Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка и стандартизация адаптогенного средства растительного происхождения

На правах рукописи

ПАРЬЕВА КСЕНИЯ ВЛАДИМИРОВНА

РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ АДАПТОГЕННОГО СРЕДСТВА РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

15.00.02-фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Улан-Удэ-2005

Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук Николаева Галина Григорьевна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Кашин Владимир Капсимович Кандидат фармацевтических наук Шелухеева Марина Геннадьевна

Ведущая организация:

Иркутский государственный медицинский университет

Защита состоится ««?/ » февраля 2005 г. в Ю00 ч. на заседании диссертационного совета К 003.028.01 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Бурятского научного центра СО РАН

Автореферат разослан « 18 » января 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета К 003.028.01

совета .к. ииз.и^в.ш

кандидат биологических наук В.Б. Хобракова

¿Mi^L ¿Ott

к £¿80

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Аюуальность темы. В течение последних десятилетий особо выделяется направление в фармации по созданию лекарственных препаратов, способных поддерживать защитные силы организма, в частности средства тонизирующего, общеукрепляющего (адаптогенного) действия.

Многочисленные неблагоприятные экологические факторы, недостаточное употребление натуральных продуктов, витаминов, минеральных веществ, пищевых волокон, биологически активных веществ растений, стрессы, чрезмерные физические и умственные нагрузки, ограничение двигательной подвижности провоцируют состояние стресса с последующим нарушением обмена веществ и повышением уровня свободных радикалов в организме [Барабой В.А., 1993; Дичев Т.Г., 1994].

Для нормализации работы физиологических систем необходимы комплексные лечебно-профилактические средства, помогающие восстановить защитные функции организма. Одним из подходов к решению этой проблемы является разработка биологически активных добавок (БАД) к пище восполняющих дефицит необходимых организму нутриентов, содержащих антиоксиданты, иммуномодуляторы, стимуляторы внутренних органов. В этой связи интерес для научных исследований представляет разработка безопасных фитосредств, созданных на основе знаний традиционной тибетской медицины прошлых веков, и современных научных достижений. Преимущества фитопрепаратов обусловлены широким спектром фармакологического действия, в отличие от химических препаратов они способны оказывать мягкое действие без побочных последствий, могут использоваться для людей постоянно подверженных воздействию неблагоприятных экологических факторов, в целях профилактики заболеваний, для реабилитации больных после операций, а также для снижения утомляемости и повышения работоспособности [Гриневич М.А., 1990; Воскресенский О.Н., 1992; Кидалов В.Н., 1998]. Таким образом, является актуальным внедрение в медицинскую практику эффективных комплексных средств профилактического действия, которые позволят существенным образом поддерживать здоровье человека на высоком уровне, расширить и улучшить ассортимент лекарственных средств адаптогенного действия.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка состава и технологии нового эффективного адаптогенного лекарственного средства растительного происхождения, представляющего собой жидкий экстракт, и способов его стандартизации.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие

I

I

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА JSJleTtpöjpr

aa»SPK

-А

основные задачи:

-разработав оптимальный состав исходной лекарственной растительной композиции для получения фитосредства,

-изучить качественный состав растительной композиции с использованием современных физико-химических методов анализа и определить содержание основных действующих веществ;

-изучить факторы, влияющие на выход БАВ из растительной композиции и разработать технологию производства жидкого экстракта;

-изучить качественный состав жидкого экстракта, разработать методики количественного определения БАВ и показатели качества для его стандартизации;

-разработать нормативную документацию в виде ФС11, ТУ, ТИ на средство, рекомендуемое для внедрения в медицинскую практику.

Научная новизна. Подобран и обоснован рациональный состав исходной растительной композиции, на основе которой разработано новое средство с адаптогенной активностью в виде жидкого экстракта (условно названного) «Тантон».

С использованием современных методов анализа установлено наличие в исходной композиции и жидком экстракте «Тантон» биологически активных соединений, относящихся к классу флавоноидов и фенолкарбоновых кислот, тритерпеноидов, дубильных веществ, витаминов, аминокислот, алколоидов, полисахаридов. Изучен состав эфирного масла исходного сбора, в результате идентифицировано более 40 индивидуальных соединений, для некоторых из них установлены растительные источники; изучен микроэлементный состав исходного сбора и полученного на его основе жидкого экстракта, в результате обнаружено 30 макро- и микроэлементов; установлен качественный и количественный состав аминокислот в жидком экстракте.

Установлено количественное содержание основных действующих веществ в исходном сборе, разработаны методики количественного определения по сумме флавоноидов и полисахаридов.

Разработана технология получения жидкого экстракта из растительного сбора, определены параметры экстрагирования сырья, обеспечивающие максимальный выход биологически активных веществ, обусловливающих адаптогенную, антистрессорную,

иммуностимулирующую активность экстракта.

Разработаны методики качественного и количественного определения БАВ и определены показатели качества для стандартизации жидкого экстракта.

Получено положительное решение на выдачу патента «Лекарственное средство «Тантон», обладающее адаптогенной

активностью».

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработана нормативная документация:

проект ФСП на лекарственное средство-жидкий экстракт «Тантон» (утвержден на заседании Ученого совета ИОЭБ СО РАН, протокол № 7 от 07.09.2004 г.);

технологические условия (ТУ 9197- 014-53015183-04) на биологически активную добавку (БАД) к пище жидкий экстракт «Тантон»; Технологическая инструкция (ТИ);

растительный сбор внедрен в производство в Центре Восточной медицины МЗ РБ (акт внедрения от 11.05.2004 г);

установлено, что жидкий экстракт «Тантон» обладает антиоксидантной, иммуномодулирующей, адаптогенной,

актопротекторной активностью Исследования специфической активности проведены в лаборатории экспериментальной фармакологии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН. Апробация работы и публикации.

