Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Разработка и стандартизация многокомпонентного растительного средства, обладающего адаптогенной активностью

На правах рукописи

СИДЕНОВА СОФЬЯ СЕРГЕЕВНА

РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ МНОГОКОМПОНЕНТНОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АДАПТОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

11 АПР 2013

Улан-Удэ - 2013

005051590

005051590

Диссертационная работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Институт общей и экспериментальной биологии» Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель:

Николаева Галина Григорьевна - доктор фармацевтических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Мирович Вера Михайловна — доктор фармацевтических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Иркутский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ / кафедра фармакогнозии и ботаники, старший преподаватель Гармаева Елена Анатольевна — кандидат фармацевтических наук, Государственное предприятие Республики Бурятия «Бурят-Фармация» / информационный отдел, заместитель начальника

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ

Защита состоится «19» апреля 2013 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 003.028.02 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН

Автореферат разослан «16» марта 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

В.Б. Хобракова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Характерной особенностью современной эпохи является многообразие неблагоприятных факторов, воздействующих на организм человека. К таким факторам риска можно отнести: неблагополучие экологии окружающей среды, использование рафинированной и высококалорийной пищи, малоподвижный образ жизни, эмоциональное перенапряжение, приводящие к стрессу, а также использование синтетических лекарственных препаратов, вызывающих множество побочных эффектов. Все это приводит к истощению адаптационных и компенсаторных механизмов, в результате чего повышается риск развития сердечно-сосудистых, эндокринных, онкологических, аллергических и других заболеваний. Для повышения общей резистентности организма как с лечебной, так и с профилактической целью необходимо достаточное поступление жизненно необходимых биологически активных веществ (БАВ). К сожалению, современное питание, особенно, для лиц с ослабленным здоровьем, пожилого возраста, а также в условиях повышенных умственных и физических нагрузок не может обеспечить организм всеми необходимыми веществами. В этой ситуации большое значение приобретают биологически активные добавки (БАД) к пище на основе лекарственных растений, содержащие не только витамины, аминокислоты и минералы, но и вторичные БАВ, такие как: полифенолы, полисахариды, эфирные масла и др., оказывающие регулирующее влияние на организм человека (Биологически активные добавки к пище, полная энциклопедия, 2001; Тутельян В.А. и др., 2004; Шантанова Л.Н. и др., 2010).

В настоящее время в реестре лекарственных препаратов, применяемых в практической медицине, доля средств растительного происхождения составляет около 30%, а в некоторых фармакотерапевтических группах их число достигает почти 70% (Гришина Е.И., Погодин И.С., Лукша Е.А., 2008). Повышенное внимание к средствам на основе лекарственного растительного сырья (ЛРС) связано с их меньшей токсичностью, физиологичностью и широтой терапевтического действия, возможностью более длительного применения, особенно, при лечении хронических заболеваний с минимальным риском проявления побочных эффектов. В этом плане весьма перспективными являются исследования по переводу чаев, сборов и отдельных растений, используемых в виде настоев и отваров, в суммарные препараты — экстракты, которые выгодно отличаются постоянством состава БАВ, рациональностью использования, а также возможностью их стандартизации (Кукес В.Г., Булаев В.М., Колхир В.К. и др., 2000; Николаев С.М., 2011).

Таким образом, разработка и создание многокомпонентных средств на основе лекарственных растений, повышающих адаптивные способности организма, является актуальной.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является разработка и стандартизация биологически активной добавки к пшце в виде чая и экстракта жидкого, обладающих адаптогенной активностью.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

- обосновать состав и соотношения ингредиентов в исходной растительной композиции для получения биологически активной добавки к пшце чая «Арура-Тан №16» и экстракта жидкого, условно названного «Фитотон»;

- провести фармакогностическое исследование чая: определить наличие биологически активных веществ, содержащихся в исходном сырье, в чае, а также установить основные анатомо-диагностические признаки чая и определить критерии подлинности и показатели его качества;

- обосновать оптимальные параметры экстракции, разработать способ получения экстракта жидкого на основе чая и провести его химическое изучение;

- разработать показатели качественной и количественной стандартизации чая «Арура-Тан №16», экстракта жидкого «Фитотон» по доминирующим биологически активным веществам;

- разработать и представить проекты нормативной документации на указанные растительные средства, обладающие адаптогенной активностью: Технические условия (ТУ); Технологическую инструкцию (ТИ); рецептуру на биологически активную добавку к пище чай «Арура-Тан №16», проект Фармакопейной статьи предприятия (ФСП) на экстракт жидкий «Фитотон» для внедрения их в производство.

Научная новизна

Обоснован и разработан оптимальный вариант растительной композиции, включающий девять видов сырья, обладающих широким спектром действия и обеспечивающих суммарную адаптогенную активность.

