Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка профилактических средств растительного происхождения, обладающих адаптогенной активностью, и их стандартизация

На правах рукописи

и03а5е701

МАРКАРЯН НАТАЛЬЯ СЕРГЕЕВНА

РАЗРАБОТКА ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, ОБЛАДАЮЩИХ АДАПТО-ГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ И ИХ СТАНДАРТИЗАЦИЯ

15 00 02 -фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Улан-Удэ 2007

003058701

Диссертационная работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН

Научный руководитель доктор фармацевтических наук

Николаева Галина Григорьевна

Официальные оппоненты доктор биологических наук

Кашин Владимир Капсимович кандидат фармацевтических наук Шелухеева Марина Геннадьевна

Ведущая организация Иркутский государственный медицинский

университет Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию РФ

Защита состоится " (К " мая 2007 года в Ю00 часов на заседании Диссертационного Совета К 003 028 01 при Институте обшей и экспериментальной биологии СО РАН

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН Автореферат разослан " ¡Ю " апреля 2007 г

Ученый секретарь Л

Диссертационного Совета К 003 028 01 у&^д

кандидат биологических наук В Б Хобракова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Результаты эпидемиологических наблюдений и статистических исследований последних двух-трех десятилетий свидетельствуют о резком замедлении прогресса в увеличении жизни населения индустриально развитых стран и значительном увеличении сердечно- сосудистых, желудочно-кишечных, эндокринных, онкологических заболеваний, обусловленных снижением адаптационных возможностей организма

Решение указанных проблем возможно путем развития профилактической медицины, направленной на повышение адаптации организма, сохранение и укрепление здоровья населения

Многокомпонентные лекарственные средства на основе растений и биологически активные добавки (БАД) к пище из растительного сырья влияют на организм человека как корригирующая система, благодаря наличию комплекса природных веществ Однако, несмотря на высокую эффективность, их широкое применение ограничивается несовершенством лекарственной формы, ограниченным сроком хранения и большой потерей ценных биологически активных веществ при приготовлении (настои и отвары)

В связи с этим, одной из главных задач является создание растительных лекарственных препаратов и БАД к пище в виде сухих экстрактов, представляющих собой сумму биологически активных веществ в концентрированной виде и сохраняющие весь спектр фармакологических свойств В связи с этим целесообразным представляется разработка БАД на основе растительной композиции, улучшающих функции обмена веществ и адаптивные возможности организма

Целью настоящих исследований является экспериментальное обоснование разработки сбора и сухого экстракта из лекарственных растений в виде БАД к пище, технологии получения и их стандартизация

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

- обосновать и экспериментально подтвердить рациональность многокомпонентного состава и их соотношения в исходной композиции,

- провести фармакогностическое изучение растительной композиции для идентификации компонентов и оценить содержание доминирующих веществ с использованием комплекса физико-химических методов анализа,

- исследовать влияние основных факторов, влияющих на процессы экстракции БАВ из растительной композиции,

разработать методики анализа для оценки критериев подлинности и количественного содержания действующих веществ в сухом экстракте,

- разработать и оформить нормативные документы Технические условия (ТУ), Технологическую инструкцию (ТИ), Рецептуру на биологически активную добавку к пище «Байкальский № 9»

3

Научная новизна. Обоснован и экспериментально аргументирован состав и соотношение компонентов исходной растительной композиции С учетом вклада каждого компонента в растительной композиции разработаны методы качественного и количественного анализа, подтверждающие наличие групп веществ и соединений, характерных для данного вида сырья,

Установлены закономерности выхода биологически активных веществ (БАВ) и! растительной композиции в ходе экстракции от типа экстрагента, от температурного режима, соотношения сырья и экстраген-та, степени измельчения, гидродинамических условий Рациональная технология получения сухого экстракта подтверждена количественной оценкой БАВ в растительной композиции и сухом экстракте

С применением фармакологических, фармакогностических, фитохи-мических и физико-химического анализов установлены критерии подлинности, разработаны методики количественного определения основных БАВ в растительной композиции и сухом экстракте

Идентификация отдельных флавоноидов, сирингина, тимола, розавина, глицкрризиновой кислоты и арбутина осуществлены методами хроматографии в тонком слое сорбента и ВЭЖХ Методом ВЭЖХ определено содержание суммы элеутерозидов в пересчете на сирингин, роза-вин, глицирризиновой кислоты в растительной композиции

Практическая значимость. По результатам исследования разработаны и внедрены

1 Нормативные документы на чай «Байкальский №9» (ТУ, ТИ, Рецептура),

2 Биологически активная добавка к пище чай «Бакальский№9» Р77 99 02 937 Б 000125 08 03)

3 Справка об апробации и внедрении Б АД к пище в Центре Восточной медицины, г Улан-Удэ,

4 Методика количественного определения в исходном сборе по сумме флавоноидов в пересчете на рутин-стандарт методомВЭЖХ (апробирована на каоедре фармакогнозии ГОУ ВПО КГМУ Росздрава),

5 Методича качественного определения сирингина в сухом экстракте

методом ВЭЖ> (апробирована в ОАО «Красногорсклексредства»)

Связь задач исследования с проблемным планом научного совета по фармакологии и фармации. Работа выполнена в соответствии планом научно- исследовательских работ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по программе «Лекарственные растения Сибири и Дальнего Востока», являющейся разделом (6 3) Государственной программы «Сибирь» и в соответствии с проектом №146 «Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины Фундаментальные основы и реализация»,утвержденным президиумом СО РАН

4

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены

на

- Всероссийском конгрессе «Человек и лекарство» (М -2007),

- XIII международной специализированной выставке «Аптека 2006»

- Ежегодных научных сессиях Бурятского научного центра СО РАН (2004-2006)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты по разработке, обоснованию рационального состава и соотношения входящих компонентов растительной смеси,