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на: -третьем конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке», Томск, 16-17 мая 2002 года;

-научно-практической конференции ВСГ'ГУ: «Химия и биологически активные вещества», Улан-Удэ, 15 апреля, 2003 г.;

-научно-практической конференции «Биологически активные добавки в профилактической медицине», Улан-Удэ, 18-19 сентября 2003 г.;

-научно-прак1ической конференции посвященной 70-летию службы контроля качества лекарственных средств в Бурятии;

-заседании объединенного семинара лабораторий медико-биологических исследований, экспериментальной фармакологии и безопасности биологически активных веществ ИОЭБ СО РАН (г. Улан-Удэ, 18.04.2004 г.)

Основное содержание диссертации опубликовано в 8 научных работах; в ТУ 9197- 014-53015183 04 и в ТИ на производство биологически активной добавки (БАД) к пище жидкий экстракт «Тантон», проекте ФСП на жидкий экстракт «Тантон».

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Отдела биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по программе: «Создание информационного банка данных по тибетской медицине и разработка новых лекарственных препаратов» (номер государственной регистрации 01.9400031.83); «Лекарственные растения Сибири и Дальнего Востока»,

являющейся разделом (6.3) Государственной программы «Сибирь» на период 1986-2005 гг и тематикой проблемной комиссии по фармации №36.08 РАМН МЗ РФ.

Работа по исследованию химического состава БАВ растительного сбора и жидкого экстракта «Тантон» поддержана грантом но программному мероприятию ] .2 Федеральной целевой программы «Интеграция науки высшего образования России на 2002-2006 годы» и проводилась в 2004 году во Всероссийском институте лекарственных и ароматических растений г Москвы, под руководством главного научного сотрудника лаборатории стандартизации ВИЛАР, д.фарм.н., профессора Даргаевой Тамары Дарижаповны.

Основные положения, выносимые на защиту: -обоснование растительной композиции и возможности создания препарата адаптогенного действия на его основе;

- результаты исследований по содержанию действующих веществ в исходном сборе и готовом препарате;

-способ получения лекарственного средства, обладающего адаптогенной активностью;

-методики стандартизации жидкого экстракта «Тантон». Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 168 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, шесть глав экспериментальных исследований, 49 таблиц, 13 рисунков, общие выводы, список используемой литературы, включающий 269 источников, из них 29 зарубежных научных публикаций. Приложения содержат (ТУ 9197- 014-53015183-04), ТИ на биологически активную добавку (БАД) к пище жидкий экстракт «Тантон»; проект ФСП на средство жидкий экстракт «Тантон».

Материалы и методы исследования Композиция из 17 лекарственных растений (исходный сбор): официнальные растения-аир болотный (корневища), бадан толстолистный (корневища), родиола розовая (корневища с корнями), левзея сафроловидная (корневища с корнями), боярышник (плоды разных видов), девясил высокий (корневища и корни), крапива двудомная (листья), календула лекарственная (цветки), солодка (корни и корневища разных видов), облепиха крушиновидная (плоды), шиповник (плоды разных видов); пищевые растения: кардамон настоящий (плоды), перец черный (плоды), мускатный орех (плоды), петрушка кудрявая (корни), имбирь аптечный (корни), пятилистник кустарниковый (побеги) и жидкий экстракт, полученный из исходного сбора.

Сырье собрано в различных районах Бурятии с 2001 по 2003 годы, а также приобреталось в аптечной сети города Улан-Удэ и аптеке Центра

восточной медицины.

Изучение качественного состава исследуемого исходного сбора и жидкого экстракта проводили с помощью стандартных химических качественных реакций, а также методом одномерной и двумерной хроматографии на бумаге марки "Filtrak"-FN-12 (Германия) и на пластинках «Silufol» марки UV-254 (Чехия).

Анализ фенольных соединений исходного сбора проводили на жидкостном хроматографе «Милихром А-02» (ЗАО «Эконова» Новосибирск, Россия).

Исследование фенольного состава экстракта «Тантон» проводили на жидкостном хроматографе фирмы «GILSTON» (Франция) с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы «Мультихром» для Windows. В качестве стандартных образцов использовали 0,05% спиртовые растворы химически чистых фенольных веществ: рутина, кверцетина, лютеолина, люгелиолина-7-гликозида, галловой кислоты, хлорогеновой кислоты, цикориевой кислоты, феруловой кислоты, глицерризиновой кислоты, гесперидина, гиперозида, наренгенина, нарингенин-5-гликозида.

Газожидкостную хроматографию с масс-спектрометрическим детектированием эфирного масла исходного сбора проводили на приборе Agilent 5973N + GC 6890. Идентификацию веществ осуществляли по базам данных РВМ и NIST на 150000 соединений: The NIST Mass Spectral Search Program for the NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library.

Микроэлементный анализ проводили на спектрографе ДФС-8 с плоскостной дифракционной решеткой для качественного и количественного спектрального анализа в области 200-1000 нм.

Анализ аминокислот проводили на аминокислотном анализаторе AAA 339 (ЧССР), хроматографическая колонка с ионообменной смолой ЛЖ-ФА. В качестве элюента использовали буферные растворы натрия цитрата, лития цитрата, скорость подачи элюента 42 мл/ч.

Значения оптических плотностей растворов при проведении количественных методик определяли на спектрофотометрах СФ-46 и Cecil 2011. В качестве стандартных образцов использовали: PCO рутина, PCO глюкозы, PCO кислоты аскорбиновой.

УФ-спектры регистрировали на саморегистрирующем спектрофотометре Agilent 8453 Е UV-VI SIBLE.

Фитохимическое изучение исходной растительной композиции

При составлении растительной композиции мы учитывали опыт приготовления тонизирующих растительных сборов в традиционной тибетской медицине, анализ данных научной литературы об использовании отдельных лекарственных растений и их сочетаний при

составлении лечебных сборов, состояние изученности химического состава растений.