В чае установлено содержание основных групп биологически активных веществ: флавоноидов, полисахаридов, экдистероидов, аскорбиновой кислоты, дубильных веществ, органических кислот, аминокислот, компонентов эфирного, жирного масел, макро- и микроэлементов; определены основные диагностические признаки чая, заключающиеся в особенностях строения клеток паренхимы, эпидермиса,

их формы, наличие включений инулина, крахмала, кристаллов и друз оксалата кальция, жирного и эфирного масел, волосков различной формы, типа устьичного аппарата. На основании фармакогностического изучения чая «Арура-Тан №16» определены критерии его подлинности, показатели качества, количественные методики определения полисахаридов и флавоноидов, разработаны и предложены показатели качества полученного экстракта жидкого «Фитотон», необходимые для его стандартизации.

Обоснованы оптимальные параметры экстракции биологически активных веществ из растительной композиции, обеспечивающие максимальный выход экстрактивных веществ, флавоноидов, что положено в основу способа получения экстракта жидкого «Фитотон».

Рациональность состава чая «Арура-Тан №16», экстракта жидкого «Фитотон» и их эффективность подтверждены фармакологическими исследованиями.

Практическая значимость работы

По результатам исследований разработаны и внедрены:

- биологически активная добавка к пище чай «Арура-Тан №16» (проекты ТУ 9361-016-03533369-12, ТИ, Рецептура);

- «Лекарственное средство, обладающее адаптогенной активностью», заявка на изобретение № 2012149295/15(079058) (Уведомление о положительном результате формальной экспертизы от 25.12.2012 г. );

- проект Фармакопейной статьи предприятия (ФСП) на экстракт жидкий «Фитотон»;

- методики количественного определения флавоноидов и полисахаридов в БАД к пище чай «Арура-Тан №16» апробированы на ООО «Малое инновационное предприятие «Арура» (Акт о внедрении от 03.12.2012 г.).

- полученные результаты используются в учебном процессе на кафедре фармации Бурятского государственного университета (Акт о внедрении от 15.11.2012 г.).

Работа выполнена в соответствии с программой и планом научно-исследовательских работ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по проекту № 146 «Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы и реализация», утвержденному президиумом СО РАН.

Апробация работы

Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на:

- II международной научной конференции «Разнообразие почв и биоты Северной и Центральной Азии» (Улан-Удэ, 2011);

- II международной научно-практической конференции «Современная медицина и фармацевтика: анализ и перспективы развития» (Москва, 2011);

- Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы экологии, безопасности жизнедеятельности и здоровья человека: теоретические, практические аспекты» (Соликамск, 2011);

- Международной научно-практической конференции «Современная наука: тенденции развития» (Краснодар, 2012);

- XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012).

Публикации

Основное содержание работы отражено в 9 научных работах, из них 3 статьи - в изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 169 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, четырех глав собственных исследований, выводов и списка используемой литературы, включающего 215 источников, из которых 36 - на иностранных языках, и содержит приложения. Работа иллюстрирована 23 рисунками и 59 таблицами.

Во введении обоснована актуальность темы, определены цель и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе изложены краткие сведения о применении адаптогенных средств растительного происхождения, приведены общие сведения о растениях, входящих в состав растительной композиции, дана краткая характеристика применяемых официнальных адаптогенных средств. В материалах и методах исследований приведены сведения об объектах исследований, характеристике используемых приборов и методов.

Во второй главе приводятся данные по экспериментальному обоснованию рационального состава и выбору оптимального соотношения компонентов в исходной растительной композиции. Описана технологическая схема получения чая и приведены товароведческие показатели. Приведены результаты микроскопического анализа растений, входящих в состав чая.

Третья глава посвящена химическому изучению чая «Арура-Тан №16» с использованием качественных реакций и методов БХ, ТСХ, ВЭЖХ, ГХ-МС с идентификацией следующих БАВ: аминокислоты, органические кислоты, витамины, дубильные вещества, макро- и

микроэлементы, полисахариды, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, экдистероиды, жир!гые кислоты, эфирные масла. Отражены исследования по количественному определению БАВ химическими, физико-химическими методами.

Глава четвертая включает исследования по разработке способа получения экстракта жидкого, описанию технологической схемы его получения, приведены числовые характеристики и результаты по химическому изучению экстракта жидкого «Фитотон».

Гпава пятая посвящена разработке показателей качества для БАД к пище «Арура-Тан №16» и экстракта жидкого «Фитотон». Приведены разработанные и валидированные методики количественного определения суммы флавоноидов и полисахаридов, позволяющие проводить сквозную стандартизацию от исходного сырья к экстракту жидкому, методом спектрофотометр ии.

На защиту выносятся:

- обоснование рационального состава биологически активной добавки к пшце чай «Арура-Тан №16»;

- показатели качественной и количественной характеристики биологически активной добавки к пище чай «Арура-Тан №16» и экстракта жидкого «Фитотон», полученного на основе чая;

- разработка способа получения и технологической схемы получения экстракта жидкого «Фитотон».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектом исследования служило растительное сырье, отвечающее требованиям нормативной документации:

- плоды шиповника (Fructus Rozae) - ГФ XI изд., вып. 2, ст. 38;

- плоды боярышника (Fructus Crataegi) - ГФ XI изд., вып. 2, ст.32;

- корневища и корни девясила (Rhizomata et radices Inulaé) - ГФ XI изд., вып. 2, ст. 73;

- корневище с корнями рапонтикума сафлоровидного {Rhizomata cum radicibus Rhapontici carthamoides) - ФС 42-2707-90;

- корневища и корни родиолы розовой (Rhizomata et radices Rhodiolae roseae) - ГФ XI изд., вып. 2, ст. 75;

- листья крапивы двудомной (Folia Urticae dioicae) - ГФ XI изд., вып. 2, ст. 25;

- корни ревеня (Radices Rhei) - ГФ XI изд., вып. 2, ст. 68;

- плоды кардамона настоящего (Fructus Elettariae cardamomi) - ТУ 29052-91 «Пряности. Кардамон»;

- корневища имбиря аптечного (Rhizomata Zingiberis) - ТУ 29046-91 «Пряности. Имбирь».