- результаты фармакогностических исследований по установлению критериев подлинности и содержания биологически активных веществ в растительной композиции,

- результаты по разработке и обоснованию технологии получения сухого экстракта,

- результаты исследований по стандартизации чая и сухого экстракта по основным группам действующих веществ

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 145 стр страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (1 глава), собственных исследований (5 глав), заключения, выводов, списка литературы, который включает 203 источника, из них 66 на иностранных языках Работа иллюстрирована 62 таблицами, 34 рисунками и схемами В приложении представлены материалы по внедрению регистрационное удостоверение нормативные документы на «Байкальский № 9», акты внедрения

Во введении раскрыта актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы

В первой главе на основании данных литературы обсуждаются вопросы актуальности применения адаптогенов растительного происхождении, природных БАД на формирование адаптивного процесса, охарактеризованы биологически активные вещества (БАВ) исследуемой растительной композиции, их вклад в адаптогенный эффект, проанализированы препараты адаптогены Государственного реестра Российской Федерации и их официнальное применение, описаны современные подходы к стандартизации лекарственного растительного сырья, сборов, лекарственных форм на их основе и БАДов, а также обсуждена важность и актуальность составления и разработки многокомпонентных композиций

Во второй главе приведены сведения об объектах исследований, аргументация об используемых методах и приборах, а также другие данные методического характера

Третья глава посвящена разработке и стандартизации растительного средства адагшм енного действия На основании данных литературы, с учетом опыта народной и традиционной медицины, а также фитохимиче-ских и фармакологических исследований подобран и обоснован состав и соотношение ингредиентов чая «Байкальский № 9» Микро- и макроскопическими методами исследования, идентифицированы основные составные растите тьные компоненты Качественными реакциями, а также методом ТСХ подтверждено наличие флавоноидов, сапонинов, Сахаров, эфирного масла, дубильных веществ, фенолкарбоновых кислот, глицир-ризиновой кислоты, сирингина и розавина Методом ВЭЖХ идентифицированы такие БАВ как флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, сирин-гин, органические кислоты, сахара, розавин Методом ГЖХ идентифицированы основные компоненты эфирного масла Разработаны и предложены для количественной оценки БАВ методики определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин-стандарт, суммы полисахаридов в пересчете на глюкозу суммы эритрозидов в пересчете на сирингин-стандарт глицирризиновон кислоты, розавина, суммы органических кислот, дубильных веществ эфирного масла

В четвертой главе представлены данные по разработке технологии получения сухою экстракта Изучено влияние различных факторов на процессы одновременного экстрагирования биологически активных соединений из 5 еидов лекарственного растительного сырья (из чая Байкальский № 9) Подобраны оптимальные условия и разработаны способ получения сухого экстракта, представлена технологическая схема его производства

Пятая глава посвящена вопросам стандартизации сухого экстракта Разработаны и предложены для количественной оценки БАВ методики определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин-стандарт, суммы полисахаридов-с пектрофотометрическим методом, глицирризиновой кислоты, суммы эритрозидов, в пересчете на сирингин- стандарт, розавина-методом ВЭЖХ, суммы органических кислот, дубильных веществ - методом титрометрии

Шестая глава содержит данные по разработке показателей качества для нормативных документов на БАД «Чай Байкальский № 9» и сухого экстракта

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Объекты и методы исследования Объектом исследования являлось лекарственное растительное сырье, отвечающее требованиям нормативной документации

-корневища и корни элеутерококка колючего - (ФС 42-2725-90) Eleutherococcus senticosus (Rupr Et Maxim ) Maxim , сем Аралиевых Aral rnceae,

-корневища и корни родиолы розовой (ГФ XI изд , вып 2, ст 7 Rhodiola rosea L , сем Толстянковые - Crassulaceae,

-побеги черники обыкновенной (ФС 42-2948-93) - Vaccinium myrtillus L сем Вересковые - Ericaceae,

-корни солодки голой и уральской (ГФ X, ст 573, ГОСТ 22839-88 Gly-cyrrhiza glabra L и Glycyrrhiza uralensis Fisch , сем Бобовые - Fabaceae

-трава чабреца (ГФ XI, вып 2,ст 60) - Thymus serpyllum L , Яснотковые -Lamiaceae

На основе вышеперечисленного сырья созданы смеси, используемые для получения экстрактов, обладающих адаптогенной активностью

Измельчение воздушно-сухого сырья с содержанием влаги от 9,06 до 12,00 % проводили согласно ГФ XI изд , вып 1 Отбор средней и аналитических проб проводили согласно - ГФ XI изд , вып 1, с 267 и ОФС 42-001303 Пробы для определения подлинности, измельченности и содержание примесей —100 г, влажности — 10 г, действующих веществ и золы - 40г Проба для определения микробиологической чистоты-50г Проба для определения радионуклидов- 50г Изучение внешних признаков растительных смесей проводили в соответствии с требованиями ГФ XI изд, вып 1, с 266 - 267 Микроскопические исследование сборов проводили по методике ГФ XI изд , вып 1 , с 277

Сгущение полученных извлечений на стадии экспериментальных исследований проводили на вакуум - выпарном ротационном испарителе марки ИРМ-1

Исследование качественного состава изучаемых объектов проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) Испопьзовали пластинки «Сорбфип» или <<Кизельгель УФ-254» и следующие системы растворителей