Многокомпонентная лекарственная композиция содержит оптимальный набор компонентов, подобранных по принципу сочетанного разностороннею действия на организм. Основу растительного сбора составляют адаптогены-родиола розовая, левзея сафроловидная, солодка уральская (голая), специфические БАВ этих растений оказывают регулирующее влияние на нейроэндокринные и иммунные процессы. В растительный сбор были включены растения, способные возместить недостаточное гь витаминов и микроэлементов: плоды шиповника, облепихи крушиновидной, боярышника, листья крапивы двудомной, корни петрушки кудрявой Также при составлении композиции учитывали необходимость присутствия растений, имеющих широкий спектр фармакологического действия, таких, как девясил высокий, аир болотный, бадан толстолистный, календула лекарственная, боярышник, курильский чай. БАВ этих растений (биофлавоноиды, каротиноиды, тритерпеноиды, катехины, фенольные, органические кислоты, дубильные вещества, полисахариды и др.) способствуют нормализации нарушенных функций и систем, выводят из организма токсины, усиливают и потенцируют действие сопутствующих ингредиентов. Особой группой, включенной в сбор, являются пищевые растения, часто используемые в практике тибетской медицины: мускатный орех, перец черный, кардамон настоящий, имбирь аптечный Входящие в их состав алкалоиды, эфирные масла, минеральные соли обладают разносторонним фармакологическим действием: возбуждают деятельность пищеварительных органов, повышают усвояемость питательных элементов, благоприятно влияют на деятельность нервной, сердечно-сосудистой систем, обладают тонизирующим, иммуномодулирующим действием

Товароведческий анализ сырья показал его соответствие требованиям нормативной документации, предъявляемым к качеству сырья.

Фармакологические исследования, проведенные в лаборатории экспериментальной фармакологии ИОЭБ СО РАН, подтвердили целесообразность выбора растительной композиции.

С помощью современных методов фитохимического анализа проведено исследование водного, водно-спиртового извлечения из растительного сбора на присутствие основных БАВ. На основании предварительного химического анализа определено содержание биологически активных веществ, относящихся к различным классам природных соединений: флавоноиды, дубильные вещества, тритерпеноиды, полисахариды, фенологликозиды, аминокислоты, алкалоиды.

Методом двумерной хроматографии водно-спиртового извлечения из растительного сбора в системе растворителей н-бутанол- кислота уксусная -вода (4:1.2) и 15% кислота уксусная выявлены II зон фенольных соединений. По характерной окраске предварительно были установлены фенольные соединения: фенолкарбоновые кислоты, кумарины, флавоноиды, таннины.

При изучении мокосахаридного состава водорастворимого полисахаридного комплекса методом нисходящей бумажной хроматографии в системе растворителей н-бутанол-пиридин-вода (6:4:3) обнаружены: глюкоза, фруктоза и манноза.

Учитывая, что в состав исходной композиции входят растения, содержащие эфирные масла (мускатный орех, имбирь аптечный, кардамон настоящий, аир болотный, девясил высокий, перец черный), было установлено количественное содержание эфирного масла, составляющее по методу ГФ 0,53%. Качественный состав эфирного масла изучали методом ГЖХ с масс-спектральным детектированием. Хроматограмма и основные идентифицированные соединения приведены на рисунке 1 и в таблице 1.

ги■ I с1\жсяа|иишмсн1\яю.0

фртнс 1

АоФ>1гм1 1 31 200Э 10: Л 11*114 ЛсчИ^ЬоЙ о_мж

1мЫМШ 1 1МЦМИ

ВМ»и Яя*1 №«С «11 21.04.01

Рисунок 1. Хроматограмма эфирного масла исходного растительного сбора

Таблица 1

Летучие компоненты эфирного масла исходного сбора

№ Наименование компонента Время Растительный источник

п/п удерживания, мин

1 а-пипен 9,84 аир, петрушка

2 Камфен 10,33 аир, петрушка

3 Бензальдегид 10,56 солодка

4 Лимонен 12,56 петрушка

5 Эвкалиптол 12,69 аир, имбирь

6 Борнеол 16,81 аир, имбирь, мускатный орех

7 (+)-«-терпинеол 17,09 кардамон, аир, мускатный орех

8 Борнилацетат 20,23 аир

9 а-кубебин 22,86

10 Кариофиллен 24,15 перец черный

11 Цедрен 24,27

12 Азарон 28,61 аир

13 Дигидрокси-изо-каламендиол 29,43 аир

14 а-кадинол 29,88

15 Этиллинолеат 39,66 солодка

16 Трикозан 41,98

Использование метода ГЖХ позволило определить в исходной композиции более 40 индивидуальных соединений, которые относятся к монотерпеноидам, сесквитерпеноидам, сложным эфирам высших спиртов и жирных кислот.

Проведен хроматографический (ВЭЖХ) анализ водно-спиртового извлечения исходного сбора. Флавоноидные гликозиды и их агликоны, а также фенолкарбоновые кислоты определяли при градиентном режиме элюирования. Использовали подвижные фазы соответственно: смесь водного раствора фосфата калия и метанола при соотношении 95:5 и метанол; смесь водного раствора фосфата - калия и ацетонитрила при соотношении 95:5 и ацетонитрил. Детектирование проводили с помощью УФ-детектора при селективных длинах волн, характерных для данных соединений. Хроматогарммы представлены на рисунках 2, 3.

Количественное определение проводили методом внешнего стандарта. Суммарная погрешность измерений не превышала 5 %. Результаты анализа представлены в таблице 2.