В исследованиях использовали варианты растительных композиций чая и экстракт жидкий, полученный на основе чая.

Изучение внешних признаков растительной композиции проводили в соответствии с требованиями ГФ XI изд., вып.1, с. 266-267. Изучение анатомических признаков цельного сырья проводили в соответствии с указаниями статьи «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» (ГФ XI изд., вып. 1, с. 277). Для экстракции БАВ и приготовления хроматографических систем использовали растворители марки «ч» и «хч».

Исследование качественного состава изучаемых объектов проводили методами восходящей хроматографии на бумаге марки «Filtrak» FN-12 и FN-16 и тонкослойной хроматографии на пластинах «Sorbfil» (ПТСХ-П-А-УФ-254). Использовали следующие системы.растворителей:

1. н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2);

2. 15 % кислота уксусная;

3. хлороформ-метиловый спирт-вода (26:14:3);

4. этилацетат-уксусная кислота-вода (25:5:5);

5. хлороформ-этанол (4:1);

6. н-бутанол-пиридин-вода (6:4:3);

7. этилацетат - ледяная уксусная кислота (80:20);

8. 90 % спирт этиловый.

Хроматографирование образцов выполняли при температуре (19-23)°С в герметически закрытых вертикальных стеклянных камерах. Обнаружение пятен веществ производили после высушивания хроматограмм в УФ-свете до и после обработки 3 % спиртовым раствором алюминия хлорида, а также 5 % раствором фосфорномолибденовой кислоты в абсолютном спирте. Флавоноиды проявляются в виде желтых пятен, до обработки коричневых; фенолкарбоновые кислоты обнаруживали по их собственной флуоресценции голубого или фиолетового цвета. Для проявления салидрозида использовали 10 % раствор натрия карбоната и диазотированный сульфацил. Розавин проявлялся пятном фиолетового цвета, а салидрозид - пятном красноватого цвета. Для обнаружения экдистероидов использовали 3 % спиртовой раствор ванилина с добавлением концентрированной кислоты серной. Соотношение растворителей учитывали в объемных частях. Все величины Rf обнаруженных соединений являются средними из пяти измерений.

Электронные спектры соединений в УФ- и видимой областях записывали на приборе СФ-2000 (Россия) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см. Для регистрации УФ - спектров исследуемых веществ готовили 0,05-10 % растворы в абсолютном спирте, а также в 70 % спирте. Оптическую плотность

измеряли на спектрофотометре CECIL СЕ 2011 (США) в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.

ВЭЖХ-анализ БАВ проводили на хроматографе «GILSTON» (Франция) с металлической колонкой размером 4,6x250 мм Kromasil С 18, размер частиц 5 микрон, а также с металлической колонкой ALTECH ОА-1000 Organic Acids размером 6.5x300 мм, с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «Мультихром для Windows».

При разработке методик качественного и количественного определения БАВ использованы хроматографически чистые вещества и стандарты: арбутин - Fluka, кат. №10960, СО ВИЛАР (ТУ 9363-133048668-44-01), галловая кислота - Fluka, кат. №48630, кофейная кислота -Sigma, кат. № 0625, хлорогеновая кислота - Sigma, кат. №3378, феруловая кислота СО - ТУ 9369-143-0486244-01, апигенин - Fluka, кат. №10748, гесперидин - Sigma, кат. № 04125, лютеолин ГСО - ФС 42-3130-95, лютеолин-7-гликозид ГСО - ФС 42-3130-95, кемпферол - Fluka, кат. №60010, экдистен (гексагидроксихолестен, экдистерон) СО - ВФС 421713-87, кверцетин ГСО - ФС 42-290-79, ВИЛАР ТУ 9369-128-0486824403, рутин ГСО - ФС 42-2508-87, ВИЛАР ТУ 9369-141-048668244-02, гиперозид ГСО - ФС 42-0106-03. ТУ разработаны ВИЛАРом.

Разработка БАД к пище чай «Арура-Тан №16», его фармакогностическая характеристика и стандартизация

Растительная композиция разработана с учётом опыта применения комплексных средств в традиционной медицине для повышения резистентности организма. Составление многокомпонентной растительной композиции проводили с учётом фармакологических свойств, химического состава, официналыюсти каждого вида сырья и состояния их сырьевой базы. Исходными компонентами являются девять видов лекарственного и пищевого сырья. С целью выбора оптимального соотношения входящих ингредиентов были составлены несколько вариантов растительной композиции, которые оценивались по количественному содержанию БАВ (таблица 1).