1 хлороформ-метанол-вода 26 14 3,

2 гексан - этилацетат 85 15,

3 этилацетат-уксусная кислота-вода 25 5 5,

4 этилацетат - метилэтилкетон муравьиная кислота - 50 30 10 10,

Хроматографирование выполняли в соответствующей системах растворителей при температуре 19-23°С в герметически закрытых стеклянных камерах Нанесение исследуемых растворов на хроматографические пластинки осуществляли при помощи микрошприцов Обнаружение пятен у-пироновых веществ производили после высушивания хроматограмм и просмотром в УФ-свете (фильтр 254 нм) до и после обработки 2% этанольным раствором алюминия хлорида, а также 5% раствором фосфорномолибдено-вой кислоты в абсолютном спирте Флавоноиды дают желтое окрашивание соответственно (до обработки коричневое) Фенолкарбоновые кислоты обнаруживаются по их собственной флуоресценции голубого или фиолетового цвета Соотношение растворителей учитывали объемных частях Все величины Rf обнаруженных соединений являются средними из пяти изме-

7

рений Растворители для хроматографии и реактивы для получения производных использовали марки ХЧ или ЧДА Электронные спектры соединений в УФ - и видимой областях записывали на приборе Gelios (США) в кювета* с толщиной поглощающего слоя 1 см Для регистрации УФ - спектров и:следуемых веществ готовили 0,05 - 10% растворы в абсолютном метаноле и абсолютном этиловом спиртах, а также в 70% этиловом спирте

При разработке методик качественного и количественного определения биологически активных веществ были использованы хроматографи-чески чистые вещества и стандарты арбутин -Fluka, кат №10960,СО ВИЛАР (ТУ 9363-133-048668-44-01), галловая кислота - Fluka, кат №48630, кофейная кислота - Sigma, кат № 0625, хлорогеновая кислота -Sigma,кат №3378, феруловая кислота СО ТУ 9369-143-0486244-01, апигенин-Р1ика,№ 10748, гесперидин- - Sigma, кат № 04125, глицирризи-новая кислота Fluka, кат № 50531, СО ВИЛАР (ТУ 9369-148-0486824402), лютеолин ГСО ФС 42-3130-95, лютеолин-7-гликозид ГСО - ФС42-3130-95, кверцетин ГСО ФС 42-290-79, СО ВИЛАР (ТУ 9369-12804868244-03), рутин ГСО-ФС42-2508-87, СО ВИЛАР (ТУ 9369-141 -048668244-02), гиперозид ГСО-ФС 42-0106-03, кемпферол- Fluka, кат № 60010, розавин-ФС42-71-01, сирингин ФС 42-89-02, ликуразидФС 422573-88, ликвирлтогенин - экспериментально выделен в ВИЛАР и соотнесен со стандартным образцом

Идентификация веществ методом ВЭЖХ Анализ проводили на приборе фирмы «Gilson» с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «Мультихром для Windows» В работе применяли обращено-фазный вариант метода, в качестве неподвижной фазы использовали металлические колонки «Platinum EPS С-18» 100А размером 4,6x250мм, Alltima С8, размером 4,6x250мм, Altech ОА-ЮОО Organic Acids, размером 6,5x300мм Подвижная фаза - метанол вода фосфорная кислота (конц) в соотношении 40 60 0,5 Анализ проводили при комнатной температуре, скорость подачи элюента — 1 мл/мин Детектирование осуществляли с помощью УФ-детектора при длине волны 254 нм Реактивы метанол - ХЧ, ГОСТ 6995-77, фосфорная кислота ОСЧ, 261201400203677-97, ацетонитрил - ЧДА, ТУ 609549791, вода, очищенная по ФС 42-2619-89

Идентификация веществ методом ГЖХ Эфирное масло из сбора получали перегонкой с водяным паром методом 1 (ГФ XI изд, вып 1, стр 290) Состав эфирного масла анализировался с помощью ГЖХ на хроматографе «Кристалюкс-4000 Россия с пламенно-ионизационным детектором и компьютеризированным интегратором, колонка капиллярная «Supelcowax» с температурой 140°С, температура испарителя - 200°С, детектора - 200СС, газ-носитель- азот, расход азота- 30-60 мл/мин, возду-ха-500 мл/мин, нодорода-55 мл/мин скорость движения бумаги до 10 ми

8

нут ■— 0,5 см/сек , после 10 минут- 0,25 см/сек Анализ хлороформных растворов масла начинали при 1=80°С (10 минут), после чего температура поднималась со скоростью 3° в минуту до 250°С Идентификацию компонентов эфирного масла проводили подколом смеси стандартных веществ и по относительным временам удерживания Статистическая обработка результатов исследований проводилась при п - повторных анализов однородного материала

Разработка и стандартизация чая «Байкальский № 9».

Составление многокомпонентного чая проводили с учетом фармакологических свойств, химического состава, официнальности каждого вида сырья и состояния их сырьевой базы С целью выбора оптимального соотношения входящих компонентов были изучены несколько вариантов чая

Чай Байкальский № 9 составлен с учетом опыта применения комплексных препаратов, а соотношение ингредиентов в композиции соответствует поставленной задаче по получению средства обладающего адапто-генным действием (таблица 1)

Таблица 1

Варианты чая «Байкальский № 9»_

№ п/п Наименование ингредиентов чая Варианты чая по количеству входящих ингредиентов, (г)

1 2 о .э 4

1 Элеутерококка корневище и корень 200 150 150 100

2 Родиолы розовой корневище и корень 150 150 100 100

-> Солодки корень 200 100 150 250

4 Черники побеги 200 300 300 250

5 Чабреца трава 250 300 300 300

Фармакологические испытания, проведенные в лаборатории экспериментальной фармакологии ИОЭБ СО РАН показали, что сухой экстракт, полученный экстракцией 1-го варианта чая обладает выраженной адапто-генной активностью

Увеличение содержания компонентов (элеутерококка и родиолы) не влечет за собой повышения адаптогенной активности, т е наступает эффект «плато» при фармакологическом исследовании Поэтому в своих дальнейших исследованиях мы остановились на 1 варианте чая с наиболее рациональной композицией, обеспечивающей выраженный адаптогенный эффект