Время, мин

Образеи 1

Рисунок 2. Хроматограмма флавоноидных соединений исходного сбора

2-гиперозид

3,4-лютеолин-7-глюкозид и рутин

5-мирицетин

8-кверцетин

ЬЗремя, мин

Рисунок 3. Хроматограмма галловой кислоты исходного сбора

И

Таблица 2

Результаты идентификации фенольных соединений в исходном сборе методом ВЭЖХ

Стандартные образцы Волно-спиртовое извлечение из сбора

tR, мин tR, мин С, мкг/мл

Гиперозид 11,42 11,3±0,6 11,3±0,6

Лютеолин-7- 11,89±0,24 11,80 Не более

глюкозид 80

Рутин 11.89+0,24 11,80 Не более 100

Мирицетин 13,2+0,26 13,00 10,0+0,6

Кверцетин 16,5±0,3 16,5 5,0±0,2

Галловая кислота 1,56±0,03 1,55 59,0±3

В результате на хроматограммах были идентифицированы флавоноиды: гиперозид, кверцетин и мирицетим. Также было установлено, что лютеолин-7-глкжозид и рутин имеют идентичные спектральные характеристики, поэтому их идентификация затруднена в данных условиях. В результате для указанных соединений не удалось однозначно сопоставить пики на полученных хроматограммах и провести их количественное определение В таблице для лютеолин-7-глюкозида и рутина дана лишь оценка возможных концентраций. Поиск органических и фенолкарбоновых кислот показал присутствие галловой кислоты в образце.

Установлен минеральный состав и количественное содержание макро-и микроэлементов Из макроэлементов отмечается наибольшее содержание кальция, магния, натрия, фосфора, а также присутствие в значительных количествах марганца, бария. Из микроэлементов присутствуют- алюминий, железо, медь, цинк, кобальт, никель, бром, фтор, бор, марганец и др.

Количественное определение БАВ в исходном сборе

Для оценки количества действующих веществ в исходной растительной композиции разработана методика определения суммы флавоноидов, основанная на дифференциальной спектрофотометрии с применением комплексообразующего реагента - алюминия хлорида. В качестве стандартного образца использовали рутин При рассмотрении УФ-спектров водно-спиртового извлечения исходного сбора и раствора стандартного образца PCO рутина в 96% спирте с добавлением реагента алюминия хлорида выявили, что максимумы спектров совпадаю!. В качестве аналитической длины волны была выбрана максимальная точка при 410 нм спектра раствора PCO рутина и водно-спиртового извлечения из исходной композиции (рис.4).

-04-

I --—1—'——п——I——'—>--1—'—'—1—' г 1 ' ' 1 1 I 1 ' ' " '""I r 1 ■ I

!__3®____2SÜ__400._____450 _ _ 500.___550 __ _ 6ffi______"».I t Mar .Ii

Рисунок 4. Спектры поглощения PCO рутина и извлечения из сбора с добавкой алюминия хлорида

1-спектр PCO рутина (0,05 мг/мл)

2-спктр извлечения исходного сбора

3-спектр жидкого экстракта «Тантон»

Подобран!.! оптимальные параметры для экстракции флавоноидов из исходной композиции: экстрагент 70% спирт этиловый, температура экстракции-кипящая водяная баня, соотношение сырья и экстрагента 1:100, проведение двукратной экстракции в течение 60 минут, степень измельчения растительного сырья до размера частиц 0,5-1 мм. Метрологические характеристики методики представлены в таблице 3.

Таблица 3

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в исходной композиции

f х,% Р,% t(p,0 S Ах Е,% Е,%

6 0,467 95 2,45 0,00592 0,0054 ±1,17 ±3,11

Содержание суммы флавоноидов в пяти сериях исходной композиции находится в пределах от 0.39 до 0,46%.

Для разработки методики количественного содержания суммы восстанавливающих моносахаров полисахаридного комплекса исходной композиции был использован метод спектрофотометрии, основанный на способности моносахаридов, образовавшихся после гидролиза, восстанавливать в щелочной среде пикриновую кислоту до пикрамовой. За основу принята методика количественного определения полисахаридов в траве мать-и-мачехи [Беляков КВ., 1999]. В качестве стандартного образца использовали PCO глюкозы. Спектры поглощения полученных

восстанавливающих моносахаров с кислотой пикриновой в щелочной среде имеют максимум поглощения при 470 нм (рис.5)

1Ш11Д МШИМ, 1Ш

Рисунок 5. Спектр поглощения восстанавливающих моносахаров с кислотой

пикриновой

1-раствор PCO глюкозы с кислотой пикриновой

2-восстанавливающие моносахара исходного сбора с кислотой пикриновой

Для выяснения подчиняемое ги исследуемого комплекса закону Ламберта-Бугера-Бера были приготовлены разведения от 0,003 до 0,03% и установлено, что в диапазоне оптических плотностей 0,2-0,7 наблюдается линейная зависимость между концентрацией растворов и величиной поглощения.

Оптимальными параметрами для извлечения полисахаридов из исходной композиции являются следующие: последовательная трехкратная экстракция 70% спиртом этиловым и водой дистиллированной; измельчение аналитической пробы до размеров частиц 0,5-1 мм; соотношение сырья и экстрагента 1:70. Результаты метрологических характеристик разработанной методики количественного определения содержания суммы восстанавливающих моносахаров полисахаридного комплекса исходной композиции представлены в таблице 4.

Таблица 4

Метрологические характеристики методики определения суммы восстанавливающих моносахаров

f Х,% Р t(p,f) S Ах Е,% Е,%

7 11,79 95% 2,36 0,22181 0,18562 ±1,6 ±4,44

Содержание суммы восстанавливающих моносахаров в пяти сериях исходной композиции находится в пределах от 4,8 до 12,0 %

Установлено количественное содержание дубильных веществ, органических кислот, аскорбиновой кислоты, суммы флавоноидов, суммы полисахаридов в исходном сборе. Результаты количественного определения БАВ представлены в таблице 5.