Таблица 1

Варианты многокомпонентной растительной композиции_

№ п/п Наименование ингредиентов растительной композиции Варианты композицир количеству входящего сы по рья, в г

1 2 3 4

1 Корневища и корни родиолы 150 100 150 150

2 Корневище с корнями рапонтикума 150 100 150 100

3 Плоды шиповника 200 200 120 180

4 Плоды боярышника 100 200 100 150

5 Корневища и корни девясила 100 150 150 100

6 Листья крапивы 150 100 150 150

7 Корни ревеня 50 50 100 50

8 Плоды кардамона 40 50 40 60

9 Корневища имбиря 60 50 40 60

На основании предварительного фармакологического и фотохимического скрининга выбрана композиция № 2 следующего состава (из расчета на 1,0 кг): родиолы розовой корневища и корни - 100,0 г; рапонтикума сафлоровидного корневище с корнями - 100,0 г; шиповника плоды - 200,0 г; боярышника плоды - 200,0 г; девясила корневища и корни - 150,0 г; крапивы двудомной листья - 100,0 г; ревеня корни - 50,0 г; кардамона настоящего плоды - 50,0 г; имбиря лекарственного корневища -50,0 г.

Разработана технологическая схема получения БАД к пище, включающая основные стадии:

ТП 1. Измельчение и просеивание растительного сырья;

ТП.2. Получение готового продукта;

УМО.1. Фасовка и упаковка.

Проведен товароведческий анализ чая, установлены следующие нормы: содержание общей золы - не более 14 %; золы нерастворимой в 10% кислоте хлористоводородной - не более 5 %; массовая доля влаги — не более 11 %; степень измельчения: частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм — не более 3 %; частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,25 мм - не более 13 %; органической примеси — не более 2 %, минеральной примеси - не более 1 %. Зараженность амбарными вредителями, плесень, затхлость, посторонние запахи и привкусы не допускаются.

Определены показатели подлинности; органолептические показатели: смесь неоднородных частиц измельченного растительного сырья, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Цвет буро-красный с зелеными, коричневато-красными и желтовато-белыми включениями. Запах ароматный, вкус водного извлечения пряно-горький.

Микроскопическое исследование чая выявило ряд признаков, которые определяют присутствие каждого из его компонентов (диагностически

Рис. 1. Микроскопическое строение порошка чая «Арура-Тан №16» (Увел. х40): секреторные клетки с эфирным маслом корневищ имбиря (1); друзы кальция оксалата (2), сосуды ксилемы (3) корней ревеня; фрагмент ариллуса плодов кардамона (4); простой ретортовидный волосок (5), устьица аномоцитного типа (6), головчатый волосок (7) листьев крапивы; каменистые клетки (8), простые одноклеточные волоски (9) плодов боярышника; эпидерма корня (10), кристаллы кальция оксалата (11) корневищ с корнями ралонтикума; обрывки многорядной пробки корневищ и корней девясила (12); одноклеточный волосок (13), спиральные сосуды (14), друзы и кристаллы кальция оксалата (15) плодов шиповника; крахмальные зерна (16), спиральные, кольчатые сосуды (17) корневищ и корней родиолы.

- фрагменты клеток с небольшими межклетниками, заполненные округлыми крахмальными зернами; обрывки спиральных и лестничных сосудов (корневища и корни родиолы)',

- фрагменты многоугольных тонкостенных клеток, содержащих инулин в виде бесформенных, блестящих, преломляющих свет «глыбок»; обрывки паренхимы коры с округло-угловатыми клетками, содержащими красно-бурое содержимое (корневище с корнями рапонтикума);

- обрывки паренхимы, состоящие из рыхлых клеток, содержащих включения оранжево-красного цвета, друзы и кристаллы; крупные одноклеточные волоски и их обломки (плоды шиповника);

- простые одноклеточные слегка извилистые толстостенные волоски и их обрывки; фрагменты клеток округлой и овальной формы, содержащие включения бурого цвета, мелкие друзы и призматические кристаллы оксалата кальция; обрывки эпидермиса окончатой структуры с 4-6-угольными клетками, с равномерно утолщенными стенками и желто-бурым содержимым, иногда с устьицами (плоды боярышника);

- фрагменты крупных клеток, содержащих инулин в виде бесцветных, бесформенных, сильно преломляющих свет «глыбок»; обрывки многорядной пробки коричневого цвета; обрывки сосудов по одному и группами (точечные и лестничные); разорванные вместилища со смолой и эфирным маслом (корневища и корни девясила);

- клетки с сильно извилистыми стенками, многоугольные клетки с прямыми стенками; устьица, окруженные 3-5 клетками эпидермиса (аномоцитный тип); волоски трех типов: одноклеточные ретортовидные, головчатые, жгучие волоски; жилки, вдоль которых расположены клетки с мелкими друзами кальция оксалата, образующие характерные цепочки (листья крапивы);

- пористые и лестничные сосуды ксилемы; крупные друзы кальция оксалата; простые и 2-3-сложные крахмальные зерна; фрагменты феллодермы, состоящей из крупных тангентально вытянутых с утолщенными стенками клеток красно-коричневого цвета (корниревеня);

- фрагменты ариллуса, состоящие из вытянутых, нерегулярно веретеновидных клеток с прямыми тонкими стенками; группы спиральных сосудов, связанные с паренхимой; склеренхимный слой семенной кожуры, состоящий из толстостенных клеток красно-коричневого цвета; паренхимные клетки с призматическими кристаллами оксалата кальция и каплями эфирного масла; большие маслянистые клетки семенной кожуры со слегка утолщенными стенками, содержащие глобулы эфирного масла (плоды кардамона);

- обрывки паренхимы со спиральными и лестничными сосудами; фрагменты, состоящие из крупных паренхимных клеток с желтыми

каплями эфирного масла; паренхимные клетки с морщинистой стенкой (корневища имбиря).

