбоцитов в ТКф к 5 суткам по сравнению с исходными значениями и по отношению к нефильтрованному компоненту не снижалась, что свидетельствовало об удовлетворительном функциональном состоянии кровяных пластинок в ТК.

Установлено, что отсроченная, на следующий день после заготовки крови, фильтрация ОТП сопровождалась значительным увеличением стартовых (в первые сутки после выделения) концентраций ИЛ-10 в приготовленном ТК. Содержание ИЛ-1Р возрастало при этом в 3,5 раза по сравнению с дозами, фильтрованными в день заготовки крови. К концу срока хранения (5 сутки) содержание ИЛ-1Р в надосадочной жидкости ТКф было ниже на 14,2% (р<0,05), чем в нефильтрованном ТК из ОТП.

Выводы

1. Использование полимерных контейнеров со встроенными лейкофильтрами при массовой заготовке крови от доноров резерва сопровождается увеличением времени работы выездной бригады на 35-48% и

требует дополнительного привлечения к работе как минимум одной медсестры-эксфузиониста и санитара.

2. Затраты рабочего времени при приготовлении лейкофильтрованной эритроцитной взвеси из консервированной крови увеличиваются в 2,4 раза, плазмы - в 1,6 раз, тромбоцитного концентрата - в 1,4 раза по сравнению с производством аналогичных нефильтрованных трансфузионных сред.

3. Эффективность производства лейкофильтрованных эритроцитосодержащих трансфузионных сред при массовой заготовке крови от доноров резерва определяется конфигурацией фильтрующих устройств (встроенные или присоединенные фильтры), этапом их применения (до или после фракционирования крови на компоненты), сроками проведения и использованием технических средств (специальных стоек, холодильных камер на +4°С), обеспечивающих фильтрацию.

4. Применение в деятельности станции переливания крови в выездных и стационарных условиях встроенных в системы полимерных контейнеров или присоединенных лейкофильтров зарубежного и отечественного производства позволяет получать лейкофильтрованные эритроцитосодержащие гемокомпоненты, обедненные (ниже 1х106 в дозе) лейкоцитами, сохраняющие требуемое нормативными документами качество в течение срока, определяемого видом гемоконсервантом.

5. Производство обедненной лейкоцитами плазмы из лейкофильтрованной консервированной крови (лейкофильтрованной обогащенной тромбоцитами плазмы) с использованием встроенных лейкофильтров сопровождается меньшими затратами времени приготовления и более низкими потерями гемокомпонента по сравнению с использованием присоединенных фильтров при соответствующем требованиям качестве трансфузионной среды.

6. Разработанная методика фильтрации эритроцитной взвеси во взвешивающем растворе типа БАОМ как после ее приготовления, так и с предварительно неразделенной плазмой, с использованием отечественного комплекта устройств для удаления лейкоцитов и получения безлейкоцитных компонентов консервированной крови «Лейкосеп» позволяет получать трансфузионную среду, обедненную лейкоцитами ниже 1х10б в дозе, отвечающую требованиям современной трансфузиологии при сроках хранения до 42 суток.

7. Фильтрация консервированной крови при температуре 4+2°С не оказывает существенного влияния на степень элиминации лейкоцитов, способствует снижению концентрации свободного гемоглобина и содержания балластных эритроцитов в фильтрованной плазме по сравнению с фильтрацией при комнатной температуре (22±2° С).

8. Повторная фильтрация предварительно обедненной лейкоцитами донорской плазмы перед применением системы для вирусинактивации с помощью метиленового синего позволяет достичь уровня лейкоцитов

3,96±0,61х104 в дозе гемокомпонента, уменьшить содержание эритроцитов в 8 раз и свободного гемоглобина в 2 раза.

9. Приготовление обедненного лейкоцитами тромбоцитного концентрата из обогащенной тромбоцитами плазмы, полученной фракционированием дозы консервированной крови, сопровождается увеличением затрат времени на 44% по сравнению со стандартным методом производства нефильтрованного компонента. Использование счетверенных полимерных контейнеров со встроенными лейкофильтрами при массовой заготовке консервированной донорской крови позволяет получать в закрытой системе тромбоцитный концентрат с содержанием 0,82±0,21х105 лейкоцитов в дозе при сохранении его биологической полноценности в течение 5 суток хранения.