Таблица 5

Содержание основных действующих веществ в исходном сборе

Определяемые биологически активные вещества в исходном сборе Количество БАВ, % Метрологические характеристики методики количественного определения БАВ в исходном сборе

Г Х,% Р,% 1(Р,0 Б Ах Ё,%

Дубильные вещества 1,37±0,01 4 1,37 95 2,78 0,01586 0,01977 + 1,44

Кислота аскорбиновая 1,87±0,03 4 1,87 95 2,78 0,02556 0,03186 ±1,7

Сумма флавоноидов 0,46 +0,005 6 0,46 95 2,45 0,00592 0,0054 ±1,17

Сумма полисахаридов 11,79+0,18 7 11,79 95 2,36 0,22181 0,18562 ±1,6

Органические кислоты 2,85+0,04 4 2,85 95 2,78 0,03536 0,04408 ±1,54

В результате проведенных исследований показано, что исходный растительный сбор представляет собой хорошую основу для приготовления лечебного фитосредства.

Разработка способа получения лекарственного средства

Для получения фитосредства была выбрана лекарственная форма-жидкий экстракт.

Установлены оптимальные параметры экстрагирования исходного сбора: степень измельчения для листьев и побегов 1-3 мм, плодов 0,5-1 мм, для корней и корневищ 1 -3 мм, соотношение сырья и экстрагента 1:15, экстрагент 40% спирт этиловый, применение трехкратной экстракции, использование метода реперколяции с законченным циклом в батарее из пяти диффузоров, общее время экстракции 16 суток.

Стандартизация жидкого экстракта

Были проанализированы три серии образцов жидкого экстракта (условно названного) «Тантон» на содержание основных групп

биологически активных веществ с использованием качественных химических реакций и различных видов хроматографии. Данные эксперимента свидетельствуют, что в жидком экстракте содержатся те же биологически активные вещества, что и в исходном сборе: флавоноиды, дубильные вещества, фенологликозиды, полисахариды, аминокислоты, сапонины, алкалоиды.

Методом тонкослойной хроматографии было проведено разделение флавонидов, витаминов, сесквитерпеновых лактонов. В экстракте установлены следующие биологически активные вещества: рутин Ш:=0,64, кверцетин ЯГ=0,93, гиперозид 1114),78, эллаговая кислота Б^ =0,85; кислота аскорбиновая ЯГ=0,92; витамин К, ИТ-0,12; сесквитерпеновые лактоны ЯГ=0,15, ШЧ),3,1*1=0,88.

Изучен фенольный состав экстракта «Тантон» с помощью метода ВЭЖХ. В качестве подвижной фазы использовали систему растворителей-метанол-вода-фосфорная кислота конц. в соотношении 40:60:5; детектирование проводили с помощью УФ-де1ектора при длине волны 254 нм. Результаты проведенных исследований приведены в таблице 6 и на рисунке 6.

Рисунок 6. Хроматограмма фенольных веществ жидкого экстракта «Тантон»

1 аблица 6

Результаты исследования фенольных соединений в жидком экстракте «Тантон» методом ВЭЖХ

№ п/п Наименование PCO Время удерживания PCO, мин Идентифицированные ЬАВ Время удерживания БЛВ, мин

1 Апигеиин 5,23 Апигеиин 5,23

2 Геснеридин 10,03 Гесперидин 10,43

3 Рутин 13,30 Рутин 13,45

4 Гиперозид 15,37 Гиперозид 15,83

5 6 Нарингенин 22,10 Нариш енин 21,91

Галловая кислота 4,73 Галловая кислота 4,74

7 Коричная кислота 4,28 Коричная кислота 4,90

8 Хлорогеновая кислота 5,23 Хлорогеновая кислота 6,19

9 Цикориевая кислота 5,58 11,икориевая кислота 6,93

10 Феруловая кислота 9,16 Феруловая кислота 8,76

11 Глицирризиновая кислота 20,06 Глш щрризиновая кислота 19,54

В результате исследования жидкого экстракта «Тантон» методом ВЭЖХ установлено присутствие флавоноидов- апигенина, гесперидина, рутина, нарингенина, гиперозида и фенолкарбоновых кислот: галловой, коричной, хлорогеновой, цикориевой, феруловой. Значительная часть флавоноидов представлена апигенином и рутином, среди фенолкарбоновых кислот превалирует хлорогеновая кислота, также идентифицирована глицирризиновая кислота, как основная действующая часть солодки. Шестнадцать веществ не идентифицированы из-за отсутствия PCO.

Исследования микроэлементного состава лекарственного сбора и экстракта позволяют объективно рассматривать их как источник поступления микроэлементов в организм человека Сравнительный анализ данных по минеральному составу, полученных при исследовании образцов золы исходного сбора и жидкого экстракта «Тантон», показал, что практически все микроэлементы переходят при экстракции растительного сбора в жидкий экстракт.

Изучен качественный и количественный состав аминокислот в жидком экстракте «Тантон». В результате исследований установлено 25 свободных аминокислот, из них 6 незаменимых: теронин, метионин,

фенилаланин, лизин, лейцин, тришофан. После гидролиза образовалось 17 аминокислот.

В качестве объекта количественного нормирования были выбраны две группы биологически активных веществ- флавоноиды и полисахариды.

Разработка количественного определения суммы флавоноидов в жидком экстракте «Тантон» проводилась на основе спектрофотометрической методики, разработанной для исходного растительного сбора. В качестве стандартного образца использовали PCO ругина. Максимумы спектров оптического поглощения продуктов взаимодействия PCO рутина и жидкого экстракта «Тантон» со спиртовым раствором алюминия хлорида совпадают при длине волны 410 нм.

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов экстракта «Тантон» представлены в таблице7.

Таблица 7

Метрологические характеристики количественного определения суммы флавоноидов жидкого экстракта «Тантон» в пересчете на рутин

f X Р, % t(P,f) S Дх Дх Е,% Е,%

4 0,0194 95 2,78 0,00025 0,00031 0,00078 ±1,63 ±3,65

Относительная ошибка методики количественного определения суммы флавоноидов в экстракте «Тантон» не превышает ±1,63%.