Проведенные исследования подтвердили подлинность исходных ингредиентов чая по входящим в его состав компонентам, результаты исследований включены в соответствующие разделы нормативных документов.

Установлено наличие основных групп биологически активных веществ (БАВ) с использованием общих химических реакций, бумажной, тонкослойной хроматографии: аминокислоты, дубильные вещества, эфирные масла, кумарины, сапонины, полисахариды, флавоноиды и фенолкарбоновые кислоты. Фенольные соединения обнаружены методами бумажной хроматографии (БХ) в системах растворителей (системы 1 и 2) и тонкослойной хроматографии (ТСХ) в смеси растворителей (система 4). Методом БХ на хроматограмме из спиртового извлечения идентифицированы пятнадцать зон, из них: рутин (желтовато-зеленая с 11п=0,54,11а=0,63); лютеолин (желтая с 11п=0,79 ^=0,06), гиперозид (ярко-желтая с 11п=0,61, Г1п=0,29); галловая кислота (фиолетовая с 11п=0,75 Кгс=0,43). Методом ТСХ обнаружено три зоны адсорбции: рутин (!?«= 0,64), гиперозид (1^4=0,53), галловая кислота (ЯГ4= 0,67).

Для подтверждения полученных результатов дальнейшее изучение состава фенольных соединений проведено методом ВЭЖХ (рис. 2, табл. 2).

Идентифицированы галловая кислота, рутин, хлорогеновая, изоферуловая, цикориевая и дигидрокумарин. Суммарное содержание фенолкарбоновых кислот, определенное методом нормализации площадей пиков, составляет более 13 %, в количественном отношении преобладает галловая кислота — 64,8 %, рутина — 1,7 %, дигидрокумарина - 4,6 %.

1! ОС

ЯБ

1ДП

2 - галловая кислота

3 - л'У/ ор о sc.fi он а я кислота 4■ - изоферуловая кислота 3 - ц икор иевая кислота

7 - д игидроку-мар и м

8 - рут ин

5 в

7

Н

Ч i i < ^ I * * Д 11 а 11 II 1» 1Ь гЬ аД 31 А ' ¡кии'

Рис. 2. ВЭЖХ 70% спиртового извлечения из чая, при 360 нм

Таблица 2

Вещества фенольной природы, идентифицированные в чае методом

№ Компонент Время Площадь пика, Содержание,

удерживания, тУ-сек %

мин

2 Галловая кислота 3,605 18062,09 64,77

3 Хлорогеновая кислота 4,126 1711,71 6,14

4 Изоферуловая кислота 5,617 649,61 2,33

5 Цикориевая кислота 6,448 1355,76 4,86

7 Дигидрокумарин 9,473 1283,50 4,60

8 Рутин 14,05 483,27 1,73

Для идентификации Сахаров в чае также использован метод ВЭЖХ (рис. 3, табл. 3). Из свободных Сахаров идентифицированы: мальтоза,

галактоза, рамноза и ксилоза.

Таблица 3

№ Компонент Время удерживания, мин Высота, тУ Содержание, %

2 Мальтоза 6,999 580,28 45,13

3 Галактоза 9,273 63,95 3,91

4 Рамноза 10,1 59,49 5,48

5 Ксилоза 11,22 64,76 11,91

Терпеновые соединения, содержащиеся в чае, анализировали методом хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) в образце эфирного масла, полученного путем перегонки с водяным паром. Результаты проведенных исследований представлены на рисунке 4.

Abundance

Рис. 4. Хроматограмма эфирного масла чая 20.58 - а-зингиберен, 31.51 - алантолактон, 32.52 - изоалантолактон, 21.41-Р-сесквифелландрен, 20.19 - аг-куркумен, 20.96- а-фарнезен, 16.07- (+)4- карен,

22.56— неролидол.

Эфирное масло, полученное путем перегонки с водяным паром, представляет собой жидкость желтого цвета. Методом ГХ-МС было идентифицировано 21 вещество, из которых основными компонентами масла являются: а-зингиберен - 22,67 %, алантолактон - 17,47 %, изоалантолактон - 11,87 %, [3-сесквифелландрен - 10,51 %, аг-куркумен -9,52 %, а-фарнезен - 8,14 %, (+)4-карен - 3,93 %, неролидол - 1,99 %,

эпизонарен - 1,86 %, патчулен - 1,34 %, гераниол - 1,01 %, а-эвдесмол -0,82 %, р-эвдесмол - 0,77 %; у-куркумен - 0,76 %, и-мент-1-ен-8-ол - 0,58 %, 2,6-октадиен 1-ол,3,7-диметшицетат (Е) - 0,57 %, борнеол - 0,446 %, 2,6-октадиеналь,3,7- диметил - 0,43 %, муурола 4,11-диен - 0,44 %, элемол

- 0,309 %, транс-кадина-1,4-диен - 0,285 %.