Таким образом, на основании предварительных фармакологических данных и результатов анализа объектом дальнейшего исследования выбран сбор из официнального растительного сырья следующего состава

9

(из расчета 1 кг сбора)

Элеутерококка корневища и корни - 200,0 г , родиолы розовой корневища и корни - 150 г, солодки корни - 200,0 г, черники побеги -200,0 i , чабреца трава - 250,0 г

Для определения критериев подлинности чая изучены методами макро- и микроскопического анализа, внешние и анатомо-диагностические признаки Установлено, что растительная композиция представляет собой смесь неоднородных частиц сырья серовато-зеленого цвета со светло-желтыми, серовато-коричневыми, кремовыми, желтовато-серыми, оранжево-красными, коричневато-красными и белыми вкраплениями, проходящие сквозь сито с отверстиями диаметром 5 мм

При просмотре чая подлупой (1 Ох) или стереомикроскопом видны

- голые, слегка блестящие, светло-зеленые, зеленые или коричневато-зеленые кусочки листьев с перистым жилкованием и остро-ребристые, зеленые или коричневато-зеленые кусочки стеблей (черники побеги),

- кусочки деревянистых корней и корневищ с занозистыми или гладкими краями, серовато-коричневые, желтовато-серые, светло-желтые или кремовые (элеутерококка корневища и корни),

- светло-желгые кусочки корней волокнистой структуры, иногда с остатками серовато-коричневой, продольно-морщинистой пробки (корни солодки),

обрывки пробки, розовато-коричневые, светло-коричневые кусочки основной ткани корневища проводящих пучков (родиолы розовой корневища и корни),

-кусочки неясно четырехгранных тонких, слегка опушенных или голых стеблей красновато-бурого цвета, слабоопушенных листьев с многочисленными буроватыми точками (железками), на кусочках листьев основания иногда заметны редкие щетинистые волоски, мелкие одиночные цветки или их чести, кусочки сине-фиолетового венчика и двугубой опу-шенности чашеччи буровато-красного цвета (травы чабреца)

Цвет чая частицы зеленого, желтовато-зеленого, желтовато-белого, бурого, розовато-коричневого, синевато-фиолетового цвета, аромат своеобразный, вкус водного извлечения - своеобразный со сладким привкусом

Микроскопический анализ чая установил следующие характерные признаки

фрагменты эпидермиса листа, состоящего из клеток с извилистыми тонкими стенками, устьица мелкие с 4-6 околоустьичными клетками (антоцитный тип), булавовидные железки состоящие из овальной многоклеточной головки с коричневым содержимым и многоклеточной двурядной ножки, встречаются главным образом по жилкам и на верхушках зубцов, ьристаллоносная обкладка вдоль жилок с нижней сторо-

10

ны листа, по жилкам с верхней стороны листа видны некрупные одноклеточные прямые изогнутые грубобородавчатые толстостенные волоски (черники побеги),

- фрагменты пористых сосудов с окаймленными порами, многочисленные склеренхимные волокна с внутренними перегородками, фрагменты коры, состоящие из пучков волокновидных склереид с группами парен-химных клеток, содержащих друзы оксалата кальция, фрагменты коры с секреторными каналами, заметными в виде коричневых или оранжево-коричневых трубок (обрывки пробки, состоящей из крупных клеток с утолщенными стенками, редко - обрывки спиральных сосудов (давленный препарат элеутерококка),

- фрагменты, состоящие из круглых клеток с неболышими межклетниками, заполненные простыми, округлыми или овальными крахмальными зернами диаметром 5-20 мкм, высыпавшиеся из клеток крахмальные зерна, обрывки спиральных и лестничных сосудов (родиолы розовой корневища и корни),

- обрывки эпидермиса листа с извилистыми в очертании клетками имеющими иногда четковидное утолщение стенок, устьицами диацитного типа, многочисленными волосками трех типов простые многоклеточные крупные и мелкие бородавчатые волоски и головчатые волоски с одноклеточной ножкой и шаровидной головкой, а также конусовидные одноклеточные, с округлыми эфирномасличными железками, состоящими из 8 ра-диально расположенных выделительных клеток, часто окруженных клетками эпидермиса в виде розетки, кусочки чашечки и венчика, несущие те же диагностические признаки, что и листья (травы чабреца),

- группы волокон с кристаллоносной обкладкой из призматических кристаллов оксалата кальция, обрывки сосудов с широкими короткими члениками («бочковидные»), имеющими пористый тип вторичного утолщения, стенок с окаймленными порами, более узкие сетчатые сосуды и их обрывки, обрывки трахеид, клетки паренхимы с крахмалом и отдельные крахмальные зерна округлые или овальные диаметром 2-14 мкм, отдельные призматические кристаллы оксалата кальция и их группы, обрывки покровной ткани (пробки), состоящей из прямостенных многоугольных клеток с утолщенными стенками (корни солодки)

Таким образом, проведенные исследования подтвердили подлинность по входящим в его состав компонентам Полученные в ходе работы результаты включены в соответствующие разделы нормативной документации

Изучение химического состава чая. Разработка характеристик подлинности, показателей качества и методик количественного определения биологически активных веществ

Анализ и стандартизация растительного сырья представляет собой сложную задачу из-за многокомпонентности состава

11

Наличие в составе соединений полифенольной природы (флавонои-дов, дубильных веществ, фенолкарбоновых кислот) установлено качественными реакциями с водными извлечениями и ТСХ в присутствии свидетелей ГСО, PCO, СОВС и чистых индивидуальных соединений, а также методами ГЖХ и ВЭЖХ В результате проведенных исследований определены критерии подлинности чая качественные реакции, которые включены в проекты ТУ