Практические рекомендации

1. При организации работы выездной бригады по массовой заготовке крови (до 100 доноров) с использованием контейнеров с встроенными фильтрами в состав выездной бригады следует дополнительно включать одну медицинскую сестру-эксфузиониста и санитара-помощника эксфузиониста.

2. С целью обеспечения оптимальных параметров и сохранения высокого качества фильтрация консервированной крови и ее компонентов с помощью встроенных в полимерные контейнеры лейкофильтров должна осуществляться в возможно ранние сроки после гемоэксфузии. Для предупреждения накопления цитокинов в тромбоцитном концентрате следует проводить фильтрацию обогащенной тромбоцитами плазмы в течение 24 ч с момента заготовки консервированной крови.

3. Условиями формирования оптимальных медико-технических параметров лейкофильтрации консервированной крови и ее компонентов являются использование дозирующих устройств для заготовки крови, лейкофильтрационных стоек, вкладышей центрифужных стаканов, автоматических плазмоэкстракторов и холодильного оборудования для обеспечения температурного режима фильтрации.

4. Для приготовления фильтрованной эршроцитной взвеси в ресуспендирующем растворе со сроками хранения до 42 суток целесообразно использовать отечественный комплект устройств для удаления лейкоцитов и получения безлейкоцитных компонентов консервированной крови «Лейкосеп».

5. Для минимизации содержания балластных клеток (лейкоцитов и эритроцитов) и свободного гемоглобина в вирусинактивированной с помощью метиленового синего плазме необходимо обедненную лейкоцитами плазму подвергать повторной фильтрации перед процедурой вирусинактивации.

6. При необходимости получения лейкофильтрованных эритроцитной взвеси, тромбоцитного концентрата и плазмы из одной дозы консервированной крови с последующим длительным (в зависимости от вида консерванта) хранением целесообразно заготовку крови от доноров резерва осуществлять в счетверенные полимерные контейнеры с двумя встроенными лейкофильтрами.

7. Для приготовления лейкофильтрованного тромбоцитного концентрата из консервированной крови целесообразно использовать

счетверенные полимерные контейнеры с встроенными фильтрами для обогащенной тромбоцитами плазмы с использованием следующего режима фракционирования: для 1-ого центрифугирования - 454 g в течение 15 мин при температуре 22±2° С, для 2-ого центрифугирования - 4490 g в течение 25 мин при температуре 22+2° С.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Пугина Н.В. Получение лейкофильтрованных гемокомпонентов в военно-медицинских учреждениях / Н.В. Пугина, A.B. Чечеткин, С.Н. Кононенко, A.B. Данилова, М.В. Мартынова, В.И. Ващенко // Вестн. Рос. Воен.-мед. академии. - 2006. - Прил. № 1 (15). - С. 229

2. Чечеткин A.B. Влияние лейкофильтрации на качество эритроцитных гемокомпонентов / A.B. Чечеткин, Н.В. Пугина, С.Н. Кононенко, А.Д. Касьянов, В.И. Ващенко, В.В. Лаптев, A.B. Данилова // Вестн. службы крови России. - 2006. - № 3. - С. 45-48

3. Данилова A.B. Влияние лейкофильтрации на иммунологические свойства гемокомпонентов / A.B. Данилова, A.B. Чечеткин, М.И. Лазаренко, С.Н. Кононенко, Н.С. Кузьмин // Мед. иммунология. - 2007. - Т.9, № 2-3. - С. 132

4. Кононенко С.Н. Влияние лейкофильтрации на иммунологические и гемостатические свойства донорской плазмы / С.Н. Кононенко, A.B. Данилова, A.B. Чечеткин, В.А. Кобилянская // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад. - 2007. - Прил. №1 (17), ч. II.-С. 728

5. Данилова A.B. Иммунологические свойства лейкофильтрованных гемокомпонентов / A.B. Данилова, А.Д. Касьянов, Т.В. Рыжкова, A.B. Чечеткин // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад. - 2007. - Прил. № 1 (17), ч. И. - С. 728