Определение состава жирных кислот также проведено методом ГХ-МС. Результаты изучения компонентного состава липофильного комплекса, выделенного из чая, и процентное содержание жирных кислот представлены на рисунке 5. В результате исследования было обнаружено 19 соединений. Отмечается наибольшее содержание а-линоленовой - 30,00 %, вакценовой- 19,63 %, дигомо-у-линоленовой - 16,88 %, пальмитиновой

- 10,69 % и линолевой кислот - 11,50 %.

3

4 5 б

i

.......и! .t . 1 ...... Л \ L^-Ü J Л_гОи1^Лл_А--------

Рис. 5. Хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот извлечений чая 1 - пальмитиновая к-та (10,63%), 2 - стеариновая к-та (2,84%), 3 -

вакценовая к-та (19,63%), 4 - линолевая к-та (11,50%), 5 - а-линоленовая к-та (30,0%), дигомо-у-линоленовая к-та (16,68%).

Высокое содержание моно- и полиненасыщенных жирных кислот подтверждает фармакологическую ценность данного продукта. Обнаружены незаменимые жирные кислоты, такие как: а-линоленовая, арахидоновая и линолевая кислоты.

Определение аминокислот проводили на аминокислотном анализаторе марки ААА-339 (Чехия). Результаты исследований представлены на рисунке 6.

Обнаружены 21 свободная и 19 связанных аминокислот, из них - 7 незаменимых: валин, изолейцин, метионин, лизин, лейцин, треонин, фенилаланин. Суммарное содержание свободных аминокислот в чае составляет 1,05 %. В наибольшем количестве присутствуют аргинин - 30,78 % от общего количества аминокислот, пролин - 20,44 %, глутаминовая кислота - 17,85 %, глутамин - 4,18 % и аланин - 3,25 %.

Рис. 6. Содержание свободных и связанных аминокислот в чае

I

В связи с тем, что в чае присутствуют корни рапонтикума, проведено определение экдистерона. Методом ВЭЖХ путем сравнения с раствором

Количественное определение БАВ проводили с использованием химических и физико-химических методов: для суммы органических кислот и дубильных веществ - титритометрия; для аскорбиновой кислоты, каротиноидов, экдистероидов и аминокислот - спектрофотометрия. Результаты исследований и данные статистической обработки приведены в таблице 4.

Таблица 4

Результаты количественного определения БАВ в чае «Арура-Тан №16»

БАВ f а. X S2 S Р,% t(P,f> ДХ Е,%

Органические кислоты 4 6,01 0,00368 0,06066 95 2,78 0,16863 ±2,80

Дубильные вещества 4 3,20 0,00165 0,04620 95 2,78 0,12843 ±4,01

Аскорбиновая кислота 4 1,32 0,00055 0,02345 95 2,78 0,06519 ±4,94

Аминокислоты 4 1,05 0,00009 0,00966 95 2,78 0,02685 ±2,56

Каротиноиды 4 0,08 0,307х106 0,00055 95 2,78 0,00153 ±1,89

Экдистероиды 4 0,07 0,135х105 0,00116 95 2,78 0,00323 ±4,75

Определение содержания макро- и микроэлементов представляет интерес в связи с высокой биологической ролью отдельных химических элементов. В результате исследования установлено содержание макро- (Са 10,00 %, 1,5 %) и микроэлементов (Тп 0,06 %, Ре 0,30 %, Мп 0,10 %, Ва 0,06 %, РЬ 0,002 %, Си 0,01 %, 10,00 %, № 0,003 %, Со <0,001 %, Сг 0,004 %, V 0,005 %, и <0,003 %, Мо 0,0002 %).

Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в чае «Арура -Тан №16»

Для оценки количества действующих веществ в растительной композиции разработана методика определения суммы флавоноидов, основанная на их способности образовывать окрашенный комплекс с раствором алюминия хлорида, который вызывает батохромный сдвиг УФ-спектра в сторону больших длин волн. В качестве стандартного вещества выбран рутин, поскольку максимум его дифференциального спектра (410

Рис.9. УФ-пектры поглощения флавоноидов с алюминия хлоридом: 1 - PCO рутина; 2 - комплекс флавоноидов извлечения из чая.

Для количественного определения флавоноидов в чае были подобраны оптимальные условия экстракции: экстрагент - 60 % спирт этиловый, измельченность сырья - 1-2 мм, соотношение сырье-экстрагент - 1:50, время экстракции - 60 мин., комплексообразователь — 5 % спиртовой раствор А1С13 в количестве 5 мл; реакция комплексообразования развивается в течение 40 мин и комплексы остаются стабильными в течение 1 часа. Для определения воспроизводимости методики проводили исследования в 5 повторностях.