Результаты качественного анализа приведены в таблице 2

Таблица 2

Результаты качественного анализа состава БАВ ____(чая Байкальский-9)_

Наименование исследуемого объекта

Группа БАВ Чай Настой по инструкции Сухой экстракт

Флавоноиды +++ +++ +++

Сапонины +++ +++ +++

Полисахариды +++ +++ +++

Дубильные вещества +++ +++ +++

Фенолкарбоновые кислоты +++ +++ +++

Эфирное масло 1 +++ +++ +++

гистохимическая реакция с раствором Судана III, капли эфирного масла окрашиваются в оранжевый цвет Кроме того, наличие эфирного масла подтверждается органолептически

Для подтверждения подлинности чая «Байкальский № 9» были использованы также следующие методы

1 УФ-спектро фотометрия

2 ТСХ эфирного масла

3 ТСХ фенольных соединений

4 ТСХ глицирризиновой кислоты 3 ТСХ элеутерозидов

6 ТСХ салидрозидов

5 ВЭЖХ органических кислот

6 ВЭЖХ Сахаров

7 ВЭЖХ фенольных соединений

8 ВЭЖХ сирингина

9 ВЭЖХ розавина

10 ГЖХ эфирного масла

УФ-спектрофотометрия чая «Байкальский №9 » Спектрофотометрическое исследование чая «Байкальский №9» проводилось с использованием водно-спиртового извлечения

С учетом этих данных, УФ-спектр поглощения водно-спиртового экстракта может служить фактором подлинности чая (рис 1)

УФ-спектр поглощения чая «Байкальский № 9» (70% спиртовое извлечение) Рис. 1

Идентификация флавоноидов. Для изучения флавоноидного состава использовали метод ТСХ в сравнении с «метчиками- свидетелями» Определение проводили хроматографированием водно-спиртового извлечения на пластинках Сорбфил» и «Кизельгель УФ-254» (системы 1-4)

На хроматограммах из спиртового извлечения чая обнаружены зоны на уровне зон свидетелей рутина, кверцетина и лютеолин-7-гликозида

ГЖХ эфирного масла. С целью изучения качественного состава эфирного масла, полученного методом перегонки с водяным паром из лекарственного растительного сырья, входящего в состав сбора был использован метод газожидкостной хроматографии

В качестве раствора сравнения использовали 0,5% растворы цитраля, тимола, а-пинена в спирте метиловом (табл 3)

В испытуемом растворе обнаруживаются зоны на уровне зон растворов сравнения (рис 2)

Хромат ограмма эфнрного масла чая «Байкальский № 9»

1 - туйон, 3 - лимонен, 4 - тимол, 5 - хлороформ, 6 - пинен, 7 - ци г-

раль Рис. 2

Из компонентов эфирного масла идентифицированы туйон, лимонен тимол, Ь-пинен, цитраль Идентифицированные компоненты являются составными частями эфирного масла травы чабреца, что позволяет определять качественно в предложенной растительной композиции их присутствие (табл 3)

Таблица 3

Времена удерживания идентифицированных компонентов эфирного масла чая «Байкальский № 9»

№ п/п Название компонента Время удерживания, мин

1 Туйон 2 450

3 Лимонен 2 538

4 Тимол 2 595

6 Пинен 2 908

7 Цитралъ 3 286

Для идентификации органических кислот (рис 3), Сахаров (рис 4), фе-нольных соединений (рис 5), сирингина (рис 6), розавина (рис 7) был использован мегод ВЭЖХ Результаты проведенных исследований приведены на рисунках 3-7

ШУ

100

80

60

40

1 : ,'

"7" 7 1--

Л

о

4

-1—1—I—I—I-—1—I—I—I—I—1—I—I—I—I—1—

8 12 16 20 мин.

Хроматограмма чая «Байкальский № 9» (70% спиртовое извлечение) 1-щавелевая кислота, 2- лмнонная кислота,З-винная кислота, 4-яблочная кислота, 5-янтарная кислота

Рис.3

ту

Хроматограмма чая «Байкальский № 9» 1 - глюкоза, 2 - лактоза, 3 - мальтоза,4 - рамноза, 5 - сахароза (Водное извлечение) Рис.4 15

•т

32 34 40 мин

Хроматограмма чая «Байкальский № 9» (70% спиртовое извлечение) 1 - галловая кислота, 2 - арбутин, 3 - кемпферол, 4 - катехин, 5 -кофейная кислота, 6 - хлорогеновая кислота, 7 - эпигаллокатехин, 8 -галлокатехингаллат, 9 - лютеолин, 10 - лютеолин-7-гликозид, 11 -апигенин, 12 - глицирризиновая кислота, 13 — рутин, 14 - ликуразид, 15 - кверцетин

Рис. 5

«14 яЫ

5 10 15 20 25 ' 30 35 40 45 50 ' ' ' ' мин.— Хроматограмма чая «Байкальский № 9» 1 - сирингин Рис. 6

шЯГ

20

15г 10 -

НИШ" 1—Г I >-1 "" I-1-Т-' ' I I-1-1 ■ - 1 1 I-1 I I-

0 " * 4 8* " 12" 16 20 мин,

Хроматограмма из чая «Байкальский№9» (70% спиртовое извлечение) 1 - розавин

Рис. 7

Таким образом, на основании метода ВЭЖХ идентифицированы органические кислоты (щавелевая, лимонная, винная, маликовая и янтарная кислоты), свободные сахара (глюкоза, лактоза, мальтоза, рамноза, сахароза), флавоноиды (апигенин, лютеолин, кверцетин, кемпферол, лютео-лин-7-гликозид, рутин, ликурозид,), катехины (катехин, галлокатехингал-лат, эпигаллокатехин), оксикоричные кислоты (кофейная, хлорагеновая и галловая), сирингин, арбутин и глицирризиновая кислота

Количественное определение БАВ в чае «Байкальский № 9»

Количественное определение основных групп БАВ проводили с использованием методов спектрофотометрии - для суммы флавоноидов и суммы полисахаридов,