6. Чечеткин A.B. Организация карангинизации свежезамороженной плазмы на военной станции переливания крови /A.B. Чечеткин, А.В Копелец, A.B. Данилова, С.Н. Кононенко // Мат. 4-ой Международной науч.-практ. конф. «Международное сотрудничество в области профилактики ВИЧ-инфекции среди военнослужащих: проблемы и перспективы. - М., 2007. - С. 55

7. Данилова A.B. Лабораторные исследования качества лейкофильтрованных эритроцитных гемокомпонентов / A.B. Данилова, A.B. Копелец, A.B. Чечеткин, Т.Б. Титулова, Г.П. Игнатович // Актуальные проблемы лабораторной диагностики. - Мат. Всерос. науч.-практ. конф. - СПб., 2008.-С. 19

8. Кононенко С.Н. Исследование гемостатических свойств лейкофильтрованной донорской плазмы / С.Н. Кононенко, A.B. Данилова, A.B. Чечеткин, В.А. Кобилянская // Актуальные проблемы лабораторной диагностики. - Мат. Всерос. науч.-практ. конф. - СПб., 2008. - С. 32

9. Чечеткин A.B. Организация карантинизации свежезамороженной плазмы в военно-медицинских учреждениях: метод, указания / A.B. Чечеткин, Ш.М. Багаутдинов, С.А. Пелешок, В.И. Ващенко, Н.С. Кузьмин, A.B. Копелец, С.Н. Кононенко, А.В.Данилова. - СПб., 2007. - 39 с.

10. Данильченко B.B. Влияние лейкофильтрации на содержание цитокинов и хемокинов в эритроцитосодержаших гемокомпонентах / В.В. Данильченко, Н.В. Пугина, A.B. Чечеткин, A.B. Данилова, А.Д. Касьянов, Т.В. Рыжкова // Актуальные вопросы профилактической медицины,- Сб. тр. науч.-исслед. центра Воен. - мед. акад. - Вып. 2. - СПб., 2008. - С. 128-133

11. Данилова A.B. Повышение иммунологической безопасности средств грансфузионной терапии / A.B. Данилова, A.B. Чечеткин, Е.Е. Халайчев, A.B. Копелец, А.Д. Касьянов // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад. - 2008. - № 2, прил., ч. II. - С. 642

12. Уваров Д.В. Обеспечение инфекционной безопасности при заготовке тромбоцитов в военно-медицинских учреждениях / Д.В. Уваров, A.B. Чечеткин, A.B. Копелец, A.B. Данилова, Ш.М. Багаутдинов, В.В. Филюшин // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад.- 2008.- № 2, пршт., ч. II. - С. 644

13. Чечеткин A.B. Иммунологические свойства лейкофильтрованных эритроцитных гемокомпонентов / A.B. Чечеткин, Н.В. Пугина, А.Д. Касьянов,

A.B. Данилова, Т.В. Рыжкова // Вестн. гематол,- 2008.- № 2,- С. 36-40

14. Данильченко В.В. Применение лейкофильтрованных эритроцитных гемокомпонентов при хирургическом лечении инфекционного эндокардита /

B.В. Данильченко, Н.Г. Руденко, Г.Г. Хубулава, A.B. Чечеткин, A.B. Данилова // Гематол. и трансфузиол. - 2009. - № 1. - С. 31-32

15. Кононенко С.Н. Влияние лейкофильтрации на качество донорской плазмы / С.Н. Кононенко, A.B. Чечеткин, A.B. Данилова, В.А. Кобилянская // Гематол. и трансфузиол. - 2009. - № 1. - С. 35

16. Копелец A.B. Обеспечение качества тромбоцитного концентрата в военно-медицинских учреждениях / A.B. Копелец, Д.В. Уваров, A.B. Чечеткин, A.B. Данилова, В.И. Ващенко, В.Н. Семелев // Гематол. и трансфузиол. - 2009. -№ 1. - С. 36