Метод количественного определения суммы восстанавливающих моносахаров полисахаридного комплекса разработан ' на основе аналогичной методики для исходного сбора. Спектры поглощения продуктов взаимодействия жидкого экстракта «Тантон» и раствора PCO глюкозы с кислотой пикриновой в щелочной среде также совпадают при длине волны 470 нм. Метрологические характеристики методики количественного определения суммы восстанавливающих моносахаров полисахаридного комплекса жидкого экстракта «Тантон» в пересчете на глюкозу представлены в таблице 8.

Таблица 8

Метрологические характеристики количественного определения суммы восстанавливающих моносахаров жидкого экстракта «Тантон»

f X Р,% t(P,f) S Дх Дх Е,% Е,%

4 0,208 95 2,78 0,00314 0,00392 0,00875 ±1,88 ±4,21

Относительная ошибка среднего значения методики количественного определения суммы восстанавливающих моносахаров в жидком экстракте «Танюн» не превышает ¿1,88%.

Результаты, полученные в ходе качественного химического анализа и количественного определения, использованы для составления нормативной документации по показателям «Количественное определение» и «Подлинность».

Установлено, что по внешнему виду жидкий экстракт «Тантон» должен соответствовать следующим требованиям: прозрачная жидкость темно-коричневого цвета, со специфичным приятным запахом и жгучим вкусом. Физико-химические показатели жидкого экстракта «Тантон» приведены в таблице 9.

Таблица 9

Физико-химические показатели жидкого экстракта «Тантон»

Наименование показателя Значение показателя

Качественные реакции: Цианидиновая проба (флавоноиды); Реакция пенообразования (сапонины), Реакция с 0,1% спиртовым раствором нингидрина (аминокислоты) Красное окрашивание Образуется пена Красно-синее окрашивание

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, не менее, % 0,015

Содержание суммы восстанавливающих моносахаров в пересчете на глюкозу, не менее, % 0,1

Сухой остаток не менее, % 1,3

Содержание спирта, % 40-45

Тяжелые металлы не более, % 0,001

Микробиологическая чистота категория «Зд»

Установлен срок годности жидкого экстракта «Тантон», который составляет 2 года при хранении в естественных условиях.

Выводы

1. На основе прописей тибетской медицины, данных научной литературы о лекарственных растениях фармакологического скрининга разработана растительная композиция, состоящая из 17 лекарственных растений.

2. На основании фотохимических исследований в исходной растительной композиции обнаружены основные действующие вещества: флавоноиды: гиперозид, лютеолин-7-глюкозид, рутин, мирицетин, кверцетин; дубильные вещества; сапонины; аминокислоты; аскорбиновая

кислота; полисахариды; фенологликозиды; галловая кислота. В составе эфирного масла исходной композиции идентифицировано более 40 индивидуальных соединений, для некоторых из них установлен сырьевой источник. Изучен минеральный состав исходной композиции, установлено 30 макро- и микроэлементов. Установлено количественное содержание в исходной композиции дубильных веществ -1,37%, органических кислот-2,85%, аскорбиновой кислоты-1,87%, суммы флавоноидов от 0,4 до 0,45%, суммы полисахаридов от 4,8 до 12,0%.

3. Разработана технология получения жидкого экстракта с использованием метода реперколяции с законченным циклом в батарее из пяти диффузоров, экстрагентом 40% спиртом этиловым, соотношением сырья и экстрагента 1:15.

4. Изучен качественный состав жидкого экстракта «Тантон» с помощью метода тонкослойной хроматографии, обнаружены: флавоноиды, дубильные вещества, фенологликозиды, полисахариды, аминокислоты, аскорбиновая кислота, сапонины, сесквитерпеновые лактоны, витамин К. Изучен фенольный состав жидкого экстракта «Тантон» с помощью метода ВЭЖХ, обнаружены флавоноиды: апигенин, геспередин, рутин, гиперозид, нарингенин; фенолкарбоновые кислоты: галловая кислота, коричная кислота, хлорогеновая кислота, цикориевая кислота, феруловая кислота, тритерпеноид глицирризиновая кислота; установлен минеральный состав жидкого экстракта «Тантон», установлено, что в образец экстракта переходят практически все макро- и микроэлементы из исходного сбора; качественный и количественный состав свободных аминокислот.

5. Разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов и восстанавливающих моносахаров полисахаридного комплекса в жидком экстракте «Тантон».

6. Установлены показатели качества жидкого экстракта «Тантон» для его стандартизации. Установлен срок годности жидкого экстракта «Тантон»-2 года при хранении в естественных условиях.

На основании проведенных исследований разработана нормативная документация: Технологические условия (ТУ) на биологически активную добавку (БАД) к пище жидкий экстракт «Тантон»; Технологическая инструкция (ТИ); Проект ФСП на лекарственное средство-жидкий экстракт «Тантон».

Список публикаций

1. Парьева К В. Новое адаптогенное средство растительного происхождения / К В Парьева, Г Г. Николаева, И.Г. Николаева, И.К. Иванова // Третий конгресс молодых ученых и специалистов «Науки о человеке»: Сб. науч. ст., Томск, 16-17 мая 2002 года -Томск, СГМУ, 2002.-С. 227-228.

3. Парьева К.В. Фитохимическое изучение лекарственного средства обладающего адаптогенным действием / К.В Парьева, Г.Г. Николаева, И Г. Николаева // Сб. науч. тр. Серия: Химия и биологически активные вещества.-Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2004.-Вып 9.-С. 162-166. 4 Парьева К.В. Влияние степени измельчения растительного материала на выход действующих веществ в многокомпонентном сборе / К.В. Парьева, Г.Г. Николаева, И.Г. Николаева // «Биологически активные добавки в профилактической медицине». 18-19 сентября 2003 г- Матер, науч.-практ. конф.-Улан-Удэ: Изд-во БНЦ СО РАН, 2003.-С. 100-101.

5. Парьева К.В. Новый растительный сбор «Танюн» ! К.В. Парьева, Г.Г. Николаева, И.Г. Николаева // «70-летие службы контроля качества лекарственных средств в Бурятии»: Матер, науч.- практ. конф.-Улан-Удэ.-2003.-С. 88-89.