-титрометрии - для суммы органических кислот и дубильных веществ, метода перегонки с водяным паром для эфирного маслом,

-ВЭЖХ - для суммы эритрозидов, розавина и глицирризиновой кислоты

Результаты исследований и их статистическая обработка приведены в таблице 5

Таблица 5

Количественное содержание основных БАВ в чае «Байкальский №

9»

БАВ Г Х,% Б Бх Р,% 1(Р,0 ДХ Е,%

Сумма флавоноидов 4 1,24 0,023 0,0103 95 2,78 0,0286 2,31

Глицирри- зиновая кислота 4 1,59 0,05 0,022 95 2,78 0,0622 3 ,91

Сумма эритрозидов, в пересчете на сирингин 4 0,03 0,00078 0,00035 95 2,78 0,00096 3,26

Розавин 4 0,05 0,00077 0,00036 95 2,78 0,00096 3,24

Свободные органические кислоты 4 1,28 0,019 0,0085 95 2,78 0023 1,80

Дубильные вещества 4 4,45 0,09 0,04 95 2,78 0,11 2,47

Полисахариды 4 6,3 0,158 0,07 95 2,78 0,195 3,10

Разработка методик количественного определения суммы фе-нольных соединений в чае «Байкальский № 9»

Учитывая тот факт, что фенольные соединения обладают выраженным адаптогенным эффектом, а также принимая во внимание информацию об их присутствии в изучаемой растительной смеси, стандартизацию чая предлагается вести по сумме флавоноидов в пересчете на рутин-стандарт и по сумме эритрозидов - в пересчете на сирингин Данные показатели заложены нормативную документацию на чай «Байкальский-9»

Разработка методики количественного определения по сумме флавоноидов

В основу разрабатываемой методики был положен метод дифференциальной спектрофотометрии, который базируется на реакции комплексообразования флавоноидов с алюминием хлоридом, сопровождающейся батохрэмным сдвигом УФ-спектра в сторону больших длин волн В качестве стандартного вещества выбран рутин, поскольку макси

мум его дифференциального спектра (413 нм) совпадает с максимумом спектра извлечений из чая Подобраны оптимальные условия извлечения суммы флавоноидов из чая

Для определения воспроизводимости методики проводили определение в 5 повторностях Метрологические характеристики представлены в таблице 6

Таблица б

Метрологические характеристики результатов спектрофотометрического количественного определения

суммы флавоноидов в чае «Байкальский № 9» в пересчете на рутин

f Р,% t(P,0 Х,% S? S Sx дх Е,%

4 95 2,78 1,24 0,000529 0,023 0,0103 0,0286 ±2,47

Как видно из результатов, приведенных в таблице 6, относительная ошибка методики количественного определения суммы флавоноидных соединений не превышает ±2,47%

Результаты опытов с добавками, представленные в таблице 7 свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки в разработанной методике

Определение суммы эршпрозидов в пересчете на сирингин-стандарт Исследование проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «Gilson» с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «Мультихром для «Windows» Детектирование проводили с помощью УФ-детектора при длине волны 266 нм

По 20 мкл исследуемого раствора (хлороформный экстракт из чая раствора А PCO (0,02% раствор сирингина в 40 % этаноле) вводили хроматограф и анализировали по вышеприведенной методике

Расчет количественного содержания суммы эритрозидов в пересчете сирингин производили методом абсолютной калибровки с помощью компьютерной программы «Мультихром» для «Windows» Полученные результаты представлены в таблице 7

Таблица 7

Метрологические характеристики результатов количественного определения суммы эритрозидов, в пересчете на сирингин-стандарт в чае «Байкальский № 9»

f Р,% t(P,D Х,% S* S Sx ДХ Е,%

4 95 2,78 0,030 0,6 ю7 0,78 103 0,00035 0,00097 3,23

Как видно из представленной таблицы, относительная ошибка единичного определения не превышает — ±3,23% Опытами с добавками доказано отсутствие систематической ошибки в предложенной методике (табл 8)

Таблица 8

Результаты количественного определения суммы эритрозидов, в пересчете сирингин-стандарт в чае «Байкальский № 9»

Содержание сирин-гина в навеске, в мг Добавлено сирин-гина, в мг Должно быть, в мг Найдено, в мг Абсолютная ошибка, в % Относит ная ошибка, в%

03 0,15 0,45 0,437 -0,013 -2,89

03 0,2 0,5 0,485 -0,015 -3,00

03 0,3 03 0,612 +0,01 +2,00

На основе полученных данных по исследованию БАВ «Байкальский № 9» разработаны нормативные документы технические условия, технологическая инструкция и рецептура, в которой регламентированы показатели качества, безопасности и способы получения БАД на чай «Байкальский № 9»

РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ СУХОГО ЭКСТРАКТА из чая «Байкальский № 9».

В данном разделе представлены исследования по влиянию экстраген-та, его соотношение с сырьем, степень измельчения сырья, продолжительность и кратность экстракций на выход БАВ, которые проводились по экстрактивным веществам а также по разработанной ранее методике количественного определения суммы флавоноидных соединений в пересчете на рутин-стандарт В результате проведенных исследований предложена технологическая схема производства сухого экстракта из сложной растительной композиции чай «Байкальский 9 (80-90°С, кратность экстракции - 3, время 1 экстракции - 1 час, 2 экстракции 30 минут, 3 экстракции - 30 минут

Стандартизация сухого экстракта чая «Байкальский № 9».