17. Данильченко В.В. Применение лейкофильтрованной эритроцитной массы при хирургическом лечении инфекционного эндокардита / В.В. Данильченко, Н.Г. Руденко, Г.Г. Хубулава, A.B. Чечеткин, А.В Данилова // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины. - Мат. науч,-практ. конф. - Киров, 2008. - С. 83

18. Данилова A.B. Влияние лейкофильтрации на морфо-функциональные показатели эритроцитных гемокомпонентов / A.B. Данилова, A.B. Копелец, A.B. Чечеткин, Т.В. Рыжкова // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины. - Мат. науч.-практ. конф. - Киров,

2008.-С. 23-24

19. Кононенко С.Н. Иммунологические и гемостатические свойства лейкофильтрованной донорской плазмы / С.Н. Кононенко, A.B. Данилова, A.B. Чечеткин, В.А. Кобилянская // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины. - Мат. науч.-практ. конф. - Киров, 2008. - С.35-36

20. Уваров Д.В. Совершенствование методов заготовки тромбоцитного концентрата при массовой заготовке крови / Д.В. Уваров, A.B. Чечеткин, A.B. Копелец, A.B. Данилова, Ш.М. Багаутдинов // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад.-

2009.- № 1(25), прьл., ч. I. - С. 209

21. Чечеткин A.B. Организация работы станции переливания крови окружного военного клинического госпиталя (военно-морского клинического госпиталя флота): метод, рекомендации. / A.B. Чечеткин, В.В. Данильченко, В.И. Ващенко, В.Н. Вильянинов, A.B. Копелец, H.H. Попова, A.B. Данилова. -М., 2009. -50 с.

22. Чечеткин A.B. Медицинские, организационные и технические аспекты внедрения универсальной лейкофильтрации гемокомпонентов / A.B. Чечеткин, A.B. Данилова // Трансфузиология. - 2009. - № 1 -2. - С. 69-70

23. Данилова A.B. Совершенствование получения фильтрованного тромбоцитного концентрата из дозы консервированной крови / A.B. Данилова, Г.П. Игнатович, Д.В. Уваров, В.Н. Кидалов // Трансфузиология. - 2009. - № 1-2.

-С. 24

Список сокращений

ИЛ

ЛТС

ОТП

ОТПф

СЗП

СЗПф

СПК

тк

ТКф

ЭВ

ЭВф

эм

ЭМф

SAGM

интерлейкин

лейкотромбоцитарный слой обогащенная тромбоцитами плазма обогащенная тромбоцитами плазма фильтрованная свежезамороженная плазма фильтрованная свежезамороженная плазма станция переливания крови тромбоцитный концентрат фильтрованный тромбоцитный концентоат эритроцитная взвесь фильтрованная эритроцитная взвесь эритроцитная масса фильтрованная эритроцитная масса взвешивающий раствор для приготовления эритроцитной взвеси

Подписано в печать 2 L09.09 Формат 60x84/16

Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 714

Типография BMA им. С.М. Кирова 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6

Актуальность исследования. Иммунологическая и инфекционная безопасность являются основными принципами гемотрансфузионной терапии у раненых и больных. Производство безопасных гемотрансфузионных сред является важной составляющей частью профилактических мер по предупреждению посттранс фу зионных осложнений (Голубева А.В., 2001; Литманович К.Ю. и соавт., 2004; Masse М., 2001; Seftel M.D. et al., 2004; Krailadsiri P. et al., 2006). Лейкоциты являются важным фактором передачи гемоконтактных инфекций, в частности, вируса Т-клеточного лейкоза человека, Эпштейна-Барр, цитомегаловируса, а также возбудителя болезни Крейцфельдта-Якоба (Минеева Н.В., 2001; Барышев Б.А., 2002; Мельникова В.Н. и соавт., 2003; Bernvil S.S. et al., 1994; Gresens C.J. et al., 1999; Roback J.D., Hillyer C.D., 1999; Schonewille H. et al., 1999; Bux J., 2005; Goldman M„ Delage G., 1995; Qu L. et al., 2005).