Таблица 5

Метрологические характеристики результатов спектрофотометрического количественного определения суммы

флавоноидов в пересчете на рутин в чае

f Хср,% S2 S Р,% t(P,f) ЛХ Е,%

4 1 0,41 0,00005 0,00707 95 2,78 0,01965 ±4,79

Относительная ошибка методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин с 95 % вероятностью составляет ±4,79 %. Результаты опытов с добавками свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки в разработанной методике.

Разработка методики количественного определения суммы полисахаридов в чае

С целью количественной оценки содержания полисахаридов использована методика их спектрофотометрического определения, основанная на реакции продуктов кислотного гидролиза чая с пикриновой кислотой в щелочной среде и использования в качестве стандартного образца PCO глюкозы. Полученный окрашенный комплекс имеет максимум поглощения при длине волны 466±4 нм как и комплекс глюкозы с пикриновой кислотой (рис. 10).

А

Рис. 10. Спектры поглощения комплекса продуктов гидролиза полисахаридов (1) и комплекса глюкозы (2) с пикриновой кислотой

Содержание полисахаридов в чае должно составлять не менее 14,0 %.

Таблица 6

Метрологические характеристики результатов спектрофотометрического количественного определения полисахаридов в ___ пересчете на глюкозу в чае __

Г Хср.% Б Р,% ДХ Е,%

4 14,68 0,04775 0,21852 95 2,78 0,60748 ±4,14

Относительная ошибка методики количественного определения суммы полисахаридов в пересчете на глюкозу с 95 % вероятностью составляет ±4,14 %. Опытами с добавками доказано отсутствие систематической ошибки в предложенной методике.

Методики валидированы, подтверждена их специфичность, прецизионность и правильность.

Установленные нормы числовых показателей включены в НД на чай. Проведено исследование по определению сроков годности чая. Установлен срок годности - 2 года.

Разработка способа получения и стандартизация экстракта жидкого «Фитотон»

Экстракты жидкие обладают рядом преимуществ перед другими лекарственными формами. Простота и удобство применения, особенно, в гериатрической практике; при приеме внутрь они всасываются быстро и действуют активнее, чем твердые лекарственные формы (порошки, таблетки и др.); производство экстрактов жидких предоставляет возможность получения их без выпаривания с содержанием летучих веществ (эфирные масла), поэтому данная лекарственная форма была выбрана для получения указанного фитосредства.

Установлены технологические характеристики сырья, необходимые для выполнения теоретических расчетов по эффективности экстрагирования и выбора оптимальных условий экстракции: коэффициент поглощения экстрагента растительным материалом (2,58 ± 0,03), содержание экстрактивных веществ (29,9 ± 1,48 %), насыпная масса (0,512 ± 0,007 г/см3). Для определения оптимальных условий экстракции нами изучена зависимость выхода БАВ от экстрагента, степени измельчения сырья, продолжительности и кратности экстракций, которые проводились по экстрактивным веществам, а также по разработанной ранее методике количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин. Результаты полученных исследований показали, что наиболее рациональным экстрагентом является 40 % спирт этиловый, наиболее оптимальная степень измельчения сырья - 2 мм. Кроме того, изучали

возможность получения жидкого экстракта методами перколяции, реперколяции и мацерации. Установлено, что оптимальным способом получения экстракта жидкого является метод реперколяции. Нами была разработана и предложена технология получения экстракта жидкого методом реперколяции в батарее из пяти диффузоров.

Стандартизацию экстракта проводили по показателям: описание, качественные химические реакции (на полисахариды, флавоноиды, аминокислоты, эфирное масло, дубильные вещества), содержание этанола, сухой остаток и количественное содержание флавоноидов и полисахаридов. Экстракт жидкий представляет собой жидкость темно-коричневого цвета, со специфичным приятным запахом и жгучим вкусом, концентрация этанола составила 33,41±1,37 %, плотность 1,014±0,02 г/см3, сухой остаток 14,8+0,65 %, содержание суммы флавоноидов 0,31±0,01 %, полисахаридов 4,28±0,13 %.

Химическими исследованиями установлено наличие в экстракте основных групп БАВ, относящихся к следующим классам соединений: флавоноиды, дубильные вещества, органические кислоты, полисахариды, аминокислоты, аскорбиновая кислота и микроэлементы.

Таким образом, состав экстракта жидкого соответствует качественному составу чая «Арура-Тан №16», что подтверждает рациональность разработанной технологии его получения.

Результаты количественного содержания основных БАВ в экстракте жидком «Фитотон» представлены в таблице 7.