Стандартизация полученного продукта осуществлена по доминирующим веществам с применением современных физико-химических методов анализа

На первом этапе проведено предварительное фитохимическое изучение полученного сухого экстракта При этом установлено, что в нем содержатся суммарные биологически активные вещества относящиеся к

20

следующим классам соединений дубильные вещества, флавоноиды, сахара, сапонины органические кислоты

На основе проведенных исследований по идентификации биологически активных веществ в сухом экстракте чая «Байкальский № 9» качественными реакциями, методами спектрофотометрии, хроматографии в тонких слоях сорбента, высокоэффективной жидкостной хроматографии подтверждено наличие фенольных соединений, в том числе флавоноидов, органических кислот, Сахаров, глицирризиновой кислоты, сирингина и розавина

Таким образом, исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что по качественному составу обнаружен переход биологически активных соединений из чая в сухой экстракт, что в свою очередь подтверждает рациональной разработанной ранее технологии его получения

Разработка методик количественного определения основных групп БАВ в сухом экстракте чая Байкальский № 9

Учитывая идентичность качественного состава чая и полученного экстракта, стандартизацию и контроль на стадиях его производства проводили по методикам, разработанным для количественного определения исходной растительной смеси Для разработки методик количественного анализа сухого экстракта уточняли массу навески, растворитель и разведения Результаты количественного определения приведены в таблице 9

Таблица 9

БАВ / Х,% 5 5х Р,% АХ Е

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Сумма флавоноидов 4 2,05 0,04 0,018 95 2,78 0,0500 2,44

Глицир- ризиновая к-та 4 3,01 0,06 0,027 95 2,78 0,0750 2,49

Сумма эригрози-

дов, в пересчете на сирин-гин 4 0,04 0,00078 0,00035 95 2,78 0 0010 2,40

Розавин 4 0,06 0,00077 0,00036 95 2,78 0,00096 1,60

Продолжение таблицы 9

1 2 j 4 5 6 7 8 9

Свобод-

ные органические 4 2,28 0,03 0,013 95 2,78 0,0360 1,62

кислоты

Дубильные ве- 4 8,71 од 0,089 95 2,78 0,25493 2,87

щества

Полисахариды 4 153 0,158 0,07 95 2,78 0,1950 1,28

На основе проведенных исследований по стандартизации чая «Байкальский № 9» и сухого экстракта, обладающего адаптогенным действием, разработаны показатели качества для нормативной документации (ТУ) БАД - чай «Байкальский № 9» и сухого экстракта из чая Методом ускоренного старения в обычных условиях установлен срок годности в процессе хранения БАД - чай «Байкальский №9» и сухого экстракта 2 года

ВЫВОДЫ

1 Разработана и обоснована рациональность состава чая «Байкальский № 9»

2 Выявлены доминирующие вещества в чае «Байкальский №9», проведена их количественная оценка суммы , полисахаридов - 6,3%, дубильных веществ - 4,45%

3 Установлено влияние основных параметров экстракции на выход БАВ из растительной композиции, что позволило разработать технологическую схему получения сухого экстракта из нее

4 Исследован качественный состав исходной композиции и сухого экстракта Качественными реакциями, методами тонкослойной, газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографией, спектрофотометрией установлено наличие следующих групп БАВ органических кислот, дубильных веществ, полисахаридов, флавоноидов, сирингина, розавина

5 Разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин - стандарт, суммы полисахаридов-в пересчете на глюкозу, глицирризиновой кислоты и суммы эритрозидов- в пересчете на сирингин - стандарт и розавина методом ВЭЖХ

6 По результатам проведенных исследований в Министерстве здравоохранения и социального развития Российской Федерации получено регистрационное удостоверение на чай «Байкальский № 9»

22

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1 Мошкова Л В , Садоян В А , Рейзин А Б , Воронова Л С , Маркарян Производители биологически активных добавок к пище на фармацевтическом рынке России // Проблемы управления здравохранением - №3 -2005 - С 50-53

2 Маркарян Н С Современные принципы разработки технологии сухого экстракта из фиточая, обладающего адаптогенным действием //Проблемы управления здравоохранением №6(31) -2006 -С 68-71

3 Маркарян Н С , Николаева Г Г Разработка технологии получения сухого экстракта фиточая, обладающего адаптогенным действием // Материалы XIII международной, специализированной выставки «Аптека 2006» -Москва -2006 - С 56-57

4 Маркарян НС, Николаева Г Г Разработка нового фиточая, обладающего адаптогенной активностью //Материалы XIII международной специализированной выставки «Аптека 2006» -Москва -2006 - С 57-59

5 Шабалдина Ю И , Маркарян А А , Маркарян Н С Исследования по разработке методов контроля качества сухого экстракта для профилактики и лечения заболеваний пародонта //Сб тезисов докладов XIV Всероссийского конгресса «Человек и лекарство» - М РЦ «Фарммединфо»,-2007 -С 67

6 Жукова О Л , Дубинская В А , Абрамов А А , Даргаева Т Д , Маркарян А А , Маркарян Н С Изучение технологических и физических свойств сухих экстрактов из лекарственного растительного сырья // Химическая технология -№2 - 2007 - С 35-37

Подписано в печать 19 04 2007 г Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная Объем 1,5 печ л Тираж 100 Заказ № 23

Отпечатано в типографии Изд-ва БНЦ СО РАН 670047 г Улан-Удэ, ул Сахьяновой, 6

Актуальность темы. Результаты эпидемиологических наблюдений и статистических исследований, последних двух-трех десятилетий свидетельствуют о значительном увеличении сердечно - сосудистых, желудочно-кишечных, эндокринных, онкологических заболеваний, обусловленных снижением адаптационных возможностей организма. В этих условиях важное место приобретают профилактические мероприятия, направленные на повышение адаптационных возможностей организма для сохранения и укрепления здоровья населения. Одним из способов решения этой задачи является применение биологически активных добавок (БАД) к пище в виде сборов лекарственных растений обладающих адаптогенной активностью. Они будут повышать эффективность первичной и вторичной профилактики, а также могут применяться в комплексном лечении многих хронических форм заболе-*' ваний.