Доказано, что лейкоциты, их фрагменты и вырабатываемые ими цитокины, содержащиеся в донорских гемокомпонентах, могут являться источником нежелательных иммунологических эффектов, таких как HLA-алло иммунизация, фебрильные негемолитические реакции, реакция "трансплантат против хозяина", острое трансфузионное поражение легких и других (Редчиц Е.Г., Парфенов А.С., 1989; Blajchman М.А., Bordin .Т.О., 1994; Ohto Н. et al., 2000; Machuca A., Hewlett L, 2003; Taylor C. et al., 2008) Традиционные методы производства гемокомпонентов (центрифугирование, криоконсервирование, отмывание) не позволяют получать высокоочищенные от лейкоцитов трансфузионные среды (Сидоркевич С.В., 2002; Taylor С. et al., 2008; Chudziak D. et al., 2008). Для профилактики лейкоцитопосредованных побочных эффектов при гемотрансфузиях используется удаление лейкоцитов из гемокомпонентов с помощью фильтров (Muller N., 2001; Plante J. et al., 2001). Как правило, лейкофильтрованные гемокомпоненты производятся на станциях переливания крови по предварительным заявкам лечебных учреждений. Применение универсальной лейкофильтрации трансфузионных сред является одним из перспективных направлений повышения безопасности гемотрансфузионной терапии (Masse М., 2001). Организационные, технологические и медицинские аспекты внедрения такой системы в производственную работу службы крови России практически не разработаны, а имеющиеся в литературе сведения не учитывают особенности массовой заготовки крови в выездных и стационарных условиях. Данные об оптимальных сроках и температурных условиях выполнения лейкофильтрации консервированной крови и ее компонентов являются разноречивыми (Rock G.A. et al., 1988; Williamson L.M. et al., 1999; A. Chabanel et al. (2003). Остаются неясными возможности использования отечественных лейко фильтров для приготовления фильтрованной эритроцитной взвеси, не проводилось сравнительного анализа использования различных фильтров на производственных этапах приготовления лейкофильтрованных гемокомпонентов при массовой заготовке крови.

Цель исследования: изучение организационных, медицинских и технологических особенностей приготовления фильтрованных гемокомпонентов из консервированной крови при ее массовой заготовке и разработка оптимальных режимов применения лейкофильтров для обеспечения высокого качества обедненных лейкоцитами трансфузионных сред.

Задачи исследования:

1) исследовать организационные особенности внедрения лейкофильтрационных технологий при переработке консервированной крови, заготовленной от доноров резерва;

2) определить пути обеспечения эффективности фильтрации и качества лейкофильтрованных эритроцитосодержащих гемокомпонентов при массовом донорстве;

3) провести сравнительную оценку организационно-технических и медицинских показателей при различных методах получения лейкофильтрованной плазмы из дозы консервированной крови;

4) разработать оптимальные технологические режимы получения лейкофильтрованного тромбоцитного концентрата из дозы консервированной крови;

5) изучить качество лейкофильтрованных гемокомпонентов, полученных с помощью отечественных и зарубежных фильтров, в течение нормированных сроков хранения.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование организационных и технологических особенностей производства лейкофильтрованных гемокомпонентов при массовой заготовке крови от доноров резерва с использованием зарубежных и отечественных лейкофильтров различной конфигурации в зависимости от этапа приготовления трансфузионных сред, сроков хранения и температурных условий, степени оснащения специальным медицинским оборудованием. Впервые научно обоснованы организационные принципы массовой заготовки крови в выездных и стационарных условиях с использованием полимерных контейнеров с встроенными лейкофильтрами и внедрения лейкофильтрационных технологий, в частности, с применением отечественных фильтров при переработке консервированной крови на компоненты. Выявлено, что массовая заготовка консервированной крови в полимерные контейнеры со встроенными лейкофильтрами и выполнение технологий лейкофильтрации сопряжены с увеличением трудозатрат, требующих привлечения дополнительного медицинского персонала и использования специального медицинского оборудования.

Разработана методика фильтрации эритроцитной взвеси после ее приготовления или с предварительной плазмофильтрацией с использованием отечественного комплекта устройств для удаления лейкоцитов и получения безлейкоцитных компонентов консервированной крови «Лейкосеп», позволяющая получать трансфузионную среду, обедненную лейкоцитами ниже 1x106 в дозе, отвечающую требованиям трансфузионной медицины.