6. Парьева К.В. Изучение химического состава многокомпонентного растительного сбора «Тантон» хроматографическими методами / К.В Парьева, Г.Г. Николаева, И.Г. Николаева, А.Л. Верещагин, А.Г. Горшков // Сибирский медицинский журнал -2004.- Т.44, №3.-С. 66-69.

7. Парьева К.В. Разработка адаптогенного фитопрепарата «Эликсир Тантон» / К.В. Парьева, Г.Г. Николаева, И.Г. Николаева // «Комплексное использование растительных ресурсов лесных экосистем»: III Региональная научно-практическая конференция с международным участием. Красноярск, 23 апреля 2004 г.: Сб. науч. тр.-Красноярск, 2004.-С. 54-56.

8. Баханова Е.М. Влияние эликсира из лекарственных растений «Тантон» на физическую работоспособность / Е.М. Баханова, И.К. Иванова, К.В. Парьева // «Будущее Бурятии глазами молодежи» 23-24 апреля 2003 г: Матер. Регион, науч.-прак. конф. Улан-Удэ: Изд-во БГУ, 2003.-С. 52-53.

9. Баханова Е.М. Влияние эликсира «Тантон» на физическую работоспособность спортсменов / Е.М. Баханова, К.В. Парьева, И.К. Иванова, Л.Н. Шантанова, С.М. Николаев // «80 лет на страже здоровья»: Матер, науч.-практ. конф.-Улан-Удэ: Изд-во БГУ, 2003.-С. 127-128.

Подписано в печать 13.01.2005 г. Формат 60x84 1/16. Усл. п.л.1,22 Тираж 100 экз. Заказ №6

Отпечатано в типографии ВСГТУ. г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40 в

i

«

I

V

я

i

РНБ Русский фонд

2005-4 46280

Актуальность темы.

Одной из важнейших задач фармацевтической науки на современном этапе является разработка и внедрение новых эффективных комплексных лекарственных препаратов растительного происхождения, обладающих общеукрепляющим, адаптогенным, тонизирующим и иммуномодулирующим действием, способных нормализовать функционирование систем организма человека.

По сравнению с предыдущими десятилетиями, заметно ухудшение состояния здоровья населения России, факторами патогенеза многих заболеваний являются стрессы различного происхождения, большая информационная нагрузка, недостаток физической активности, поступление в организм техногенных токсических веществ. Изменился характер питания человека и как следствие этого отмечается недостаточное употребление натуральных продуктов, витаминов, минеральных веществ, пищевых волокон, биологически активных веществ растений [19, 76]. В связи с этим необходимы комплексные лечебно-профилактические средства, помогающие восстановить защитные функции организма. Одним из подходов к решению этой проблемы является разработка БАД к пище восполняющих дефицит необходимых организму нутриентов, содержащих антиоксиданты, иммуномодуляторы, стимуляторы внутренних органов. Преимущества разработки и применения фитопрепаратов очевидны и обусловлены многими достоинствами, в числе которых широкий спектр фармакологического действия, в отличие от классических лекарств они оказывают мягкое действие без побочных последствий [54, 104, 215]. В этой связи интерес для научных исследований представляют лекарственные средства на основе рецептурных прописей, которые имеют общее воздействие на организм и издавна применяемых в традиционной тибетской медицине. Такие средства могут использоваться в целях профилактики заболеваний, для реабилитации больных после операций, коррекции дезадаптационных нарушений здоровья, снижения утомляемости и повышения работоспособности [68, 69]. Поэтому является актуальным внедрение в практику новых комплексных фитопрепаратов профилактического действия полученных на основе эффективной технологии, а также разработка рекомендаций по стандартизации лекарственных средств, включающих методы качественной и количественной оценки БАВ.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка состава и технологии ' нового эффективного адаптогенного лекарственного средства растительного происхождения, представляющего собой жидкий экстракт, и-способов его стандартизации.

Для достижения указанной цели необходимо- было решить следующие основные задачи:

-разработать оптимальный состав исходной лекарственной растительной композиции для получения ¿фитосредства;

-изучить качественный состав растительной композиции с использованием' современных физико-химических методов анализа и определить содержание основных действующих веществ;

-изучить факторы, влияющие на выход БАВ из растительной композиции ^ разработать технологию производства жидкого экстракта;

-изучить качественный состав жидкого экстракта, разработать методики количественного определения1 БАВ и показатели качества для его стандартизации;

-разработать нормативную документацию в виде ФСП, ТУ, ТИ на средство, рекомендуемое для внедрения в медицинскую практику.

Научная новизна. Подобран и обоснован рациональный состав исходной растительной композиции, на основе которой разработано новое средство с адаптогенной активностью в виде жидкого экстракта (условно названного) «Тантон».

С использованием современных методов анализа установлено наличие в исходной композиции и жидком экстракте «Тантон» биологически активных соединений, относящихся к классу флавоноидов и фенолкарбоновых кислот, тритерпеноидов, дубильных веществ, витаминов, аминокислот, алкалоидов, полисахаридов. Изучен состав эфирного масла исходного сбора, в результате идентифицировано более 40 индивидуальных соединений, для некоторых из них установлены растительные источники; изучен микроэлементный состав исходного сбора и полученного на его основе жидкого экстракта, в результате обнаружено 30 макро- и микроэлементов; установлен качественный и количественный состав аминокислот в жидком экстракте.

Установлено количественное содержание основных действующих веществ в исходном сборе, разработаны методики количественного определения по сумме флавоноидов и полисахаридов.

Разработана технология получения жидкого экстракта из растительного сбора, определены параметры экстрагирования сырья, обеспечивающие максимальный выход биологически активных веществ, обусловливающих адаптогенную, антистрессорную, иммуностимулирующую активность экстракта.

Разработаны методики качественного и количественного определения БАБ и определены показатели качества для стандартизации жидкого экстракта.