Многокомпонентные лекарственные средства на основе растений и БАД к пище могут оказывать влияние на организм человека как корригирующая система, благодаря наличию комплекса природных веществ. Не-., смотря на их высокую эффективность, в настоящее время применяется до-' вольно ограниченный набор лекарственных средств растительного происхождения, который не удовлетворяет возросшие потребности населения. В связи с этим, является актуальной разработка БАД к пище на основе растительной композиции, улучшающих функции обмена веществ и повышающие адаптационные способности организма.

Наиболее распространенной формой их применения являются сборы -чаи из лекарственных растений. В последние годы, весьма перспективным являются перевод в суммарные сухие экстракты, преимуществом которых является стойкость при хранении, удобство применения, а также решение вопросов стандартизации. Таким образом, весьма актуальным являются исследования по разработке БАД к пище, улучшающих функции обмена веществ и повышающие адаптивные возможности организма.

Цель и задачи исследованиям). Целью настоящих исследований является разработка и стандартизация биологически активной добавки к пище чая «Байкальский № 9» и экстракта сухого, рекомендуемого как адаптогенное средство.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

- обосновать и разработать рациональный состав многокомпонентной растительной композиции;

- провести фармакогностическое изучение растительной композиции;

- разработать способ получения биологически активной добавки к пище чая «Байкальский №9» и экстракта сухого;

- определить качественное и количественное содержание основных биологически активных веществ в чае и экстракте сухом

- исследовать влияние основных факторов, влияющих на процессы экстракции БАВ из растительной композиции;

- разработать нормативные документы: Технические условия (ТУ), Тех-"", нологическую инструкцию (ТИ), Рецептуру на биологически активную добавку к пище чай «Байкальский № 9».

Научная новизна работы. Разработан и обоснован состав и соотношение компонентов исходной растительной композиции.

Установлены критерии подлинности чая «Байкальский № 9», числовые показатели, внесенные в нормативные документы. С учетом вклада каждого компонента в растительной композиции разработаны методы качественного и количественного анализа, подтверждающие наличие групп веществ характерных для данного вида сырья.

Определены условия для оптимальной экстракции биологически активных веществ (БАВ) из растительной композиции: тип экстрагента, температурный режим, соотношение сырья и экстрагента, степень измельчения, гидродинамические условия. Рациональность технологии получения сухого экстракта подтверждена количественной оценкой БАВ в растительной композиции и экстракте сухом.

Разработаны методики качественного и количественного анализа основных БАВ в чае «Байкальский № 9» и экстракте сухом по сумме флаво-ноидов в пересчете на рутин-стандарт.

Практическая значимость работы. По результатам исследований разработаны и внедрены:

1. Биологически активная добавка к пище чай «Байкальский № 9» Р.77.99.02.937.Б.000125.08.03.

2. Справка об апробации и внедрении Б АД к пище в ГУЗ МЗ РБ «Центр Восточной медицины», г. Улан-Удэ.

3. Методика количественного определения чая «Байкальский № 9» по сумме флавоноидов в пересчете на рутин-стандарт (апробирована на кафедре фармакогнозии ГОУ ВПО КГМУ Росздрава).

4. Методика качественного определения сирингина в сухом экстракте (апробирована в ОАО «Красногорсклексредство»).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты по разработке, обоснованию рационального состава и соотношения входящих компонентов растительной смеси;

- результаты фармакогностических исследований по установлению критериев подлинности и содержания биологически активных веществ в растительной композиции;

- результаты по разработке и обоснованию технологии получения сухого экстракта;

- результаты исследований по стандартизации чая и экстракта сухого по основным группам действующих веществ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРИНЦИПЫ ФИТОКОРРЕКЦИИ СРЕДСТВАМИ, ОБЛАДАЮЩИМИ АДАПТОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. На основании данных литературы о химическом составе растений, применении их в научной и традиционной медицине, их фармакологической направленности действия и состояния сырьевой базы составлена и обоснована рациональная композиция в виде чая «Байкальский № 9».

2. Методами фармакогностического изучения выявлены диагностические признаки пяти компонентов чая «Байкальский № 9» при их совместном присутствии. Установлены числовые показатели подлинности, исследован качественный состав методами хроматографии на бумаге и тонком слое, ВЭЖХ, при этом идентифицированы: флавоноиды (апигенин, лютеолин, кверцетин, кемпферол, лютеолин-7-гликозид, рутин, ликурозид); катехины (катехин, галлокатехингаллат, эпигаллокатехин); оксикоричные кислоты (кофейная,/ хлорогеновая и галловая); сирингин, арбутин, сахара, элеутерозиды, глицир-ризиновая кислота. Выявлены доминирующие вещества в чае «Байкальский -№ 9», проведена их количественная оценка: полисахаридов - 6,3%; дубильных веществ - 4,45%, органических кислот - 1,28%, глицирризиновой кислоты - 1,59%, розавина - 0,03%, сирингина - 0,05%. Разработан способ получения чая «Байкальский №9».

3. Разработан способ получения экстракта сухого. Установлено влияние основных параметров экстракции на выход БАВ из растительной композиции (тип экстрагента - горячая вода с температурой 80-90°С; соотношение 1:(10-12); кратность -3; время 1- 1 час, 2 экстракции- 30 минут, 3 экстракции -30 минут.

4. Исследован качественный и количественный состав чая и экстракта сухого. Качественными реакциями, методами тонкослойной, газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографией, спектрофотометрией установлено наличие следующих групп БАВ: органических кислот, дубильных веществ, полисахаридов, флавоноидов, сирингина, розавина. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчёте на рутин - стандарт,

5. Разработаны нормативные документы и по результатам проведенных исследований Министерством здравоохранения и социального развития Российской Федерации выдано регистрационное удостоверение "на чай «Байкальский № 9»