Доказана необходимость повторной фильтрации предварительно обедненной лейкоцитами донорской плазмы перед применением системы для вирусинактивации с помощью метиленового синего.

Разработаны новые режимы получения фильтрованного тромбоцитного концентрата из дозы консервированной крови, заготовленной в выездных условиях в счетверенные полимерные контейнеры с встроенными фильтрами, и предложены алгоритмы действий медицинского персонала по выбору оптимальных параметров фракционирования консервированной крови. Выявлены новые закономерности зависимости технологических параметров и качества обедненной лейкоцитами плазмы, полученной из дозы фильтрованной консервированной крови, от температурных условий фильтрации донорской крови.

Практическая значимость. Доказано, что приготовленные лейкофильтрованные компоненты при массовой заготовке крови на СПК с помощью зарубежных и отечественных лейкофильтров соответствуют требованиям стандартов службы крови.

Конкретизирован состав выездной бригады СПК для массовой заготовки донорской крови в полимерные контейнеры, содержащие встроенные лейкофильтры, уточнены требования к оснащению рабочих мест для приготовления лейкофильтрованных гемокомпонентов из консервированной крови.

Доказано, что устройство-лейкофильтр отечественного производства «Лейкосеп» может применяться для приготовления фильтрованной эритроцитной взвеси с ресуспендирующим раствором SAGM и обеспечивать высокое качество трансфузионной среды во время ее хранения до 42 суток.

Установлено, что соблюдение температурного режима фильтрации и максимальное сокращение сроков предфильтрационного хранения консервированной крови и ее компонентов позволяет повысить качество лейкофильтрованных трансфузионных сред.

Показано, что использование в производственной деятельности СПК алгоритмов выбора режимов приготовления тромбоцитного концентрата с последующей лейкофильтрацией позволяет получать из консервированной крови трансфузионную среду, обедненную лейкоцитами ниже 1x103 на дозу, при сохранении ее биологической полноценности в течение 5 суток хранения.

Положения, выносимые на защиту

1. Организационными принципами внедрения метода лейкофильтрации в производственную деятельность станции переливания крови при массовой заготовке донорской крови являются:

- привлечение дополнительного медицинского персонала к заготовке крови в полимерные контейнеры со встроенными лейкофильтрами и приготовлению фильтрованных гемокомпонентов; оснащение рабочих мест специальным оборудованием для проведения фильтрации консервированной крови и ее компонентов;

- соблюдение температурного режима предфильтрационного хранения и выполнения фильтрации трансфузионных сред в зависимости от типа фильтра и получаемого компонента;

- максимальное сокращение сроков предфильтрационного хранения консервированной крови и ее компонентов.

2. Обеспечение эффективности фильтрации и качества лейкофильтрованных гемокомпонентов, полученных из консервированной крови, основывается на дифференцированном использовании систем полимерных контейнеров различной конфигурации с разными типами фильтров с учетом производственного этапа их применения, сроков и температурных условий хранения, степени внедрения специальных технических средств.

3. Методом выбора приготовления лейкофильтрованных гемокомпонентов при массовой заготовке донорской крови является использование систем полимерных контейнеров с встроенными лейкофильтрами, позволяющими получать из одной дозы консервированной крови обедненные лейкоцитами эритроцитную взвесь, плазму и тромбоцитный концентрат, качество которых соответствует требованиям национальных и международных стандартов на всем протяжении регламентированных сроков хранения.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на Втором съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных Сил Российской Федерации (Санкт-Петербург, 2006), на съезде гематологов и трансфузиологов с международным участием «Совершенствование гематологии и трансфузиологии в современных условиях» (Москва, 2006), VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2007), Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2007), заседании подсекции трансфузиологии Ученого Медицинского Совета ГВМУ МО РФ «Состояние и пути повышения качества производства и безопасности применения компонентов и препаратов крови в военно-лечебных учреждениях» (Москва, 2007), III Всероссийской конференции «Организация донорства и эффективное использование крови» (Москва, 2007), на сборе главных трансфузиологов видов Вооруженных Сил, округов и флотов Министерства обороны Российской Федерации ««О состоянии донорства крови и ее компонентов в Вооруженных Силах РФ и основных направлениях по его развитию» (Санкт-Петербург, 2008), IX Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2009), Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2009).