Получено положительное решение на выдачу патента «Лекарственное средство «Тантон», обладающее адаптогенной активностью».

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработана нормативная документация:

- проект ФСП на лекарственное средство-жидкий экстракт «Тантон» (утвержден на заседании Ученого совета ИОЭБ СО РАН, протокол № 7 от 07.09.2004 г.);

- Технические условия (ТУ 9197- 014-53015183-04) на биологически активную добавку (БАД) к пище жидкий экстракт «Тантон»; Технологическая инструкция (ТИ);

- растительный сбор внедрен в производство в Центре Восточной медицины МЗ РБ (акт внедрения от 11.05.2004 г);

- установлено, что жидкий экстракт «Тантон» обладает антиоксидантной, иммуномодулирующей, адаптогенной; актопротекторной активностью. Исследования специфической активности проведены в лаборатории экспериментальной фармакологии Института; общей и экспериментальной биологии СО РАН.

Апробация работы И: публикации.

Материалы.диссертационной работы доложены и обсуждены на: -третьем: конгрессе; молодых ученых. и специалистов «Науки о человеке», Томск; 16-17 мая 2002 года; -научно-практической,- конференции ВСГТУ: «Химия и биологически активные вещества», Улан-Удэ; 15 апреля, 2003 г.;: 1 .

-научно-практической конференции «Биологически активные добавки в профилактической медицине»; Улан-Удэ, 18-19сентября2003г.;^

-научно-практической: конференции' посвященной 70-летию службы контроля качества лекарственных средств в Бурятии;; .

-заседании; объединенного семинара лабораторий медико-биологических, исследований, экспериментальнойфармакологииибезопасности биологически активных веществ ИОЭБ СО РАН (г. Улан-Удэ, 18.04.2004 г.)

Основное содержание: диссертации опубликовано в 8 научных работах; в ТУ 9197- 014-53015183-04 и в ТИ на производство биологически активной добавки (БАД) к пище экстракт жидкий «Тантон», проекте ФСП на экстракт жидкий «Тантон».

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Отдела биологически активных; веществ- Института / общей | и экспериментальной биологии СО РАН по программе: «Создание информационного банка данных по тибетской медицине и разработка новых лекарственных препаратов» (номер , государственной регистрации 01.9400031.83); «Лекарственные растения Сибири и Дальнего Востока», являющейся разделом (6.3) Государственной; программы «Сибирь» напериод 1986-2005 гг. и тематикой проблемной комиссии по фармации №36.08 РАМН

МЗ РФ.

Работа по исследованию химического состава БАВ растительного сбора и жидкого экстракта «Тантон» поддержана грантом по программному мероприятию 1.2. Федеральной целевой программы «Интеграция науки высшего образования России на 2002-2006 годы» и проводилась в 2004 году во Всероссийском институте лекарственных и ароматических растений г. Москвы, под руководством главного научного сотрудника лаборатории стандартизации ВИЛАР, д.фарм.н., профессора Даргаевой Тамары Дарижаповны.

Основные положения, выносимые на защиту;

-обоснование растительной композиции и возможности создания средства адаптогенного действия на его основе;

- результаты исследований по содержанию действующих веществ в исходном сборе и готовом средстве;

-способ получения лекарственного средства, обладающего адаптогенной активностью;

-методики стандартизации жидкого экстракта «Тантон».

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. На основе прописей тибетской медицины, данных научной литературы о лекарственных растениях фармакологического скрининга разработана растительная композиция, состоящая из 17 лекарственных растений.

2. На основании фитохимических исследований в исходной растительной композиции обнаружены основные действующие вещества: флавоноиды: гиперозид, лютеолин-7-глюкозид, рутин, мирицетин, кверцетин; дубильные вещества; сапонины; аминокислоты; кислота аскорбиновая; полисахариды; фенологликозиды; галловая кислота. В составе эфирного масла исходной композиции идентифицировано более 40 индивидуальных соединений, для некоторых из них установлен растительный источник. Изучен минеральный состав исходной композиции, установлено 30 макро- и микроэлементов. Установлено количественное содержание в растительном сборе дубильных веществ -1,37%, органических кислот- 2,85%, кислоты аскорбиновой -1,87%, суммы флавоноидов от 0,4 до 0,45%, суммы полисахаридов от 4,8 до 12,0%.

3. Разработана технология получения жидкого экстракта с использованием метода реперколяции с законченным циклом в батарее из пяти диффузоров, экстрагентом 40% спиртом этиловым, соотношением сырья и экстрагента 1:15.

4. Изучен качественный состав жидкого экстракта «Тантон» с помощью метода тонкослойной хроматографии, обнаружены: флавоноиды, дубильные вещества, фенологликозиды, полисахариды, аминокислоты, кислота аскорбиновая, сапонины, сесквитерпеновые лактоны, витамин К^ Изучен фенольный состав жидкого экстракта «Тантон» с помощью метода ВЭЖХ, обнаружены флавоноиды: апигенин, геспередин, рутин, гиперозид, нарингенин; фенолкарбоновые кислоты: галловая, коричная, хлорогеновая, цикориевая, феруловая, тритерпеноид глицирризиновая кислота; установлен минеральный состав жидкого экстракта «Тантон», выявлено, что в образец жидкого экстракта «Тантон» переходят практически все макро- и микроэлементы из исходного растительного сбора; также установлен качественный и количественный состав свободных и связанных аминокислот.

5. Разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов и восстанавливающих моносахаров полисахаридного комплекса в жидком экстракте «Тантон».

6. Установлены показатели качества жидкого экстракта «Тантон» для его стандартизации. Установлен срок годности жидкого экстракта «Тантон»-2 года при хранении в естественных условиях.

На основании проведенных исследований разработана нормативная документация: Технические условия (ТУ) на биологически активную добавку (БАД) к пище жидкий экстракт «Тантон»; Технологическая инструкция (ТИ); Проект ФСП на лекарственное средство-жидкий экстракт «Тантон».