Таблица 7

Содержание БАВ в экстракте жидком «Фитотон»_

БАВ f хср,% S2 S Р,% t(P,f) ДХ Е,%

Флавоноиды 4 0,314 0,00001 0,00370 95 2,78 0,01029 ±3,28

Полисахариды 4 4,28 0,00223 0,04722 95 2,78 0,13128 ±3,06

Дубильные вещества 4 0,88 0,00023 0,01528 95 2,78 0,04248 ±4,81

Аминокислоты 4 2,49 0,00122 0,03493 95 2,78 0,09710 ±3,90

Органические кислоты 4 7,87 0,01463 0,12095 95 2,78 0,33624 ±4,27

Для количественной стандартизации экстракта жидкого «Фитотон» предлагается использовать разработанные методики количественного определения суммы флавоноидов и полисахаридов в чае. Относительная ошибка единичного определения суммы флавоноидов в экстракте жидком не превышает 3,28 %, для суммы полисахаридов - 3,06 %. Для проверки отсутствия систематической ошибки проведены эксперименты с добавками PCO рутина и PCO глюкозы. Методики валидированы, подтверждена их

специфичность, прецизионность и правильность. Установлены сроки годности экстракта жидкого; предварительный срок годности - 2 года.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Экспериментально обоснован и предложен рациональный состав биологически активной добавки к пище чай «Арура-Тан №16».

2. Установлены диагностически значимые признаки, необходимые для подтверждения подлинности, нормированы товароведческие показатели чая «Арура-Тан №16».

3. Определены качественный и количественный состав БАВ чая «Арура-Тан №16», установлен компонентный состав эфирных масел, идентифицированы флавоноиды (гиперозид, лютеолин, рутин), фенолкарбоновые кислоты (галловая, изоферуловая, хлорогеновая, цикориевая кислоты), дигидрокумарин, сахара, свободные и связанные аминокислоты, экдистерон, жирные кислоты.

4. Разработан способ получения экстракта жидкого на основе чая с использованием метода реперколяции в батарее из пяти диффузоров; установлено влияние основных факторов экстракции на выход БАВ: экстрагент - 40 % спирт этиловый, степень измельчения сырья - 2 мм, соотношение сырья и экстрагента 1:1.

5. Разработаны по доминирующим биологически активным веществам показатели качественной и количественной стандартизации чая, экстракта жидкого; разработаны и предложены методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин, суммы полисахаридов в пересчете на глюкозу в чае «Арура-Тан №16», экстракте жидком «Фитотон».

6. Разработана и представлена нормативная документация на биологически активные добавки к пище, обладающие адаптогенной активностью - «Арура-Тан №16», экстракт жидкий «Фитотон».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сиденова С.С. Исследование эфирного масла растительного сбора / С.С. Сиденова, Г.Г. Николаева, И.Г. Николаева // «Разнообразие почв и биоты северной и центральной Азии»: Материалы II международной научной конференции. - Улан-Удэ, 2011. - С. 86.

2. Gatypova D.B Influence of adaptogenic plants remedy on the course of acute toxic liver injury / D.B. Gatypova, A.S. Tulesonova, L.N. Shantanova, S.S. Sidenova // Мэс засал. - 2011. - № 13. - С. 147.

3. Сиденова С.С. Химический состав эфирного масла Elettaria cardamomum (L.) Maton / С.С. Сиденова, Г.Г. Николаева, Л.Д. Раднаева, И.Г. Николаева, В.В. Тараскин, Т.Э. Соктоева // «Современная наука: тенденции развития»: Материалы международной научно-практической конференции. - Краснодар, 2012. - С. 191-192.

4. Цыбиктарова Л.П. Количественное определение полисахаридов в растительном сборе адаптогенного действия / Л.П. Цыбиктарова, Л.Д. Раднаева, С.С. Сиденова, Г.Г. Николаева, И.Г. Николаева // «Современная медицина и фармацевтика: анализ и перспективы развития»: Материалы II Международной научно-практической конференции. - М., 2012. - С 168170.

5. Сиденова С.С. Изучение аминокислотного состава многокомпонентного растительного сбора / С.С. Сиденова, Г.Г. Николаева, И.Г. Николаева // XIX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: Сборник материалов конгресса. - М., 2012. - С. 422.

6. Сиденова С.С. Обоснование состава растительной композиции, обладающей адаптогенным действием / С.С. Сиденова, Г.Г. Николаева, И.Г. Николаева, Л.П. Цыбиктарова // «Современные проблемы экологии, безопасности жизнедеятельности и здоровья человека: теоретические, практические аспекты»: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Соликамск, 2012. - С. 98-104.

7. Сиденова С.С. Изучение химического состава нового адаптогенного растительного сбора / С.С. Сиденова, Г.Г. Николаева, И.Г. Николаева, Б-Ц.Б. Намзалов // Вестник Бурятского государственного университета. - Спецвыпуск С. - 2012. - С. 148-150.

8. Сиденова С.С. Анализ липофильной фракции, полученной на основе растительного сбора / С.С. Сиденова, Г.Г. Николаева, И.Г. Николаева, Л.Д. Раднаева, Г.М. Федосеева // Вестник Бурятского государственного университета. - Спецвыпуск С. - 2012. - С. 150-153.

9. Сиденова С.С. Элементный состав адаптогенного средства / С.С. Сиденова, Г.Г. Николаева, И.Г. Николаева, Г.М. Федосеева // Вестник Бурятского государственного университета. - Спецвыпуск С. - 2012. - С. 153-155.

Подписано в печать 15.03.2013 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Объем 1,4 печ. л. Тираж 100. Заказ №11.

Отпечатано в типографии Изд-ва Федерального государственного бюджетного учреждения науки БНЦ СО РАН 670047 г. Улан-Удэ ул. Сахьяновой, 6.