Материалы исследования реализованы при выполнении в рамках Гособоронзаказа научно-исследовательской работы «Исследования по разработке устройства для проведения фильтрации гемотрансфузионных сред в учреждениях службы крови МО РФ», шифр «Фильтрация», для нужд Минобороны РФ (Постановление Правительства РФ от 30.12.2004 г № 876-48 «О государственном оборонном заказе на 2005 год»).

Результаты исследования использованы в материалах 2 тем НИР, проводимых в соответствии с планом научной работы ГВМУ МО РФ:

Получение и клиническое применение лейкофильтрованных гемокомпонентов в военно-медицинских учреждениях» № VMA. 02.06.0507/0181;

- «Оптимизация получения и хранения тромбоцитного концентрата в военно-медицинских учреждениях», № VMA. 02.06.08/0170.

Основные материалы исследования опубликованы в 23 научных работах, из них 11 - опубликованы в журналах, рекомендованных перечнем ВАК.

По материалам диссертации внедрено 32 рационализаторских предложения.

Реализация работы. Результаты работы внедрены в практическую работу СПК ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М.Кирова».

На основе материалов исследования подготовлены методические рекомендации, утвержденные начальником Главного военно-медицинского управления МО РФ:

1. Организация карантинизации свежезамороженной плазмы в военно-медицинских учреждениях (2007);

2. Организация работы станции переливания крови окружного военного клинического госпиталя (военно-морского клинического госпиталя флота) (2008).

Результаты работы используются в учебном процессе на факультете последипломного и дополнительного профессионального образования ВМедА на циклах усовершенствования «Избранные вопросы трансфузиологии», «Клиническая трансфузиология», профессиональной переподготовки «Трансфузиология».

Личное участие автора в получении результатов. Автор непосредственно выполняла сбор материала, разрабатывала и оценивала эффективность режимов приготовления гемокомпонентов, лично производила лейкофильтрацию трансфузионных сред, отбирала образцы для контроля качества и анализировала результаты лабораторных исследований, проводила статистический анализ полученных результатов и подготовку материалов к публикациям.

выводы

1. Использование полимерных контейнеров со встроенными лейкофильтрами при массовой заготовке крови от доноров резерва сопровождается увеличением времени работы выездной бригады на 35-48% и требует дополнительного привлечения к работе как минимум одной медсестры-эксфузиониста и санитара.

2. Затраты рабочего времени при приготовлении лейкофильтрованной эритроцитной взвеси из консервированной крови увеличиваются в 2,4 раза, плазмы — в 1,6 раз, тромбоцитного концентрата — в 1,4 раза по сравнению с производством аналогичных нефильтрованных трансфузионных сред.

3. Эффективность производства лейкофильтрованных эритроцитосодержащих трансфузионных сред при массовой заготовке крови от доноров резерва определяется конфигурацией фильтрующих устройств I встроенные или присоединенные фильтры), этапом их применения (до или после фракционирования крови на компоненты), сроками проведения и использованием технических средств (специальных стоек, холодильных камер на +4°С), обеспечивающих фильтрацию.

4. Применение в выездных и стационарных условиях работы станции переливания крови встроенных в системы полимерных контейнеров или присоединенных лейкофильтров зарубежного и отечественного производства позволяет получать лейкофильтрованные эритроцитосодержащие гемокомпоненты, обедненные (ниже 1x106 в дозе) лейкоцитами, сохраняющие требуемое нормативными документами качество в течение срока, определяемого видом гемоконсерванта.

5. Производство обедненной лейкоцитами плазмы из лейкофильтрованной консервированной крови (лейкофильтрованной обогащенной тромбоцитами плазмы) с использованием встроенных лейкофильтров сопровождается меньшими затратами времени приготовления

164 I и более низкими потерями гемокомпонента по сравнению с использованием присоединенных фильтров при соответствующем требованиям качестве трансфузионной среды.

6. Разработанная методика фильтрации эритроцитной взвеси во взвешивающем растворе типа SAGM как после ее приготовления, так и с предварительно неразделенной плазмой, с использованием отечественного комплекта устройств для удаления лейкоцитов и получения безлейкоцитных компонентов консервированной крови «Лейкосеп» позволяет получать трансфузионную среду, обедненную лейкоцитами ниже 1x106 в дозе, отвечающую требованиям современной трансфузиологии при сроках хранения до 42 суток.

7. Проведение фильтрации консервированной крови при температуре 4±2°С не оказывает существенного влияния на степень элиминации лейкоцитов, но приводит к снижению концентрации свободного гемоглобина и содержания балластных эритроцитов в фильтрованной плазме по сравнению с фильтрацией при комнатной температуре (22+2° С).

8. Повторная фильтрация предварительно обедненной лейкоцитами донорской плазмы перед применением системы для вирусинактивации с помощью метиленового синего позволяет достичь уровня лейкоцитов 3,96±0,61х104 в дозе гемокомпонента, уменьшить содержание эритроцитов в 8 раз и свободного гемоглобина в 2 раза.

9. Приготовление обедненного лейкоцитами тромбоцитного концентрата из обогащенной тромбоцитами плазмы дозы консервированной крови, сопровождается увеличением затрат времени на 44% по сравнению со стандартными методоми производства нефильтрованных компонентов. Использование счетверенных полимерных контейнеров со встроенными лейкофильтрами позволяет получать в закрытой системе тромбоцитный концентрат с содержанием 0,82±0,21х105 лейкоцитов в дозе при сохранении его биологической полноценности в течение 5 суток хранения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При организации работы выездной бригады по массовой заготовке крови (до 100 доноров) с использованием контейнеров с встроенными фильтрами в состав выездной бригады следует дополнительно включать одну медицинскую сестру-эксфузиониста и санитара-помощника эксфузиониста.

2. С целью обеспечения оптимальных параметров и сохранения высокого качества фильтрация консервированной крови и ее компонентов с помощью встроенных в полимерные контейнеры лейкофильтров должна осуществляться в возможно ранние сроки после гемоэксфузии. Для предупреждения накопления цитокинов в тромбоцитном концентрате следует проводить фильтрацию обогащенной тромбоцитами плазмы в течение 24 ч с момента заготовки консервированной крови.

3. Условиями формирования оптимальных медико-технических параметров лейкофильтрации консервированной крови и ее компонентов являются использование дозирующих устройств для заготовки крови, лейкофильтрационных стоек, вкладышей центрифужных стаканов, автоматических плазмоэкстракторов и холодильного оборудования для обеспечения температурного режима фильтрации.

4. Для приготовления фильтрованной эритроцитной взвеси в ресуспендирующем растворе со сроками хранения до 42 суток целесообразно использовать отечественный комплект устройств для удаления лейкоцитов и получения безлейкоцитных компонентов консервированной крови «Лейкосеп».

5. Для минимизации содержания балластных клеток (лейкоцитов и эритроцитов) и свободного гемоглобина в вирусинактивированной с помощью метиленового синего плазме необходимо обедненную лейкоцитами плазму подвергать повторной фильтрации перед процедурой I вирусинактивации.

6. При необходимости получения лейкофильтрованных эритроцитной взвеси, тромбоцитного концентрата и плазмы из одной дозы консервированной крови с последующим длительным (в зависимости от вида консерванта) хранением целесообразно заготовку крови от доноров резерва осуществлять в счетверенные полимерные контейнеры с двумя встроенными лейкофильтрами.

7. Для приготовления лейкофильтрованного тромбоцитного концентрата из консервированной крови целесообразно использовать счетверенные полимерные контейнеры с встроенными фильтрами для обогащенной тромбоцитами плазмы с использованием следующего режима фракционирования: для 1-ого центрифугирования - 454 g в течение 15 мин при температуре 22±2°С, для 2-ого центрифугирования - 4490 g в течение 25 мин при температуре 22±2°С.